Методики анализа на основе нуклеиновых кислот – Подходы к определению следовых количеств нуклеиновых кислот (испытание на содержание остаточной ДНК)

Методики анализа на основе нуклеиновых кислот – Подходы к определению следовых количеств нуклеиновых кислот (испытание на содержание остаточной ДНК)

ВВЕДЕНИЕ

В настоящей главе внимание уделено методикам анализа, применяемым для количественного определения остаточной ДНК в биотехнологических препаратах.

Характеристики процесса и теоретические проблемы безопасности, связанные с производственными примесями, обусловливают необходимость испытания биотехнологических препаратов на содержание остаточной ДНК. Удаление остаточной ДНК из биотехнологического препарата в процессе производства свидетельствует о качестве и стабильности процесса, а также о том, что он хорошо контролируется. Кроме того, клетки, используемые для производства биотехнологических препаратов, могут служить источником целого ряда комплексных, гетерогенных и потенциально небезопасных примесей, включая ДНК клетки-хозяина. Для перевиваемых линий потенциальный риск содержания остаточной ДНК может быть связан с обоими видами ее биологической активности, а именно, инфекционностью и онкогенностью. Инфицирующая способность может быть вызвана присутствием инфекционного вирусного генома в клеточной ДНК клеточного субстрата. Онкогенная активность остаточной ДНК может проявляться в виде возможности индуцировать изменение (трансформацию) нормальной клетки, что в свою очередь может вести к туморогенности. Несмотря на то, что испытания на животных показали, что посторонняя ДНК может вызывать развитие опухолей или инфекций, в настоящее время отсутствует какое-либо научное подтверждение подобных рисков у людей. Для остаточной ДНК, источником которой служат клеточные культуры млекопитающих, может быть допустимо содержание до 10 нг в одной дозе препарата для парентерального введения; однако допустимое содержание остаточной ДНК может варьировать в зависимости от источника такой ДНК и способа введения лекарственного средства. Проблема содержания остаточной ДНК в биотехнологических препаратах может быть решена двумя путями: 1) путем валидации удаления остаточной ДНК в ходе валидации производственного процесса, и/или 2) путем контроля уровней содержания остаточной ДНК в ходе стандартного испытания лекарственного средства. Как правило, допустимый предел содержания остаточной ДНК клеток-продуцентов, полученной из клеточных культур млекопитающих, составляет 10 нг на одну дозу, согласно требованиям регуляторных органов. Предельно допустимое содержание остаточной ДНК может зависеть от ее источника и способа введения препарата, по этой причине спецификации по остаточной ДНК и процедура контроля ее удаления для определенного препарата должны разрабатываться при участии регуляторных органов. Вне зависимости от способа определения содержания остаточной ДНК (в ходе стандартных испытаний лекарственного препарата или в ходе валидации производственного процесса, когда подтверждается удаление ДНК) для этого требуются количественные аналитические методики. Технологии амплификации ДНК, такие как количественная ПЦР, наиболее часто применяют для определения содержания остаточной ДНК ввиду их высокой чувствительности и исключительных преимуществ (например, высокой специфичности). В идеале методика анализа, применяемая для количественного определения остаточной ДНК в биотехнологических препаратах, должна иметь значительно более низкий предел обнаружения, чем уровень содержания ДНК, установленный регуляторными органами для биотехнологических препаратов (как правило, 10 нг/доза). Предпочтительными методиками являются гибридизация, ДНК-связывающий белок и количественная ПЦР, поскольку они отвечают требованию к чувствительности.

Предварительная обработка образцов

Анализ на содержание остаточной ДНК требует точного количественного определения ДНК до пикограммных уровней в миллиграммах (или бОльших единицах) препарата, который может быть представлен в целом ряде матриц. В некоторых случаях образец может быть проанализирован без предварительной обработки с использованием методики анализа с приемлемой прецизионностью и степенью обнаружения. Если сам препарат или иные компоненты образца оказывают влияние на исследуемую пробу, возможно, для устранения такой интерференции будет достаточно развести образец, если при этом указанное содержание ДНК в образце останется в рабочем диапазоне методики анализа. Если разведение образца не приводит к снижению интерференции, может потребоваться применение экстенсивных процедур предварительной обработки образца, например, протеолитического расщепления, химической диссоциации или извлечения (экстрагирования). Может возникнуть необходимость использования комбинации различных этапов предварительной обработки для устранения интерференции до приемлемого уровня. Экстенсивные манипуляции с образцом могут вести к потере ДНК или попаданию ДНК из окружающей среды, что необходимо учитывать при включении одного или нескольких этапов предварительной обработки. Контаминация ДНК из окружающей среды может являться проблемой при использовании методики определения содержания остаточной ДНК, не являющейся специфичной к последовательности.

Для количественного определения содержания остаточной ДНК в белковых образцах может потребоваться только расщепление протеиназой (например, Протеиназа К, Проназа). Также существует вероятность связи ДНК с компонентами образца; для устранения этой связи может быть применена химическая диссоциация (например, с помощью детергентов), что позволит в достаточной степени обнаружить содержание остаточной ДНК. Методы анализа на содержание остаточной ДНК зачастую включают использование белковых реагентов и реагента для химической диссоциации. Данные соединения необходимо использовать в достаточно малых количествах или полностью удалять из образца во избежание их влияния на результаты анализа.

Для удаления ингибирующих веществ, снижающих степень обнаружения ДНК, может потребоваться извлечение ДНК из образца. В основе процедур экстракции, как правило, лежит осаждение ДНК из образца или ДНК-специфичной связи на матрицу (например, магнитные микроносители). Изначально в молекулярной биологии для очистки ДНК использовали методы экстракции с помощью фенола или хлороформа с последующим осаждением этанолом. Экстракция фенолом/хлороформом может быть эффективной техникой предварительной обработки образцов с остаточной ДНК перед анализом, однако, это не лучшая техника при низких уровнях содержания ДНК, как правило, обнаруживаемых в образцах биотехнологических препаратов. Ввиду низких уровней количественное определение ДНК с использованием техники осаждения этанолом может быть затруднительно. По этой причине при использовании подобной техники для обнаружения ДНК может потребоваться молекула-носитель (например, гликоген). Налажен серийный выпуск наборов, которые успешно используются для предварительной обработки образцов с остаточной ДНК для ее улучшенного обнаружения в анализах на содержание остаточной ДНК. Например, в некоторых наборах для разрыва связи ДНК с образцом используется хаотроп (натрия йодид) и детергент (натрия N-лауроил саркозинат). Затем под действием изопропилового спирта ДНК соосаждается с использованием гликогена в качестве молекулы-носителя. Экстракция ДНК из образца путем ее связывания с твердой матрицей может осуществляться в разных форматах. Одной из наиболее популярных техник является использование магнитных микроносителей: микроносители добавляют в образец со связывающим раствором для захвата ДНК. После захвата микроносители фиксируются в пробирке с образцом за счет магнитного держателя (стойки), а надосадочная жидкость, содержащая интерферирующие вещества, удаляется и утилизируется. Микроносители отмывают несколько раз, используя магнитную стойку и отмывочный раствор. На последнем этапе ДНК извлекают для анализа из адсорбента с помощью элюирующего буферного раствора, при этом микроносители удаляют из образца, используя магнитную стойку.

Манипуляции с образцом в процессе предварительной обработки могут снизить степень обнаружения остаточной ДНК или стать причиной попадания в образец ДНК из окружающей среды. Во избежание потери ДНК или контаминации следует соблюдать особую осторожность при проведении любых манипуляций с образцом. Обычной практикой является добавление в анализ образцов с известным количеством остаточной ДНК-мишени. Образец с известным количеством ДНК-мишени не следует путать с внутренним положительным контролем, который, как правило, представляет собой не являющуюся мишенью ДНК, добавленную в образец после его предварительной обработки с целью обнаружения ингибиторов ПЦР и оценки амплификации ДНК в ходе анализа. Внутренний положительный контроль также может быть добавлен до экстракции для более эффективного контроля данного этапа. Степень обнаружения 50–150 % ДНК-мишени, добавленной в известном количестве, зачастую применяется к анализам на содержание остаточной ДНК для обеспечения гарантии того, что анализ дает приемлемые результаты. Однако если при определенных характеристиках образца (например, влияния матрицы или метода подготовки образца) критерий приемлемости степени обнаружения 50–150 % нецелесообразен, в качестве возможного подхода можно рассматривать корректировку полученной концентрации ДНК с учетом общего процента обнаружения.

Анализ на содержание остаточной днк на основе гибридизации

В основе первых анализов на содержание остаточной ДНК лежала техника гибридизации ДНК, которая заключается в том, что ДНК-зонд, созданный из ДНК клетки-хозяина, обнаруживает и определяет количество комплементарных ДНК, присутствующих в исследуемом препарате. Двухцепочечная ДНК клетки-хозяина состоит из двух комплементарных цепочек ДНК, соединенных между собой с помощью водородных связей. Двухцепочечная ДНК в исследуемом образце подвергается денатурации, в результате которой образуются две отдельные цепочки и затем иммобилизуются на мембране, как правило, из нитроцеллюлозы или нейлона. В образец помещается зонд из денатурированной и меченой ДНК клетки-хозяина. ДНК-зонд не является некоторой определенной последовательностью; его получают путем произвольного мечения, в ходе которого радиоактивная или флуоресцентная метка вводится в ДНК клетки-хозяина, в результате чего образуется зонд. При контакте с иммобилизованной на мембране ДНК денатурированный меченый ДНК-зонд образует связь с комплементарными последовательностями ДНК клетки-хозяина. Если зонд мечен радиоактивными изотопами, мембрану располагают под рентген-пленкой для радиоавтографии в течение требуемого количества времени, затем пленку проявляют, и в том месте, где ДНК была иммобилизована, на пленке будет наблюдаться затемнение. Уровень гибридизации можно измерить с помощью флуоресцентной микроскопии. Если зонд мечен флуоресцентной меткой, интенсивность зон определяют с помощью флуоресцентной микроскопии. Интенсивность зон пропорциональна тем фрагментам зонда, которые гибридизировались с исследуемой ДНК, а значит, пропорциональна и количеству остаточной ДНК, содержащейся в образце. Интенсивность зоны можно визуально сравнить с интенсивностью зон, соответствующих стандартной кривой, таким образом, можно получить полуколичественные результаты (т.е. визуальное количественное определение); также интенсивность можно определить с помощью прибора (например, денситометра) для получения количественного значения, которое сравнивается со значениями, полученными для стандартной кривой.

Анализ на содержание остаточной днк на основе днк-связывающего белка

Серийно выпускается оборудование для количественного определения содержания остаточной ДНК в биотехнологических препаратах. Для данного оборудования требуются специальные реагенты с ДНК-связывающими белками и антителами к ДНК. Процедура анализа состоит из четырех этапов:

методики полимеразной цепной реакции

Количественная ПЦР в режиме реального времени является процедурой, хорошо адаптированной к быстрому анализу образцов, и применяется во многих областях производства биотехнологических препаратов (например, для определения числа копий, обнаружения вирусов). Данная техника позволяет подсчитать количество нуклеотидной последовательности-мишени в ДНК из разных образцов. Ключевыми элементами процедуры являются ДНК-зонды и праймеры, используемые в анализе. Наиболее распространенным техникой количественной ПЦР для обнаружения амплификации является анализ с использованием 5′-нуклеаз. В данной технике к зонду с одного конца присоединен репортерный краситель, а с другого – тушитель. В реакцию также добавляют пару ДНК-праймеров. В процессе реакции амплификации термостабильная ДНК-полимераза запускает синтез ДНК, при этом ДНК-праймер связывается с одноцепочечной ДНК из образца и продвигается вдоль этой ДНК, синтезируя новую комплементарную цепочку. При движении вдоль ДНК образца ДНК-полимераза I отщепляет любую комплементарную ДНК, встречающуюся ей на пути. При столкновении ДНК-полимеразы I с меченым ДНК-зондом происходит его отщепление. Репортерный краситель испускается в раствор, и в отсутствии тушителя измеряется итоговое свечение. Повторение цикла реакции ведет к амплификации флуоресцентного сигнала. Количество циклов, требуемое для измерения свечения, превышающего пороговое значение, взаимосвязано с количеством остаточной ДНК в образце. Сравнение интенсивности свечения, полученного от образца, со стандартной кривой позволяет количественно определить содержание остаточной ДНК в образце.

Альтернативные методики обнаружения

Помимо приведенных выше методик был разработан и коммерчески реализован целый ряд инновационных стратегий обнаружения. Среди наиболее распространенных:

Анализ на содержание остаточной ДНК на основе мультиплексной количественной ПЦР

На основании количественной ПЦР была разработана мультиплексная количественная ПЦР, при которой несколько пар праймеров и соответствующих им зондов вводятся в реакционную среду для одновременного обнаружения множества мишеней. Преимущества такой методики включают бОльшие объемы анализируемых образцов и лучший контроль ложноотрицательных результатов, недостатки же связаны с интерференциями в процессе амплификации и обнаружения (см. Методики анализа на основе нуклеиновых кислот - Амплификация 〈1127〉). Одним из вариантов данной методики является дуплексная количественная ПЦР, в которой при введении экзогенной ДНК, называемой внутренним положительным контролем (см. раздел Предварительная обработка образца), повышается достоверность точности анализа при надлежащей амплификации. Для анализа на содержание остаточной ДНК клетки-хозяина в биотехнологических препаратах мультиплексную количественную ПЦР используют не так часто, как одномишеневую количественную ПЦР.

Анализ на содержание остаточной днк. важные вопросы

При разработке анализа на содержание остаточной ДНК необходимо учитывать, как именно будет использоваться анализ, какая структура ДНК доступна (например, какова длина фрагмента), а также регуляторные аспекты. Стоимость также может играть существенную роль, поэтому должна учитываться при выборе формата анализа. Кроме того, необходимо принимать во внимание аспекты, касающиеся окружающей среды, здравоохранения и безопасности. Изначально анализы на основе гибридизации проводились с использованием меченой фосфором (32P) ДНК и радиоавтографии. Поскольку фосфор 32P быстро разлагается, зонды с такими метками имеют ограниченный срок хранения, кроме того, меры предосторожности при обращении с радиоактивным материалом могут быть очень обременительными. Ввиду таких сложностей в работе с фосфором 32P мечение гибридизационного зонда флуоресцентными метками может оказаться более предпочтительным вариантом. Визуальная оценка позволяет получить полуколичественные результаты анализа, тогда как определение интенсивности зон с помощью денситометра или иной системы формирования изображений позволяет получить количественные результаты. Анализы на основе ДНК-связывающего белка и количественной ПЦР дают количественный результат. Количественные методы, как правило, более предпочтительны, чем полуколичественные (например, более старые методы гибридизации), поскольку благодаря им можно получить более достоверные и точные результаты, а значит, осуществлять более эффективный мониторинг и контроль процессов. Ввиду интерференции со стороны матрицы образца для получения достоверных и воспроизводимых результатов зачастую требуется этап предварительной обработки образца. Этапы предварительной обработки могут влиять на степень обнаружения ДНК, поэтому, как правило, необходимо разрабатывать анализы, дизайн которых включает контроль степени обнаружения в пробе с известным количеством определяемого элемента с заданным критерием приемлемости, что позволит гарантировать надлежащую результативность анализа.

Внутренние контрольные пробы, как правило, готовят в самой лаборатории и проводят их квалификацию с помощью УФ-спектроскопии с использованием стандартных методик, применяемых в молекулярной биологии для определения содержания ДНК и чистоты. В анализе на основании гибридизации в качестве гибридизационного зонда используется геномная и/или векторная ДНК, меченная случайным образом по всей длине последовательности. По этой причине анализ на основании гибридизации специфичен к источнику ДНК, но не к определенной последовательности. Зонд, обладающий специфичностью к определенной последовательности, может быть синтезирован для проведения анализа на основании гибридизации, если такой уровень специфичности приемлем. Анализ на основании ДНК-связывающего белка не специфичен к последовательности, а значит, не специфичен к ДНК продуцента. В связи с этим сотрудники лабораторий должны принимать меры предосторожности во избежание контаминации образцов для данного типа анализа ДНК из окружающей среды перед денатурацией; иначе полученный результат может быть недостоверно высоким. Зонд в количественной ПЦР специфичен к последовательности, что является преимуществом, однако, с этим связаны определенные сложности при разработке анализа на содержание остаточной ДНК на основании количественной ПЦР. Последовательность, к которой специфична количественная ПЦР, должна быть стабильной и включать пригодный участок ДНК. Степень обнаружения последовательности-мишени должна неизменно представлять собой степень обнаружения всей остаточной ДНК. Производство биотехнологических препаратов, как правило, может включать операции по разделению ДНК на более короткие фрагменты, и это необходимо учитывать при выборе метода анализа. Существуют процедуры, которые позволяют определить, достаточна ли длина фрагментов ДНК в образце для адекватной степени обнаружения остаточной ДНК при использовании заданного метода. При переходе от одного метода анализа ДНК к другому исключительно важно иметь исчерпывающие сведения об анализируемой ДНК. Некоторые анализы позволяют обнаруживать как одноцепочечные, так и двухцепочечные ДНК, тогда как другие – только двухцепочечные (например, некоторые анализы с использованием связывающих флуоресцентных красителей). Некоторые анализы не специфичны к нуклеотидной последовательности, а на те, что специфичны, может оказывать влияние число копий последовательности-мишени, присутствующих в ДНК. Существуют анализы, требующие использования двух и более молекул антител для связывания с фрагментом ДНК (например, анализ на содержание остаточной ДНК на основании ДНК-связывающего белка). А в случае, если фрагменты ДНК слишком малы и присутствуют в достаточном количестве, они могут насыщать реагенты, что ведет к искажению результатов анализа (так называемый хук-эффект).

Несмотря на то, что на сегодняшний день вопрос безопасности примесей остаточных ДНК стоит не так остро, как прежде, уровень содержания остаточной ДНК в любом биологическом процессе остается ключевым показателем качества и является значимой характеристикой производственного процесса.