Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях

Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях

ПРИНЦИП

Спектроскопия (или спектрофотометрия) в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях основана на способности атомов, молекул и ионов поглощать свет с определенными длинами волн в УФ (примерно 180−400 нм) и видимом (примерно 400−800 нм) диапазонах. Это поглощение связано с изменениями энергии электронов в виде временных переходов электронов в возбужденное состояние на орбитали с более высокой энергией. Поскольку каждый энергетический уровень молекулы или молекулярного иона также имеет соответствующие колебательные и вращательные подуровни, это приводит к множеству разрешенных переходов, которые, как правило, невозможно разделить, в результате чего образуются полосы поглощения, а не четкие линии. Эти полосы
характерны для функциональных групп и связей в молекуле.

Проведение спектроскопических измерений в УФ и видимой областях предполагает воздействие на образец светом и измерение ослабления и/или рассеяния возникающего (проходящего или отраженного) света либо при одной длине волны, либо при определенном диапазоне длин волн.

ПРИМЕНЕНИЕ

Спектроскопия в УФ и видимой областях традиционно используется для количественного и качественного анализа жидких образцов, но также подходит для твердых и газообразных анализируемых веществ и может применяться и для других целей, например, определения физических или химических свойств.

Спектроскопия в УФ и видимой областях, описанная в настоящей главе, может применяться различными способами:

− если фармакопейная статья или общая глава содержат ссылку на настоящую главу, требования, описанные в соответствующих параграфах настоящей главы, являются обязательными;

− если метод используется для детектирования в хроматографических системах, согласно описанию в общей главе 2.2.46, требования, перечисленные в соответствующих параграфах настоящей главы, являются обязательными;

− если метод используется в качестве инструмента процессной аналитической технологии (PAT), и способы применения для PAT сопоставимы со способами применения, описанным в настоящей главе, применяются положения настоящей главы; если способы применения для PAT отличаются от описанных в настоящей главе, то используются те же принципы, однако критерии устанавливаются с учетом предполагаемой цели анализа и с использованием подхода, основанного на оценке риска.

ОБОРУДОВАНИЕ

Спектрофотометры, используемые для проведения измерений в УФ и видимой областях, обычно состоят из:

− подходящего источника света (например, дейтериевой лампы для УФ диапазона, галоген-вольфрамовой лампы для видимого диапазона или ксеноновой лампы для покрытия всего УФ-видимого диапазона); Спектрофотометры, работающие в диапазоне УФ и видимого спектров, часто имеют 2 источника;

− монохроматор, например, решетчатый;

− другие оптические компоненты, такие как линзы или зеркала, которые направляют свет через прибор и которые также могут использоваться для получения более одного луча света, например, в двухлучевых спектрофотометрах, в отличие от однолучевых спектрофотометров;

− контейнер для проб, держатель или устройство для отбора проб; например, обычные кюветы, волоконно-оптические зонды и иммерсионные пропускающие ячейки (например, из высокочистого кварца или сапфира, прозрачных в УФ и видимом диапазонах); выбор зависит от предполагаемого применения, при этом особое внимание уделяется их пригодности для типа анализируемого образца;

− одноканальный (например, фотоумножитель, фотодиод) или многоканальный детектор (например, фотодиодная матрица (ФДМ) или прибор с зарядовой связью (ПЗС));

− подходящие компьютеризированные системы обработки и оценки данных.

Контроль кювет. Для настольных приборов используются кюветы или ячейки с определенной длиной пути. Они могут быть сделаны из разных материалов, например, из кварца или стекла. Погрешность длины пути для кварцевых и стеклянных кювет составляет ± 0,5% (например, ± 0,005 см для кюветы с толщиной слоя 1 см). Можно также использовать пластиковые кюветы, но интервал допуска для них шире, поэтому их использование должно быть тщательно обосновано и основано на оценке риска.

Для проверки чистоты оптических окон кювет и любых значительных различий в их толщине или параллельности может применяться следующий метод: заполняют кювету водой R и измеряют ее кажущуюся оптическую плотность против воздуха при 240 нм для кварцевых кювет и при 650 нм для стеклянных кювет; поворачивают кювету в держателе на 180 ° и снова измеряют кажущуюся оптическую плотность на той же длине волны.

При использовании сканирующих приборов рекомендуется сканировать интересующую оптическую область.

При использовании двухлучевых спектрофотометров необходимо принимать меры (например, по подбору кювет), гарантирующие, что любое различие в оптической плотности кювет не окажет значительного влияния на выполняемый анализ.

Критерии приемлемости:

− кажущаяся оптическая плотность не превышает 0,093 для кварцевых кювет с толщиной слоя 1 см (УФ область) и 0,035 для стеклянных кювет с толщиной слоя 1 см (видимая область);

− оптическая плотность, измеренная после вращения (180 °), не отличается более чем на 0,005 от ранее полученного значения.

ИЗМЕРЕНИЯ

Режим пропускания. Режим пропускания обеспечивает измерение коэффициента пропускания (T) при заданной длине волны в УФ и видимом диапазоне для образца, помещенного между источником света и детектором. Коэффициент пропускания − это отношение интенсивности проходящего света к интенсивности падающего света, которое определяется следующим уравнением:

T = I

I0

I = интенсивность проходящего излучения;

I0 = интенсивность падающего излучения.

Спектр может быть получен путем построения графика изменения коэффициента пропускания (T) или оптической плотности (A) в зависимости от длины волны.

Оптическая плотность представляет собой десятичный логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания для монохроматического излучения. Это безразмерная величина, выражаемая в единицах оптической плотности (AU) и определяемая следующим уравнением:

Согласно закону Бера-Ламберта, который применяется к прозрачным разбавленным растворам, при отсутствии мешающих физико-химических факторов оптическая плотность (A) пропорциональна длине пути (l) излучения, проходящего через образец, и концентрации (c) вещества в растворе в соответствии со следующим уравнением:

A = εcl

ε = молярный коэффициент поглощения, выраженный в литрах на моль на сантиметр;

c = молярная концентрация вещества в растворе, выраженная в молях на литр;

l = длина пути поглощения, выраженная в сантиметрах.

Удельный показатель поглощения вещества обычно используется в фармакопейных статьях и связан с оптической плотностью (A) следующим образом:

A = ⨉ cm ⨉ l

cm = массовая концентрация вещества в растворе, выраженная в граммах на 100 миллилитров.

Величина представляет собой удельный показатель поглощения растворенного вещества и показывает оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл (или 1 % (м/об)) в кювете или ячейке с толщиной слоя 1 см, и измеряется при определенной длине волны. Величины и ε связаны отношением:

=

Mr = относительная молекулярная масса.

Коэффициент пропускания или оптическая плотность обычно измеряются для жидкостей (дисперсий и растворов), но также могут измеряться для твердых веществ (включая таблетки и капсулы). При проведении измерений для твердых веществ используется подходящее устройство для проб. Испытания для жидких образцов проводятся с использованием ячейки или кюветы с подходящей длиной пути (как правило, 0,01−1 см), изготовленных из материала, прозрачного в УФ и видимом диапазонах, или с помощью волоконно-оптического зонда подходящей конфигурации, погруженного в жидкость.

Режим диффузного отражения. Режим диффузного отражения обеспечивает
измерение коэффициента отражения (R), который определяется следующим
уравнением:

R = I

I0

I = интенсивность света, отраженного от образца и/или рассеянного образцом;

I0 = интенсивность света, отраженного от холостой пробы или стандартной отражающей поверхности и/или рассеянного холостой пробой или стандартной отражающей поверхностью.

В зависимости от химического состава и физических характеристик образца УФ и видимое излучение может поглощаться при прохождении через образец. В режиме диффузного отражения детектор измеряет непоглощенное излучение, которое частично отражается и/или рассеивается образцом. Спектры отражения в УФ и видимой областях обычно получают путем вычисления и построения графика log10(1/R) как функции длины волны.

Этот режим измерения обычно выбирают для твердых веществ. Образец исследуют либо в подходящем устройстве (например, держателе образца), либо при прямом контакте с зондом. В целях мониторинга процесса образец может анализироваться через интерфейс с полированным окном (например, из кварца или сапфира) или в потоке с помощью зонда. Необходимо следить за тем, чтобы условия измерения были как можно более воспроизводимыми для разных образцов.

Эксплуатация оборудования. Приведенные ниже факторы влияют на спектральную чувствительность и всегда должны приниматься во внимание.

Выбирают режим измерения, соответствующий предполагаемому применению, а также типу образца.

Определяют условия проведения измерений с учетом размера образца и используемого пробоотборного зонда таким образом, чтобы получить удовлетворительное отношение сигнал/шум (например, размер луча, время измерения и количество измерений). Для сканирующих спектрофотометров также выбирают диапазон сканирования, скорость сканирования и ширину спектральной щели, которые обеспечивают необходимое оптическое разрешение для предполагаемого применения без потери требуемого отношения сигнал/шум или линейности аналитического метода. При использовании спектрофотометров с матричными датчиками нет необходимости регулировать размер луча, диапазон сканирования, скорость сканирования или ширину спектральной щели, поскольку оптическое разрешение обычно является фиксированным, и всегда записывается полный спектр.

Перед измерением оптической плотности необходимо установить или определить нулевое значение оптической плотности (провести коррекцию базовой линии) для интересующих длин волн или в соответствующем диапазоне длин волн.

В случае с PAT при измерении движущихся материалов или образцов следует убедиться, что датчик не загрязнен (например, отсутствует контаминация или скопление материала).

Если в фармакопейной статье не указано иное, оптическую плотность измеряют, используя длину пути 1 см на заданной длине волны. Если в фармакопейной статье дано одно значение положения максимума или минимума поглощения, пользователь должен определить положение длины волны. Полученное значение не должно отличаться от указанного более чем на ± 2 нм, если не указано иное.

Следует избегать количественных измерений, основанных на значениях оптической плотности выше 2,0.

Коррекция фона. Выбирают подходящую холостую пробу для спектроскопического анализа (например, воздух, холостой растворитель, твердое вещество). Если не указано иное, все измерения проводятся путем сравнения с одним и тем же растворителем или одной и той же смесью растворителей (холостой пробой).

Проводят измерения для холостой пробы и испытуемого образца за короткий промежуток времени либо параллельно в двухлучевых спектрофотометрах, либо последовательно в однолучевых спектрофотометрах. Значения оптической плотности холостой пробы и испытуемого образца должны находиться в рабочем диапазоне прибора, указанном производителем.

Для настольных приборов оптическая плотность растворителя, измеренная против воздуха при указанной длине волны, не должна превышать 0,4 и, желательно, чтобы она была менее 0,2.

Для хроматографических систем в качестве значения холостой пробы может использоваться коэффициент пропускания подвижной фазы.

В некоторых проектах PAT бывает невозможно удалить зонд для сбора фоновых данных. Следовательно, необходимо рассмотреть различные варианты, включая использование внутренних эталонов, измерение холостой пробы с использованием второго детектора и т. д. Прямое сравнение возможно только для тех спектров, которые были получены путем измерений в сравнении с холостой пробой с одинаковыми оптическими свойствами.

При измерении коэффициента отражения наиболее часто используются такие контрольные образцы отражения, как керамика, фторполимеры, такие как политетрафторэтилен (ПТФЭ), и порошки, такие как сульфат бария (BaSO4) и оксид магния (MgO), но также могут использоваться другие подходящие материалы.

МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА СПЕКТРАЛЬНЫХ ДАННЫХ

В случае проведения анализа на одной длине волны для определения концентрации неизвестного образца (например, согласно указаниям в фармакопейных статьях), математическая обработка заключается в определении регрессии фотометрических показаний (оптической плотности) по отношению к концентрации стандартных образцов.

В случае полнодиапазонных спектров может понадобится обработка данных как для режима диффузного отражения, так и для режима пропускания, до начала разработки модели классификации или калибровки. Это может быть необходимо, например, для уменьшения дрейфа базовой линии или коррекции рассеяния, вызванного изменениями размера частиц в твердых образцах. Например, спектры производных первого, второго и более высокого порядков обычно могут использоваться для улучшения разрешающей способности или чувствительности. Эта предварительная обработка может быть полезна для упрощения данных и, таким образом, уменьшения вариаций, которые могут повлиять на применяемые впоследствии математические модели.

Широкий спектр методов обработки, таких как масштабирование, сглаживание, нормализация и дериватизация, могут применяться по отдельности или в комбинациях. Более подробная информация представлена в общей главе 5.21. «Хемометрические методы, применяемые к аналитическим данным».

КОНТРОЛЬ РАБОТЫ ОБОРУДОВАНИЯ

Рабочие характеристики спектрофотометра контролируются (автоматически или вручную) через регулярные промежутки времени, предписанные системой менеджмента качества и продиктованные использованием оборудования и способами его применения. Например, оборудование, подверженное колебаниям температуры и влажности, может нуждаться в более частых проверках рабочих характеристик.

Требования к контролю рабочих характеристик оборудования для различных режимов измерения приведены в Таблице 2.2.25.-1. При необходимости могут проводиться дополнительные приведенные испытания.

Точность длины волны, точность и линейность оптической плотности контролируются с использованием либо сертифицированных эталонных материалов, таких как твердые фильтры или жидкие фильтры в соответствующих герметичных ячейках, либо растворов, приготовленных в лаборатории, как описано ниже.

Таблица 2.2.25.-1. – Минимальный перечень испытаний, которые должны выполняться для контроля рабочих характеристик оборудования

Контроль точности длины волны. Контролируют точность длины волны соответствующего количества полос в предполагаемом спектральном диапазоне с использованием одного или нескольких стандартных образцов; например, используют твердые или жидкие фильтры (например, раствор перхлората гольмия R) для проверки положения полос поглощения или измеряют излучение от источника света, чтобы проверить положение линии излучения. В таблице 2.2.25.-2 приведены примеры длин волн, используемых для проверки точности длины волны. При использовании сертифицированных стандартных образцов длина волны сравнения указана в соответствующем сертификате.

В некоторых приборах может быть автоматическая или встроенная функция контроля точности длины волны.

Таблица 2.2.25.-2. Примеры длин волн, используемых для контроля точности длины волны

* Примечание: длина волны зависит от разрешающей способности прибора.

Для хроматографических систем также можно контролировать точность длины волны путем измерения оптической плотности раствора 0,05 мг/мл кофеина R в метаноле R; максимум поглощения достигается при 272 нм, а минимум − при 244 нм.

Критерии приемлемости

Рекомендуется тестировать не менее 2 длин волн, которые ограничивают предполагаемый спектральный диапазон.

Для настольных приборов погрешность измерения точности длины волны при спектроскопии в УФ и видимой областях в кюветах составляет ± 1 нм при длинах волн ниже 400 нм и ± 3 нм при длинах волн 400 нм и выше.

Для хроматографических систем погрешность измерения точности длины волны составляет ± 2 нм для всего диапазона УФ и видимого излучения.

Для PAT рекомендуется погрешность ± 2 нм для диапазона УФ и видимого излучения. Однако для некоторых проектов PAT могут быть необходимы более широкие интервалы погрешности, и в этом случае необходимая точность длины волны должна определяться пользователем в зависимости от предполагаемой области применения и с использованием подхода, основанного на оценке риска.

Параметры прибора (особенно входная оптика, например, ширина щели или диаметр оптического волокна) влияют на разрешающую способность и должны быть такими же, как те, которые предназначены для реальных измерений.

Контроль точности оптической плотности. Контролируют точность оптической плотности при соответствующем количестве длин волн в предполагаемом спектральном диапазоне, используя подходящие твердые или жидкие фильтры, чтобы убедиться, что оптическая плотность, измеряемая на определенной длине волны, соответствует оптической плотности, указанной в сертификате фильтра, или значению оптической плотности, рассчитанному на основе указанного в сертификате удельного показателя поглощения. Может использоваться стандартный образец никотиновой кислоты CRS, предназначенный для квалификации оборудования.

Рекомендуется проверять точность оптической плотности на выбранных длинах волн, используя один или несколько твердых или жидких фильтров с разными уровнями оптической плотности. Следует, как минимум, проверить значения на двух примерных границах ожидаемого диапазона оптической плотности.

Для хроматографических систем и для PAT проверка абсолютной погрешности оптической плотности может не потребоваться при условии, что проводятся надлежащие измерения с использованием стандартной кривой.

Для измерений с использованием стандартного образца никотиновой кислоты CRS, предназначенного для квалификации оборудования, используется сертифицированный удельный показатель поглощения, приведенный в соответствующем информационном листке.

Раствор никотиновой кислоты можно быть приготовлен следующим образом: растворяют 57,0-63,0 мг стандартного образца никотиновой кислоты для квалификации оборудования CRS в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, приготовленном из хлористоводородной кислоты R, и доводят до 200,0 мл тем же раствором кислоты; доводят 2,0 мл полученного раствора до 50,0 мл тем же раствором кислоты для получения итоговой концентрации в 12 мг/л. Эти объемы можно менять для получения растворов никотиновой кислоты с другими концентрациями (примерно до 40 мг/л) с целью проверки различных уровней оптической плотности. Измеряют оптическую плотность при 213 нм и 261 нм.

Критерии приемлемости

Разница между измеренной оптической плотностью и оптической плотностью сертифицированного материала составляет ± 0,010 или ± 1% (в зависимости от того, какая из этих величин больше) для каждой проанализированной комбинации длины волны и оптической плотности (относится к значениям оптической плотности не более 2). Погрешности для более высоких значений оптической плотности следует определять на основе оценки риска.

Контроль фотометрической линейности. Контролируют фотометрическую линейность в предполагаемом спектральном диапазоне. В УФ диапазоне можно использовать фильтры, используемые для контроля точности оптической плотности, а также растворы никотиновой кислоты или кофеина. В видимом диапазоне можно использовать фильтры из нейтрального стекла. Перед проведением испытания необходимо убедиться, что оптическая плотность стандартных образцов соответствует предполагаемому линейному диапазону.

Можно использовать растворы с возрастающими концентрациями (например, 5-40 мг/л) стандартного образца никотиновой кислоты для квалификации оборудования CRS в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, приготовленном из хлористоводородной кислоты R. Оптическую плотность измеряют при 213 нм и 261 нм.

Для хроматографических систем также можно выполнять проверку фотометрической линейности с использованием растворов 0,5-50 мг/л кофеина R в воде для хроматографии R. Оптическую плотность измеряют при 273 нм.

Критерий приемлемости

Коэффициент детерминации (R²) не менее 0,999.

Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет определяется на подходящей длине волны с использованием подходящих твердых или жидких фильтров или растворов, приготовленных в лаборатории. Параметры прибора, используемые для проведения испытания, такие как ширина щели и тип источника света (например, дейтериевая или вольфрамовая лампа), должны быть такими же, как те, которые предназначены для реальных измерений.

Критерий приемлемости

Критерий приемлемости зависит от используемых фильтров или растворов, например:

– оптическая плотность составляет не менее 3,0 при использовании раствора 10 г/л йодида натрия R при 220 нм, раствора 10 г/л йодида калия R при 250 нм или раствора 50 г/л нитрита натрия R при 340 нм и 370 нм;

– оптическая плотность составляет не менее 2,0 при использовании раствора 12 г/л хлорида калия R при 198 нм.

Эти значения действительны при использовании ячейки с толщиной слоя 1 см и воды R в качестве раствора сравнения.

Контроль разрешающей способности. Если есть указание в фармакопейной статье, определяют разрешающую способность прибора либо с использованием подходящих сертифицированных стандартных образцов, либо путем записи спектра 0,02 % (об/об) раствора толуола R в гексане R или гептане R, используя, соответственно, гексан R или гептан R в качестве раствора сравнения.

Критерий приемлемости

Для измерений, проводимых для раствора, приготовленного согласно приведенным выше инструкциям, минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указано в фармакопейной статье.

ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ

Перед проведением измерений для образца могут потребоваться испытания на пригодность системы для проверки критических параметров, которые могут повлиять на результат.

Эти испытания могут охватывать точность длины волны, точность оптической плотности, рассеянный свет и фотометрическую линейность. Испытания функциональных возможностей системы, например те, которые выполняются в процессе автотестирования прибора, могут считаться частью испытаний на пригодность системы.

В случае с хроматографическими системами с детектированием в УФ и видимой областях применяются дополнительные испытания на пригодность системы, если это предписано в фармакопейной статье и/или в общей главе 2.2.46. «Хроматографические методы разделения».