Валидация МДР

«Валидация методики количественного определения метилендифосфоновой кислоты в препарате «медроник, 99mтс, реагент для получения» и субстанции «мdp (комплекс метилендифосфоновой кислоты с оловом двухвалентным)»

Резюме. Важнейшими показателями качества любого радиофармацевтического лекарственного препарата (РФЛП) являются его радиохимическая чистота (РХЧ) или содержание основного вещества, значения которых нормированы. Однако в настоящее время не существует единого подхода к валидации аналитических методик в условиях работы с высоко радиоактивными образцами.

Цель работы: формирование подхода к валидации методики определения содержания основного вещества в РФЛП. Материалы и методы: количественное определение основного вещества в радиофармацевтической композиции, содержащей комплекс технеция-99м с метилендифосфоновой кислотой, проводили спектрофотометрическим методом, в калиброванную пробирку вместимостью 10 мл помещали по 0,2 мл раствора лиофилизата и прибавили по 2,0 мл ацетатного буферного раствора с рН-4,0±0,1, 1,6 мл раствора кислоты сульфосалициловой, 0,4 мл 0,005 М раствора квасцов железоаммонийных доводили объем до метки водой и перемешивая. Через 5 мин измеряли оптическую плотность полученного раствора на в максимуме поглощения при 490 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве контрольной пробы использовали раствор, содержащий все компоненты в указанных количествах, кроме раствора лиофилизата, вместо которого вносят 0,2 мл раствора натрия хлорида изотонического 0,9% для инъекций.

Результаты: рассмотрены и проанализированы существующие нормативные подходы к валидации аналитических методик в сравнении с результатами описанных в литературе экспериментальных исследований, проведена оценка валидационных параметров на соответствие критериям приемлемости, предъявляемым действующими нормативными документами. Доказана селективность спектрофотометрического определения содержание основного вещества в выбранных условиях анализа. Коэффициенты вариации при выполнении тестов «Повторяемость, воспроизводимость и правильность» не превышали 0,28; 2,8 и 8,9% соответственно при относительной погрешности не более 10,5%. Продемонстрирована линейность сигнала при разведении в 10 раз модельного раствора натрия пертехнетата, доказано соответствие нанесенной и детектируемой радиоактивности при анализе в диапазоне содержания примесей 0,5–5%. Показано, что выполнение процедуры валидации связано со значительными радиационными нагрузками на персонал лаборатории контроля качества.

Выводы: предложен методологический подход к валидации методик определения содержания РХП в РФЛП на основе технеция-99м, который в дальнейшем может быть использован при разработке отдельного документа по валидации аналитических методик определения РХЧ или РХП для РФЛП или внесения соответствующих разделов в действующие документы.

Одним из основных средств ядерной медицины является радиофармацевтический лекарственный препарат (РФЛП)1 , представляющий собой композицию, включающую радиоактивный изотоп в определенной химической форме и лиганд, отвечающий за доставку радиоактивного изотопа в тот или иной орган пациента. Ядерно-физические свойства технеция-99м (характер излучения и период полураспада) обуславливают возможность его применения в диагностике (получение изображений и функциональных характеристик органов и систем организма, имеющих различный характер в норме и при наличии патологического процесса). РФЛП на основе технеция-99м (99mТс) готовят в медицинских организациях путем введения раствора натрия пертехнетата (Na99mТсO4 ), который получают при элюировании генератора 99Mo/99mТс, во флакон с лиофилизированной смесью восстановителя (обычно SnCl2 ) и комплексообразующего вещества. Технеций в семивалентном состоянии (в виде натрия пертехнетата) не склонен к комплексообразованию, в то время как технеций с более низкими степенями окисления является реакционноспособным и образует комплексные соединения2 . Восстановитель переводит 99mТс в необходимое окислительное состояние, а комплексообразующее вещество обеспечивает возможность накопления технеция в тканях для визуализации конкретного патологического очага. В результате изготовления РФЛП в его составе могут присутствовать следующие радиохимические примеси (РХП): Na99mТсО4 , не восстановленный двухвалентным оловом и не вступивший в реакцию комплексообразования, и гидролизованный восстановленный технеций-99м (ГВТ).

Одним из важнейших параметров, определяющих качество РФЛП, является его радиохимическая чистота (РХЧ). В случае невозможности определения РХЧ проводят определение содержания радиохимических примесей (РХП)3 . В настоящее время для определения РХЧ или РХП используют преимущественно тонкослойную хроматографию (ТСХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), бумажную хроматографию, электрофорез. В соответствии с Федеральным законом4 для государственной регистрации лекарственного средства заявитель представляет регистрационное досье, структура которого предусматривает наличие данных о валидации аналитических методик. Процесс валидации является важной частью системы обеспечения качества, обязательной в практике производства лекарственного средства. Процесс валидации методик, используемых для определения качества лекарственных средств, регламентирован Государственной фармакопеей Российской Федерации5 , Евразийской экономической комиссией также принято соответствующее Руководство6 . В 2018 г. Европейским Директоратом по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) выпущено «Руководство по разработке монографий на радиофармацевтические препараты»7 , которое содержит рекомендации по валидации методик, связанных с измерением радиоактивности, и учитывает некоторую специфику РФЛП по сравнению с лекарственными средствами других групп. При валидации методики определения РХП устанавливают относительное содержание примесей, которые образуются только в момент взаимодействия Na99mТсО4 с восстановителем и комплексообразующим веществом. Создать модельные смеси с заданным постоянным соотношением примесей невозможно. Необходимо учитывать, что со временем радионуклид распадается (изменяется его радиоактивность), и для определения межлабораторной прецизионности методики РФЛП сложно транспортировать. Кроме того, следует по возможности минимизировать эффективные дозы облучения персонала, выполняющего валидацию. Цель работы — формирование подхода к валидации методики определения содержания радиохимических примесей в радиофармацевтических лекарственных препаратах. Для достижения поставленной цели были реализованы следующие задачи: 1) провести сравнение оцениваемых характеристик для методик определения посторонних примесей в нерадиоактивных лекарственных средствах и радиофармацевтических препаратах; 2) предложить методологические подходы к оценке этих характеристик на примере экспериментальных данных по валидации методик определения РХП в радиофармацевтической композиции, содержащей комплекс технеция-99м с метилендифосфоновой (медроновой) кислотой. Медронат технеция-99м является наиболее широко применяемым РФЛП для остеосцинтиграфии, основной задачей которой является поиск метастатических и оценка распространенности опухолевых поражений скелета8 . Лиофилизат для изготовления этого препарата непосредственно в медицинских организациях выпускается многими радиофармацевтическими компаниями. Методики определения примесей медроната технеция-99м в лекарственной форме для инъекций описаны в фармакопее США9 (для определения содержания Na99mТсО4 используется бумажная хроматография в 85% растворе метанола, а для определения содержания ГВТ — бумажная хроматография в 0,9% растворе натрия хлорида) и в Европейской фармакопее10 (для определения содержания Na99mТсО4 используется ТСХ в метилэтилкетоне, а для определения содержания ГВТ — ТСХ в 13,6% растворе ацетата натрия). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Радиофармацевтическую композицию (РК) готовили путем добавления 4 мл раствора Na99mТсО4 с необходимой объемной активностью (185– 1480 МБк/мл) во флакон, содержащий лиофилизированную смесь 10 мг метилендифосфоновой кислоты (МДФК) (кат. № M9508 Merck, Германия), 1 мг олова дихлорида дигидрата (кат. № 31669 SigmaAldrich, США) и 2 мг аскорбиновой кислоты (кат. № 95212 Fluka, Швеция). Полученную РК инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего проводили определение содержания РХП (Na99mТсО4 и ГВТ). Раствор Na99mТсО4 получали путем элюирования генератора 99Мо/99mТс (НИФХИ им. Л.Я. Карпова, г. Обнинск, Россия) 0,9% раствором натрия хлорида, входящим в комплект поставки генератора, в соответствии с инструкцией по его эксплуатации. Активность полученного элюата измеряли на дозкалибраторе РИС А1 (ООО «НТЦ Амплитуда», Россия). При необходимости элюат разбавляли 0,9% раствором натрия хлорида до требуемой объемной активности (185–1480 МБк/мл). Раствор Na99mТсО4 готовили непосредственно перед приготовлением РК. Определение содержания Na99mТсО4 в синтезированной РК проводили методом ТСХ. Для этого использовали пластинки ITLC-SG (Agilent Technologies, США) из стекловолокна, импрегнированного силикагелем, размером 10×100 мм, в качестве подвижной фазы использовали метилэтилкетон (кат. № 1097081000 Merck, Германия). На линию старта хроматографических пластинок наносили по 2 мкл раствора РК. После подсушивания пятна на воздухе проводили хроматографирование восходящим методом11. Ориентировочное время хроматографирования составляло 6 мин. В указанном режиме хроматографирования примеси Na99mТсО4 соответствует пятно с Rf = 0,95 ± 0,05. Содержание Na99mТсО4 в РК определяли как отношение активности участка хроматограммы 80–100 мм к активности всей хроматограммы. Содержание Na99mТсО4 должно быть не более 2%12. Определение содержания ГВТ в синтезированной РК проводили методом ТСХ. Для этого использовали пластинки ITLC-SG (Agilent Technologies, США) из стекловолокна, импрегнированного силикагелем, размером 10×100 мм, в качестве подвижной фазы использовали 13,6% раствор натрия ацетата. Хроматографию проводили сразу же после нанесения пробы на линию старта, не давая пятну высохнуть. Ориентировочное время хроматографирования составляло 7 мин. В указанном режиме хроматографирования ГВТ остается на старте хроматограммы (Rf = 0 ± 0,05). Содержание ГВТ в препарате определяли как отношение активности участка хроматограммы 0–25 мм к активности

всей хроматограммы. Содержание ГВТ в РК должно быть не более 5% при полном отсутствии Na99mТсО4 . Нормированное суммарное значение содержания примесей (Na99mТсО4 и ГВТ) в РК не должно превышать 5%13. Распределение радиоактивности по хроматограмме определяли радиометрическим методом путем сканирования хроматограмм на приборах Mini-Scan (Bioscan, США) или Scan-RAM (LabLogic Systems Ltd., Великобритания) при скорости сканирования 2 мм/с. Процедура валидации включала оценку специфичности методик, повторяемости, прецизионности, правильности и линейности. При оценке специфичности, повторяемости и прецизионности проводили хроматографическое разделение компонентов РК с последующим сканированием полученных хроматограмм. После проведения хроматографии пластинки высушивали на воздухе при комнатной температуре, обклеивали с двух сторон лентой с липким слоем и проводили измерение радиоактивности на хроматограмм-сканере. При оценке правильности и линейности использовали модельные растворы и проводили сканирование хроматографических пластинок без предварительной хроматографии. При изучении линейности модельные растворы Na99mТсО4 с минимальной и максимальной объемной активностью разбавляли в 2, 4, 5 и 10 раз. На линию старта хроматографических пластинок наносили по 2 мкл разбавленных модельных растворов Na99mТсО4 , а на линию фронта — по 2 мкл растворов Na99mТсО4 с объемной активностью 185 МБк/мл (при валидации метода для растворов с минимальной объемной активностью) и 1480 МБк/мл (при валидации метода для растворов с максимальной объемной активностью). После подсушивания пятен пластинки обклеивали с двух сторон лентой с липким слоем и проводили измерение радиоактивности путем их сканирования. Математическую обработку полученных результатов и статистический анализ данных проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010. Расчет эквивалентных доз облучения на глаза и руки (кончики пальцев) сотрудников проводили исходя из радиоактивности образцов, времени выполнения тестов и расстояния между облучаемым объектом и образцами14. Для уменьшения дозовых нагрузок на персонал при выполнении некоторых тестов, где это было возможно, использовали РК с минимальной допустимой по нормативным документам для РФЛП объемной активностью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оцениваемые характеристики. Перечень характеристик, которые рекомендуется оценивать при валидации методик количественного определения примесей согласно требованиям ОФС.1.1.0012.1515 в сравнении с рекомендациями Руководства EDQM16, приведен в таблице 1. В настоящее время Руководство EDQM переведено на русский язык и практически без изменений предложено к утверждению Фармакопейным комитетом ЕАЭС в качестве аналогичного Руководства, то есть в ближайшее время документ начнет действовать. Поэтому представлялось целесообразным провести сравнение оцениваемых характеристик, представленных в обоих документах. Показано, что для методик количественного определения посторонних примесей и радиохимической чистоты оба документа предписывают определение одних и тех же показателей, при этом для РХЧ (РХП) оценка прецизионности не является обязательной для РФЛП, содержащих относительно короткоживущий радионуклид. Оценка робастности методики также не является обязательной для количественного определения примесей. Специфичность. При проведении теста «Специфичность» было доказано различное положение пиков, соответствующих примесям (Na99mТсО4 , ГВТ) и комплексу технеция-99м с медроновой кислотой. Аналогичный подход используется в работах [1–4]. Если радиохимические примеси недоступны в качестве индивидуальных соединений (в нашем случае это ГВТ), но их можно получить путем проведения стресс-испытаний (подвергая РК воздействию повышенной температуры, влажности, рН и т.д.), то результаты этих испытаний могут использоваться для подтверждения специфичности методики [2, 3]. Раствор ГВТ получали путем растворения восстановителя (олова дихлорида) в растворе Na99mТсО4 в отсутствие медроновой и аскорбиновой кислот. Результаты проведения теста, представленные на рисунке 1, доказывают специфичность методики определения содержания Na99mТсО4 , а результаты, представленные на рисунке 3, доказывают специфичность методики определения содержания ГВТ в РК. На хроматограмме раствора Na99mТсО4 в системе силикагель–метилэтилкетон имеется только один пик с Rf = 0,95 ± 0,05 (рис. 1а), в то время как при хроматографировании в этой же системе раствора РК детектируется один пик с Rf = 0±0,05, соответствующий комплексу технеция-99м с МДФК

Таблица 1. Характеристики, оцениваемые при валидации методик определения посторонних примесей Table 1. Characteristics assessed during validation of methods for determination of impurities Характеристика методики Characteristic Количественное определение посторонних примесей15 Quantitative determination of impurities15 Радиохимическая чистота16 Radiochemical purity16 Специфичность Specificity + + Предел обнаружения Detection limit – – Предел количественного определения Quantification limit + + Аналитическая область Range + + Линейность Linearity + + Правильность (точность) Accuracy + + Прецизионность: Precision: - повторяемость (сходимость) Repeatability + (+) - промежуточная (внутрилабораторная прецизионность) Intermediate precision + (+) Устойчивость Robustness Определяется при необходимости If necessary Определяется при необходимости If necessary Примечание. «+» — определение предусмотрено; «–» — определение не предусмотрено; (+) — определение не всегда возможно (например, короткий период полураспада). Note. + required; — not required; (+) not always possible (e.g. short half-life).

Измеренная радиоактивность, имп. Measured radioactivity, counts

Длина хроматограммы, мм

Chromatogram length, mm

0 20 40 60 80 100 120 140

0

500

250

750

1000

1250

1750

1500

2000

2250

Старт / Start

Фронт/ Front

Фон/ Bkg

Измеренная радиоактивность, имп.

Measured radioactivity, counts

Длина хроматограммы, мм

Chromatogram length, mm

0 20 40 60 80 100 120 140

0

1000

500

1500

2000

2500

3000

3500

Рис. 1. Хроматограммы, полученные в системе силикагель–метилэтилкетон: (a) раствора Na99mТсО4 с объемной активностью 185 МБк/мл; (b) раствора радиофармацевтической композиции с объемной активностью 185 МБк/мл, содержащего

комплекс 99mТс с метилендифосфоновой кислотой

Fig. 1. The chromatograms obtained using silica gel and methyl ethyl keton: (a) sodium pertechnetate (99mTc) solution with volume

radioactivity of 185 MBq/mL; (b) radiopharmaceutical formulation solution containing a complex of 99mTc and medronic acid, with

volume radioactivity of 185 MBq/mL

a

(рис. 1b). При наличии примеси Na99mТсО4 в РК на хроматограмме регистрируется второй пик с Rf = 0,95±0,05. Хроматограмма раствора РК с объемной активностью 186,6 МБк/мл, содержащего комплекс 99mТс-МДФК и Na99mТсО4 , представлена на рисунке 2.

На хроматограмме модельного раствора ГВТ в системе силикагель — 13,6% раствор ацетата натрия имеется только один пик с Rf = 0 ± 0,05 (рис. 3а), в то время как при хроматографировании в этой же системе раствора РК детектируется один