Рецептор P2Y1, повышающем вентиляцию

Содержание

Введение 3

Обзор литературы 5

Дыхательная система: общий обзор 8

Пуринергическая сигнализация в центральной хеморецепции 11

Гипоксическая вентиляционная реакция и АТФ 15

Роль периферических хеморецепторов в гипоксическом вентиляционном ответе 19

Центральные механизмы, формирующие вторичную депрессию 22

Механизм ощущения гипоксии 24

Предпосылки и обоснование текущей работы 27

Ионные каналы, которые могут способствовать опосредованному P2Y1-рецептором увеличению частоты дыхания 31

Цели исследования 34

Записи 38

Записи внеклеточных нервных корешков 42

Наркотики и их применение 43

Статистический анализ 45

Внутриклеточный сигнальный путь, который опосредует частотные эффекты активации рецептора P2Y1 47

Активация рецептора P2Y1 увеличивает Ca2 + i в инспираторных нейронах 48

Вызванное рецептором P2Y1 увеличение частоты вдоха включает высвобождение Ca2 + из внутриклеточных запасов 49

Идентификация ионных каналов, лежащих в основе частотных эффектов активации рецептора P2Y1 52

Каналы ГИРК 53

Сигнальные пути, опосредующие эффекты активации рецептора P2Y1 на Ca2 + i и частоту Пре-Бётцингерский комплекс 57

Активация рецептора P2Y1 увеличивает Ca2 + i инспираторных нейронов Пребетца 59

Пребетцовые инспираторные нейроны дифференциально чувствительны к активации рецептора P2Y1 60

Ca2+, высвобождаемый из внутриклеточных запасов, способствует опосредованному рецептором P2Y1 увеличению частоты дыхания 62

Минимальный вклад каналов GIRK, SK и K +, управляемых напряжением, в возбуждение сети, опосредованное P2Y1R 64

Каналы GIRK 67

Каналы K+ с регулируемым напряжением (VGKC) 69

Каналы SK 70

BK-каналы типа II могут быть нижестоящим эффекторным каналом рецептора P2Y1 72

Заключение 73

Список источников 74

Введение

Гипоксическая вентиляционная реакция является двухфазной, состоящей из первоначального увеличения вентиляции с последующим вторичным угнетением. Первоначальное увеличение вентиляции опосредуется периферическими каротидными телами, где в качестве центральных механизмов были задействованы вторичные депрессии. Фаза вторичной депрессии более выражена у недоношенных детей, что представляет угрозу для жизни. Рецепторы P2Y1 играют важную роль в формировании гипоксической вентиляционной реакции. Во время гипоксии АТФ высвобождается в вентральном дыхательном тракте, включая комплекс Пребетцингера (ключевой участок генерации ритма вдоха), где он вызывает опосредованное рецептором P2Y1 увеличение частоты вдоха, что ослабляет вторичную депрессию. Молекулярные механизмы, участвующие в возбуждении сети АТФ, неизвестны. В других частях мозга рецепторы P2Y1 связаны с Gaq-сигнальным путем, который включает фосфолипазу С и инозитол-трисфосфат-опосредованное высвобождение Ca2+ из внутриклеточных хранилищ. Таким образом, я предсказал, что пребетцовские инспираторные нейроны будут реагировать на активацию рецепторов P2Y1 увеличением флуоресценции Ca2 +.

18 инспираторных нейронов из 5 срезов показали увеличение базовой флуоресценции на ~50% при локальном применении агониста рецептора P2Y1 MRS 2365 (100 мкм, 10 сек). Основываясь на высокой чувствительности сети к активации P2Y1R, я предположил, что популяция нейронов, которая важна для генерации ритма или для обеспечения прямого возбуждения нейронов, генерирующих ритм, очень чувствительна к активации рецептора P2Y1. Я проверил гипотезу о том, что не все инспираторные нейроны одинаково чувствительны к вызванному MRS 2365 увеличению Ca2 +i. Респонденты, изменение флуоресценции которых было очевидным при визуальном осмотре, составляли 12 нейронов из 20 нейронов, прошедших скрининг, показали увеличение исходного Ca2 + на 46,9 ± 10,2%. с другой стороны, у респондентов, не ответивших, наблюдалось только увеличение флуоресценции Ca2 + на 6,54 ± 2,8%. Затем я проверил источник вызванного MRS 2365 Ca2 + и его вклад в возбуждение дыхательной сети. Истощение Ca2 + i с помощью блокаторов Са2 +-атфазы сарко / эндоплазматического ретикулума (SERCA) ослабило вызванное MRS 2365 увеличение Ca2 + i на 43,9 ± 7,3%. На сетевом уровне блокаторы SERCA тапсигаргин (200 мкм) и циклопиазоновая кислота (CPA) ослабляли увеличение частоты, вызванное MRS 2365, на 26,7 ± 7,2% и 31,43 ± 7,93% соответственно. Затем я провел скрининг связанных с G-белком калиевых каналов с внутренним выпрямлением (GIRK; BaCl2), SK (апамин), K +-каналов с регулируемым напряжением (тетраэтиламмоний) (TEA), BK-каналов типа I (ибериотоксин) в качестве нисходящего эффектора рецептора P2Y1 и не обнаружил никакого влияния на MRS 2365, вызванное увеличением частоты, в то время как Паксиллин, блокатор BK-каналов типа I и II с ослабленным на 1 мкм MRS 2365, вызывал увеличение частоты на 29,12 ± 13,2%, что указывает на возможную роль каналов Ca2 + i и BK типа II в возбуждении сети, опосредованном рецептором P2Y1.

1.0 Обзор литературы

1.1 Дыхательная система: общий обзор

У млекопитающих дыхательная система генерирует сложный, высоко скоординированный паттерн ритмической активности, называемый дыханием. Дыхание играет важную роль в ряде функций. У позвоночных он поддерживает метаболизм, обеспечивая газообмен, регулируя PO2, PCO2 и pH крови, а у многих позвоночных он также способствует регулированию температуры.

Создание сложных форм поведения, таких как дыхание, требует интеграции и координации множества нервно-мышечных и скелетных компонентов. Дыхание одновременно и сильное; оно начинается в эмбриональной жизни и у большинства млекопитающих продолжается почти непрерывно до самой смерти, несмотря на драматические изменения в мозге и теле, которые сопровождают рост и развитие, беременность, болезни и старение. Кроме того, чтобы соответствовать метаболическим потребностям при различных физиологических состояниях в факте вышеуказанных временных изменений, дыхание также обладает высокой адаптивностью.

Как и многие другие ритмичные двигательные действия, дыхательный ритм также вырабатывается центральным генератором паттернов (CPG). CPG - это полуавтономные нейронные сети, которые способны генерировать ритмичные выходные сигналы без входов от других центральных цепей и сенсомоторных сигналов обратной связи.

Дыхательный CPG состоит из генератора ритма, комплекса Пребетцингера, который вырабатывает основной ритм, и генератора паттернов, включающего премотонейроны и мотонейроны, которые преобразуют основной ритм в требуемые паттерны активности во всех инспираторных мышцах, которые накачивают воздух, модулируют сопротивление воздушного потока и стабилизируют грудная клетка (Лейн, 2011; Монто и Илер, 1991).

Центральная сеть получала механорецептивную обратную связь из ряда источников, включая медленно адаптирующиеся рецепторы растяжения легких в дыхательных путях, которые лежат в основе рефлексов Брейера-Херринга, важных для синхронизации дыхания и поддержания эффективного двигательного паттерна.

Гомеостатический контроль газов крови посредством газообмена в легких является основной физиологической ролью дыхания и сетей, контролирующих дыхание. Для достижения этого дыхательная сеть получает хемосенсорную обратную связь о PO2 и PCO2/pH от датчиков, расположенных в артериях и головном мозге. Любое изменение артериальных PaO2, PaCO2 или pH вызывает вентиляционные хеморефлексии, которые регулируют вентиляцию для восстановления гомеостаза.

Основные компоненты для генерации дыхательного ритма и формирования моторных паттернов вдоха и выдоха расположены вдоль обширной колонны в вентролатеральном стволе мозга, называемой вентральной дыхательной колонной (VRC), которая проходит от каудального продолговатого мозга до моста. Двигаясь от каудального к ростральному, VRC далее делится на следующие области (1) каудальная вентральная дыхательная группа (cVRG), соответствующая уровню ретроамбигусного ядра (2) ростральный VRG (rVRG), локализованный на уровне неоднозначного ядра (3) преБетЦ, расположенный каудально к ретрофациальному ядру (4) комплекс Бетцингера (Комплекс Ботцингера) расположены каудально к лицевому (VII) ядру и вентрально к неоднородному ядру (5) ретротрапезоидное ядро / парафациальная дыхательная группа (RTN / pFR), расположенная вентрально к VII ядру и понтийской дыхательной группе (PRG), которые включают ядро парабрахиальной медиалис и предохранитель Келликера.

Дыхательные ядра также включают область в дорсальном мозговом веществе, называемую дорсальной дыхательной группой (DRG). DRG расположен в каудальном, вентролатеральном ядре одиночного тракта (cNTS) и в основном содержит инспираторные нейроны. DRG содержит насосные или Р-клетки, которые получают информацию от легочных механорецепторов, важных для рефлексов Брейера-Геринга.

У грызунов он значительно снижен по сравнению с кошками, где он также содержит значительную популяцию диафрагмальных премотонейронов (Даффин и Липски 1987; Липски, Кубин и Йодковский 1983; Тянь и Даффин 1998).

Уменьшенный размер DRG у крыс в сочетании с повышением роли грызунов в качестве предпочтительной модели животных для контроля дыхания означает, что DRG уделялось мало внимания. NTS, однако, является важным афферентным ретрансляционным ядром, отдельным от DRG, которое является первым центральным синапсом для множества афферентных сигналов, связанных с дыханием, и, что наиболее важно, от хеморецепторов сонных артерий.

PRG участвует в контроле фазовых переходов при вдохе и выдохе (и сенсомоторной интеграции.

Понтиновые проекции на медуллярные контуры имеют решающее значение для поддержания сопротивления верхних дыхательных путей во время начальной фазы выдоха, называемой постинспирацией, когда удлиненное сокращение диафрагмы и активация мышц дыхательных путей замедляют поток воздуха при выдохе, максимизируя газообмен.

RTN / pFRG, расположенные вблизи медуллярной поверхности вентрально лицевому ядру, сначала рассматривались как одна большая область, чувствительная к химиотерапии по своей природе. Основываясь на наблюдении, что растормаживание или активация преимущественно латеральных парафациальных нейронов (pFL) вызывает активный выдох, можно предположить, что RTN / pFRG можно разделить на ритмичный активный выдох, генерирующий pFRG, и хемочувствительный RTN, по крайней мере, у взрослых крыс (Хакстепп и др. 2015; Pagliardini и др., 2011). Помимо постоянного мониторинга уровней CO2 в мозге, RTN считается интегрирующим центром, который получает информацию от периферических хеморецепторов, чувствительных к кислороду и CO2, а также других центральных хеморецептивных центров.

Хемочувствительные нейроны RTN экспрессируют фактор транскрипции Phox2b. Мутация в Phox2b связана с врожденным синдромом центральной гиповентиляции. ‘Прединспираторные’ осцилляторные нейроны были идентифицированы в области pFRG в препаратах ствола головного мозга и спинного мозга новорожденных грызунов in vitro. pFRG обеспечивает ритмичный возбуждающий импульс для Пре-Бётцингерский комплекс на эмбриональной и ранней стадиях развития; это снижает скорость развития, и у взрослых грызунов в состоянии покоя активность позднего выдоха полностью отсутствует как в RTN, так и в областях pFRG (Оку, Масумия и Окада 2007). Недавние достижения подтверждают представление о pFRG как о генераторе условного выдоха, который генерирует активный выдох во время усиленного дыхания (например, при физических упражнениях) и быстрого сна.

Пре-Бётцингерский комплекс преимущественно содержит экспираторные нейроны и обеспечивает широко распространенные тормозные проекции по всему VRC. В Комплекс Ботцингера были идентифицированы два подтипа нейронов выдоха, а именно E-AUG (увеличивающий нейрон выдоха) и E-DEC (уменьшающий нейрон выдоха). Другой подтип E-AUGs обнаружен в cVRG, но это премотонейроны выдоха. Считается, что тормозные нейроны E-DEC Комплекс Ботцингера играют важную роль в фазовых переходах выдоха и вдоха. Активность нейронов E-AUG в Комплекс Ботцингера может подавлять мотонейронную активность верхних дыхательных путей, которая обычно остается неактивной во время вокализации, глотания и сжимающей фазы кашля/

Каудальнее Комплекс Ботцингера находится Пре-Бётцингерский комплекс, который считается ядром для генерации ритма вдоха у млекопитающих. преБетЦ - это гетерогенная нейронная сеть. Подмножество нейронов в Пре-Бётцингерский комплекс, называемых нейронами-кардиостимуляторами, обладает способностью выражать автономные колебательные свойства и когда-то считалось важным для генерации дыхательного ритма. Авторы предположили, что активируемый кальцием неселективный катионный ток (ICAN) или постоянный натриевый ток (INaP) в сочетании с возбуждающими синаптическими взаимодействиями могут способствовать этой внутренней ритмической активности.

Однако, на удивление, ритм сохранялся даже после фармакологической блокировки этих токов, предполагая, что эти токи не являются необходимыми для генерации ритма вдоха.

Также была изучена роль торможения в формировании дыхательного ритма. Ритм сохранялся, несмотря на блокирование ингибирования как в регионах Пре-Бётцингерский комплекс, так и в регионах Комплекс Ботцингера взрослых крыс. Большинство нейронов Пре-Бётцингерский комплекс являются глутаматергическими и экспрессируют рецепторы нейрокинина-1 (NK1-R), которые используются в качестве маркера Пре-Бётцингерский комплекс. Блокада не-N-метил-D-аспартатных (NMDA) глутаматных рецепторов 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дионом (CNQX) отменяла ритм, предполагая, что глутаматергическая передача сигналов имеет решающее значение для генерации дыхательного ритма.

Селективная и двусторонняя абляция клеток, экспрессирующих NK1-R, в Пре-Бётцингерский комплекс вызывала тяжелую атаксию дыхания и аномальные реакции на гипоксию и гиперкапнию in vivo, в то время как односторонняя абляция клеток, экспрессирующих NK1-R, в Пре-Бётцингерский комплекс вызывала нарушение дыхания, которое впервые появилось во время сна. Локализованные совместно с NK1-R-позитивными нейронами, пребетц-нейроны экспрессируют соматостатин, пептидный гормон. Интересно, что подавление этих клеток, экспрессирующих соматостатин, у бодрствующих взрослых крыс вызывает стойкое апноэ. Эти эксперименты указали на специфические фенотипы клеток, которые играют важную роль в генерации ритма. Глутаматергические преБетЦ-нейроны, обладающие рецепторами NK1 и экспрессирующие соматостатин, необходимы для генерации ритма. Эти глутаматергические, экспрессирующие NK1 и SST нейроны были идентифицированы как происходящие из Dbx1-экспрессирующих клеток-предшественников.

Нейроны, полученные из клеток-предшественников Dbx1, экспрессируются по всему VLM. Тем не менее, те, которые присутствуют в Пре-Бётцингерский комплекс, необходимы для генерации ритма. Это подтверждается тем фактом, что у мышей-мутантов Dbx1 наблюдался тяжелый респираторный дефицит и что избирательное, нейрон за нейроном удаление нейронов, полученных из Dbx1, полученных из Пре-Бётцингерский комплекс, быстро нарушает ритм вдоха in vitro.

rVRG содержит возбуждающие глутаматергические бульбоспинальные инспираторные нейроны, которые моносинаптически проецируются на инспираторные мотонейроны в диафрагмальном ядре и на внешние межреберные мотонейроны.

Нейроны E-AUG в cVRG представляют собой возбуждающие бульбоспинальные нейроны, которые проецируются на выдыхающие абдоминальные и выдыхающие внутренние межреберные мотонейроны. Входные данные из нескольких областей VRC, включая Пре-Бётцингерский комплекс, Комплекс Ботцингера и области pFRG / RTN, объединяются для получения соответствующей активации и торможения различных дыхательных мышц-насосов.

Появление ритмически активного препарата медуллярного среза значительно продвинуло наше понимание генерации дыхательного ритма и модуляции ритма различными нейротрансмиттерами и модуляторами. Относительно легкий физический и фармакологический (отсутствие гематоэнцефалического барьера) доступ к определенной интересующей области в сочетании с возможностью применения широкого спектра технологий к такой определенной схеме сделали медуллярный срез универсальным инструментом для изучения физиологических механизмов, лежащих в основе генерации ритмов, формирования паттернов и нейромодуляции в сети, синаптических, клеточный и, в конечном счете, молекулярный уровни. Я использовал эти преимущества ритмической подготовки медуллярного среза, чтобы изучить роль пуринергической сигнализации в модуляции пребетцовского ритма вдоха

2 Пуринергическая модуляция дыхательных сетей

Физиологическое действие внеклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) впервые было продемонстрировано в 1929 году на сердце и кровеносные сосуды.

Первоначально АТФ был распознан как нейромедиатор в неадренергических, нехолинергических тормозных нервах морской свинки taenia coli, а позже как ко-передатчик в симпатических и парасимпатических нервах (Барнсток 1976). С тех пор роль АТФ в различных физиологических и патофизиологических путях была тщательно исследована.

Первые Р2-рецепторы были клонированы в 1993 году. С тех пор многочисленные исследования выявили широкое распространение подтипов пуринергических рецепторов по всей ЦНС (Барнсток 2007). Пуринергические рецепторы можно в широком смысле разделить на Р1 (аденозиновые) и Р2 (АТФ) рецепторы. Рецепторы P2 снова подразделяются на рецепторы P2X и P2Y. P2X представляют собой ионотропные, управляемые лигандами неселективные катионные каналы, проницаемые для Na +, K + и Ca2 +, которые опосредуют быстрые возбуждающие реакции на АТФ. Семь генов, от P2X1 до P2X7, кодируют семь подтипов рецепторов P2X. Восемь рецепторов P2Y (P2Y1, 2, 4, 6, 11-14) представляют собой рецепторы, связанные с G–белком (GPCR), которые опосредуют более медленные реакции на АТФ, аденозиндифосфат (ADP) и уридинтрифосфат (UTP). На основании путей второго мессенджера, с которыми связаны эти рецепторы, подтипы рецепторов P2Y могут быть сгруппированы в соответствии с рецепторами, связанными с G-белком, которые они активируют, которые включают: i) Gaq – P2Y1,2,4,6; ii) Gi – P2Y12,13 и; iii) множественные G-белки: P2Y14 для Gi/GO и P2Y12 для Gaq и GS. Рецепторы P2X и P2Y экспрессируются по всей ЦНС на астроцитах и нейронах. Однако экспрессия рецептора P2Y11 ограничена нейронами, где экспрессия рецептора as P2X7, по-видимому, ограничена иммунными клетками и глией (Барнсток 2007).

Гидролиз АТФ, АДФ или АМФ эктонуклеотидазами приводит к образованию аденозина (ADO) в качестве конечного продукта, который действует как эндогенный лиганд для Р1-рецепторов. Рецептор P1 содержит четыре метаботропных аденозиновых рецептора A1, A2a, A2b и A3. Обычно A1 и A3 связаны с GI, активация которых ингибирует выработку циклического AMP (цАМФ), тогда как A2a и A2b стимулируют выработку цАМФ через Gs. Рецепторы А1 высоко экспрессируются по всему мозгу. Рецепторы A2a высоко экспрессируются на стриатопаллидальных ГАМКергических нейронах головного мозга.

В целом, активация рецептора A1 ингибирует высвобождение нейротрансмиттеров пресинаптически и снижает возбудимость нейронов постсинаптически.

Суммарный эффект внеклеточной АТФ на сети ЦНС является результатом динамического взаимодействия между: i) действием АТФ на рецепторы P2X; ii) АТФ и АДФ на рецепторы P2Y; (ii) эктонуклеотидазами, которые дифференцированно разлагают АТФ, АДФ и АМФ в конечном итоге в ADO; iii) действием ADO на рецепторы P1. (Фанк 2013). Следовательно, в дополнение к уровням экспрессии рецепторов P2 и P1, концентрация и подтипы эктонуклеотидаз также будут влиять на суммарный эффект АТФ на сети ЦНС.

Эктонуклеотидазы гидролизуют внеклеточные нуклеотиды до их соответствующих нуклеозидов. Были идентифицированы четыре семейства эктонуклеотидаз. К ним относятся эктонуклеотидазы трифосфатдифосфогидролазы (ENTPDases). Это широко экспрессируемые эктонуклеотидазы в ЦНС. Было выделено восемь подтипов. ENTPDase1 гидролизует АТФ и АДФ до AMP в равной степени. И ENTPDase2, и ENTPDase3 предпочтительно гидролизуют АТФ, а не АДФ, но ENTPDase3 обладает приблизительно в десять раз более высоким сродством к АДФ, чем ENTPDase2.

Эктонуклеотидпирофосфатаза/фосфодиэстераза (E-NPP) представляют собой второй класс, который гидролизует АТФ до AMP. В-третьих, щелочные фосфатазы гидролизуют АТФ до ADO, а экто-5’-нуклеотидазы гидролизуют AMP до ADO.

Активность и экспрессия этих эктонуклеотидаз могут варьироваться в зависимости от возраста, вида и, возможно, пола, что может существенно влиять на влияние АТФ на сети ЦНС.  Например, АТФ оказывает совершенно иное влияние на дыхательный ритм в Пре-Бётцингерский комплекс новорожденных крыс по сравнению с мышами при применении in vitro. У крыс АТФ вызывает значительное увеличение частоты дыхания, когда АТФ вводят в генератор ритма вдоха, Пре-Бётцингерский комплекс, что отражает чувствительность дыхательного ритма к АТФ, действующей на рецепторы P2Y1.

Напротив, на дыхательный ритм мышей почти не влияет АТФ, применяемый практически в идентичных условиях, поскольку возбуждающее действие АТФ на рецепторы P2Y1 нейтрализуется ингибирующим действием его побочного продукта, аденозина, на рецепторы A1. Интересно отметить, что эта разница в чувствительности частично обусловлена дифференциальной экспрессией эктонуклеотидаз у крыс и мышей, а также большей чувствительностью мышиного Пре-Бётцингерский комплекс к аденозину. Мыши экспрессируют высокие уровни эктонуклеотидазы, тканевой неспецифической щелочной фосфатазы (TNAP), которая расщепляет АТФ непосредственно на ADO, а последний активирует ингибирующие рецепторы A1. Крысы, с другой стороны, экспрессировали в основном ENTPDase2, который преимущественно гидролизует АТФ до АДФ, который является предпочтительным физиологическим агонистом возбуждающих рецепторов P2Y1.

Способность экзогенной АТФ модулировать дыхательные сети была впервые признана в 1997 году с демонстрацией того, что АТФ увеличивает инспираторный моторный отток подъязычной жидкости в гениоглоссус (GG) у новорожденных крыс in vitro и взрослых крыс in vivo. Дополнительные доказательства модуляции ATP моторной активности при вдохе появились в 2002 году в результате демонстрации in vitro аналогичного ATP-опосредованного потенцирования возбудимости диафрагмальных мотонейронов.

Основываясь на потенциалах обращения вызванных АТФ токов и изменениях проводимости мембраны, действия АТФ на мотонейроны первоначально приписывались рецепторам P2X.  По крайней мере, в подъязычных мотонейронах рецепторы P2Y1, по-видимому, вносят свой вклад, увеличивая амплитуду инспираторных импульсов, регистрируемых подъязычным нервом.

Роль АТФ в контроле дыхания привлекла значительное внимание в середине 90-х годов. Высокие уровни экспрессии рецепторов P2X2 в хемочувствительных областях VLM и потенцирование ответов ATP на рецепторах P2X2 за счет снижения pH привели к гипотезе, что рецепторы P2X2 могут быть фактическими сенсорами CO2, участвующими в центральной респираторной хеморецепции. Эта гипотеза была в конечном счете отвергнута, поскольку центральная химиочувствительность у мышей с нокаутом P2X2 оставалась неизменной, а антагонисты P2X2 не влияли на чувствительность к CO2 in vitro. Однако эти данные не исключали потенциальной роли передачи сигналов АТФ и Р2-рецепторов в хеморецепции, используя биосенсоры АТФ, продемонстрировали, что АТФ высвобождается с вентральной поверхности продолговатого мозга, покрывающей область ретротрапезоидного ядра (RTN) (CO2 хемочувствительная область ствола головного мозга) в ответ на гиперкапнию. Кроме того, блокада Р2-рецепторов пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновой кислотой (PPADS) ослабляла гиперкапнический вентиляционный ответ на 20-30% (Гурин. 2005). Эти данные убедительно подтвердили вклад АТФ и Р2-рецепторов в центральную чувствительность к CO2 и привели к значительному объему текущей работы, описанной ниже, которая продолжает изучать роль АТФ и глии в центральной хемочувствительности.

Передача сигналов ATP и P2R также участвует в гипоксической вентиляционной реакции. Гурин и его коллеги также продемонстрировали высвобождение АТФ с вентральной поверхности продолговатого мозга в ответ на гипоксию. Они предположили, что этот АТФ ослабляет фазу вторичной депрессии гипоксической вентиляционной реакции, поскольку увеличение концентрации АТФ было отложено и произошло во время вторичной депрессии. Блокирование Р2-рецепторов с помощью PPADS также усиливало вторичную депрессию. Дальнейшее исследование источника АТФ показало, что АТФ, обнаруженный на вентральной поверхности, происходит из VRC, включая Пре-Бётцингерский комплекс. Без ответа остался вопрос о подтипе Р2-рецептора, который опосредует возбуждающее действие АТФ на дыхательные сети. АТФ-опосредованное возбуждение Пре-Бётцингерский комплекс было отменено путем предварительного применения антагониста рецептора P2Y1 MRS 2179 при приготовлении медуллярного среза крысы. С тех пор это было подтверждено на мышах и крысах, что привело к основной цели моего исследования, которая заключается в том, чтобы понять, как активация рецептора P2Y1 АТФ возбуждает пребетцовую инспираторную сеть. В частности, меня интересуют пути (пути) второго мессенджера и ионные каналы, хотя рецепторы P2Y1 сигнализируют об увеличении частоты вдоха in vitro.

3 Пуринергическая сигнализация в центральной хеморецепции

Респираторная хеморецепция - это способность организма ощущать изменения в уровнях O2, CO2 или pH крови или спинномозговой жидкости. Постоянный мониторинг этих параметров необходим для гомеостатического контроля дыхательной и сердечно-сосудистой систем. Как центральные, так и периферические рецепторы участвуют в хеморецепции и работают согласованно. Специализированные клетки в стволе головного мозга, которые воспринимают CO2 / H +, способствуют центральной хеморецепции. Периферически, хеморецепторы сонных артерий, которые улавливают изменения в O2 / CO2 / H +, вносят ~ 20% вентиляционного ответа на CO2 / H +. До недавнего времени увеличение вентиляции во время гипоксии полностью приписывалось хеморецепторам каротидного тела, но недавно выяснилось, что астроциты ствола мозга способны обнаруживать низкий PO2 и возбуждать дыхательную сеть и, по-видимому, играют роль в респираторном ответе на гипоксию, ослабляя вторичную гипоксическую респираторную депрессию.

Гиперкапническая вентиляционная реакция состоит из увеличения частоты дыхания и дыхательного объема, которые способствуют общему увеличению вентиляции. Однако это увеличение вентиляции из-за гиперкапнии варьируется у разных видов и в зависимости от развития. Множественные центральные участки, чувствительные к химиотерапии, включая RTN, locus coeruleus (LC), NTS solitarius nucleus tractus, костномозговую рафу и преБетЦ, вместе вносят 80% увеличения вентиляции, а остальная часть приходится на каротидные тела.

Среди этих различных центральных сайтов RTN стал, возможно, ключевым сайтом для хеморецепции. Я кратко излагаю современное понимание передачи сигналов пуринергических рецепторов и ее вклада в центральную хемочувствительность в каждой из вышеупомянутых предполагаемых хеморецептивных областей.

Медуллярный раф включает в себя раф магнус, раф бледный и раф обскурус. Некоторые считают, что серотонинергические медуллярные раф-нейроны играют важную роль в центральной хеморецепции, но являются ли они основными участниками или просто обеспечивают тонизирующий возбуждающий модулирующий импульс для хемочувствительных нейронов RTN, остается спорным.

Различные ядра рафинада также проявляют различную чувствительность к CO2. Ростральный раф магнус содержит большую популяцию серотонинергических нейронов с большей хемочувствительностью, чем каудальный раф обскурус.

Raphe magnus демонстрирует сильную иммуномаркировку для рецепторов P2Y1, P2X1 и P2X3, в то время как рецепторы P2X1-6 экспрессируются в нейронах raphe obscurus. У анестезированных крыс инъекция АТФ в рафа магнуса и рафа бледного возбуждала и подавляла дыхание соответственно; PPADS, антагонист рецептора P2, не влиял на основную дыхательную активность, но частично блокировал эффекты АТФ.

У крыс, находящихся в сознании, локальное введение PPADS (20 мм) в ростральный раф магнуса притупляло вентиляционный ответ на CO2, тогда как очень незначительное влияние на гиперкапнический вентиляционный ответ наблюдалось после введения PPADS в хвостовой раф обскурус и раф бледный, который предоставил доказательства того, что пуринорецепторы P2 в ростральной, но не каудальной мозговой рафе оказывают возбуждающую модуляцию вентиляционной реакции на гиперкапнию. PPADS в концентрации, используемой в da Silva и др и Sobrinho и др. исследование может повлиять на глутаматергическую передачу, что затрудняет прогнозирование того, обусловлены ли наблюдаемые результаты антагонизмом пуриноцепторов P2X или ингибированием глутаматергической передачи.

NTS в дорсальном мозговом веществе является фундаментальным местом для интеграции висцеросенсорной информации, участвующей в контроле сердечно-сосудистой системы и дыхания. Каудальные участки NTS вовлечены в хеморецепцию.

Р2-рецепторы широко экспрессируются в NTS. Инъекция АТФ в каудальный NTS увеличивает вентиляцию легких, тогда как PPADS (используемый в наномолярной концентрации, где он не влияет на глутаматные рецепторы) в NTS притупляет периферический хеморефлексный контроль кардиореспираторной функции. Однако пуринергическая передача сигналов, по-видимому, не вносит существенного вклада в хеморецептивную функцию NTS, поскольку блокирование рецептора P2 в УНТ не влияло на скорость срабатывания в ответ на CO2 / H + in vitro или вентиляционный ответ на CO2 in vivo.

Как уже упоминалось, RTN является важным участком центральной хеморецепции. рН-чувствительные нейроны (Малки. 2004) и глиальные клетки (Гурин. 2010) вносят вклад в хеморецепцию в RTN. рН-чувствительные нейроны RTN являются глутаматергическими, экспрессируют фактор транскрипции Phox2b и проецируются непосредственно на ключевые понтомедуллярные дыхательные центры, включая комплекс пре-Бетцингера (Малки др., 2004). Молекулярный механизм, с помощью которого эти нейроны ощущают изменение рН, представляет большой интерес. Способность этих нейронов реагировать на изменения рН сохранялась даже после блокады ионотропных глутаматных рецепторов с помощью CNQX и рецепторов P2 с помощью PPADS (Малки и др. 2006) и потенциалов действия, что указывает на то, что они по своей природе чувствительны к химиотерапии. Эти нейроны выражают чувствительную к pH, независимую от напряжения K + проводимость, которая, вероятно, участвует в восприятии изменений pH (Малки., 2004). Этот чувствительный к рН ток настоятельно предполагает участие семейства фоновых K + каналов TASK, включая каналы TASK 2 (Бейлисс и др. 2015). Важно отметить, что рН-чувствительность сохранялась в субпопуляции нейронов RTN у мышей с нокаутом TASK-2, что предполагает наличие дополнительного молекулярного сенсора (Бейлисс и др. 2015). Недавно было показано, что GPR4, активируемый протонами GPCR, вносит вклад в чувствительность к pH подмножества нейронов RTN (Кумар и др., 2015). У мышей, лишенных GPR4, наблюдалась сниженная активация нейронов RTN, вызванная CO2, и дыхание, стимулированное CO2 (Кумар и др., 2015).

Чувствительные к pH / CO2 астроциты, которые выстилают вентральную поверхность продолговатого мозга, также вносят свой вклад в центральную хемочувствительность. Чувствительные к pH глиальные клетки в RTN выделяют АТФ в ответ на изменения CO2 / pH (Гурин. 2005) и вносят вклад в чувствительность нейронов RTN к pH, повышая их возбудимость. Внеклеточное подкисление вызывает повышение уровня внутриклеточного Ca2+ и высвобождения АТФ (Гурин., 2010). Оптогенетическая имитация вызванного pH возбуждения Ca2 +i в астроцитах вызывает высвобождение АТФ и значительное учащение дыхания (Гурин., 2010). Индуцированный деполяризацией экзоцитоз идентифицируется как один из механизмов высвобождения АТФ астроцитами RTN (Касымов и др., 2013). АТФ также высвобождается через механизм, чувствительный к полуканалам. Гемиканалы коннексина 26 (Cx26), преимущественно экспрессируемые на астроцитах вблизи вентральной поверхности мозгового вещества, высвобождают АТФ в ответ на повышенный PCO2, а не на снижение pH (Хакстепп и др., 2010). Селективные блокаторы гемиканалов Cx26 in vivo ослабляют высвобождение АТФ и последующую гиперкапническую вентиляционную реакцию на ~ 20% (Хакстепп и др., 2010). Трансфицированные Cx26 клетки HeLa, предварительно загруженные АТФ, показали CO2-зависимую АТФ, аналогичную той, которая наблюдается в срезах мозга (Хакстепп и др., 2010). Исследования In vivo продемонстрировали высвобождение АТФ внутри RTN при воздействии гиперкапнии. Кроме того, применение АТФ в RTN увеличивало дыхательный выход, и вызванное гиперкапнией увеличение частоты дыхания ослаблялось примерно на ~ 25%, когда рецепторы P2 блокировались PPADS (100 мкм, т. е. Концентрации, которые могут влиять на глутаматергическую передачу) в том же регионе (Гурин. 2005). Предполагается, что изменения CO2 / pH вызывают высвобождение АТФ из астроцитов, что возбуждает чувствительные к pH нейроны RTN. Несмотря на чувствительность к АТФ, рН-чувствительность этих нейронов RTN не зависит от Р2-рецепторов (Малки и др. 2006). Нейроны RTN модулируются пуринергической сигнализацией. Активация постсинаптического рецептора P2Y возбуждает нейроны RTN, тогда как пресинаптическая активация рецептора P2X через интернейрон ингибирует нейроны RTN. (Малки и др., 2006). Таким образом, общий эффект вызванного гиперкапнией высвобождения АТФ на вентиляционный ответ на CO2 будет зависеть от баланса между вызванным АТФ возбуждением и ингибированием центральных респираторных хеморецепторов, а также от воздействия на другие связанные с дыханием нейроны в регионе (Малки и др., 2006).

Недавние исследования установили роль передачи сигналов, опосредованных рецептором P2Y1, в RTN. Однако его вклад в пуринергический компонент центральной хемочувствительности в РТН остается неясным. В органотипической культуре MRS 2179 (3 мкм), PPADS (5 мкм) или TNP-ATP (20 нМ) значительно ослабляли индуцированное подкислением увеличение внутриклеточного Ca2 + в астроцитах, что указывает на роль передачи сигналов P2Y1 (Гурин. 2010). Все используемые лекарственные средства также могут блокировать ионотропные АТФ-рецепторы, в частности рецепторы P2X1 и P2X3. В том же исследовании (Гурин., 2010) также было продемонстрировано, что подкисление вызывает волну Ca2 +, которая распространяется между астроцитами вентральной поверхности из-за межклеточного высвобождения АТФ, действующего на рецепторы P2X и P2Y, в конечном итоге достигая нейронов RTN для их деполяризации через рецепторы АТФ, которые, вероятно, относятся к классу P2X или P2Y. Поддерживая роль рецептора P2X, Венкер и др. 2012 продемонстрировали, что пуринергическая передача сигналов в RTN способствует ∼30% хеморецепции RTN, фракции, которая зависит от высвобождения АТФ, опосредованного гемиканалом, и что действие эндогенной АТФ на нейроны RTN не было опосредовано рецепторами P2Y1 (Венкер и др. 2012;Ках и Север 2012).

Другой важной группой нейронов рострального VLM (RVLM), которые контролируют симпатический вазомоторный тонус в состоянии покоя и во время хеморефлексии, являются нейроны C1 (Гайенет и др., 2013). Нейроны C1 получают возбуждающие глутаматергические сигналы от периферических хеморецепторов. Эти нейроны экспрессируют рецепторы P2Y1, но не являются чувствительными к pH нейронами RTN (Венкер и др. 2013). Это было установлено на основании следующих наблюдений: i) агонист рецептора P2Y1 значительно способствует возбуждению pH-нечувствительных нейронов, тогда как возбуждение pH-чувствительных нейронов RTN не изменяется при активации рецептора P2Y1 (Венкер и др. 2013); ii) иммунореактивность рецептора P2Y1 колокализуется с тирозингидроксилазой (TH), которая маркер нейронов C1, но не Phox2b-положительных хемочувствительных нейронов (Венкер и др. 2013); iii) активация рецептора P2Y1 в RVLM увеличивает диафрагмальную и симпатическую нервную активность и среднее артериальное давление (Венкер и др. 2013) у взрослых крыс под наркозом, и этот ответ блокируется при поражении нейронов C1 (Венкер и др., 2013).

4 Гипоксическая вентиляционная реакция и АТФ

Гипоксическая вентиляционная реакция является двухфазной, включающей первоначальное увеличение вентиляции, за которым следует вторичная депрессия, которая может представлять угрозу для жизни у недоношенных и новорожденных детей (Мос и Хардинг 2000; Уотерс и Гозал, 2003). Первоначальное увеличение вентиляции в основном опосредуется периферическими хеморецепторами.

Вторичная депрессия в основном связана с центральными механизмами. Пуринергическая сигнализация заметно проявляется в обеих фазах ответа на периферическом и центральном уровнях, соответственно.

5 Роль периферических хеморецепторов в гипоксическом вентиляционном ответе

Несмотря на то, что несколько областей ЦНС, включая каудальный гипоталамус, NTS и Пре-Бётцингерский комплекс, способствуют первоначальному увеличению вентиляции во время гипоксии, в основном это опосредуется хеморецепторами периферических сонных артерий (Прабхакар 2000). Сонные тела расположены в месте бифуркации сонной артерии и очень чувствительны к изменению уровня PO2 в крови. В теле сонной артерии присутствуют два типа клеток, а именно гломус I типа, нейроноподобные клетки и сустентакулярные глиа-подобные клетки II типа. Гломусные клетки I типа играют важную роль в ощущении гипоксии. Недавние исследования предполагают, что сероводород (H2S) является важной молекулой в ощущении гипоксии сонных артерий. Во время гипоксии выработка H2S в клетках гломуса увеличивается из-за уменьшения ингибирования цистатионин-γ-лиазы, фермента, который катализирует расщепление цистатионина на цистеин, повышенный уровень H2S стимулирует нервную активность сонных артерий и, в конечном счете, вентиляцию.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе гипоксической чувствительности клеток гломуса, по-видимому, включают закрытие чувствительных к гипоксии K +-каналов, что приводит к деполяризации клеток, активации потенциалзависимых Ca2 +-каналов и везикулярному высвобождению АТФ и ацетилхолина, которые активируют рецепторы P2X2 и P2X3, а также рецепторы ацетилхолина на концах аксонов каротидного синусового нерва. Действия АТФ на рецепторы P2X3 также способствуют активации каротидного синусового нерва, поскольку реакции гипоксии у мышей с нокаутом P2X2 и P2X3 намного более притуплены, чем у мышей с нокаутом P2X2.

У мышей с нокаутом, лишенных каналов TASK 1, двухпористого домена, чувствительного к кислоте K +-канала, реакция на гипоксию сонного синусового нерва снижена на ~ 50% по сравнению с животными дикого типа.

Эти данные свидетельствуют о том, что каналы ЗАДАЧИ 1 являются кандидатами на роль чувствительного к гипоксии K+-канала. Терминалы нейронов каротидного синуса передают эту информацию в NTS, который интегрирует эту информацию и через PRG и pFRG / RTN подключается к Пре-Бётцингерский комплекс, чтобы вызвать учащение дыхания. ADO, который образуется в результате деградации внеклеточной АТФ и из внутриклеточных запасов, ингибирует ЦЕЛЕВЫЕ каналы и способствует хемосенсорному ответу. Одновременно АТФ-активация рецепторов P2Y1 гиперполяризует гломусные клетки и обеспечивает отрицательную обратную связь для прекращения стимула.

Альтернативный механизм предполагает, что чувствительный к гему и/ или окислительно-восстановительному ферменту фермент является датчиком кислорода и что биохимическое событие, связанное с белком гема, запускает возбуждающий нейротрансмиттер (ы) из гломусных клеток (Прабхакар 2000). Митохондриальные цитохромы представляют собой один из типов гемсодержащих ферментов, которые находятся внутри митохондрий. Согласно этой теории, митохондрии в гломусных клетках участвуют в процессе восприятия кислорода, а цитохром с необычно низким сродством к кислороду служит датчиком кислорода (Прабхакар 2000). Поддерживая эту гипотезу, сообщили, что митохондрии гломусных клеток деполяризуются при гипоксии и очень чувствительны к изменениям кислорода по сравнению с другими клетками, которые деполяризуются при гипоксии (Прабхакар 2000). Кроме того, ингибирование дыхательной цепи митохондрий увеличивало базальную сенсорную разрядку и предотвращало сенсорную реакцию на гипоксию, но не на CO2. Также предлагается роль немитохондриальных гем-содержащих ферментов в восприятии кислорода (Прабхакар 2000).

6 Центральные механизмы, формирующие вторичную депрессию

Во время второй фазы гипоксической вентиляционной реакции частота дыхания снижается с начального пика, который возникает в первую минуту, до стабилизации на установившемся уровне, как правило, через 3-4 минуты после первоначального воздействия гипоксии (при условии, что гипоксический стимул был доставлен внезапно) (Мос и Хардинг 2000). Стационарный уровень вентиляции у взрослых остается выше базовой линии, но у недоношенных и (некоторых новорожденных) младенцев вентиляция падает значительно ниже базовой линии, что может привести к развитию опасной для жизни петли положительной обратной связи, в результате чего незрелая дыхательная нейронная сеть у новорожденных создает дыхательный паттерн, который характеризуется частыми апноэ, которые приводят к гипоксии, вызванному гипоксией угнетению дыхания и более тяжелой гипоксии, в конечном счете, к смерти. Механизмы, лежащие в основе вторичной депрессии, все еще обсуждаются, но центральные механизмы сильно вовлечены (Теппема и Дахан 2010). Таким образом, считалось, что двухфазная гипоксическая вентиляционная реакция отражает первоначальное возбуждение со стороны сонных артерий, за которым следует вторичная, центрально-опосредованная депрессия. Возбуждение было приписано большей частью исключительно периферическим хеморецепторам. Однако практически у всех протестированных млекопитающих были получены доказательства того, что со временем после денервации хеморецепторов сонных артерий возникает возбуждающая гипоксическая вентиляционная реакция; т.е. в гипоксической вентиляционной реакции может быть центральный возбуждающий компонент. В частности, денервированные сонные артерии собак и крыс (Мартин-боди, Робсон и Синклер, 1985) показали увеличение вентиляции в ответ к гипоксии, указывая на то, что либо вступили в действие дополнительные периферические хеморецепторы (например, тельца аорты), либо имело место прямое возбуждающее воздействие гипоксии на вентиляцию легких.

В 2005 году, используя биосенсоры АТФ, Гурин и его коллеги продемонстрировали высвобождение АТФ с вентральной поверхности продолговатого мозга во время гипоксии у крыс под наркозом (Гурин. 2005). Интересно, что пиковая концентрация АТФ была зафиксирована после первоначального увеличения вентиляции. Кроме того, нанесение антагониста рецептора Р2, PPADS, на вентральную мозговую поверхность не влияло на первоначальное увеличение вентиляции, но вызывало большее вторичное угнетение. Эти данные показали, что АТФ не способствует первоначальному увеличению вентиляции, но что его замедленное высвобождение является возбуждающим и ослабляет вторичную депрессию. Однако чувствительность биосенсоров, селективность PPADS (при более высоких концентрациях PPADS могут ингибировать глутаматергическую передачу) вызвали сомнения в участии АТФ. На этой ранней стадии (2005 г.) оставалось много вопросов, но с тех пор был достигнут значительный прогресс в отношении: i) места высвобождения / действия АТФ во время гипоксии и подтипов рецепторов, которые лежат в основе возбуждающего действия АТФ; ii) происходит ли высвобождение АТФ при гипоксии из нейронов или астроцитов; и iii) механизм восприятия гипоксии и высвобождения АТФ. Область, которая остается наиболее плохо изученной, - это механизмы, с помощью которых АТФ возбуждает инспираторную сеть после высвобождения во время гипоксии. Этот последний вопрос находится в центре моего исследования. Я рассмотрю прогресс в каждой из трех областей, описанных выше, прежде чем завершить изложение предыстории и обоснования моих конкретных исследовательских вопросов.

(i) сайт высвобождения / действия АТФ и подтипы рецепторов, которые лежат в основе возбуждающего действия АТФ.

У анестезированных крыс высвобождение АТФ во время гипоксии впервые было обнаружено на вентральной поверхности продолговатого мозга с помощью датчиков, размещенных рострокаудально, которые отбирали образцы по всей длине продолговатого мозга (Гурин. 2005). Дальнейшее исследование источника АТФ in vitro показало, что АТФ происходит из брюшной дыхательной системы, включая преБетЦ (Гурин. 2005). Точное место, где АТФ действует на увеличение частоты дыхания в VLM, оставалось неясным. Пре-Бётцингерский комплекс, ядро генератора дыхательного ритма, был сильным кандидатом. Картирование VLM в препарате ритмического медуллярного среза с использованием местных инъекций АТФ выявило преБетЦ как место действия АТФ-опосредованного возбуждения. Кроме того, MRS 2179, антагонист рецептора P2Y1, значительно ослаблял вызванное АТФ увеличение частоты in vitro. Чувствительность рецептора P2Y1 была подтверждена позже с использованием агониста рецептора P2Y1 MRS 2365. Эти данные свидетельствуют о том, что АТФ, высвобождаемый во время гипоксии, активирует рецепторы P2Y1 в Пре-Бётцингерский комплекс, вызывая увеличение частоты. Кроме того, экспрессия TMPAP (трансмембранной простатической кислой фосфатазы, эктонуклеотидазы, которая предотвращает накопление АТФ во внеклеточном пространстве и в пузырьках) в Пре-Бётцингерский комплекс in vivo усиливала вторичную гипоксическую респираторную депрессию, как было замечено ранее при нанесении PPADS на вентральную поверхность продолговатого мозга (Гурин и др., 2005). Наконец, односторонняя инъекция антагониста рецептора P2Y1 MRS 2279 (500 мкм) в Пре-Бётцингерский комплекс взрослых крыс, подвергнутых анестезии, усиливала вторичную гипоксическую респираторную депрессию. Эти наблюдения в совокупности позволяют предположить, что во время гипоксии высвобождение АТФ в преБетЦ активирует рецепторы P2Y1, которые ослабляют гипоксическое угнетение дыхания.

(ii) Источник АТФ во время гипоксии

Глия также, по-видимому, играет роль в увеличении частоты дыхания, вызванном АТФ в Пре-Бётцингерский комплекс ритмически активного препарата медуллярного среза от новорожденных крыс (Хакстейбл и др., 2010). Срезы, инкубированные с глиальными токсинами, показали значительное снижение вызванного АТФ увеличения частоты. Однако никаких существенных изменений в реакциях на вещество Р замечено не было, что указывает на то, что токсины не влияли на способность сети реагировать на возбуждающую модуляцию. Кроме того, культивируемые глиальные клетки преБетЦ показали зависимое от рецептора P2Y1, вызванное АТФ увеличение внутриклеточного Ca2 +. Эти данные приводят к формулировке гипотезы о том, что АТФ, высвобождаемый из неизвестного источника во время гипоксии, частично воздействует на глию, высвобождая глутамат и АТФ, что, в свою очередь, возбуждает пребетцовые инспираторные нейроны, вызывая увеличение частоты (Хакстейбл и др. 2010). Анализ первичных диссоциированных глиальных культур из нескольких областей мозга позволяет предположить, что астроциты являются источником АТФ при гипоксии.

Флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением (TIRF), визуализирующая культивированные астроциты, показала, что гипоксия вызывает экзоцитоз АТФ-содержащих везикул (Ангелова и др., 2015). Однако, в отличие от данных Хакстейбл и др (2010), предполагающих, что глия высвобождает и реагирует на АТФ посредством вызванного АТФ высвобождения АТФ, антагонист рецептора P2Y1 MRS 2179 не влиял на индуцированный гипоксией экзоцитоз везикул, предполагая, что вызванное АТФ высвобождение АТФ не происходит в культивируемых астроцитах (Ангелова и др., 2015). Единственное соображение, связанное с данными культивирования астроцитов, заключается в том, что астроциты культивировались при низкой плотности, что может ограничить способность обнаруживать аутокринные или паракринные действия АТФ.

Нарушение экзоцитоза астроцитов с использованием столбнячного белка с легкой цепью (TeLC) в Пре-Бётцингерский комплекс и окружающих областях анестезированных крыс усиливало вторичную гипоксическую респираторную депрессию (Ангелова и др. 2015). Это свидетельствует о том, что экзоцитозное высвобождение АТФ из глии возбуждает преБетЦ-сеть для увеличения вентиляции и ослабления вторичного гипоксического угнетения дыхания.

7 Механизм ощущения гипоксии

Способность глиальных клеток ощущать гипоксию была недавно исследована Ангелова и др. (2015), опять же с использованием культивируемых астроцитов. Когда культивируемые астроциты подвергались воздействию физиологически соответствующих уровней гипоксии, они реагировали увеличением внутриклеточного Ca2+. Деполяризация митохондрий лежит в основе ответов астроцитов Ca2 + на гипоксию, что позволяет предположить, что митохондрии астроцитов являются датчиками гипоксии (Ангелова и др., 2015). Использование флуоресцентных зондов для измерения активных форм кислорода (АФК) выявило немедленное увеличение митохондриальной АФК в ответ на гипоксию, что указывает на ингибирование дыхательной цепи митохондрий, что приводит к образованию свободных радикалов, перекисному окислению липидов, активации фосфолипазы С (PLC), опосредованному инозитолтрифосфатом (IP3) увеличению внутриклеточного Ca2 +, и, в конечном счете, везикулярное высвобождение АТФ (Ангелова и др., 2015). Ca2 + считается важным в высвобождении глиальной АТФ. Хелаторы Ca2+ блокировали высвобождение везикулярного АТФ. Экспрессия легкой цепи столбнячного токсина, которая может влиять на механизмы высвобождения везикул, в астроцитах Пре-Бётцингерский комплекс уменьшала вызванное гипоксией увеличение дыхания у крыс с денервированными периферическими респираторными хеморецепторами (Ангелова и др. 2015).

8 Предпосылки и обоснование текущей работы

АТФ высвобождается в Пре-Бётцингерский комплекс во время гипоксии, где он воздействует на рецепторы P2Y1 и увеличивает вентиляцию, уменьшая величину вторичного гипоксического угнетения дыхания (Ангелова и др. 2015).

Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе возбуждающего действия АТФ в ПРЕБОТ, неизвестны. Общая цель моей диссертации состоит в том, чтобы продвинуть понимание этих возбуждающих действий, в частности, для дальнейшего понимания сигнальных путей GPCR, через которые рецепторы P2Y1 действуют для возбуждения Пре-Бётцингерский комплекс и ионных каналов, которые модулируются для возбуждения Пре-Бётцингерский комплекс ритма вдоха. Поэтому я рассмотрю то, что известно о сигнальных путях рецептора P2Y1 в ЦНС и их известных мишенях для ионных каналов, прежде чем представить свои конкретные цели.

9 GPCR, которые опосредуют действия рецепторов P2Y1

Рецепторы P2Y1 экспрессируются во всей ЦНС. В большинстве областей мозга рецепторы P2Y1 связаны с сигнальным путем Gaq. Обычно активация Gaq-сигнального пути диссоциирует гетеротримерный G-белок на aq и βγ-субъединицы. Субъединица aq активирует PLC, который впоследствии гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) до инозитол трисфосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG). IP3 способствует высвобождению Ca2+ из внутриклеточных запасов путем связывания с рецепторами IP3 на эндоплазматическом ретикулуме. Ca2+ и DAG активируют протеинкиназу С (PKC). Неизвестно, соединяются ли рецепторы P2Y1 с Gaq в нейронах Пре-Бётцингерский комплекс или Пре-Бётцингерский комплекс, и это будет рассмотрено здесь (косвенно).

В других клетках или областях мозга также существуют доказательства того, что рецепторы P2Y1 могут связываться через сигнальный путь Gai. В CFTR-экспрессирующих клетках яичников китайского хомяка опосредуемое рецептором P2Y1 увеличение Ca2+ чувствительно к коклюшному токсину (Marcet и др., 2004). В симпатических нейронах крыс коклюшный токсин устраняет опосредованное рецептором P2Y1 закрытие каналов GIRK, что дополнительно предполагает сцепление Gai (Эрб и Вайсман 2012). Исследования также показали, что рецепторы P2Y1 могут образовывать гетеромерные комплексы с рецепторами аденозина (A1). Этот гибридный рецептор реагирует на ADPβs, активируя как Gai, так и Gaq.

Подобно многим GPRCs, рецепторы P2Y1 также экспрессируют с-концевые PDZ-связывающие домены. PDZ-связывающий домен рецептора P2Y1 взаимодействует с NHERF-2, который может модулировать связывание рецепторов P2Y1 с ионными каналами. NHERF2 присутствует в головном мозге, где он связан как с глией, так и с нейронами. Коэкспрессия NHERF-2 в нейронах верхних шейных симпатических ганглиев (SCG) крыс с рецепторами P2Y1 подавляла опосредованное рецептором P2Y1 ингибирование токов Ca2 +, но не изменяла ингибирование M-тока (Филиппов и др., 2010). Интересно, что передача сигналов Ca2 +, опосредованная активацией рецептора P2Y1, значительно продлевается в клетках глиомы C6, когда рецепторы P2Y1 совместно экспрессируются с NHERF-2, тогда как нарушение взаимодействия рецепторов P2Y1 и NHERF-2 точечными мутациями уменьшало продолжительность Ca2+–ответов, опосредованных рецептором P2Y1.

10 Ионные каналы, которые могут способствовать опосредованному P2Y1-рецептором увеличению частоты дыхания

Нижестоящие эффекторные каналы, которые опосредуют возбуждающие действия активации рецептора P2Y1 в сети Пре-Бётцингерский комплекс, неизвестны. Ниже я предлагаю серию потенциальных ионных каналов, основанных на том факте, что они либо модулируются рецепторами P2Y1, либо сигнальным путем Gaq, и что эти каналы при активации или ингибировании изменяют ритм Пре-Бётцингерский комплекс.

Ca2+ активированные калиевые каналы (BK/SK)

Ca2+-активированные калиевые каналы включают каналы с большой проводимостью (BK) и малой проводимостью (SK). Каналы BK - это каналы с высокой проводимостью K+ с проводимостью 100-200 пС. BK-каналы активируются как повышением внутриклеточного Ca2 +, так и деполяризацией мембраны и в основном вносят вклад в fAHP. Основываясь на стробирующих свойствах, каналы BK классифицируются как типы I и II (Ванг и др., 2014). BK-каналы имеют тетрамерную структуру, содержащую α (порообразующую) субъединицу, связанную с тканеспецифичной β-субъединицей (от β1 до β4) (Ванг, Джеф, и Бреннер 2014). Большинство нейронов ЦНС экспрессируют β2 и β4 в качестве основных β-субъединиц (Ванг и др., 2014). Судьба BK-каналов зависит от того, как α-субъединица взаимодействует с β-субъединицами. В каналах BK II типа α-порообразующая единица экспрессируется β4-субъединицей (Ванг и др., 2014). β4-субъединица наделяет BK-каналы медленной кинетикой стробирования и устойчивостью к ибериотоксинам (Ванг, Джеф, и Бреннер 2014). BK-каналы II типа экспрессируются во многих областях ЦНС, включая заднюю долю гипофиза (Бреннер и др. 2005), пирамидные нейроны коры головного мозга, пирамидные нейроны CA3, зубчатую извилину гиппокампа, обонятельную луковицу и нейроны пуркинье мозжечка (Бреннер и др. 2005; Ванг и др. 2014).

Влияние блокады канала BK на дыхательный ритм зависит от вида, препарата, препарата и дозы. У крыс (P0-P4) препаратов ствола головного и спинного мозга частота блокады BK-каналов снижается (Онимару и Хома 2003), в то время как частота увеличивается при подготовке медуллярного среза, когда BK-каналы были заблокированы паксиллином (10 мкм), блокатором BK-каналов типа I и II (Жанг и др. 2010). В препаратах мышиного медуллярного среза паксиллин (1-3 мкм) увеличивает частоту, в то время как ибериотоксин (блокатор каналов I типа) не влияет на частоту (Завала-Текуапетла и др. 2008). Блокада канала BK при снижении глицинергического ингибирования отменяла, предполагая роль канала BK в генерации ритма, возможно, через роль в прекращении импульса (Раджани и др. 2016). Во время гипоксии высвобождается АТФ, и глицинергическое ингибирование уменьшается. Таким образом, возможно, что АТФ усиливает BK-опосредованные токи и увеличивает частоту (Раджани и др., 2016).

Каналы SK имеют меньшую одноканальную проводимость (10-20 пС) по сравнению с каналами BK (100-200 пС). Активация SK-канала зависит от увеличения внутриклеточного Ca2 + и вносит значительный вклад в среду после гиперполяризации, что напрямую влияет на внутреннюю возбудимость нейронов.

Блокада каналов SK с помощью апамина в препаратах ствола головного мозга-спинного мозга крыс оказывает минимальное влияние на базовый ритм или амплитуду (Онимару и Хома 2003). У мышей, однако, как в медуллярном срезе, так и в препаратах in vivo блокада каналов SK апамином увеличивает частоту и амплитуду ритма вдоха (Завала-Текуапетла и др. 2008), в то время как применение активатора каналов SK 1-этил-2-бензимидазолинона уменьшает амплитуду и частоту дыхательных всплесков у препараты медуллярных срезов мышей (Завала-Текуапетла и др. 2008).

Таким образом, каналы BK / SK не являются существенными для генерации дыхательного ритма, но могут модулировать ритм, в зависимости от вида и, возможно, препарата.

М ток

Ген KCNQ кодирует субъединицу K +-канала Kv7, четыре из которых собираются вместе, образуя функциональный канал, который опосредует ток M. Ток М был впервые идентифицирован в симпатических ганглиозных нейронах лягушки.

М-каналы начинают активироваться при -60 мВ, постепенно активируются с увеличением деполяризации и не инактивируются. Таким образом, они помогают поддерживать мембранный потенциал покоя, сопротивляясь деполяризации. М-каналы также ингибируются рецепторами, связанными с Gaq. Рекомбинантные рецепторы P2Y1, экспрессируемые в диссоциированных нейронах верхнего шейного ганглия крысы, ингибируют ток M. Кроме того, в первичной культуре клеток гиппокампа ток М-канала ингибируется активацией рецептора P2Y1 (Филиппов 2006). Рецепторы P2Y могут модулировать ток M в нейронах SCG либо путем IP3-зависимого высвобождения Ca2+, либо путем IP3-независимого прямого ингибирования PIP2.

Неизвестно, модулируется ли ритм вдоха M-токами. Эндогенный ацетилхолин, действуя главным образом через никотиновые рецепторы, модулирует ритм в ритмичном мозговом срезе (Шао И Фельдман 2005). Нанесенный на ванну мускарин (50 мкм) увеличивает частоту ритмических срезов медуллярного мозга на 50%, скорее всего, воздействуя на М3-рецепторы (Шао И Фельдман 2000). В гибридных клетках нейробластомы и глиомы активация рецептора М3 ингибирует М-ток. В препаратах с ритмическими срезами новорожденных мышей блокада М-токов в Пре-Бётцингерский комплекс с помощью XE991 увеличивает продолжительность импульса и замедляет частоту, в то время как активация М-токов ретигабином замедляет ритм и уменьшает продолжительность импульса. Таким образом, роль модуляции М-канала в установлении частоты вдоха неясна, но его активация во время инспираторной вспышки может способствовать прекращению инспираторной вспышки наряду с синаптической депрессией и активацией направленного наружу Na +-K + атфазного тока, который развивается во время инспираторной вспышки (Де Негро и др. 2009). Эффективность М-токов в контроле продолжительности импульсов in vivo еще предстоит изучить.

Неспецифический катионный ток, активируемый кальцием (ICAN)

ICAN способствует генерации импульсов (Пасе и др. 2007) и играет ключевую роль в поведении кардиостимулятора в некоторых инспираторных нейронах. Однако считается, что он больше не играет существенной роли в реальном генерировании ритма вдоха (Пасе и Де Негро 2008). Считается, что токи TRPM 4 и 5 лежат в основе тока ICAN (Кроудер и др. 2007) и выражаются в Пре-Бётцингерский комплекс, особенно TRPM4 (Кроудер и др. 2007). Как внутриклеточный Ca2 +, так и деполяризация могут активировать ICAN, который переносится ионами Na + и K +, но не Ca2 +. Активация рецептора P2Y1 в подъязычных мотонейронах также, по-видимому, усиливает ICAN (Альварес и др. 2014; Фанк и др. 2011). Активация ICAN потенцирует амплитуду инспираторных импульсов в ритмически активных препаратах медуллярных срезов и потенциал возбуждения в отдельных инспираторных нейронах, предположительно, путем усиления синаптических токов при вдохе (Миронов 2008; Дель Негро и др. 2005; Пейс и др. 2007). Наблюдение, что в Пре-Бётцингерский комплекс ICAN влияет на амплитуду, а не на частоту, предполагает, что ICAN не может быть мишенью рецепторов P2Y1, поскольку активация рецептора P2Y1 в первую очередь увеличивает частоту (Хакстейбл и др. 2009, 2010; Лориер и др. 2007).

Канал ЗАДАЧ

ЦЕЛЕВЫЕ каналы представляют собой двухпористые, чувствительные к рН K +-каналы, которые опосредуют фоновые K +-токи. ЗАДАЧА-1, ЗАДАЧА-2 и ЗАДАЧА-3 кодируются генами KCNK3, KCNK5 и KCNK9 соответственно. Пребетцовские инспираторные нейроны, подъязычные мотонейроны (Тэлли и др. 2000) и рафные выражают каналы TASK-1 и TASK-3. ЗАДАЧА 2 каналы экспрессируются в рН-чувствительных нейронах RTN. Галотан, активатор каналов TASK-1 и 3, значительно снижает частоту дыхания медуллярных срезов при нанесении ванны или введении в Пре-Бётцингерский комплекс. Рецепторы, связанные с Gaq, могут ингибировать канал TASK. Поскольку предполагается, что рецепторы P2Y1 связаны с Gaq в Пре-Бётцингерский комплекс, ингибирование каналов TASK рецепторами P2Y1 является возможным механизмом, посредством которого АТФ может увеличивать частоту.

11 Цели исследования

Рецепторы ATP и P2Y1 играют важную роль в формировании гипоксической вентиляционной реакции. АТФ, высвобождаемый во время гипоксии, ослабляет вторичное гипоксическое угнетение дыхания, воздействуя на рецепторы P2Y1 (Раджани и др. 2015). Молекулярные механизмы, лежащие в основе АТФ-возбуждения дыхательной сети, неизвестны. Основная цель моей диссертации - проанализировать молекулярные механизмы, лежащие в основе опосредованного рецептором P2Y1 возбуждения дыхательной сети.

Конкретные цели моего исследования заключаются в том, чтобы:

Гипоксическая вентиляционная реакция является двухфазной. Вентиляция сначала увеличивается, а затем снижается до устойчивого уровня, который остается выше исходного уровня у взрослых, но значительно ниже исходного уровня у недоношенных / новорожденных млекопитающих (Мос и Хардинг 2000). Механизмы, лежащие в основе вторичной депрессии, все еще обсуждаются, но центральные механизмы сильно вовлечены (Теппема и Дахан 2010). В 2005 году Гурин и его коллеги, используя биосенсоры АТФ, продемонстрировали, что во время гипоксии АТФ высвобождается с вентральной медуллярной поверхности по всей длине VRC, включая Пре-Бётцингерский комплекс (Гурин. 2005). Введение PPADS, антагониста рецептора P2, в VLM усиливало вторичную депрессию, не влияя на первоначальное увеличение вентиляции. Эти эксперименты показали, что АТФ ослабляет вторичную депрессию. С тех пор был достигнут значительный прогресс в понимании (i) сайта и рецептора (рецепторов), которые лежат в основе возбуждающего действия АТФ (ii) источника АТФ и (iii) механизма восприятия гипоксии и высвобождения АТФ.

Не все участки, где АТФ действует на увеличение частоты дыхания, известны, но растущие данные свидетельствуют о том, что ПРЕБОТ является важным фактором. Картирование VLM в ритмичном медуллярном срезе с использованием локальных инъекций АТФ показало, что преБетЦ наиболее чувствителен к возбуждающим воздействиям АТФ. Кроме того, MRS 2179, антагонист рецептора P2Y1, фактически блокировал вызванное АТФ и MRS 2365 увеличение частоты вдоха (Лориер и др. 2007; Цвиккер и др. 2011). Кроме того, экспрессия TMPAP (трансмембранной простатической кислой фосфатазы, эктонуклеотидазы, которая предотвращает накопление АТФ во внеклеточном пространстве и в везикулах) в Пре-Бётцингерский комплекс in vivo усиливала вторичное гипоксическое угнетение дыхания (Ангелова и др. 2015). В соответствии с данными in vitro, одностороннее введение антагониста рецептора P2Y1 в Пре-Бётцингерский комплекс in vivo показывает, что АТФ-компонент гипоксического вентиляционного ответа опосредуется, по крайней мере частично, рецепторами P2Y1 в Пре-Бётцингерский комплекс (Раджани и др. 2015). Эти данные свидетельствуют о том, что АТФ, высвобождаемый во время гипоксии, активирует рецепторы P2Y1 Пребот для увеличения частоты.

Флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением (TIRF) показала, что гипоксия вызывает экзоцитоз АТФ-содержащих везикул астроцитов (Ангелова и др., 2015). Эти эксперименты предполагают, что глия является по крайней мере одним источником АТФ во время гипоксии. Та же группа также предоставила информацию о механизме восприятия гипоксии астроцитами.  Митохондрии внутри астроцитов действуют как датчик гипоксии. Снижение Po2 ингибировало дыхательную цепь митохондрий, что приводило к образованию свободных радикалов, перекисному окислению липидов, активации PLC, индуцированному IP3 увеличению внутриклеточного Ca2+ и, в конечном счете, высвобождению АТФ. Нарушение экзоцитоза с использованием столбнячного белка с легкой цепью (TeLC) в астроцитах билатерально в Пре-Бётцингерский комплекс и прилегающих областях анестезированных крыс, дает in vivo доказательства того, что экзоцитотическое высвобождение АТФ способствует увеличению вентиляции, наблюдаемому во время второй фазы гипоксической вентиляционной реакции (Раджани и др. 2015).

Одним из наименее изученных вопросов являются молекулярные механизмы, лежащие в основе АТФ-возбуждения дыхательной сети. Основная цель моей диссертации - проанализировать молекулярные механизмы, лежащие в основе опосредованного рецептором P2Y1 возбуждения дыхательной сети. Обычно рецепторы P2Y1 соединены с Gaq. Неизвестно, соединяются ли рецепторы P2Y1 с Gaq в Пре-Бётцингерский комплекс, и я исследовал это косвенно, отслеживая изменения базовой интенсивности флуоресценции инспираторных нейронов, меченных Ca2 +-чувствительным красителем Fluo-4 в присутствии MRS 2365, агониста рецептора P2Y1. преБетЦ - это гетерогенная нейронная сеть. Высокая чувствительность сети к активации P2Y1R позволяет предположить, что нейроны Пре-Бётцингерский комплекс дифференциально чувствительны к активации P2Y1R. Конечно, эквивалентная активация возбуждающих и тормозных механизмов с меньшей вероятностью приведет к сильному возбуждению, чем избирательная активация возбуждающих нейронов. Эта гипотеза проверяется путем применения ванны MRS 2365 и мониторинга визуально обнаруживаемого изменения интенсивности флуоресценции инспираторных нейронов, расположенных на той же глубине. Чтобы определить источник Ca2 + и его вклад в возбуждение дыхательной сети, были использованы блокаторы SERCA. Изменения базовой интенсивности флуоресценции инспираторных нейронов на MRS 2365 в присутствии блокатора SERCA сравнивали с контрольными реакциями, аналогично частота, вызванная MRS 2365 в присутствии блокатора SERCA, сравнивалась с контрольной частотой, вызванной MRS 2365, для проверки вклада высвобождаемого Ca2+ в сетевое возбуждение. Наконец, чтобы идентифицировать нисходящий эффекторный канал рецептора P2Y1, я сравнил реакцию сети на MRS 2365 до и после применения блокаторов ионных каналов, которые являются известными мишенями для передачи сигналов рецептора P2Y1.

Для решения этих вопросов я использовал ритмически активную подготовку медуллярных срезов. Прямой физический и фармакологический (т.Е. Отсутствие гематоэнцефалического барьера) доступ к этой определенной области интереса в сочетании с возможностью применения широкого спектра технологий к определенной схеме Пре-Бётцингерский комплекс были важными факторами при выборе этого подхода для выявления молекулярных механизмов, лежащих в основе возбуждения рецептора P2Y1, генерирующего ритм дыхания Пре-Бётцингерский комплекс сеть.

Все эксперименты и процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Университета Альберты и проводились в соответствии с их руководящими принципами по уходу, обращению и лечению экспериментальных животных.

12 Ритмически активное приготовление медуллярного среза

Эксперименты проводились на ритмически активных препаратах медуллярных срезов неонатальных крыс Sprague-Dawley в возрасте от 0 до 4 дней после рождения (P0-P4). Препараты ритмичных медуллярных срезов были получены, как описано ранее. Вкратце, выполняются следующие шаги. Животных подвергали глубокому наркозу путем вдыхания изофлуорана, децеребрировали, рассекали хвостовую часть грудной клетки и удаляли передние конечности. Оставшийся препарат затем переносили в секционную камеру, содержащую искусственную спинномозговую жидкость (aCSF) комнатной температуры (~20ºC), содержащую (в мм): 120 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl2, 2 MgSO4, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4 и 20 D-глюкозы, уравновешенных карбогеном, A смесь 95% O2 и 5% CO2. Основание камеры для вскрытия было покрыто смолой Sylgard ™, к которой был прикреплен препарат таким образом, чтобы брюшная поверхность была обращена вниз, затем череп разрезали по средней линии и также прижимали лоскуты черепа. Мозжечок и мозжечковые ножки были удалены. Мышцы спины были удалены, чтобы обнажить позвоночный столб, и была выполнена дорсальная ламинэктомия, чтобы обнажить дорсальную поверхность спинного мозга. Препарат перевернули и удалили челюсть. Грудную клетку разрезали сбоку и удалили вместе с внутренностями. После средней линии были вырезаны твердое и мягкое небо и выполнена вентральная ламинэктомия, обнажающая вентральную сторону спинного мозга. Подъязычные (XII) нервы были перерезаны, и спинной мозг был обнажен до шейного сегмента C4-C5. Затем спинной мозг был отсечен на уровне 4-5-го шейного сегмента (C4-C5) и прижат. После осторожного удаления твердой мозговой оболочки был сделан окончательный разрез в понтомедуллярном соединении.

Таким образом, препараты простирались от понтомедуллярного соединения в ростральном направлении примерно до C4-C5 в каудальном направлении. Препарат ствола головного и спинного мозга переносили на восковой патрон и закрепляли. Восковой патрон, содержащий препарат, хранится погруженным в aCSF, уравновешенный карбогеном. С помощью вибратома (VT1000S, Leica, Германия) были вырезаны серийные срезы толщиной 150-250 мкм в ростральном и каудальном направлениях. Срезы были просвечены и исследованы на наличие специфических анатомических ориентиров. Тонкие срезы формировали до тех пор, пока компактное разделение неоднородного ядра (cNA) больше не было очевидным, и ростральный край нижней оливы впервые появился в тонком срезе. После этого тонкого среза был вырезан ритмически активный срез толщиной 700 мкм. Ритмический срез содержит преБетЦ, ростральную вентральную дыхательную группу (rVRG), большую часть двигательных ядер XII и ростральные нервные корешки XII. Ритмически активные медуллярные срезы переносили в камеру для записи (объемом 7,0 мл), закрепленную на смоле Sylgard ™ ростральной поверхностью вверх, и перфузировали aCSF, который циркулировал со скоростью потока 18 мл/мин и поддерживался при комнатной температуре (25°C).

По меньшей мере за тридцать минут до начала сбора данных концентрация K+ в aCSF была повышена с 3 до 9 мм (Фанк и др. 1993; Smith и др. 1991). Повышенный уровень [K +] e не является необходимым для генерации ритма. Продемонстрировано, что срезы медуллярного мозга крысы, вырезанные со специфическими рострокаудальными границами, способны генерировать стабильный ритм в течение более длительного времени даже при 3 мм К +. Причиной увеличения внеклеточного K + с 3 до 9 мм было создание стабильного ритма, связанного с вдохом, в течение длительных периодов. Большинство протоколов в этом исследовании включали множественные вмешательства и, следовательно, требовали срезов, которые обеспечивали стабильный ритм, связанный с вдохом, в течение более длительных периодов времени. Механизм, с помощью которого повышенный [K +] e продлевает ритм, неясен. Однако считается, что повышенный [K+] e компенсирует потерю возбуждающего/модулирующего ввода (Фанк и др. 1993), который теряется во время процесса нарезки.

13 Записи

13.1 Записи внеклеточных нервных корешков

Связанную с вдохом активность препаратов ритмического среза регистрировали из XII (подъязычных) нервных корешков с помощью стеклянных отсасывающих электродов. Сигналы были усилены (10 000 раз), отфильтрованы по полосе пропускания, выпрямлены в полноволновом диапазоне, интегрированы с использованием негерметичного интегратора (=50 мс) и отображены на компьютерном мониторе с использованием программного обеспечения. Данные были сохранены на компьютер с использованием цифровой платы Digidata 1322. Данные анализировались в автономном режиме с помощью программного обеспечения. Все эксперименты проводились при комнатной температуре.

Чтобы оценить влияние конкретного агента на частотную характеристику, вызванную местной инъекцией агонистов рецептора P2 в преБетС, я сравнил относительное увеличение пиковой частоты, вызванное агонистом в контроле и в присутствии препарата. Исходная частота представляла собой среднюю частоту, измеренную за 2 минуты непосредственно перед применением препарата. Пиковая частота представляла собой пиковое значение в первую минуту применения препарата, полученное из скользящего среднего, рассчитанного на основе трех последовательных серий XII (Хакстейбл и др. 2010; Цвиккер и др. 2011).

Для экспериментов по визуализации Ca2+, сопровождающих внеклеточные записи, активность подъязычного нерва регистрировали, как описано ранее, за исключением того, что вместо аксоскопа 9.2 использовалась LabChart 7 (AD Instruments).

14 Двухфотонные записи изображений Ca2 +

Ca2+-колебания инспираторных нейронов в Пре-Бётцингерский комплекс ритмически активных медуллярных срезов (описанных выше и в визуализировали с использованием Ca2+-чувствительных флуорофоров, загруженных в цитоплазму клеток Пре-Бётцингерский комплекс, для мониторинга Ca2+-зависимых изменений испускаемой флуоресценции. Относительные изменения концентрации свободного цитозольного Ca2+ (Ca2+i) отслеживали в ритмически активных срезах медуллярного мозга, полученных, как описано ранее, с использованием многофотонной сканирующей микроскопии Olympus FV1000. Мембранопроницаемый Ca2+ чувствительный краситель fluo-4-AM вводили под давлением (25-50 мм рт.ст., непрерывно в течение 10 мин с ростральной поверхности в Пре-Бётцингерский комплекс, используя сломанную пипетку для пластыря (наружный диаметр 5-10 мкм), содержащую aCSF вместе с 0,5 мМ fluo-4-AM, растворенным в диметилсульфоксиде и 20% плюроновой кислоты. Ритмическую инспираторную активность одновременно регистрировали от корешков подъязычных (XII) нервов (описанных выше). Для возбуждения флуоресценции использовался фемтосекундный импульсный лазер, настроенный на возбуждение при длине волны 810 нм, а для получения изображения нейронов использовался иммерсионный объектив Olympus X 20 1.0 NA (20x XLUMPlanFl, числовая апертура 0,95) (Николенко, Немет и Юсте, 2003). После инъекции давали десять минут, чтобы краситель диффундировал. Вся окрашенная область сканируется для выявления инспираторных нейронов в различных отделах. Если инспираторных нейронов обнаружено не было, пипетку перемещают в другое место и процесс повторяют. Окрашенные участки имели диаметр 150-300 мкм, а изображенные клетки располагались на расстоянии от 30 до 75 мкм от поверхности среза, который был установлен ростральной поверхностью вверх. Окрашенную область контролировали с использованием 2-кратного цифрового увеличения при уменьшенном поле для сканирования по оси y. По сравнению с полнокадровым получением (512 x 512 пикселей), такое изображение в “обрезанном режиме” отбирало область размером 512 x 100-220 пикселей и обеспечивало скорость сканирования 1,25-1,43 сканирования/с, достаточную для обнаружения 70-100% пиковых повышений Ca2+ при вдохе, как установлено эмпирически. Тапсигаргин, CPA и MRS 2365 либо наносили в ванну, либо вводили под давлением (0,5-2 фунт/кв. дюйм) с помощью сломанной пипетки для пластыря (наружный диаметр 5-8 мкм).

Ритмические срезы переносили в камеру для записи объемом 3 мл и удерживали на месте горизонтальными нейлоновыми нитями, натянутыми на U-образную платиновую проволоку. Срезы непрерывно перфузировали рециркулируемым aCSF со скоростью потока 5 мл/мин (мертвое пространство перфузионной системы, включая линии притока и оттока, и камеру, составляло ~20 мл).

Исходные данные и изменения базовой флуоресценции клеток из-за применения лекарств были записаны и сохранены с использованием программного обеспечения fluoroview. Эти записи были проанализированы в автономном режиме для количественной оценки изменений базовой флуоресценции клеток из-за применения различных лекарств. Область интереса (ROI) была помещена на каждую интересующую ячейку (в большинстве случаев инспираторные нейроны), которая обеспечивала измерения интенсивности флуоресценции (произвольные единицы) для каждой ячейки с течением времени, которые использовались для вычисления значений ΔF/FO. ΔF указывает на разницу между исходной интенсивностью флуоресценции и интенсивностью после применения препарата. Средняя интенсивность 3-5 вдохов перед введением препарата использовалась для расчета базовой флуоресценции (FO). Аналогичным образом, средние значения 3-5 самых высоких значений, полученные во время применения препарата, были использованы для расчета F.

15 Наркотики и их применение

За исключением BaCl2, все препараты, использованные для моих экспериментов, были получены от Tocris bioscience. Тапсигаргин был получен в Alomone Labs, Израиль. BaCl2 был получен из Sigma-aldrich.

Тапсигаргин, CPA и паксиллин растворяли в 100% ДМСО. Концентрации ДМСО в рабочем растворе составляли 0,2% для тапсигаргина, 0,1% для CPA и 0,04% для паксиллина. Все контрольные применения MRS 2365 были сопряжены с нанесением носителя, содержащего ту же концентрацию ДМСО, что и лекарственное средство.

Ибериотоксин, апамин, MRS 2365 и вещество Р растворяли в aCSF. Эти препараты готовили в виде концентрированных исходных растворов (в 10 раз превышающих рабочие концентрации) и замораживали в аликвотах по 10 мкл. Во время каждого эксперимента препараты размораживали и разбавляли 90 мкл aCSF до экспериментальных концентраций. Конечная концентрация K+ в растворах лекарственных средств была сопоставлена с концентрацией aCSF.

Лекарства либо наносились в ванночку, либо вводились микроинъекциями в преБетЦ. Для нанесения в ванну лекарственные средства добавляли непосредственно в циркулирующий aCSF и промывали в камеру регистрации при их требуемых концентрациях. Для микроинъекции использовались трехстворчатые лекарственные пипетки (наружный диаметр 4-5 мкм на ствол). Эти трехствольные лекарственные пипетки были извлечены из капилляров из боросиликатного стекла (WPI, США), и их кончики были аккуратно сломаны для получения желаемого диаметра. Наконечники стволов размером более 5 мкм могут протекать. Программируемый стимулятор (Master-8, AMPI, Израиль) использовался для контроля продолжительности и продолжительности инъекции препарата. За исключением MRS 2365 и вещества P, все другие лекарственные средства вводили в течение 45 мин, 5 секунд включали и 5 секунд выключали, позволяя лекарству диффундировать. MRS 2365 и вещество P вводили в течение 10 секунд. Для получения повторяемого ответа две последовательные инъекции MRS 2365 были разделены друг от друга по меньшей мере на 15 минут.

15.1 Статистический анализ

Параметры сообщаются относительно контрольных (до введения препарата) уровней, как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения. Все статистические анализы проводились на необработанных данных. Средние значения двух групп сравнивались с использованием t-критерия Стьюдента. Когда сравнивались средние значения более чем для двух групп, проводили повторное измерение ANOVA, за которым следовали тесты множественного сравнения Бонферрони (Prism 4.0, программное обеспечение GraphPad, США). Значения р < 0,05 считались значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ 4.0

16 Внутриклеточный сигнальный путь, который опосредует частотные эффекты активации рецептора P2Y1

16.1 Активация рецептора P2Y1 увеличивает Ca2 + i в инспираторных нейронах

Рецепторы P2Y1 играют решающую роль в формировании гипоксической вентиляционной реакции. АТФ высвобождается в вентролатеральном мозговом веществе во время гипоксии, где он действует через рецепторы P2Y1, увеличивая вентиляцию и ослабляя вторичную депрессию. Обычно рецепторы P2Y1 передают сигнал через путь Gaq, который активирует путь фосфолипазы С и вызывает увеличение Ca2+i (обычно путем высвобождения Ca2+ из внутриклеточных запасов). Моей целью было проверить это явление в нейронах Пребетца. Для достижения этой цели я пометил нейроны Пре-Бётцингерский комплекс ритмических срезов Ca2 +-чувствительным красителем Fluo-4, в то время как инспираторная активность электрофизиологически контролировалась по подъязычным (XII) нервам. Инспираторные нейроны были идентифицированы по ритмическому увеличению сигнала Fluo-4 в фазе с ритмом, записанным с XII нерва. Пять таких нейронов отмечены стрелками на фиг. 1A и их базовые, связанные с вдохом колебания в Ca2+i видны на записях интенсивности флуоресценции (рис. 1B). MRS 2365 (100 мкм, 10 сек) наносили локально и отслеживали изменения базовой флуоресценции инспираторных нейронов. Локальное нанесение MRS 2365 вблизи поверхности среза вызывало значительное увеличение сигнала Fluo-4 во всех 5 инспираторных нейронах, изображенных на этом срезе (рис. 1B). Групповые данные, полученные из 18 инспираторных нейронов в 5 срезах, показали кратное увеличение сигнала Fluo-4 Ca2+i (рис. 1C).

Рисунок 1. Инспираторные нейроны Пре-Бётцингерский комплекс реагируют на локально применяемый MRS 2365 с увеличением Ca2 +. A. Двухфотонное изображение инспираторных клеток Пре-Бётцингерский комплекс, показывающее флуоресценцию Fluo-4 множества клеток на исходном уровне (i) и на пике ответа MRS 2365 (ii). B. Реакции флуоресценции пяти инспираторные нейроны (отмечены цветными стрелками в A) к локально примененному MRS 2365 (100 мкм, 10 Сек), который показал колебания Ca2 +, которые были синхронны с активностью XII нерва. Обратите внимание на увеличение частоты, вызванное MRS 2365. C. Данные группы, показывающие увеличение по сравнению с исходным уровнем пиковой флуоресценции в ответ на локальное нанесение MRS 2365 (100 мкм, 10 сек) (n=18 из 5 срезов).  * p<0,0001, достоверная разница между исходным уровнем и MRS 2365. D. Данные группы, показывающие приблизительное ~50% увеличение флуоресцентной реакции на локально нанесенный MRS 2365 (100 мкм, 10 сек) (n = 18 из 5 срезов).

17 Не все пребетцовские инспираторные нейроны ответили на активацию рецептора P2Y1 увеличением Ca2 + i

преБетЦ - это гетерогенная нейронная сеть. Наиболее распространены прединспираторные и инспираторные нейроны, но иногда встречаются и нейроны с выдыхательным разрядом. Инспираторные нейроны могут быть дополнительно разделены на кардиостимуляторные и не-кардиостимуляторные подтипы и могут быть либо возбуждающими, либо тормозящими. Мои эксперименты показали, что активация рецептора P2Y1 увеличивает Ca2 +i в пребетцовых инспираторных нейронах. Основываясь на высокой чувствительности пребетцевого ритма к активации рецептора P2Y1, я предсказал, что возбуждающие нейроны, вероятно, более чувствительны, чем тормозные нейроны, и что нейроны, участвующие в генерации ритма или контролирующие возбудимость нейронов, генерирующих ритм, вероятно, более чувствительны к активации рецептора P2Y1, чем другие нейроны. Я не смог ответить на это предсказание напрямую, но если оно верно, вполне вероятно, что инспираторные нейроны не одинаково чувствительны к MRS 2365; то есть некоторые нейроны, скорее всего тормозящие инспираторные нейроны, вероятно, будут нечувствительными. Чтобы ответить на этот вопрос, я нанес MRS 2365 (10 мкм в течение 1 мин) на ванну и контролировал флуоресценцию Ca2 + инспираторных нейронов. Применение ванны не только стимулирует все инспираторные клетки в заданной плоскости среза толщиной 700 мкм.

Я не использовал местное применение MRS 2365 в этих экспериментах из-за разного расстояния от инъекционной пипетки и разных инспираторных нейронов. Инспираторные нейроны, расположенные дальше от пипетки с лекарством, будут получать более низкую концентрацию лекарства, чем соседний нейрон, из-за разбавления. Кроме того, местное применение позволяет стимулировать только ограниченное количество инспираторных нейронов вблизи кончика пипетки. Я записал ответы 20 инспираторных нейронов в 7 срезах. Когда данные от всех нейронов были сгруппированы вместе, они показали среднее увеличение флуоресценции Ca2 + на 30,8 ± 6,8% по сравнению с исходным уровнем (рис. 2). Однако при визуальном осмотре данных визуализации было ясно, что нейроны демонстрируют различные реакции. Некоторые реагировали сильно, в то время как реакции других инспираторных нейронов, которые были окружены сильно реагирующими неинспираторными нейронами, не были заметны при визуальном осмотре. Таким образом, я произвольно разделил нейроны на две группы: не отвечающие (те, которые ответили на MRS 2365 с увеличением флуоресценции Ca2 + менее чем на 10%) и отвечающие (те, которые ответили на MRS 2365 с увеличением флуоресценции Ca2 + более чем на 10%). Двенадцать инспираторных нейронов из 5 срезов, которые были классифицированы как реагирующие, показали в среднем 47 ± 10% увеличение их флуоресценции Ca2 +i. Восемь не отвечающих инспираторных нейронов из 2 срезов показали только среднее увеличение флуоресценции Ca2 + в среднем на 6,5 ± 2,8%, что позволяет предположить, что увеличение Ca2 + i в ответ на активацию рецептора P2Y1 варьируется между нейронами Пре-Бётцингерский комплекс. В качестве положительного контроля данные из экспериментов с невосприимчивыми инспираторными нейронами были включены в анализ только в том случае, если в одном и том же срезе были нейроны (инспираторные или неинспираторные), которые показали сильную реакцию на нанесенный в ванну MRS 23656 (рис. 2C). Инспираторные нейроны не были классифицированы дальше.

A. Типичное базовое увеличение флуоресценции инспираторных нейронов Пребетца в ответ на нанесение ванны MRS 2365 (10 мкм, 1 мин) (респондеры) B. Три инспираторных нейрона в фокальной плоскости демонстрируют минимальное увеличение их базовой флуоресценции (не ответившие) C. Не инспираторные нейроны из той же фокальной плоскости не ответивших демонстрируя значительное увеличение их базового сигнала флуоресценции Ca2 + в ответ на применение ванны MRS 2365. D. Групповые данные, показывающие вызванные MRS 2365 (10 мкм, 1 мин) изменения флуоресценции Ca2 + во всех исследованных нейронах и нейронах, которые были классифицированы как сильно реагирующие или слабые / не реагирующие. (*р<0,001, Парный t-тест).

18 Блокаторы SERCA ослабляют вызванное MRS 2365 увеличение Ca2 + i в пребетцовых инспираторных нейронах

Эксперименты по визуализации Ca2 + показали, что активация рецептора P2Y1 увеличивает Ca2 + i в ~ 60% инспираторных нейронов Пре-Бётцингерский комплекс. Ca2+ может поступать из внеклеточного пространства через управляемые напряжением ионные каналы или высвобождаться из внутриклеточных хранилищ. Если источником Ca2 + является внутриклеточный, то истощение внутриклеточного Ca2 + блокаторами SERCA должно ослабить вызванное MRS 2365 увеличение Ca2 +. Чтобы проверить это, я сначала измерил реакции флуоресценции Ca2 +, вызванные MRS 2365 (10 мкм, 1 мин) в контроле. Чтобы контролировать возможное зависящее от времени снижение реакции, вызванной Ca2 + MRS 2365, которое может произойти при отбеливании, я провел второе контрольное исследование MRS 2365 через 30 минут.

После дополнительного 30-минутного периода восстановления я применил MRS 2365 после ванны -нанесение блокатора SERCA (тапсигаргин, 100 мкм, n = 8; CPA, 100 мкм, n = 4) в течение 30 минут. Затем я сравнил величину 2-го контрольного ответа относительно первого контрольного ответа с величиной тестового (третьего) ответа (блокатор SERCA) относительно второго контрольного ответа. Эффекты двух блокаторов SERCA были схожими, поэтому данные были объединены.

Инспираторные нейроны идентифицируются, как описано выше. Два инспираторных нейрона отмечены стрелками на рис. 3A и их ответы на два контрольных приложения MRS 2365 показаны на фиг. 3B и 3C соответственно. Третье применение в присутствии тапсигаргина показано на рис.3D. Групповые данные, взятые из 12 инспираторных нейронов в 5 срезах (те же реагирующие нейроны, что и на фиг. 2) показали, что второе контрольное нанесение MRS 2365 вызывало увеличение флуоресценции Ca2+, которое составляло 95,0±2,7% от первого контрольного ответа (т.е. снижение на ~5% с течением времени).

Ответ MRS 2365, вызванный в присутствии блокаторов SERCA, был значительно снижен по сравнению с предыдущим применением и составил всего 43,9 ±7,3% от второго контрольного ответа MRS 2365. Другими словами, уменьшение флуоресценции за тот же период времени было в ~7 раз больше в присутствии тапсигаргина/CPA. Данные указывают на минимальное зависящее от времени замедление реакции и на то, что основным источником вызванного MRS 2365 увеличения флуоресценции Ca2 + являются внутриклеточные запасы. Обратите внимание, что вызванное MRS 2365 увеличение частоты вдоха также было значительно ослаблено блокаторами SERCA (рис. 3D).

A (i), двухфотонное изображение, показывающее флуоресценцию Fluo-4 2 инспираторных нейронов (помечено стрелками в исходном состоянии (i), во время пика ответов, вызванных MRS 2365 (10 мкм, 1 мин) (ii и iii) и после нанесения блокатора SERCA в ванне, тапсигаргин, в течение 30 мин B, C, D. Записи флуоресценции Ca2+ от инспираторных нейронов (тех же нейронов, что и в A), показывающие ритмические колебания в фазе с инспираторными всплесками, записанными от XII нерва, и ответы на два контрольных применения MRS 23656 (B, C) и третье применение в присутствии тапсигаргина (D). График E. Box групповых данных, показывающий, что снижение флуоресценции Ca2 +, вызванной MRS 2365 в блокаторе SERCA по сравнению со вторым контрольным ответом MRS 235, было значительно больше, чем снижение между двумя контрольными ответами MRS 2365 (n= 12 нейронов, 5 срезов; * p= 0063).

19 Вызванное рецептором P2Y1 увеличение частоты вдоха включает высвобождение Ca2 + из внутриклеточных запасов

Чтобы дополнительно проверить, связано ли увеличение частоты, вызванное MRS 2365, с высвобождением Ca2 + из внутриклеточных запасов, я сравнил контрольные ответы MRS 2365 с ответами, вызванными после местного применения двух блокаторов SERCA к Пре-Бётцингерский комплекс. Поскольку место действия этих блокаторов является внутриклеточным, было предоставлено дополнительное время для диффузии в ткани и через клеточную мембрану. Сначала я протестировал тапсигаргин. Нанесению MRS 2365 предшествовало 15-минутное предварительное нанесение носителя (0,2% ДМСО, 5 секунд включено, 5 секунд выключено) или тапсигаргина (200 мкм в 0,2% ДМСО). Два последовательных испытания MRS 2365 проводили в тапсигаргине с интервалом в 15 минут. Реакция одного препарата и групповые данные показаны на фиг. 4. Тапсигаргин уменьшил увеличение частоты, вызванное MRS 2365, с пика в 2,59 ± 0,15 раза в контроле до 2,11 ± 0,19 раза через 15 мин (p = 0,063) и до 1,89 ± 0,20 раза при втором применении после 30 мин тапсигаргина (n = 6, p = 0,007, повторные измерения ANOVA, Множественный сравнительный тест Бонферрони). Другими словами, 30 минут местного применения тапсигаргина уменьшали потенцирование MRS 2365 на ~ 30%.

Концентрация ДМСО, необходимая для растворения тапсигаргина до указанной концентрации, составляла 0,2%. Чтобы убедиться, что длительное местное применение 0,2% ДМСО в Пре-Бётцингерский комплекс не влияет на способность сети реагировать на MRS 2365, я сравнил реакцию сети Пре-Бётцингерский комплекс на MRS 2365 с интервалами в 15 минут в течение непрерывного 75-минутного (5 секунд включено, 5 секунд выключено) применения транспортное средство (aCSF с 0,2% ДМСО). MRS 2365 был стабилен в течение 5 последовательных применений. На 15, 30, 45, 60 и 75 минутах пиковое увеличение частоты, вызванное MRS 2365, составляло в среднем 4.00 ± 0.83, 3.73 ± 0.51, 3.73 ± 0.55, 3.98 ± 0.54 и 4,07 ± 0,78 относительно исходного уровня.

Рисунок 4 Истощение внутриклеточных запасов Ca2 + тапсигаргином ослабляет увеличение частоты, вызванное MRS 2365. Репрезентативные следы интегрированного выхода подъязычного нерва (∫XII), показывающие увеличение частоты, вызванное в ответ на местную инъекцию агониста P2Y1 MRS 2365 (100 мкм, 10 сек) в ПРЕБОТ в контрольных условиях, и после 15 (B) и 30 мин (C) применения тапсигаргина (200 мкм) локально в преБетЦ. D, Групповые данные, показывающие пиковое увеличение частоты, вызванное MRS 2365 в контроле и после 15 и 30 мин тапсигаргина. (n = 6, p = 0,01 (необходимо указать точное значение p), повторные измерения ANOVA, множественный сравнительный тест Бонферрони). E, ответы группового сравнения, показывающие несущественные различия между контролем времени 0,2% ДМСО. (n= 5, p> 0,05, повторные измерения ANOVA, множественный сравнительный тест Бонферрони). Все данные нанесены на график относительно (относительно) базовых уровней.

Второй блокатор SERCA циклопиазоновой кислоты (CPA, 100 мкм) тестировали с использованием протокола, аналогичного протоколу Тапсигаргина, за исключением того, что носитель содержал 0,1% ДМСО, и CPA применяли в общей сложности в течение 45 минут, поскольку для достижения значительного эффекта требовалось больше времени, чем тапсигаргин. Реакция одного препарата и групповые данные показаны на фиг. 5. CPA уменьшил увеличение частоты, вызванное MRS 2365, на ~ 35% с пика в 2,80± 0,28 раза в носителе до 1,82± 0,12 при третьем нанесении после 45 мин циклопиазоновой кислоты (n = 6, p = 0,040, парный t-тест).

20 Идентификация ионных каналов, лежащих в основе частотных эффектов активации рецептора P2Y1

Продемонстрировав, что высвобождение Ca2 + из внутриклеточных запасов является частью каскада, посредством которого активация рецептора P2Y1 увеличивает частоту Пре-Бётцингерский комплекс, моей следующей целью было идентифицировать ионный канал или каналы, которые отвечают за увеличение частоты, опосредованное рецептором P2Y1. Обзор литературы выявил множество ионных каналов в различных областях мозга, которые модулируются рецепторами P2Y1, действующими черезсигнальный путь gq, и включают чувствительное к тапсигаргину увеличение внутриклеточного Ca2 + (Раджани и др. 2016). Потенциальные цели включали (i) GIRK, (ii) SK (iii) зависящий от напряжения K +. Каналы. (iv) БК. Чтобы выделить ионный канал, участвующий в увеличении частоты, опосредованном рецептором P2Y1, я использовал ритмически активный препарат медуллярного среза и сравнил пиковую частоту, вызванную MRS 2365, в контроле и после приема ванны или местного применения блокаторов, которые нацелены на эти потенциальные ионные каналы. Всего было протестировано четыре потенциальных ионных канала. Первые три, которые не имели явного вклада в увеличение частоты, опосредованное рецептором P2Y1, описаны первыми.

21 Каналы ГИРК

GIRKs представляют собой семействоионных каналов K+ с внутренним выпрямлением. Для активации этих каналов требуется взаимодействие с белком Gβy. Каналы GIRK проницаемы для ионов K +, которыепри активации приводят к гиперполяризации мембраны. Я использовал хлорид бария (BaCl2) для блокирования каналов GIRK. BaCl2 наносили в ванну с начальной концентрацией 400 мкм и повышали до 500 и 700 мкм. При 400 мкм BaCl2 был связан со снижением базовой частоты и увеличением тонизирующей активности. Концентрация BaCl2 не превышала 700 мкм, поскольку на этих уровнях ритм, связанный с вдохом, было трудно отличить от фоновой тонической активности. MRS 2365 вводили в течение 10 секунд с интервалом в 15 минут, сначала в контрольную и снова через 15 минут в 400, 500 и 700 мкм BaCl2.

Реакция одного препарата и групповые данные показаны на фиг. 6. Контрольная MRS 2365 вызывала увеличение в 2,23 ± 0,18 раза, в то время как инъекции MRS 2365 в присутствии BaCl2 при 400 мкм, 500 мкм и 700 мкм вызывали увеличение в 3,18 ± 0,28, 3,89 ± 0,29 и 4,88 ± 0,70 раза соответственно (n = 4, p> 0,05, повторные измерения ANOVA, множественный сравнительный тест Бонферрони). Однако, поскольку базовая частота постепенно снижалась с увеличением BaCl2, очевидное усиление увеличения частоты, вызванного MRS 2365, отражало снижение базовой частоты больше, чем увеличение абсолютной частоты, вызванное MRS 2365, которое достигло максимума при 0.40 ± 0.02, 0.42 ± 0.03, 0.45 ± 0.08, 0.51 ± 0.03 под контролем, 400, 500 и 700 мкм BaCl2 соответственно.

Паксиллин при 20 мкм ослабил MRS 2365-вызванное увеличение частоты. Репрезентативные следы ∫XII нерва, показывающие увеличение частоты, вызванное агонистом P2Y1 MRS 2365 (100 мкм, 10 сек) в контроле (A) и после 30-минутного нанесения паксиллина (20 мкм) локально на преБетЦ (B). C. Сравнение групповых данных показывает значительное снижение MRS 2365-вызванный ответ после 15 и 30 минут приема паксиллина (n = 3, p<0,05, повторные измерения ANOVA, множественный сравнительный тест Бонферрони). Все данные нанесены на график относительно базовых уровней.

Однако при 20 мкм паксиллин обладает потенциальным нецелевым действием на SERCA, которое, как я уже показал, ингибирует реакцию MRS 2365. Чтобы оценить, было ли это потенциальное нецелевое действие паксиллина проблемой в моих экспериментах, я использовал метод визуализации Ca2 +, описанный ранее. В этом случае я локально ввел 20 мкм паксиллина в Пребот и отслеживал изменения базовой интенсивности флуоресценции инспираторных нейронов. Через 15 мин за испытанием паксиллина последовала местная инъекция блокатора SERCA (либо тапсигаргина, либо CPA) в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что инъекция препарата была эффективной, а также для сравнения реакции, вызванной паксиллином, с реакцией на известный блокатор SERCA. Любое увеличение базовой интенсивности флуоресценции паксиллином указывает на нецелевую блокаду SERCA.

Паксиллин (20 мкм) увеличивал исходную флуоресценцию Ca2 + инспираторных нейронов на 29,9 ± 5,6% по сравнению с контролем. Блокаторы SERCA вызывали аналогичное увеличение на 21,8 ± 1,7% выше базовой линии (n = 4 инспираторных нейрона из 2 срезов p = 0,26, парный t-тест). Эти эксперименты предполагают, что при 20 мкм паксиллин блокирует SERCA, и ослабление ответа MRS 2365 на сетевом уровне паксиллином может быть связано с этим нецелевым действием на SERCA.

Рисунок 10. Паксиллин в дозе 20 мкм и блокаторы SERCA вызывают аналогичное увеличение базовой флуоресценции Ca2 +i инспираторных нейронов. Измерения интенсивности флуоресценции из двух инспираторных нейронов, показывающие увеличение базовой флуоресценции (Ca2 + i), вызванной местным применением паксиллина (20 мкм) (A) B, групповые данные из 4 инспираторных клеток из 2 срезов, показывающие среднее влияние на базовую флуоресценцию Ca2 +, вызванную паксиллином и блокаторами SERCA соответственно (p = 0,2604, парный t-тест).

22 Обсуждение

22.1 Сигнальные пути, опосредующие эффекты активации рецептора P2Y1 на Ca2 + i и частоту Пре-Бётцингерский комплекс

АТФ, высвобождаемый в преБетЦ во время гипоксии, ослабляет вторичное гипоксическое угнетение дыхания, главным образом, воздействуя на рецепторы P2Y1 (Раджани и др., 2015). Молекулярные механизмы, лежащие в основе опосредованного рецептором P2Y1 возбуждения инспираторной сети, были неясны. Основной целью моей диссертации было проанализировать молекулярные механизмы, лежащие в основе опосредованного рецептором P2Y1 возбуждения пребетцевой инспираторной сети. Я впервые продемонстрировал, что инспираторные нейроны в Пре-Бётцингерский комплекс демонстрируют увеличение Ca2 + i после активации рецептора P2Y1.

Однако, как и предсказывалось для гетерогенной нейронной сети, содержащей возбуждающие и тормозные нейроны, я также продемонстрировал, что инспираторные нейроны дифференциально чувствительны к опосредованному рецептором P2Y1 увеличению внутриклеточного Ca2 +, которое происходит, по крайней мере частично, из тапсигаргина и CPA-чувствительных внутриклеточных запасов Ca2 +. Наконец, я установил, что BK-каналы II типа являются одной из нижестоящих мишеней рецепторов P2Y1, которые способствуют общему увеличению частоты, вызываемой ATP в Пре-Бётцингерский комплекс.

23 Активация рецептора P2Y1 увеличивает Ca2 + i инспираторных нейронов Пребетца

Многие нейромодуляторы, такие как амины, нейропептиды и нейротрансмиттеры, модулируют ритм с помощью сигнальных систем GPCR. Эти нейромодулирующие сигналы исходят из многочисленных областей, распределенных по всей центральной нервной системе, и могут либо возбуждать, либо подавлять дыхательную активность, в зависимости от рецептора, который они активируют.

Эндогенная ГАМК через рецепторы GABAB, опиоиды из периакведуктального серого через μ-опиоидные рецепторы и норадреналин из группы клеток A5 в вентролатеральном мосту через α2-рецепторы - все они снижают частоту дыхания. Обработка животных коклюшным токсином за день до приготовления среза и эксперименты in vitro ослабляли угнетение дыхания, вызванное активацией этих рецепторов, предполагая, что они связаны через сигнальный путь Gi / o.

С другой стороны, ацетилхолин через М3-рецепторы (Шао И Фельдман 2000, 2005), норэпинефрин из голубого пятна через α1-рецепторы, гистамин из туберомамиллярного ядра через Н1-рецепторы, серотонин из рафа магнуса через 5-HT2-рецепторы (Пенья и Рамирес 2002; Птак и др., 2009). АТФ (Хакстейбл и др. 2009, 2010; Лориер и др. 2007) высвобождается из глии вентролатерального продолговатого вещества (Ангелова и др. 2015) через рецепторы P2Y1, вещество P из дорсального шва через рецепторы NK1, холецистокинин из периакведутального серого, протокового ядра solitarius и raphe magnus через рецепторы CCK1 и TRH от raphe magnus увеличивают частоту дыхания. Анализ рекомбинантных рецепторов во множестве экспрессионных систем подтверждает, что эти рецепторы действуют через сигнальный путь Gaq GPCR. Однако существует мало прямых доказательств того, что эти нейромодуляторы активируют путь Gaq конкретно в нейронах Пре-Бётцингерский комплекс.

Обычно активация сигнального пути Gaq диссоциирует гетеротримерный G-белок на aq и βγ-субъединицы. Субъединица aq активирует фосфолипазу С, которая впоследствии гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) до инозитол трисфосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG). IP3 способствует высвобождению Ca2+ из внутриклеточных запасов путем связывания с рецепторами IP3 на эндоплазматическом ретикулуме. Ca2 + и DAG активируют PKC для опосредования клеточных и, в конечном счете, сетевых эффектов.

Возбуждение рецептора P2Y1 инспираторной сети Пребетца также, по-видимому, опосредуется, по крайней мере частично, через сигнальный путь Gaq. Во-первых, активация рецепторов P2Y1 при местном применении MRS 2365 вызывала увеличение Ca2+i во инспираторных нейронах, которые были чувствительны к SERCA-блокаторам тапсигаргину и CPA. Кроме того, сетевые эффекты активации рецептора P2Y1 были ослаблены хелатированием внутриклеточного Ca2 + (с помощью BAPTA AM), ингибированием рецепторов IP3 (с помощью 2-APB) и PKC (хлоридом хелеритрина) (Раджани и др. 2015), которые все являются частью сигнального пути.

Несмотря на эти мощные действия агонистов рецептора P2Y1 на инспираторные нейроны и частоту сети Пре-Бётцингерский комплекс, а также данные, подтверждающие, что рецепторы P2Y1 сигнализируют через активацию Gaq, вызывая увеличение Ca2 + i, я не могу однозначно заключить, что рецепторы P2Y1 связаны с Gaq в Пре-Бётцингерский комплекс. Рецепторы P2Y1 также могут действовать через сигнальный путь Gai для увеличения Ca2 +i. В CFTR-экспрессирующих клетках яичников китайского хомяка опосредуемое рецептором P2Y1 увеличение Ca2+ чувствительно к коклюшному токсину. В симпатических нейронах крыс коклюшный токсин устраняет закрытие каналов GIRK, опосредованных рецепторами P2Y1, что дополнительно предполагает сцепление Gai (Эрб и Вайсман 2012). Gai может индуцировать увеличение Ca2+i через субъединицы белка Giβy, которые могут активировать PLC и запускать высвобождение Ca2+ из различных сигнальных путей. Газ также может увеличивать Ca2 +i через IP3-зависимый путь. Активация газа затем увеличивает PKA через цАМФ. PKA-опосредованное фосфорилирование рецепторов IP3 изменяет чувствительность к IP3. Альтернативно, запускаемый цАМФ Epac, обменные белки, активируемые цАМФ, могут активировать PLC через β2-адренорецепторы, экспрессируемые в клетках HEK, продуцирующих запускаемое IP3 высвобождение Ca2+ из эндоплазматического ретикулума. Рецепторы P2Y1 также могут образовывать гетеромерные комплексы с аденозиновыми (A1) рецепторами. Эти гибридные рецепторы реагируют на ADPβs, активируя как Gai, так и Gaq. Таким образом, хотя данные убедительно подтверждают роль передачи сигналов Gaq в потенцировании частоты вдоха, опосредованном рецептором P2Y1, требуются дополнительные эксперименты, чтобы подтвердить этот вывод.

24 Пребетцовые инспираторные нейроны дифференциально чувствительны к активации рецептора P2Y1

преБетЦ - это гетерогенная нейронная сеть. В дополнение к инспираторным и меньшему количеству экспираторных нейронов, пребот содержит небольшую популяцию постинспираторных нейронов. В группе инспираторных нейронов есть кардиостимуляторы и нейроны, не являющиеся кардиостимуляторами. Не все инспираторные пребетцовые нейроны или даже нейроны кардиостимулятора являются возбуждающими; некоторые из них являются тормозными.

Высокая чувствительность сети к активации рецептора P2Y1 подсказала мне, что нейроны Пре-Бётцингерский комплекс дифференциально чувствительны к активации рецептора P2Y1. Более конкретно, мы предсказываем, что популяция нейронов, важных для генерации ритма или для обеспечения прямого возбуждающего импульса для нейронов, генерирующих ритм, проявляет большую чувствительность к активации рецептора P2Y1, чем другие нейроны.

Конечно, эквивалентная активация возбуждающих и тормозных механизмов с меньшей вероятностью приведет к сильному возбуждению, чем избирательная активация возбуждающих нейронов. Основываясь на величине увеличения флуоресценции Ca2 +, вызванной MRS 2365, мы обнаружили два различных класса нейронов; 60% нейронов (12/20) показали сильное увеличение флуоресценции Ca2 +, в то время как 8/20 ответили очень слабо. Важно отметить, что эксперименты, в которых нейроны не реагировали на MRS 2365, включались в анализ только в том случае, если в срезе были другие нейроны, которые реагировали на MRS 2365; т. е. у нас был положительный контроль для исключения ложноотрицательных ответов. Эти данные согласуются с нашей гипотезой о том, что высокая чувствительность к АТФ отражает дифференциальную чувствительность инспираторных пребетцовых нейронов. Остается определить фенотип чувствительных и нечувствительных к MRS 2365 нейронов; т.е. Являются ли чувствительные нейроны исключительно возбуждающими?

Также интересно отметить, что когда срезы имели чувствительные инспираторные нейроны, все инспираторные нейроны были чувствительными. Когда срез содержал нечувствительные инспираторные нейроны, все инспираторные нейроны были нечувствительными. Одно из возможных объяснений состоит в том, что срезы с нечувствительными нейронами были вырезаны более рострально, чем срезы с чувствительными нейронами, которые были вырезаны на ростральной поверхности Пребетца.  Эта возможность согласуется с наблюдением о том, что ритм вдоха наиболее чувствителен к активации рецепторов P2Y1 в Пре-Бётцингерский комплекс (Лориер и др. 2007). Однако я не документировал границы среза в различных экспериментах. Таким образом, необходимы дополнительные эксперименты, чтобы выяснить, являются ли инспираторные нейроны, расположенные рострально к Пре-Бётцингерский комплекс, менее чувствительными к активации рецептора P2Y1, чем те, которые находятся внутри Пре-Бётцингерский комплекс.

25 Ca2+, высвобождаемый из внутриклеточных запасов, способствует опосредованному рецептором P2Y1 увеличению частоты дыхания

Ca2+ является основным вторичным мессенджером, который регулирует различные внутриклеточные сигнальные пути и процессы. Ca2 + обычно поглощается и сохраняется в эндоплазматическом ретикулуме (ER) в большинстве типов клеток (Berridge 2002) и высвобождается в цитозоль в ответ на мессенджеры, такие как IP3 (Berridge 1998). Высвобождаемые ионы Ca2 + выполняют множество различных функций в зависимости от типа и местоположения клетки. SERCA представляют собой важное семейство АТФаз, которые отвечают за поддержание высоких уровней Ca2+ в ER. SERCA переносит Ca2+ из цитозоля клетки в просвет ER за счет гидролиза АТФ. Блокада активности SERCA в конечном итоге приведет к истощению ER Ca2+. Здесь я показал, что как увеличение внутриклеточного Ca2 + во инспираторных преБетЦ-нейронах, так и увеличение частоты сети, вызванное активацией рецептора P2Y1, были чувствительны к блокаде SERCA.

Однако ни тапсигаргин, ни CPA полностью не блокировали вызванное MRS 2365, опосредованное рецептором P2Y1 Ca2 + и увеличение частоты. Эта неполная блокировка может отражать то, что дополнительные сигнальные пути вносят вклад в действие рецепторов P2Y1 или что путь тапсигаргина / CPA, предполагаемый путь Ca2+i, повышенный Gaq – IP3, не был полностью заблокирован. При нанесении ванны на 100 мкм блокаторы SERCA почти полностью устраняли вызванное MRS2365 увеличение внутриклеточного Ca2 +. В некоторых экспериментах с визуализацией эта концентрация также блокировала частотный эффект.

Однако в экспериментах, в которых изучались механизмы, лежащие в основе частотных эффектов активации рецептора P2Y1, тапсигаргин наносился локально на 100 мкм в ПРЕБОТ. В этих условиях ингибирование, опосредованное тапсигаргином, было меньшим, чем при применении ванны. В этом нет ничего удивительного. Во время местной инъекции фактическая концентрация лекарственного средства (тапсигаргина) экспоненциально уменьшается от точечного источника на кончике инъекционной пипетки. Действительно, предыдущие работы, в которых сравнивались эффекты ванн и лекарств местного применения, показывают, что для получения аналогичных эффектов локально применяемая концентрация должна быть примерно в 10 раз больше, чем при применении ванн. (Лю и др., 1990)

Эти данные свидетельствуют о том, что действия тапсигаргина и CPA зависят от дозы, но даже при применении в ванне блокаторы SERCA не полностью блокировали влияние активации рецептора P2Y1 на частоту. Нечувствительный компонент эффекта MRS 2365 может отражать: 1) альтернативные сигнальные пути второго мессенджера; 2) наличие насосов SERCA, которые нечувствительны к тапсигаргину (Liang и Sze 1998) или CPA; или (3) то, что может быть невозможно полностью истощить внутренние запасы Ca2+ (Касперсен и Кристенсен 1998).

Как обсуждалось ранее, существуют также доказательства того, что рецепторы P2Y1 могут связываться с Gai. В CFTR-экспрессирующих клетках яичников китайского хомяка повышение Ca2+, опосредованное рецептором P2Y1, чувствительно к коклюшному токсину (Марсет и др., 2004). В симпатических нейронах крыс коклюшный токсин устраняет закрытие каналов GIRK, опосредованных рецептором P2Y1, что дополнительно предполагает сцепление Gai (Эрб и Вайсман 2012).

Активация рецептора P2Y1 также вызывает возбуждение в различных областях мозга, например, в заднем гипоталамусе активация рецептора P2Y1 вызывает возбуждение (Сергеева и др., 2006). Несмотря на то, что рецептор P2Y1 является возбуждающим по своей природе, не всегда верно, что активация приводит к возбуждению сети, поскольку активация exmape рецептора P2Y1 оказывает возбуждающее действие на ингибирующие интернейроны, что в конечном итоге вызывает ингибирование нейронов CA3 гиппокампа (Кавамура и др. 2004).

26 Минимальный вклад каналов GIRK, SK и K +, управляемых напряжением, в возбуждение сети, опосредованное P2Y1R

Продемонстрировав, что опосредованное рецептором P2Y1 увеличение частоты Пре-Бётцингерский комплекс частично вызвано активацией сигнального каскада, который запускает высвобождение Ca2 + из внутриклеточных запасов, моя цель состояла в том, чтобы определить нисходящий ионный канал, опосредующий это возбуждение. Я проверил несколько каналов, основываясь на том факте, что они модулируются либо рецептором P2Y1, либо сигнальным путем Gaq, и они могут влиять на ритм вдоха (Раджани и др., 2016).

26.1 Каналы GIRK

Каналы GIRK представляют собой семейство калиевых каналов с внутренним выпрямлением, активируемых компонентом Gβy GPCR, которые вызывают гиперполяризацию нейронов при активации. Четыре субъединицы канала GIRK идентифицированы у млекопитающих (GIRK1-GIRK 4). GIRK1- GIRK3 чаще экспрессируются в головном мозге (Люшер и Шлезингер, 2010). Субъединица GIRK 2 экспрессируется в Пре-Бётцингерский комплекс, где предполагается, что она опосредует опиоидную депрессию дыхания. В соответствии с этим частота дыхания и амплитуда мышц genioglossus уменьшались, когда ML297, специфический активатор канала GIRK, вводили микроперфузией в Пре-Бётцингерский комплекс взрослых крыс-самцов под наркозом.

Каналы GIRK ингибируются BaCl2, поэтому я проверил влияние этого двухвалентного катиона на увеличение частоты, вызванное MRS 2365. Сам по себе BaCl2 влиял на базовый ритм вдоха и вызывал значительное увеличение фоновой тонической активности, что иногда затрудняло различение отдельных вдохов. Эти эффекты ясно указывали на то, что BaCl2 диффундировал в срез, но даже при нарушениях ритма было очевидно, что BaCl2 не блокировал способность MRS 2365 увеличивать частоту, что убедительно свидетельствует о том, что каналы GIRK не являются ионным каналом, который лежит в основе увеличения частоты, вызванного рецептором P2Y1.

26.3 Каналы K+ с регулируемым напряжением (VGKC)

VGKCs активируются во время деполяризации и избирательно проницаемы для ионов K +. Восемь VGKC были идентифицированы у млекопитающих. Токи, переносимые VGKC, могут быть в широком смысле классифицированы на неактивирующие токи с замедленным выпрямлением (KDR) и переходные токи типа A (IA). TEA преимущественно блокирует IKDR, а не IA.

Многие виды K+ каналов могут вносить вклад в задержку тока K+ выпрямителя, включая членов зависящих от напряжения семейств генов Kv1, Kv2 и Kv3 и другие. Конкретная комбинация кандидатов на замедленный выпрямитель, выраженная в Пре-Бётцингерский комплекс, неизвестна. Влияние специфической блокады IKDR на генерацию и модуляцию ритма также неизвестно. У крыс (P0-P4) препарат TEA для обработки ствола головного и спинного мозга снижал частоту.

Однако роль VGKCs в опосредовании возбуждающего действия рецепторов P2Y1 на ритм Пре-Бётцингерский комплекс представляется маловероятной. Местное применение ЧАЯ (1 мм) вызывало увеличение тонических выделений, регистрируемых из XII нерва, но на частоту, вызванную MRS 2365, ЧАЙ существенно не влиял.

27 Каналы SK

SK-каналы представляют собой семейство Ca2+-активированных K+-каналов. В отличие от BK-каналов, эти каналы активируются исключительно повышением внутриклеточного Ca2 +. Не существует доказательств того, что эти каналы участвуют в генерации ритма, но могут модулировать ритм, в зависимости от вида и, возможно, препарата.

Апамин оказывал минимальное влияние на увеличение частоты, вызванное MRS 2365, что позволяет предположить, что SK-каналы могут не быть нижестоящим эффекторным каналом рецепторов P2Y1. Единственное предостережение здесь заключается в том, что, поскольку апамин не влиял на базовый ритм, я не могу быть на 100% уверен, что он диффундировал в срез и блокировал каналы SK. Я также не проводил положительный контроль, чтобы продемонстрировать, что Апамин попал внутрь. Однако апамин использовался несколько раз в подобных ситуациях (Завала-Текуапетла и др. 2008), где он легко диффундировал в ткани и противодействовал SK. Таким образом, хотя я не могу полностью исключить возможность того, что апамин не попал внутрь, данные свидетельствуют о том, что SK-каналы не опосредуют действие активации рецептора P2Y1 на ритм Пре-Бётцингерский комплекс.

28 BK-каналы типа II могут быть нижестоящим эффекторным каналом рецептора P2Y1

BK-каналы представляют собой K +-каналы с большой проводимостью, которые способствуют быстрой фазе постгиперполяризации большинства клеток.

Подобно SK-каналам, BK-каналы не участвуют в генерации ритма, но, по-видимому, способствуют опосредованному рецептором P2Y1 увеличению частоты вдоха. Паксиллин в дозе 20 мкм значительно ослаблял вызванное MRS 2365 увеличение частоты. Однако данные визуализации Ca2 + показали, что при этой концентрации паксиллин также увеличивал внутриклеточную концентрацию Ca2 +. Таким образом, невозможно приписать этот антагонизм действию паксиллина на BK-каналы. Ингибирование, возможно, было вызвано ингибированием SERCA, как сообщалось ранее при высоких концентрациях. Эксперименты с визуализацией также показали, что 10 мкм паксиллина не влияют на внутриклеточный Ca2 +, что свидетельствует о минимальном ингибировании SERCA при 10 мкм. Однако, чтобы быть уверенным, что какие-либо действия паксиллина не были вызваны ингибированием SERCA, мы использовали в 10 раз более низкую концентрацию паксиллина (1 мкм), чтобы проверить, способствуют ли BK-каналы опосредованному рецептором P2Y1 увеличению частоты вдоха.

Паксиллин, блокатор BK-каналов типа I и II, был повторно протестирован в концентрации 1 мкм на сетевом уровне, где он значительно ослаблял увеличение частоты, вызванное MRS 2365 в Пре-Бётцингерский комплекс, что позволяет предположить, что BK-каналы могут быть нижестоящим эффекторным каналом рецепторов P2Y1. Интересно, что ибериотоксин, который блокирует BK-каналы типа I с очень низким сродством к BK-каналам типа II (Ванг, Джеф, и Бреннер 2014), не влиял на увеличение частоты, вызванное MRS 2365. Таким образом, это, скорее всего, каналы BK типа II, через которые MRS 2365 действует для увеличения частоты. Эффект частоты, вызванный MRS 2365, не был полностью блокирован паксиллином. Этому могут способствовать следующие факторы: во-первых, повышенный уровень Ca2+ увеличивает вероятность открытия BK-каналов, что приводит к растормаживанию паксиллином. Поскольку я продемонстрировал, что активация рецептора P2Y1 вызывает увеличение внутриклеточного Ca2+, и ответчики более чувствительны к активации P2Y1R, возможно, что в срезах, имеющих больше ответчиков, максимальная блокировка паксиллином не достигается. Во-вторых, также возможно, что BK-каналы не являются единственным ионным каналом, на который действуют рецепторы P2Y1 для увеличения частоты. Как обсуждалось ранее, рецепторы P2Y1 модулируют широкий спектр каналов. Вполне возможно, что опосредованное рецептором P2Y1 возбуждение сети Пре-Бётцингерский комплекс является результатом активации BK и других каналов.

Вышеупомянутые два фактора, возможно, все способствовали вариабельности величины опосредованного паксиллином ингибирования увеличения частоты MRS 2365, которое варьировалось между препаратами от отсутствия ингибирования до максимума почти 70%.

Заключение

Основной целью этой работы было углубить понимание молекулярных механизмов, с помощью которых активация рецепторов P2Y1 увеличивает вентиляцию легких. Основным вкладом были демонстрации того, что: i) активация рецептора P2Y1 в инспираторных нейронах Пре-Бётцингерский комплекс вызывает высвобождение Ca2 + из внутриклеточных запасов; ii) вызванное рецептором P2Y1 увеличение Ca2 + способствует возбуждению сети; iii) как и предсказывалось для сети, включающей возбуждающие и тормозящие инспираторные нейроны Пре-Бётцингерский комплекс, не все инспираторные нейроны Пре-Бётцингерский комплекс нейроны возбуждаются активацией рецептора P2Y1; и iv). Активация BK-каналов способствует опосредованному рецептором P2Y1 возбуждению ритма вдоха.

Библиография

Абраккио М.П., Бернсток Г., Бойнаемс Дж.М., Барнард Е.А., Бойер Дж.Л., Кеннеди С, Найт Дж.,   Фумагалли М., Гаше С., Якобсон К. А. и Вайсман Г.А. (2006). Международный союз фармакологии LVIII: обновленная информация о нуклеотидных рецепторах, связанных с белком P2Y G: от молекулярных механизмов и патофизиологии до терапии. Фармакологические обзоры58,281-341.

Абраккио, Мария П., Джеффри Бернсток, Алексей Верхратский и Герберт Циммерманн. 2009. “Пуринергическая сигнализация в нервной системе: обзор”. Тенденции в нейробиологии32(1):19-29.

Экленд, Г. Л., В. Касымов и А. В. Гурин. 2007. “Физиологическая и патофизиологическая роль внеклеточной АТФ в хемосенсорном контроле дыхания”. Труды биохимического общества35 (Статья 5):1264-68.

Адельман, Джон П., Джеймс Мэйли и Панкадж Сах. 2012. “Малопроводящие Ca2+ -активированные K + каналы с малой проводимостью: форма и функции”. Ежегодный обзор физиологии74(1):245-69.

Альварес, Т. С., А. Л. Ревилл, А. Г. Хакстейбл, К. Д. Лоренц и Г. Д. Фанк. 2014. “Опосредованное рецептором P2Y1 потенцирование инспираторной моторной активности у новорожденных крыс in Vitro”. Журнал физиологии592 (Pt 14): 3089-3111.

Ангелова, П. Р. и др., 2015. “Функциональная чувствительность астроцитов к кислороду”. Журнал неврологии35(29):10460-73.

Антунес, Вагнер Р., Вальдир А. Брага и Бенедито Х. Мачадо. 2005. “Вегетативные и дыхательные реакции на микроинъекцию атф в промежуточное или хвостовое ядро tractus solitarius в рабочем препарате сердце – ствол мозга крысы”.Клиническая и экспериментальная фармакология и физиология(2005)32,467-472.

Бейлисс, Д.А., Барханин, Дж., Гестро, К. и Гайенет, П.Г. (2015). Роль рН-чувствительных целевых каналов в центральной респираторной хеморецепции. Арка Пфлюгерса, 467, 917-929.

Берридж, Майкл Дж. 2002. “Эндоплазматический ретикулум: многофункциональная сигнальная органелла”. Клеточный кальций32 (5-6):235-49.

Берридж, штат Мэриленд, 1998 год. “Нейронная кальциевая сигнализация”. Нейрон21:13-26.

Билмен, Дж. Дж., Л. Л. Вуттон и Ф. Микеланджели. 2002. “Механизм ингибирования Ca2 +-АТФазы Сарко / эндоплазматического ретикулума паксиллином”. Архив биохимии и биофизики406(1):55-64.

Биско, Т. Дж., М. Р. Дюшен, Д. А. Эйснер, С. К. О'Нил и М. Вальдеолмиллос. 1989. “Измерения внутриклеточного Ca2+ в диссоциированных клетках I типа сонного тела кролика”. Журнал физиологии416:421-34.

Бисгард, Г. Э., Х. В. Форстер и Дж. П. Кляйн, 1980. “Восстановление функции периферических хеморецепторов после денервации у пони”. Журнал прикладной физиологии49(6):964-70.

Брэди, Джун П., Рафаэль Де Иа и Торре Вердуско. 1975. “Возраст на Венти...” 55(5).

Брага, Валдир а и др., 2007. “Участие L-глутамата и АТФ в нейротрансмиссии симпато-возбуждающего компонента хеморефлекса в спаечном ядре солитарного тракта бодрствующих крыс и в подготовке рабочего сердца к стволу головного мозга”. Журнал физиологии581 (Pt 3): 1129-45.

Брелидзе, Тинатин И. и Карл Л. Маглеби. 2005. “Исследование геометрии внутреннего преддверия каналов BK с помощью сахаров”. Журнал общей физиологии126(2):105-21.

Бреннер, Роберт и др., 2005. “Субъединица бета-4 канала BK снижает возбудимость зубчатой извилины и защищает от судорог височной доли”. Nature Neuroscience8(12):1752-59.

Браун, д.А. и П. Р. Адамс. 1980. “Мускариновое подавление нового чувствительного к напряжению тока K + в нейроне позвоночных”. Природа283(5748):673-76.

Браун, Д. А., А. К. Филиппов и Э. А. Барнард. 2000. “Ингибирование калиевых и кальциевых токов в нейронах молекулярно определенными рецепторами P2Y”. Журнал вегетативной нервной системы81(1-3):31-36.

Браун, Дэвид А. и Гейл М. Пассмор. 2009. “Нейронные каналы KCNQ (Kv7)”. Британский журнал фармакологии156(8):1185-95.

Бугрим, А. Э. 1999. “Регуляция высвобождения Ca2+ цАМФ-зависимой протеинкиназой. Механизм передачи сигналов кальция, специфичных для агонистов?” Клеточный кальций25(3):219-26.