Комплексные функциональные эффекты антигена глатирамера ацетата, непосредственно связанные с его составом

19 Рис. 5. Копаксон значительно повышал экспрессию противовоспалительного гена IL1RN (a); обогащенные пути среди основных наборов зондов с модулированием экспрессии генов под действием Копаксона в сравнении с контролем (маннитолом) (b). 4. Обсуждение Т-клетки и антиген-представляющие клетки (АПК) являются двумя ключевыми компонентами, которые вместе с ГА (или аутоантигеном) составляют иммуногенную триаду, отвечающую за антигенное действие ГА. Был проведен комплексный анализ обоих типов клеток, и последующие эксперименты также подтвердили достоверность полученных результатов как с точки зрения технологической платформы (полногеномные профили экспрессии были подтверждены ПЦР в реальном времени), так и с биологической точки зрения (уровни секреции белков подтвердили основные результаты анализа мРНК). В параллельном исследовании с взаимным контролем использовалась животная модель. Анализы на уровне генов и биологических путей позволили идентифицировать известное и новое модулирующее действие ГА, связанное с его терапевтическим эффектом, и позволили обнаружить функционально значимые различия между ГА и препаратом-аналогом Полимунолом, которые могут пролить свет на клинический эффект препаратов у пациентов с рассеянным склерозом. В качестве одного из подходов к моделированию значимых эффектов Т-клеток использовалась система спленоцитов мышей в исследовании с дизайном, основанном на взаимном контроле, что позволило использовать 3 сценария: переход с ГА на Полимунол, переход с Полимунола на ГА и сравнение эффектов от постоянного применения ГА и постоянного применении Полимунола. Система спленоцитов, полученных от иммунизированных мышей, уже доказала свою информативность при изучении механизма действия ГА, а также при установлении различий между на первый взгляд похожими, но по-разному получаемыми глатирамоидами и ГА (Bakshi et al., 2013; Towfic et al., 2014) в сценариях с иммунизацией ГА, а используемый дизайн, основанный на взаимном контроле, существенно увеличивает информативность и специфичность итоговых результатов анализа в отношении уникальных свойств ГА и данных, полученных при сравнении ГА с глатиоамоидами, получаемыми иным образом. В более двух третей наборов зондов с генами, экспрессирующими в селезенке, наблюдалась значительная модуляция экспрессии под действием ГА, и были обогащены многие значимые биологические пути в основных наборах зондов с модуляцией экспрессии в любом из направлений, в том числе это касается иммунного ответа и взаимодействия рецепторов «цитокин-цитокин». Ключевые гены противовоспалительных цитокинов, такие как Il10 и Il4, а также маркеры регуляторных Т-клеток, например, Foxp3 и Gpr83, демонстрировали повышенную экспрессию под действием ГА, в то время как ген провоспалительного цитокина Il12a имел пониженную экспрессию под действием ГА в данной модели системы, что согласуется с переключением иммунного ответа с Th1 на Th2-хелперный путь. Таким образом, настоящие исследования помогают проиллюстрировать комплексность механизма действия ГА и подтверждают надежность экспериментальной системы. 20 Некоторые из этих путей были похожи на пути, наблюдаемые в более раннем исследовании спленоцитов с похожим дизайном (Bakshi et al., 2013), несмотря на то, что в тех исследованиях использовались другие платформы микроматриц (Illumina, а не Affymetrix), другие платформы анализа путей (программное обеспечение Ingenuity Pathway Analysis, а не анализ обогащения путей при помощи программы DAVID), а также другие отрицательные контроли (среда, а не маннитол). К ним относятся повышенная регуляция активации лимфоцитов и пониженная регуляция дифференцировки гематопоэтических клеток. Пониженная регуляция экспрессии как Il18 так и Il18r1 под действием ГА уже отмечалась ранее (Bakshi et al., 2013). В настоящем исследовании в дополнение к известным эффектам был отмечен взаимный эффект для наборов зондов Il18bp (ингибитора IL-18), чья экспрессия повышалась под действием ГА. Тот факт, что Полимунол оказывает систематическое модулирующие действие на Il18, и степень этого действия значительно отличается от действия ГА, вне зависимости от иммунизирующего агента, требует проведения дополнительного исследования, поскольку это может иметь последствия как для безопасности, так и для эффективности препаратов. IL-18 имеет большое значение для дифференцировки Т-хелперных клеток, и уровни концентрации IL-18 выше в сыворотке пациентов, страдающих рассеянным склерозом, по сравнению с группой контроля, а также у пациентов с острой формой заболевания по сравнению с пациентами со стабильной формой заболевания (Nicoletti et al., 2001). IL-18 также индуцирует экспрессию IFNg и задействован в иммунопатогенезе рассеянного склероза (Losy and Niezgoda, 2001). Было также установлено, что аллели гена IL-18 влияют на риск возникновения рассеянного склероза (Karakas Celik et al., 2014; Thompson and Humphries, 2007). Кроме того, мыши, не имеющие гена IL-18, резистентны к экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту (ЕАЕ) (Shi et al., 2000). При сравнении с действием ГА в исследуемой системе Полимунол повышал экспрессию ряда генов, связанных с синтезом интерферона, что подтверждалось как анализом микроматриц, так и ПЦР в реальном времени. На рис. 4с показаны пути продукции интерферона первого типа (Trinchieri, 2010) и отдельно в рамках указаны гены с повышенной регуляцией под действием Полимунола в сравнении с ГА, к которым относятся RIG-I, MDA5 и IRF7. Как отмечалось, повышенная регуляция данных генов согласуется с повышенной продукцией интерферона первого типа. На уровне путей наблюдается обогащение различных связанных с иммунитетом путей среди наборов зондов с различной экспрессией, в том числе путей, участвующих в регуляции иммунных процессов и ответе на вирус, и различная экспрессия наблюдается для множества генов, играющих роль в сигнализации интерферонов (например, приводящих к значительному обогащению пути сигнализации RIG-I-подобных рецепторов), что, вместе взятое, вызывает серьезные опасения, касающиеся безопасности и эффективности. Хронические долгосрочные изменения в экспрессии ключевых генов, вне зависимости от величины кратности изменения, могут оказывать влияние на пути, релевантные для рассеянного склероза. АПК играют ведущую роль в механизме действия ГА, поскольку они презентируют ГА Т-клеткам во время прайминга на периферии и, возможно, опосредуют взаимодействие ГА-специфичных Т-клеток с аутоантигенами в мозге (хотя подобная перекрестная реактивность не является обязательной для положительного эффекта), а также изменяют профиль секреции цитокинов в ответ на действие ГА. ГА стимулирует 21 сдвиг фенотипа моноцитов в направлении противовоспалительного фенотипа 2-го типа, что характеризуется увеличением выработки этими клетками противовоспалительных цитокинов (например, IL-10) и уменьшением образования в них провоспалительных цитокинов (например, IL-12) (Weber et al., 2007). Сотни генов по-разному экспрессируются в моноцитах человека после активации Полимунолом в сравнении с активацией ГА. Противоположная ситуация с отсутствием каких-либо различий наблюдается в параллельных испытаниях трех разных партий ГА, протестированных с ослеплением в этом же эксперименте (таблица 16 в дополнительных материалах). Тот факт, что по-разному экспрессирующиеся гены обогащены в ключевых биологических путях, например, «иммунном ответе», свидетельствует о биологической значимости наблюдаемых различий. Многие из обогащенных путей среди дифференциально экспрессирующихся генов являются релевантными для механизма действия ГА, например, взаимодействие рецепторов «цитокин-цитокин», а также вызывают потенциальные опасения, связанные с безопасностью, например, пути воспалительного ответа и пути ответа на липополисахариды. Путь ответа на липополисахариды также был обогащен среди дифференциально экспрессирующихся генов под действием другого предполагаемого препарата-аналога Пробиоглата (Kolitz et al., 2015). Из 137 обогащенных путей среди основных наборов зондов с повышенной регуляцией под действием Полимунола в сравнении с ГА 37 были обогащены при более раннем сравнении с Пробиоглатом (из 64 путей, наблюдаемых для Пробиоглата). Следует отметить, что использование Пробиоглата в Мексике привело к трехкратному увеличению числа нежелательных явлений и 7-кратному увеличению числа рецидивов (Kolitz et al., 2015). Измерение концентрации белков в клетках линии ТНР-1 подвтердило наличие различий на уровне генов. Секреция белков, связанных с воспалением (в том числе IL-1b, MCP-1, RANTES, Gro-a и MMP-9), была выше после применения Полимунола в сравнении с ГА, что согласуется с данными анализа микроматриц, представленными выше. 22 23 Рис. 6. Действие Полимунола отличается от действия ГА на уровне экспрессии генов. (a) Экспрессия CYP1B1 значительно повышается под действием Полимунола в сравнении с ГА. (b) Значительно обогащенные пути среди наборов зондов с дифференциально экспрессирующимися генами под действием Полимунола и ГА. (c) График рассеяния, показывающий наборы зондов, приводящие к обогащению пути ответа на липополисахарид, среди наборов зондов с повышенной регуляцией под действием Полимунола в сравнении с ГА. Пунктирная линия указывает уровень значимости р с коррекцией  0,05. Глатирамоид Полимунол производства компании Synthon продается в Аргентине (с мая 2014 г.) в качестве предполагаемого клинического эквивалента ГА. Полимунол считается тем же препаратом, который изучался в единственном на сегодняшний день клиническом исследовании, в чьи задачи входила демонстрация эквивалентности на основе данных МРТ (Cohen et al., 2014). Однако данное клиническое исследование (GATE), несмотря на большой объем выборки, ставит ряд важных вопросов, касающихся используемых показателей клинической эффективности. Например, учитывая объем выборки GATE (Копаксон=357, плацебо=84), вероятность обнаружения какого-либо уровня сокращения общегодовой частоты рецидивов (ARR) (т.е., клинической эффективности) для референтного, зарекомендовавшего себя препарата Копаксона при сравнении с плацебо была высока (90%) с учетом данных, полученных в многочисленных предыдущих рандомизированных плацебо-контролируемых исследованиях Копаксона, проведенных различными спонсорами в течение двух последних десятилетий. Однако в исследовании GATE не был обнаружен эффект сокращения ARR для группы Копаксона в сравнении с группой плацебо (что является маловероятным результатом, прогнозируемым только для 10% случаев), что свидетельствует о недостаточной точности и информативности анализа (т.е. возможности отличить эффективный препарат от неэффективного). Кроме того, частота нежелательных явалений, ведущих к прекращению приема препарата, была выше в группе препарата фирмы Synthon, чем в группе Копаксона (12 к 5), что может быть в определенной степени 24 связано с повышением регуляции провоспалительных путей  схожая картина наблюдалась в исследовании препарата-аналога Пробиоглата (Kolitz et al., 2015). Результаты нашего исследования демонстрируют значительные отличия между ГА и Полимунолом на уровнях мРНК, белков и биологических путей. 4.1. Выводы Исследования экспрессии генов, описываемые в настоящей статье, являются источником дополнительной информации о механизме действия ГА и предлагают комплексные данные, полученные с использованием линии клеток моноцитов человека, а также модели спленоцитов мышей, основанной на взаимном контроле. В обоих этих исследованиях используется подход, целью которого является изучение целого генома и объективное рассмотрение всего экспрессионного биочипа в моделях систем, отражающих различия в значимых аспектах действия ГА. В модели спленоцитов мышей используется инновационный дизайн исследования, основанный на взаимном контроле, который позволяет моделировать ситуацию с переходом пациентов с одного глатирамоида на другой, производимый иным образом, а также сравнивать получаемый эффект у пациентов, получавших только ГА, с пациентами, получавшими глатирамоид иного способа производства. Полученные результаты свидетельствуют о комплекности механизма действия ГА, который модулирует тысячи генов в десятках различных биологических путей. Биологические свойства особенно чувствительны к различиям в составе препарата и методе его производства (Weinstein et al., 2015). Были установлены значимые различия между профилями генной экспрессии, модулируемыми препаратом Полимунол, производимым фирмой Synthon, и профилями, модулируемыми под действием ГА, как в моноцитах человека, так и в спленоцитах мышей. Эти данные согласуются со значимыми различиями между ГА и Полимунолом, обнаруженными во множестве физикохимических анализов с использованием передовых технологий (Weinstein et al., 2015). В настоящее время ведется поиск наиболее оптимальных способов определения безопасности и эффективности глатирамоидов, полученных новыми методами, в сравнении с ГА. Приложение А. Дополнительные данные Дополнительные данные к настоящей статье доступны онлайн по ссылке: http://dx. doi.org/10.1016/j.jneuroim.2015.11.020.