Динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование для анализа отличающихся по заряду компонентов биофармацевтических препаратов

Динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование для анализа отличающихся по заряду компонентов биофармацевтических препаратов

нализ отличающихся по заряду вариантов терапевтических белков очень важен для описания характеристик и отслеживания показателей качества антител. Разные заряды — результат дезамидирования, образования N-концевого пироглутамата, агрегации, изомерных превращений, сиалилирования гликанов, фрагментации антител и гликирования по остаткам лизина. Иногда такие изменения отражаются на связывании, биологической активности и сроке хранения препарата, а также на безопасности пациентов. В биофармацевтической отрасли для определения характеристик компонентов, отличающихся по заряду, используют такие средства, как ионообменная хроматография (ИОХ), гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (ИЭФ) и его капиллярные эквиваленты, такие как капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ) и динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование (дКИЭФ). Динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование, благодаря своей высокой разрешающей способности, минимальному количеству времени на разработку метода, меньшим объемам образца и короткому времени выполнения, играет важную роль в разработке биофармацевтических препаратов. Перечисленные преимущества позволяют применять данную технику анализа для всех связанных с фармацевтическим препаратом процессов — от культивирования и оптимизации линии клеток до контроля качества (КК) и стабильности препарата перед выпуском в продажу. В этой статье описывается использование данной техники в рамках КК и определения характеристик лекарственного препарата и процесса его производства. Основное внимание в статье уделяется уникальным преимуществам дКИЭФ для анализа конъюгатов препарат-антитело. Кроме того, в ней наглядно проиллюстрировано, какими возможностями для оценки изменений технологического процесса обладает дКИЭФ. А в конце приводится подробное описание инновационной техники — изучения характеристик полученного с помощью дКИЭФ профиля средствами масс-спектрометрии.

ЦЕЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ: МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА И КОНЪЮГАТЫ

ЦЕЛЕВОЙ ПРОЦЕСС:

ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА

ЦЕЛЕВАЯ АУДИТОРИЯ: ЛИЦА, ОТВЕЧАЮЩИЕ ЗА ОБЕСПЕЧЕНИЕ / КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА, РАЗРАБОТКУ АНАЛИЗА/ПРОЦЕССА

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЦЕССА, ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК, ЗНАЧЕНИЯ PI, СТАБИЛЬНОСТЬ, ИСПЫТАНИЯ ПРИ ВЫПУСКЕ ПАРТИЙ

УРОВЕНЬ СЛОЖНОСТИ: СРЕДНИЙ

ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ТЕХНОЛОГИЕЙ дКИЭФ

Основным средством для изучения зависящих от заряда характеристик структуры и механизмов деградации биофармацевтического препарата, для проведения испытаний при выпуске партий препарата и для контроля его стабильности была и остается ионообменная хроматография. Но, хотя она все еще является полезной техникой для анализа основанной на заряде гетерогенности, вариабельность, характерная партиям колонок, и недостаток разрешающей способности и робастности для проведения в рабочем порядке анализов отдельных антител наводят на мысль о необходимости альтернативных методов анализа. Динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование получает признание и все чаще применяется для определения характеристик электрофоретической гетерогенности белков и экспериментального определения изоэлектрической точки (pI) [2].

Разделение совокупностей антител с помощью ионообменной хроматографии основано в первую очередь на поверхностном заряде гидрофильных остатков и часто сопровождается значительным нежелательным гидрофобным взаимодействием. Динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование, напротив, представляет собой технику, которая с высокой разрешающей способностью разделяет вещества в первую очередь на основании присущего pI молекулы суммарного заряда. При этом учитываются находящиеся на поверхности и внутренние аминокислоты, а разрешение не ухудшается из-за гидрофобных взаимодействий.

Разделение с помощью дКИЭФ осуществляется путем фокусирования изоформ в амфолитическом градиенте pH под воздействием приложенного электрического поля. После фокусирования проводится детектирование, которое при проведении стандартного КИЭФ потребовало бы мобилизации белков в сторону неподвижного УФ-детектора с помощью химической реакции или под действием разности давлений [4]. Недостаток этапа мобилизации в том, что он не только удлиняет время выполнения процедуры, но и добавляет параметр оптимизации и может ухудшить изначально высокое разрешение, полученное на этапе фокусирования. Уникальное преимущество динамического КИЭФ над стандартным заключается в отсутствии этапа мобилизации. Детектирование осуществляется путем непрерывного сканирования по всей длине капилляра. Это позволяет пристально следить за УФ-излучением в течение этапа фокусирования, после чего моментально получается готовый профиль отличающихся по заряду вариантов без необходимости мобилизации [5]. Поскольку этап мобилизации пропускается, профиль отличающихся по заряду вариантов можно записать с самым высоким из возможных разрешением, затратив на анализ рациональное количество времени — 15-20 минут.

ПРИМЕНЕНИЕ В РАМКАХ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

Оценка распределения отличающихся по заряду компонентов — ключевой аспект мониторинга однородности и стабильности разных партий лекарственного препарата.

Профили заряда чувствительны к изменениям процесса и часто встречающимся механизмам деградации, поэтому регуляторные органы обычно требуют, чтобы в список испытаний при выпуске препарата включали количественное определение компонентов с разными зарядами. С точки зрения контроля качества, дКИЭФ — перспективная альтернатива ионообменной хроматографии, поскольку обладает рядом преимуществ над традиционными хроматографическими методами.

Обладая подобными или лучшими разрешением и прецизионностью, дКИЭФ позволяет осуществлять разделение быстрее и часто с более высокой робастностью. Для КК, при котором выявление и устранение проблем может быть довольно трудоемкой задачей в силу строгих требований к документации, особенно востребован метод, обладающий высокой надежностью и подходящий для целевого назначения.

Использование дКИЭФ в рамках КК уже обсуждалось в нескольких недавних статьях [2, 3]. Применив ИОХ для типичного образца рекомбинантного моноклонального антитела (rMAb), З.Сошич с соавт. [2] показали, что обнаруженные дКИЭФ изоформы белка коррелируют с гетерогенностью по заряду. Они подробно описали аттестацию метода дКИЭФ в контексте КК для проведенного ими количественного анализа электрофоретической гетерогенности rMAb и мониторинга стабильности белка. Исследователи установили, что внутрилабораторная прецизионность определения изоэлектрической точки (pI) пика определяемого компонента составила ≤ 0,2 % относительного стандартного отклонения (RSD), а значения площадей пиков кислых, определяемых и основных компонентов в относительных процентах были воспроизводимы в рамках 1,9, 0,9 и 16,6 % RSD, соответственно. Они пришли к заключению, что при КК количественное определение с помощью дКИЭФ является подходящей альтернативой ионообменной хроматографии и отличается быстротой разработки метода и проведения анализа, а также позволяет обработать большое количество образцов.

Значения pI в большинстве случаев определяются с достаточной специфичностью, чтобы служить в системе контроля проверкой подлинности и количественным определением. Как следствие, с помощью метода дКИЭФ может выполняться двойная задача: определение подлинности препарата и количественное определение чистоты вещества для КК при выпуске.

АНАЛИЗ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛО-ПРЕПАРАТ

Конъюгаты антитело-препарат — новый класс терапевтических белков, состоящих из нацеленных моноклональных антител, связанных ковалентной связью (с помощью расщепляемого под действием ферментов линкера) с малой цитотоксичной молекулой, такой как монометил ауристатин Е (ММАЕ) [6]. В результате такой нацеленной доставки лекарственного средства конъюгаты антитело-препарат избирательно связываются с клетками опухоли, которые в избыточном количестве экспрессируют целевой антиген, и убивают их, в то же время токсичность для нормальных, здоровых тканей ограничивается.

Хотя ионообменная хроматография и применима для определения характеристик отличающихся по заряду вариантов антител, она не подходит для анализа или фракционирования конъюгатов антитело-препарат. Из-за того, что в них присутствуют вещества, предотвращающие или тормозящие процесс деления клеток, их гидрофобность выше, чем у неконъюгированных антител. Поэтому отличающиеся по заряду варианты конъюгатов антитело-препарат плохо поддаются разделению с помощью хроматографических методов (вероятно, из-за взаимодействия с неподвижной фазой).

Динамическое капиллярное изоэлектрическое фокусирование — более подходящая техника для оценки гетерогенности конъюгатов антитело-препарат по заряду. Механизм разделения этой техники электрофореза основывается в первую очередь на разнице изоэлектрических точек вариантов белка, отличающихся по заряду. На рис.1 показан потенциал дКИЭФ для выявления общего распределения зарядов конъюгатов антитело-препарат. На электрофореграмме между маркерами pI 7,6 и 9,7 видны различные изоформы конъюгата антитело-препарат. Значения pI пиков конъюгата антитело-препарат (по оси абсцисс) были вычислены с помощью калибровки по двум точкам с маркерами изоэлектрических точек.

У пика определяемого компонента, или формы конъюгата антитело-препарат с лизином в положении 0 (0-Lys), явная изоэлектрическая точка — 9.2. Более щелочные молекулы с одним или двумя остатками лизина на C-концах тяжелой цепи полностью, до нулевой линии, разделены друг от друга и от пика определяемого вещества. Также перед пиком 0-Lys наблюдались кислые варианты.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ПРОФИЛЯ В ПОДДЕРЖКУ РАЗРАБОТКИ ПРОЦЕССА

Определение характеристик и идентификация пиков профилей, полученных с помощью дКИЭФ, очень важны для понимания распределения изоформ препарата, отличающихся по заряду, и того, как они влияют на биологическую активность. Изучение характеристик профилей, полученных таким образом, также позволяет лучше понять механизмы деградации.

Чтобы воспользоваться дКИЭФ для определения характеристик, обязательно изолируют неизмененный белок, отделенный по изоэлектрической точке, и тщательно изучают его характеристики с помощью ортогональных техник, таких как обращенно-фазовая ЖХ, совмещенная с масс-спектрометрией (МС). Однако, как и со многими техниками на базе КЭ, определение характеристик в рабочем порядке с помощью данного подхода имеет ограничения, связанные с фракционированием образца непосредственно из капилляра или прямым линейным сопряжением с МС-детектированием. Хотя в некоторых случаях фракционирование с помощью ионообменной хроматографии может быть полезно, подготовительная ионообменная хроматография часто дает фракции низкой чистоты из-за различий, связанных с разделением в смешанном режиме. Это усложняет определение характеристик отдельных пиков профиля, полученного с помощью дКИЭФ.

Чтобы решить проблемы, возникающие при автономном изучении характеристик с помощью дКИЭФ, в некоторых аналитических лабораториях активно ищут альтернативные подготовительному изоэлектрическому фокусированию методы, используя приборы, которые появились около 20 лет назад. Эти альтернативы представлены системой для проведения подготовительного изоэлектрического фокусирования «Bio-Rad Rotofor» [7–10] и прибором для безгелевого фракционирования «Agilent 3100 OFFGEL» [11–13], которые служат для изоэлектрического фокусирования белков в растворе. Каждая из названных платформ обладает уникальными достоинствами. В методе с системой «Rotofor» изоэлектрическое фокусирование в жидкой среде (или в свободном растворе) используется для занимающего всего несколько часов разделения больших количеств белка в одной камере. Фракционатор «OFFGEL» позволяет за 24–48 часов провести разделение белка, одновременно совмещая извлечение из жидкой фазы и работу с пластинами геля с иммобилизованным градиентом pH на двух планшетах с 8 дорожками (с 12 или 24 лунками на дорожке). После этапа фокусирования специалист, проводящий анализ, может путем простой замены буфера или очистки с белком А извлечь из раствора амфолита неизмененные изоформы, с высокой степенью очистки и повышенным содержанием. Пока такие новые технологии, как электрофорез в свободном потоке [14–16], не получат стабильного коммерческого распространения, методы с использованием приборов «Rotofor» и «OFFGEL» продолжат быть простым в использовании основанным на растворах способе разделения для фракционирования неизмененных белков по их изоэлектрическим точкам.

К настоящему времени в исследованиях протеомики платформы для подготовительного ИЭФ применяются для разделения цельноклеточных белковых экстрактов и комплексных пептидных смесей в рабочем порядке [17–20]. Подобным образом и в биофармацевтической отрасли при разработке препаратов и изучении характеристик рекомбинантных моноклональных антител все еще высоко оценивают эти приборы [21]. Например, ученые из компании «Генинтех» разработали способ подготовительного ИЭФ на платформе «OFFGEL» для изучения характеристик полученных с помощью дКИЭФ профилей ряда терапевтических препаратов. Дж.Чжан с соавт. опубликовали работу об идентифицированной ими изомеризации легких и тяжелых цепей остатков аспартата, которые они сочли основной причиной повышения количества основных вариантов в полученном с помощью дКИЭФ профиле подвергнутого температурному воздействию препарата Fab-фрагментов [1].

Практический пример

В одном неопубликованном исследовании разработка метода подготовительного изоэлектрического фокусирования сыграла решающую роль для понимания и объяснения нового пика, который был замечен в полученном с помощью дКИЭФ профиле. В исследовании изучались характеристики нескольких партий стандартного рекомбинантного моноклонального антитела на стадии клинической разработки. Во время анализа в обрабатываемой партии, в которую перед сбором клеток был добавлен цистин, с помощью дКИЭФ был обнаружен новый кислый пик (~ 3 % от общей площади пиков). Результаты сравнили с контрольным образцом, который был изготовлен без добавления цистина (рис. 2а). Поскольку разделение с помощью ионообменной хроматографии не удалось оптимизировать для получения достаточного разрешения нового кислого пика, для выделения отличающихся по заряду вариантов изоформы с повышенным содержанием использовали систему «OFFGEL» с оптимизированными условиями, которые определялись на основании большого опыта разделения с помощью капиллярного метода ИЭФ. Совместив смесь амфолитов с узким интервалом pH и соответствующую пластину геля с иммобилизованным градиентом узкого интервала pH, исследователи фракционировали отличающиеся по заряду изоформы с повышенным содержанием и степенью чистоты 60–80% (рис. 2b).

При дальнейшей оптимизации разделения с помощью системы «OFFGEL» удалось выделить фракцию, содержащую в 4 раза больше нового кислого варианта, устранив при этом практически все пики определяемого вещества и основные пики (рис. 2c). Впоследствии исследователи проанализировали эту фракцию с помощью масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ЭРИ-МС) и электрофореза с использованием молекулярных сит и микрочипа (КЭ на микрочипе с ДСН) [22–23]. На масс-спектрах отобразились все ожидаемые массы полноразмерного неизмененного белка рекомбинантного моноклонального антитела за исключением двух неизвестных веществ, которых не было в контрольном образце (с массами ~ 23 и 123 кДа). По отношению к ожидаемым фрагментам рекомбинантного моноклонального антитела эти массы соответствовали веществам с цистеинилированной тяжелой-тяжелой-легкой цепью (cys-HHL) и свободной цистеинилированной легкой цепи (cys-LC). По результатам анализа с помощью КЭ на микрочипе с ДСН также подтвердилось повышенное количество пиков фрагментов, соответствующих свободной L-цепи и веществам с HHL-цепью (данные не приводятся). Повышенные количества веществ с cys-HHL-цепью в полученной на приборе «OFFGEL» фракции коррелируют как с предсборовым добавлением цистина, так и с появлением нового кислого пика в профиле, полученном с помощью дКИЭФ. С помощью системы «OFFGEL» и тщательного подбора амфолитов исследователи идентифицировали новый кислый пик и охарактеризовали его как соединенные нековалентной связью ассоциации между формами cys-LC и cys-HHL. Этим примером иллюстрируется важность и эффективность автономных систем фракционирования и их применения в процессе разработки и производства терапевтических антител для идентификации различающихся по заряду изоформ и изучения характеристик профилей, полученных с помощью дКИЭФ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ