Оценка качества растительных лекарственных средств с точки зрения контаминантов и остаточных веществ

Оценка качества растительных лекарственных средств с точки зрения контаминантов и остаточных веществ Оглавление Оглавление 2 Благодарности 4 Предисловие 6 Вступительное слово 8 1. Введение 11 1.1 Вводная информация 11 1.2 Цель и задачи 13 1.3 Применение руководства 14 1.4 Глоссарий 16 1.4.1 Термины, относящиеся к растительным лекарственным средствам 16 1.4.2 Термины, относящиеся к контаминантам и остаточным веществам в растительных лекарственных средствах 18 2. Потенциально опасные контаминанты и остаточные вещества в растительных лекарственных средствах 24 2.1 Общие соображения 24 2.2 Химические контаминанты 27 2.2.1 Токсичные металлы и неметаллы 27 2.2.2 Стойкие органические загрязняющие вещества 27 2.2.3 Контаминация радиоактивными веществами 28 2.2.4 Микотоксины и эндотоксины 28 2.2.5 Растворители, встречающиеся как контаминанты 29 2.3 Биологические контаминанты 29 2.3.1 Микробиологические контаминанты 29 2.3.2 Контаминация паразитами 30 2.4 Остаточные сельскохозяйственные химикаты 30 2.4.1 Остаточные пестициды 30 2.4.2. Посторонние остаточные пестициды (см. раздел 2.2.2) 32 2.5 Остаточные растворители 32 3. Принципы, которыми слдует руководствоваться при оценке безопасности растительных лекарственных средств с точки зрения контаминантов и остаточных веществ 33 3.1 Общий подход – соблюдение требований надлежащей практики 33 3.2 Посторонние включения 33 3.3 Контаминанты 33 3.3.1 Мышьяк и токсичные металлы 33 3.3.2 Стойкие органические загрязняющие вещества 34 3.3.3 Радиоактивные контаминанты 34 3.3.4 Токсины микроорганизмов 34 3.3.5 Микробиологические контаминанты 35 3.4 Остаточные вещества 35 3.4.1 Остаточные пестициды 35 3.4.2 Посторонние остаточные пестициды 37 3.4.3 Остаточные растворители 37 4. Рекомендуемые методы анализа 38 4.1 Определение мышьяка и токсичных металлов (приложение 3) 39 4.2 Определение радиактивных контаминантов 41 4.3 Определение афлатоксинов (приложение 4) 42 4.4 Определение микробиологических контаминантов (приложение 5) 43 4.5 Определение остаточных пестицидов (приложение 6) 45 5. Список литературы 50 Приложение 1. Список участников консультации ВОЗ по контаминантам и остаточным веществам в растительных лекарственных средствах, Милан, Ловено-ди-Менаджо, Италия, 12–14 июля 2004 54 Приложение 2: Общие сведения технического характера 58 Приложение 3: Определение мышьяка и токсичных металлов 65 A. Испытания на предельное содержание 65 A.1 Испытание на предельное содержание мышьяка 65 A.2 Испытание на предельное содержание кадмия и свинца 68 A.3 Испытание на предельное содержание всех токсичных металлов в пересчете на свинец 69 A.4 Испытание на предельное содержание токсичных металлов в пересчете на свинец для экстрактов 70 B. Определение конкретных токсичных металлов 70 B.1 Определение кадмия, меди, железа, свинца, никеля и цинка 72 B.2 Определение мышьяка и ртути 73 Приложение 4. Определение афлатоксинов 75 Приложение 5: Определение микроорганизмов 78 A. Общее количество аэробных бактерий и грибов (суммарно) 78 A.1 Предварительная обработка испытуемого материала растительного происхождения 78 A.2 Процедуры испытаний 80 A.3 Подтверждение продуктивности среды для культивирования, антибактериальных свойств субстанций и валидности счетных методов 82 B. Испытания на конкретные микроорганизмы 83 B.1 Предварительная обработка проверяемых материалов 84 B.2 Процедуры испытаний на кишечные и некоторые другие грамотрицательные бактерии 84 Определение бактерий 84 Количественная оценка 84 Escherichia coli 85 Виды Salmonella 85 Pseudomonas aeruginosa 86 Staphylococcus aureus 86 Виды Clostridium 87 Shigella 88 B.3 Валидация испытаний на конкретные микроорганизмы 89 Приложение 6: Определение остаточных пестицидов 91 Общая информация 91 1. Определение общего количества хлора и фосфора 93 2. Определение хлоридов 96 3. Определение фосфатов 97 4. Качественное и количественное определение хлорорганических пестицидов 97 5. Анализ эфиров органофосфорных соединений 101 6. Определение конкретных остаточных пестицидов в материале растительного происхождения 101 7. Определение остаточного десметрина, прометрина и симазина 102 8. Определение конкретных хлорорганических, органофосфорных и пиретроидных остаточных пестицидов 106 Приложение 7. Список сред и штаммов, используемых в микробиологическом анализе 111 Приложение 8. Перечень реактивов и растворов 117 Предисловие Лечение заболеваний с помощью лекарственных растений, вероятно, самый древний способ из тех, к которым прибегает человечество в борьбе с болезнями. Поэтому лекарственные растения применяли и продолжают применять в терапевтических целях по всему миру как важный компонент различных систем народной медицины. Несмотря на разные теоретические и культурные модели, фитотерапия интегрирована во все системы нетрадиционной медицины: от индийской Аюрведы до китайской народной медицины, от арабской Унани до тибетской медицины, от Амазонии до Африки. В конце первой половины 20 века в странах с высоким уровнем доходов распространенность фитотерапии сократилась, уступив место разработке и производству синтетических препаратов. Однако последние несколько десятилетий фитотерапию применяют все чаще даже в промышленно развитых странах. В странах со средним или низким уровнем доходов фитотерапия никогда и не теряла своего значения. Часто это единственная система, к которой имеет доступ определенный круг людей. В сложившихся обстоятельствах приобретает фундаментальную важность создание условий для корректного и надлежащего применения фитотерапии. При правильном использовании эти методы могут помочь в защите и улучшении здоровья и самочувствия граждан. При правильном использовании должны соблюдаться критерии безопасности, эффективности и качества. Эти принципы характерны для современной практической медицины и стоят в основе защиты потребителей медицинских услуг. Работа правительства региона Ломбардия в области народной, дополнительной и альтернативной медицины (НМ/ДАМ) велась с соблюдением вышеназванных критериев. НМ/ДАМ была включена в План развития общественного здравоохранения в регионе (2002–2004). Рядом правительственных положений в соответствующем ключе были определены рамки для защиты пациентов и медицинских работников. В основу всего процесса лег Четырехлетний план взаимодействия между правительством региона Ломбардия и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в области применения и оценки средств НМ/ДАМ. Кроме того, очень важным шагом для оценки эффективности средств НМ/ДАМ стало содействие в проведении клинических и наблюдательных исследований на территории Ломбардии. Как уже говорилось выше, в странах с высоким уровнем доходов фитотерапия распространяется все больше, но доказательная модель медицины распространяется в развивающихся странах еще быстрее. Из-за контакта этих двух моделей возникла срочная необходимость сопоставить необъятный багаж знаний о народной медицине и научные процедуры проведения исследований и валидации. Цель этого процесса – доказать безопасность и эффективность каждой из существовавших последнюю тысячу лет систем народной медицины или их сочетаний. В этой ситуации правительство региона Ломбардия разделяет намерения ВОЗ доказывать не только безопасность, но и эффективность фитотерапевтических средств. Это особенно актуально для стран, где первоначально или преимущественно применяется система официальной медицины и фитотерапия могла бы заменить лекарственные средства с уже подтвержденной эффективностью. В таких случаях терапевту рекомендуется тщательно взвесить преимущества и недостатки с точки зрения безопасности и эффективности, которые может иметь растительный лекарственный препарат по сравнению с синтетическим. По вышеуказанным причинам очевидно, что распространение фитотерапии в развитых странах требует проведения серии крупных исследований, целью которых будет установление безопасности и эффективности широко применяемых растительных лекарственных препаратов. Для того чтобы перенести использование (безопасное) народных рецептов в индустриальные страны, необходимы согласованные действия разных специалистов. Однако чтобы гарантировать и качество, и правильное применение растительных лекарственных препаратов, простого использования фитотерапии в соответствии с критериями эффективности и безопасности не достаточно. Нужны лекарственные средства, отвечающие высоким стандартам качества, чтобы пациенты могли безопасно пользоваться фитотерапевтическими средствами. На сегодняшний день, вследствие глобализации рынка, многие лекарственные средства, используемые в традиционных системах фитотерапии, поступают на рынок из третьих стран, а не из страны происхождения. Для гарантии высоких стандартов качества лекарственных растений чрезвычайно важно иметь общие регуляторные нормы. Законодательные рамки должны задавать основные параметры, чтобы гарантировать качество и безопасность применения фитотерапевтических средств. Осознавая вышесказанное, эксперты со всего мира собрались на Консультации ВОЗ по контаминантам и остаточным веществам, которая прошла 12-14 июля 2004 года в Ловено-ди-Менаджо, чтобы составить данное руководство. Эта работа может стать образцом для других руководств по качеству лекарственных растений и должна стать ориентиром для поставщиков, а также для политиков и административных учреждений, которые хотят использовать фитотерапию для поддержания здоровья граждан в соответствии с критериями безопасности и эффективности. Лучиано Брескиани, Министр здравоохранения региона, Правительство региона Ломбардия Джан Карло Абелли, Министр по делам семьи и общественной солидарности региона, Правительство региона Ломбардия Вступительное слово В условиях, когда растительные лекарственные средства используются все больше, а рынок растительных препаратов распространяется все дальше, серьезным поводом для беспокойства как органов здравоохранения, так и населения многих государств-членов стала безопасность. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) разработала стратегию по средствам народной медицины на период 2002–2005 гг. («Стратегия ВОЗ по средствам народной медицины на 2002–2005 гг.»), которая была впоследствии воплощена в жизнь в рамках Стратегии ВОЗ в области лекарственных средств на 2004–2007 годы. Одна из главных задач – способствовать безопасности, эффективности и качеству народных лекарственных средств. Качество растительных лекарственных средств напрямую влияет на их безопасность и эффективность. Существует множество способов контроля растительных лекарственных средств, и самый важный шаг – контролировать качество лекарственных растений и материалов растительного происхождения. Однако это очень сложно, поскольку затрагивается множество различных вопросов, например, сохранение должного состояния окружающей среды и надлежащая практика культивирования лекарственного сырья растительного происхождения. Хорошо известно множество контаминантов и остаточных веществ, которые могут нанести вред потребителям растительных лекарственных средств. Многие из них встречаются в природе, например, естественные радионуклиды, токсичные металлы и бактерии. Некоторые появляются из-за использования в прошлом или в настоящем времени химических веществ или материалов, которые загрязняют окружающую среду, а следовательно, и лекарственные растения, например это выбросы с фабрик или остатки определенных пестицидов. Недавно проведенное исследование также показало, что лекарственные растения могут в ходе роста впитывать тяжелые металлы. Поэтому на данный момент существует потенциальная глобальная угроза здоровью и благополучию людей. Риск можно сократить, если сделать так, чтобы растительные лекарственные средства, содержащие опасные контаминанты и остаточные вещества не доходили до широкой публики. Этого можно добиться путем оценки качества лекарственных растений, материалов растительного происхождения и готовых растительных препаратов перед выходом на рынок. ВОЗ разработано несколько технических руководств и документов, имеющих отношение к безопасности и обеспечению качества лекарственных растений и материалов растительного происхождения. Это «Руководство по надлежащей практике культивирования и сбора лекарственных растений (GACP)» и «Методы контроля качества материалов растительного происхождения». В вышеупомянутых технических документах ВОЗ было предложено несколько методов, широко применяемых для обнаружения биологических, химических и радионуклидных контаминантов, а также остатков пестицидов. Однако в этих документах основное внимание, как правило, уделяется техническим вопросам, относящимся к контролю качества материалов растительного происхождения и лекарственных растений, и хотя и упоминаются методы обнаружения контаминантов, описание не достаточно подробное. Документ «Методы контроля качества материалов растительного происхождения» разработан очень давно, когда еще не было подходящих методов испытаний и государственных или региональных стандартных спецификаций по качеству для конкретных контаминантов и остаточных веществ. Поэтому сейчас возникла необходимость и появилась возможность использовать силы всех поучаствовавших стран, технические достижения и последние открытия, чтобы разработать это новое руководство, в котором основной упор делается на технические рекомендации по оценке качества растительных лекарственных средств с точки зрения как основных, так и часто встречающихся контаминантов и остаточных веществ. Материалы растительного происхождения и лекарственные растения также часто используются в качестве пищи и функциональных, питательных или диетических добавок. Результаты проведенного ВОЗ обзора государственных принципов и руководств по растительным лекарственным средствам по всему миру (2005) показали, что более чем в 100 участвовавших в опросе стран растительные лекарственные средства имеют регуляторный статус нерецептурных препаратов, рецептурных лекарственных средств или диетических добавок и продуктов для здорового питания. В некоторых странах даже говорят, что «еда как лекарство». Ясно, что контроль качества материалов растительного происхождения и лекарственных растений очень важен, не только для безопасности растительных лекарственных средств, но и для безопасности продуктов питания. Поэтому большая часть выполненной работы в области безопасности пищевых продуктов актуальна и для безопасности растительных лекарственных средств. Например, разработка данного руководства начата как совместный проект групп по безопасности средств народной медицины и продуктов питания в сотрудничестве с совместной программой Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ «Codex Alimentarius» Здесь следует особо подчеркнуть, что поскольку на данный момент данных исследований недостаточно, а также есть ограничения технического характера, многие приемлемые пределы в руководствах взяты из работ, написанных по темам, касающимся продуктов питания, или получены путем экстраполяции. Следует помнить, что хотя контроль за контаминантами и остаточными веществами в пищевых продуктах и в растительных лекарственных средствах в некотором смысле похож, также может быть и множество различий. Поэтому необходимо провести еще исследования, чтобы установить научно-обоснованные критерии для растительных лекарственных средств. Группа по народной медицине сотрудничает не только с Программой ВОЗ по безопасности продуктов питания, но и с другими имеющими отношение к делу департаментами и техническими подразделениями ВОЗ, например, с Департаментом общественного здравоохранения и окружающей среды и Департаментом по стандартам и политике в области лекарственных средств в штаб-квартире ВОЗ в Женеве. Валидированные методы испытаний и актуальные для определения контаминантов и остаточных веществ стандарты, описанные в этом руководстве, были переняты после тщательной технической проверки из некоторых существующих руководств и технических документов ВОЗ, посвященных растительным лекарственным средствам и средствам народной медицины, в частности, это «Методы контроля качества материалов растительного происхождения», а также из документов по безопасности продуктов питания, безопасности химических веществ, контролю за заразными заболеваниями, радиационной безопасности и охране окружающей среды, а также из некоторых государственных, региональных и международных фармакопей. Рекомендованные здесь методы анализа, методики и стандарты прошли окончательную проверку в ходе встреч Комитета экспертов ВОЗ по спецификациям на фармацевтические препараты в 2004, 2005 и 2006 годах. Несмотря на то, что в данном руководстве содержится много новых валидированных методов анализа, в которых задействуются новые технологии, они не охватывают все сложные ситуации и не покрывают полностью спрос на техники контроля за контаминантами и остаточными веществами в растительных лекарственных средствах. ВОЗ продолжит сотрудничество с государствами-членами и взаимодействие с другими программами ВОЗ, чтобы обновлять руководство с учетом разработки новых технологий и методов, с целью облегчения контроля качества растительных лекарственных средств и обеспечения безопасности и эффективности применения средств народной медицины. Д-р Сяожуй Чжан, координатор, Народная медицина, Департамент технического сотрудничества в области основных лекарственных средств и народной медицины Введение Вводная информация В условиях, когда растительные лекарственные средства используются все больше, а рынок растительных препаратов распространяется все дальше, серьезным поводом для беспокойства органов здравоохранения, фармацевтической промышленности и широкой общественности стали безопасность и качество материалов растительного происхождения и готовых растительных препаратов. Регулирование обращения и регистрация растительных лекарственных средств на государственном уровне различаются от страны к стране. Если обращение растительных лекарственных средств регулируется, их относят либо к категории рецептурных препаратов, либо к категории препаратов, продаваемых без рецепта. Где-то может параллельно существовать еще и группа растительных препаратов, которая не будет относиться к категории лекарственных средств и продуктов питания. Препараты этой группы набирают все большую популярность, а из-за отсутствия должного регулирования, недостаточно строгих систем контроля и плохо поддающихся контролю каналов сбыта (например, почтовые заказы и продажи через Интернет), есть потенциальная опасность столкнуться с нежелательными явлениями. В Резолюции ВОЗ по народной медицине (WHA56.31), которая была принята на 56 сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в мае 2003 года, государства-членов призывают по возможности гарантировать безопасность, эффективность и качество растительных лекарственных средств путем определения государственных стандартов или выпуска монографий, посвященных растительному сырью и рецептам народной медицины. Также этой резолюцией от генерального директора ВОЗ требуется оказывать техническую поддержку в разработке методик для отслеживания или обеспечения качества, эффективности и безопасности растительных лекарственных средств и в подготовке руководств и поощрять обмен информацией. Международная конференция уполномоченных органов в сфере обращения лекарственных средств (ICDRA) на 9-м, 10-м и 11-м заседаниях и на Встрече государственных центров, принимающих участие в осуществлении Программы ВОЗ по международному мониторингу лекарственных средств, запросила у ВОЗ разработать и постоянно обновлять техническое руководство по качеству, безопасности и эффективности растительных лекарственных средств. Участники неофициальной встречи ВОЗ по методикам контроля качества готовых растительных препаратов, которая прошла 20-21 июля 2001 года в Оттаве, Канада, также рассмотрели весь процесс производства растительных лекарственных средств, от необработанных материалов до распространения и поставки готовых растительных препаратов. Рекомендации, полученные на этой встрече, привели к разработке данного общего руководства, в котором рассматривается важная проблема безопасности и качества растительных лекарственных средств с особым упором на контаминанты и остаточные вещества. В деле обеспечения качества и безопасности растительных лекарственных средств государственные органы во многих странах-членах ВОЗ, а также другие лица, задействованные в снабжении потребителей растительными лекарственными средствами, вероятно, столкнутся со множеством сложностей, в том числе в вопросах установления и принятия стандартов качества, отслеживания и обеспечения их соблюдения. В государственных принципах и руководствах, которые, скорее всего, будут разработаны на основе данного руководства ВОЗ, следует также учитывать все характерные для конкретной местности и прочие нужды. В данном документе также есть рекомендации касательно методов определения различных стандартов и предельных значений, как для общих, так и для индивидуальных случаев. По многим причинам отсутствие надлежащих и соответствующих государственных стандартов означает риск, что растительные лекарственные средства будут потеряны для тех, кто ими всегда пользовался, а также не попадут в руки тех, кто хотел бы попробовать их впервые. Среди этих причин то, что растительные лекарственные средства окажутся не соответствующими требованиям для продажи, регистрации, импорта и экспорта; потеря доверия к таким средствам из-за реальных или кажущихся рисков для здоровья; возрастающее количество сообщений о нежелательных явлениях на фоне применения таких лекарственных средств. Время от времени во многих странах мира в растительных лекарственных средствах или лекарственных растениях на самом деле или по слухам находят нежелательные и/или не заявленные субстанции. Это бывали пестициды, радиоактивные частицы, микроорганизмы (в том числе патогенные), микотоксины, тяжелые металлы и мышьяк. Чтобы сократить риск возникновения нежелательных явлений из-за небезопасных и некачественных растительных лекарственных средств, ВОЗ возложила на себя обязанность разработать ряд новых технических руководств, касающихся обеспечения безопасности и качества растительных лекарственных средств, и обновлять существующие технические документы в данной сфере. Эти действия – практическое осуществление Стратегии ВОЗ по средствам народной медицины на 2002-2005 гг. [1]. Работая над темой контроля качества растительных лекарственных средств, ВОЗ также подготовила общее международное руководство по оценке качества потенциально опасных субстанций в составе растительных лекарственных средств с особым вниманием к биологическим, химическим и радиоактивным контаминантам и остаточным пестицидам. Цель и задачи В общем контексте обеспечения качества первостепенная цель данного руководства – предоставление государствам – членам ВОЗ общих технических рекомендаций по оценке качества растительных лекарственных средств с точки зрения безопасности с точки зрения как основных, так и часто встречающихся контаминантов и остаточных веществ. Это руководство, возможно, понадобится адаптировать в зависимости от ситуации, сложившейся в каждой конкретной стране. Задачи этого руководства предоставить: принципы, которыми следует руководствоваться при оценке качества растительных лекарственных средств с точки зрения их безопасности с учетом контаминантов и остаточных веществ; образец критериев для применения при идентификации возможных контаминантов и остаточных веществ; примеры методов и техник; примеры практических технических процедур контроля качества готовых растительных препаратов. При решении вышеперечисленных задач следует применять это руководство в совокупности с другими документами и публикациями ВОЗ (в том числе с их версиями, которые будут опубликованы позднее), которые касаются обеспечения качества растительных лекарственных средств с точки зрения их безопасности, например (подробнее в списке литературы): «Методы контроля качества материалов растительного происхождения» [2], «Надлежащая практика культивирования и сбора лекарственных растений (GACP)» [3], Международная фармакопея, 4-е издание [4, 5], «Основные принципы Надлежащей производственной практики для фармацевтических препаратов» [6], «Надлежащая производственная практика. Дополнительное руководство по производству лекарственных растительных препаратов» [7], «Руководство по Надлежащей практике хранения фармацевтической продукции» [8], «Надлежащая торговая и дистрибьюторская практики (GTDP) для исходного сырья для фармацевтических препаратов» [9], «Общее руководство ВОЗ по методологиям научных исследований и оценке народной медицины» [10], «Руководство по оценке растительных лекарственных средств» [11], Монографии ВОЗ на избранные лекарственные растения [12, 13]. Кроме того, поскольку для безопасности растительных лекарственных средств имеет актуальность работа, проведенная в области безопасности продуктов питания, следует рассматривать эти руководства в сочетании с соответствующими руководствами и практическими нормами, разработанными в рамках совместной программы Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ «Codex Alimentarius», обращая особое внимание на документы, подготовленные комитетами по остаточным пестицидам, пищевым добавкам и контаминантам, которые часто находят отражение в государственном законодательстве. Таким образом, на лекарственные растения допустимо распространять общие требования для продуктов питания. Примеры текстов Codex Alimentarius, которые допустимо применять к лекарственным растениям, включают: «Практические нормы “Codex Alimentarius”. Общие принципы гигиены пищевых продуктов» [14], «Руководство “Codex Alimentarius” по производству, обработке, маркировке и продаже продуктов питания, полученных с помощью технологии органической агрокультуры» [15], «Практические нормы “Codex Alimentarius” для специй и сухих ароматических растений» [16]. Область применения этих руководств не охватывает проблему фальсификации растительных лекарственных средств и/или контрафактной продукции, с которой надо разбираться в отдельном руководстве. ВОЗ издавала руководства по контрафактной продукции в целом [8, 9, 17– 20]. Применение руководства Быстрый рост использования растительных лекарственных средств в последние годы привел к обеспокоенности безопасностью и качеством материалов растительного происхождения и готовых растительных препаратов. На данный момент контроль качества таких материалов и препаратов значительно варьируется от страны к стране, и это влияет не только на здравоохранение, поскольку контаминанты в составе растительных лекарственных средств могут нести лишнюю и предотвратимую угрозу здоровью пациентов и потребителей, но и на международную торговлю. Поэтому очень рекомендуется проводить испытания на контаминанты в рамках государственного и/или регионального контроля качества растительных лекарственных средств, и цель данного документа – предоставить руководство по аспектам, которые следует учитывать при практическом осуществлении таких испытаний. В частности: • Следует принять во внимание потенциальные факторы риска, которые могли бы повлиять на возможность контаминации. Например, испытание на радиоактивные контаминанты будет необходимо только в случае наличия особых причин для беспокойства. Однако следует отметить, что даже если лекарственное растительное сырье выращено с помощью технологии органической или «биологической» агрокультуры, в нем все равно могут быть контаминанты из почвы или других источников в окружении. • Не придется выполнять все испытания для каждой произведенной серии. Например, если доказано, что в ходе процесса экстракции пестициды концентрироваться не будут, будет достаточно протестировать материал растительного происхождения. • Некоторые методы анализа требуют покупки дорогостоящих приборов и реактивов. Как бы там ни было, ограничения экономического характера не должны мешать внедрению в практику испытаний на контаминанты. Если ресурсов недостаточно, следует рассмотреть в качестве решения проблемы возможность создания государственной или региональной лаборатории по контролю пестицидов или сотрудничество с лабораториями научных или исследовательских центров или со специализированными лабораториями, работающими в сфере, связанной с продуктами питания. В данном руководстве перечислен ряд потенциальных основных контаминантов и остаточных веществ, которым государствам – членам ВОЗ рекомендуется отдавать приоритет в программах испытаний в соответствии с местными особенностями в сельском хозяйстве или, если дело касается импорта, агрономическим особенностям стран-экспортеров. В приложениях к данному руководству представлено несколько примеров подходящих методик, обнаруженных в государственных или региональных фармакопеях и в документах ВОЗ. Следует отметить, что эти методы нужно валидировать для определенного материала, который предполагается тестировать с его помощью, например, для корней, семян, листьев, видов растений, а также для каждого типа приборов, например, предназначенных для газовой хроматографии (ГХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или атомной абсорбционной спектрофотометрии (АА). Этот процесс должен включать валидацию пределов обнаружения, поскольку они могут зависеть от прибора и от типа пробы. Государствам – членам ВОЗ рекомендуется сообща работать над усовершенствованием этих методов анализа и гармонизацией требований, чтобы в перспективе включить валидированные стандартные методы в Международную и региональные фармакопеи. Многие из допустимых предельных значений экстраполированы из работ, проводившихся в области пищевых продуктов, поэтому необходимо больше исследований для создания научной базы (например, значений предельно допустимого содержания остаточных веществ (MRL) в растительных лекарственных средствах или материалах растительного происхождения в целом). Руководство – постоянно меняющийся документ, в будущем оно будет пересматриваться с учетом последних достижений и новых технологий, по мере их появления. Важно, чтобы государства – члены ВОЗ приняли документ в качестве рабочего документа для регуляторного контроля на своих территориях. Государствам-членам предлагается пользоваться этим документом без ограничений и встроить его в свои законодательные рамки. Глоссарий Ниже приводятся термины, которые используются в данном руководстве. Цифры в скобках после термина означают номер публикации в списке литературы. В некоторых случаях пришлось немного изменить определение, чтобы оно лучше подходило для описания растительных лекарственных средств. Если есть отсылка к документу, она указывает на источник, из которого термин был взят или на основе которого выведен. 1.4.1 Термины, относящиеся к растительным лекарственным средствам Эти термины и их определения были выбраны и взяты из других документов и руководств ВОЗ, которые широко используются государствами – членами ВОЗ. Определения терминов могут отличаться от определений в руководящих и/или широко используемых документах в некоторых государствах – членах ВОЗ. Тем не менее, одна из целей, с которыми приводятся данные определения, – соблюсти единство терминологии с другими документами ВОЗ в этой области, такими как «Общее руководство ВОЗ по методологиям научных исследований и оценке народной медицины» [10] и «Надлежащая производственная практика» ВОЗ [6, 7]. Также следует отметить, что эти определения разрабатывались, чтобы удовлетворить потребность в утверждении стандартных, признанных на международном уровне определений для использования в научных исследованиях и оценке растительных лекарственных средств [10]. Растительные лекарственные средства [10] Под это определение подпадают лекарственное растительное сырье, материалы растительного происхождения, растительные фармацевтические субстанции и готовые лекарственные растительные препараты: Лекарственное растение [7] Дикорастущее или культурное растение, используемое в медицинских целях. Лекарственное растительное сырье [10] Под «лекарственным растительным сырьем» понимается сырой растительный материал, например, листья, цветки, плоды, семена, стебли, древесина, кора, корни, корневища или другие части растений, которые могут быть целыми, поделенными на составляющие или измельченными в порошок. Материалы растительного происхождения [10] Материалы растительного происхождения – это либо лекарственные растения целиком, либо их части в сыром виде. Это лекарственное растительное сырье, свежевыжатые соки, камеди, жирные и эфирные масла, смолы и высушенное и измельченное в порошок лекарственное растительное сырье. В некоторых странах эти материалы могут подвергаться различным видам характерной для определенной местности обработки, например, обработке паром, запеканию или термообработке с перемешиванием с добавлением меда, алкогольных напитков или других материалов. Растительные фармацевтические субстанции [10] Растительные фармацевтические субстанции – основа для готовых растительных препаратов, под это определение могут подпадать мелко порезанные или измельченные в порошок материалы растительного происхождения, экстракты, настойки, жирные масла, выжатые соки и подвергнутые обработке экссудаты, полученные из материалов растительного происхождения. Растительные фармацевтические субстанции получают путем экстракции, дистилляции, отжима, деления на части, очистки, концентрации, ферментации или других физических или биологических процессов. Также к ним относятся субстанции, полученные с помощью вымачивания или нагревания материалов растительного происхождения в алкогольных напитках и/или в меду, или в других субстанциях. Готовые растительные препараты или лекарственные растительные препараты [10] Это лекарственные препараты, которые в качестве активных фармацевтических субстанций содержат исключительно растительные материалы или растительные фармацевтические субстанции. Это могут быть субстанции, полученные из одного или нескольких лекарственных растений. Если используется больше одного вида растений, то такой препарат называется «комплексный растительный препарат». Лекарственные растительные препараты помимо действующих веществ могут содержать вспомогательные. В некоторых странах в состав растительных лекарственных средств могут по традиции входить натуральные органические и неорганические действующие вещества нерастительного происхождения (например, сырье животного происхождения или минеральное сырье). Однако, как правило, готовые или комплексные препараты, в которые добавлены активные фармацевтические субстанции с известным химическим составом, в том числе синтезированные соединения и/или отделенные компоненты материалов растительного происхождения, растительными не считаются. Сырье из лекарственных растений См. «лекарственное растительное сырье». 1.4.2 Термины, относящиеся к контаминантам и остаточным веществам в растительных лекарственных средствах Далее, как правило, полностью цитируются термины и их объяснения, применяемые к контаминантам и остаточным веществам в растительных лекарственных средствах, а если есть необходимость, корректируются определения, применяемые для остаточных пестицидов в продуктах питания, разработанные Комиссией Codex Alimentarius или на посвященной остаточным пестицидам встрече Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (FAO) и ВОЗ. Поэтому при выборе соответствующих нуждам терминов государствам-членам следует руководствоваться документацией вышеупомянутых разработчиков. Такая рекомендация дается, потому что в будущем встречи Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ, посвященные остаточным пестицидам (JMPR), продолжатся в формате группы для оценки безопасности пестицидов, а также Объединенного комитета экспертов Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) применительно к контаминантам в растительных лекарственных средствах и продуктах питания. Определения, процитированные в данном глоссарии, изначально взяты из различных вышеперечисленных источников и изменены на Консультации ВОЗ по контаминантам и остаточным веществам, чтобы отражать область применения настоящего документа. Как правило, когда в какой-либо стране устанавливают стандарты для своих растительных лекарственных средств, рекомендуется принимать во внимание отличия от продуктов питания в дозировках, количествах, в которых используются препараты, и частоте применения, а также в методах изготовления растительных лекарственных средств. Контаминация [6] Нежелательное занесение химических или микробиологических примесей в или на исходное сырье, промежуточный продукт или готовый лекарственный растительный препарат во время производства, обора проб, упаковки или переупаковки, хранения или транспортировки. Перекрестная контаминация [6] Контаминация исходного сырья, промежуточного продукта или готового препарата другим сырьем или препаратом во время производства. Посторонние включения [2] Материалы, состоящие из чего-либо из следующего: • части материалов растительного происхождения или материалов, отличающихся от заявленных в пределах, заданных для соответствующего растительного материала; • любой организм, часть или продукт жизнедеятельности какого-либо организма, за исключением названных в спецификации на соответствующий материал растительного происхождения; • минеральные примеси, например, почва, камни, песок, пыль; стекло, метал, пластики или любые другие посторонние материалы. Они могут быть сами по себе или прилипнуть к материалам растительного происхождения. Допустимое суточное потребление (ADI) химического вещества [21] Это расчетное максимальное количество какого-либо вещества, выраженное по отношению к массе тела, воздействию которого отдельный представитель (под)группы населения может подвергаться ежедневно на протяжении всей жизни без заметного риска для здоровья. Допустимое суточное потребление обычно определяют для субстанций, которые добавляются намеренно (в продукты питания) или представляют собой остаточное количество какого-либо вещества, которое ранее было использовано по разрешенному назначению. Это суточное потребление на протяжении всей жизни человека, которое, судя по всем фактам, известным на момент оценки химического вещества на встрече Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ, посвященной остаточным пестицидам, не приводит к ощутимым рискам для здоровья. Оно выражается в миллиграммах химического вещества на килограмм массы тела. Приемлемое содержание остаточных веществ (ARL) [21] Приемлемое содержание остаточных веществ указывается в мг пестицида на кг материала растительного происхождения и может быть вычислено по максимальному значению допустимого суточного потребления (ADI) пестицида для людей, как это рекомендовано Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН и ВОЗ, и по среднесуточному потреблению (MDI) материала растительного происхождения. Референтная доза при сильном кратковременном воздействии (ARD) [21] Референтная доза химического вещества при сильном кратковременном воздействии это примерно оцененное количество некой субстанции, обычно выражаемое по отношению к массе тела, которое можно принимать внутрь в течение 24 часов или более короткого строка без заметного риска для здоровья. Оценка проводится на основании всех имеющихся на текущий момент фактов. Референтная доза при сильном кратковременном воздействии – это количество пестицида, которое человек получает, обычно, при однодневной схеме приема растительных лекарственных средств и которое приводит к сильному кратковременному воздействию на организм. При оценке референтной дозы при сильном кратковременном воздействии закладывается коэффициент безопасности, который обеспечивает защиту пожилым людям, младенцам, детям и людям, чей организм ослаблен болезнью. Предельно допустимое содержание остаточных посторонних веществ (EMRL) [21] Это остаточные пестициды или контаминанты, попавшие в растительное лекарственное средство из окружающей среды (в том числе в результате сельскохозяйственного использования земель в прошлом), а не в результате прямого или косвенного применения пестицида или контаминанта к растительному лекарственному средству. Концентрация выражается в мг остаточного пестицида или контаминанта на кг растительного лекарственного средства. Предельно допустимое содержание остаточных веществ (MRL) [21] Это максимальная концентрация остаточного пестицида (выраженная в мг/кг), которая рекомендована Комиссией Codex Alimentarius к официальному разрешению (в продовольственных товарах и кормах для животных). Предельно допустимое содержание остаточных веществ устанавливается на основании данных Надлежащей сельскохозяйственной практики (GAP) для продуктов питания, а продукты питания, изготовленные из продовольственных товаров, в которых соблюдаются соответствующие MRL, считаются приемлемыми с точки зрения токсикологии. Такие значения MRL могут применяться к растительным лекарственным средствам по аналогии. MRL, которые в первую очередь предполагается применять в международной торговле, выводятся из оценок, сделанных на встрече Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ, посвященной остаточным пестицидам (JMPR), по результатам: Токсикологической оценки пестицидов и их остатков и проверки данных об остаточных пестицидах из исследований и случаев применения под надзором WHOPES (Схема ВОЗ по оценке пестицидов), в том числе тех, которые отражают особенности ведения сельскохозяйственной деятельности в соответствующих государствах. Обычно в отчет включаются данные, полученные в ходе поднадзорных исследований, проведенных при самом активном использовании, какое рекомендуется, разрешено или зарегистрировано в государстве. Рассмотрения разных оценок и определений остаточных количеств вещества в пищевых продуктах, выполненных на государственном или международном уровне, по сравнению с ADI, которое должно указывать, что растительные лекарственные средства соответствуют требованиям с точки зрения MRL, предложенных Комиссией Codex Alimentarius, и безопасны для потребления человеком. Чтобы оставить возможность для вариаций в государственных требованиях к контролю вредителей, в установленные Комиссией Codex Alimentarius MRL заложены самые высокие показатели из проявивших себя в таких поднадзорных исследованиях, которые считаются показательными с точки зрения эффективности практического контроля вредителей. Когда речь идет о растительных лекарственных средствах, рекомендованное Комиссией Codex Alimentarius для официального разрешения в продовольственных товарах или кормах для животных предельно допустимое содержание остаточных веществ может применяться к материалам растительного происхождения или растительным фармацевтическим субстанциям. Как правило, значения MRL опираются на данные Надлежащей сельскохозяйственной практики (GAP) и вычисляются так, чтобы быть приемлемыми с точки зрения токсикологии. В Надлежащей сельскохозяйственной практике описаны признанные на государственном уровне способы безопасного применения пестицидов в существующих условиях, которые необходимы для эффективного и надежного контроля вредителей. В ней рассматривается применение пестицидов в разных количествах, вплоть до самого высокого из допустимых, таким способом, чтобы остаточных пестицидов было наименьшее возможное на практике количество. Разрешенные безопасные способы использования пестицидов определены на государственном уровне и включают признанные или рекомендуемые в государстве способы. Во внимание принимается общественное здравоохранение, гигиена труда и безопасность окружающей среды. Надлежащая сельскохозяйственная практика применяется на всех этапах производства, хранения, транспортировки, распространения и обработки растительных лекарственных средств. Допустимая суточная доза (PDE) Термин «допустимая суточная доза» (PDE) в руководствах ICH определяется как допустимое с точки зрения фармацевтики потребление остаточных растворителей, чтобы не путать PDE с отличающимися значениями ADI для той же субстанции [22]. Пестицид В данном руководстве пестицидами считаются любые субстанции, назначение которых предотвращать появление, уничтожать, привлекать или отгонять любых вредителей (в том числе контролировать нежелательные виды растений или животных) в ходе производства, хранения, транспортировки, распространения и обработки растительных лекарственных средств. Термин распространяется на субстанции, предназначенные для использования в качестве регуляторов роста растений, дефолиантов, десикантов, веществ для прореживания завязи или ингибиторов роста или средств, применяемых к урожаю перед сбором или после него с целью защиты продовольствия от потери качества в ходе хранения и транспортировки. Обычно термин не распространяется на удобрения и питательные вещества для растений. Остаточные пестициды [21] Это любые обнаруженные в пищевых и сельскохозяйственных продуктах или кормах для животных вещества, которые присутствуют там в результате применения пестицидов. Данный термин охватывает любые производные пестицидов, такие как продукты превращения, метаболиты, продукты реакции и примеси, которые считаются значимыми с точки зрения токсикологии. Стойкие органические загрязнители (СОЗ) Это химические вещества, которые долго сохраняются в окружающей среде, аккумулируются в живых организмах по пищевой сети и несут риск нежелательного влияния на здоровье людей и окружающую среду. Учитывая свидетельства переноса этих веществ на дальние расстояния, в места, где они никогда не использовались и не производились, а также связанную с этим фактом опасность для окружающей среды всего земного шара, международное сообщество уже не раз призывало срочно действовать на глобальном уровне, чтобы сократить и остановить выбросы этих химических веществ. Переносимое потребление (TI) (общее определение) Переносимое потребление определяется как расчетное потребление некой субстанции в течение всего срока жизни, которое, как считается, не несет ощутимого риска для здоровья [23]. TI контаминанта В данном руководстве под переносимым потреблением контаминанта понимается выраженное по отношению к массе тела расчетное количество контаминанта, воздействию которого отдельный представитель какой-либо (под)группы населения может подвергаться без особого риска в течение определенного времени. Определение «переносимое» используется для веществ, которые добавлены не специально, например, для контаминантов. TI пестицида, выступающего контаминантом в лекарственном растительном препарате Это расчетное количество пестицида, которое потребляется как контаминант в лекарственном растительном препарате, а также из других источников в течение срока от одного дня до всей жизни и не причиняет человеку никакого вреда. Остаточные растворители Это оставшиеся от органических растворителей вещества, которые используются или производятся в ходе изготовления или обработки растительных фармацевтических субстанций/лекарственных растительных препаратов. Растворители классифицированы ICH (CPMP/ICH 283/95) в соответствии с их потенциальным риском на: • класс 1 (растворители, которых следует избегать; например, это бензол); • класс 2 (растворители с ограниченным потенциалом токсичности, такие как метанол и гексан); • класс 3 (растворители с низким потенциалом токсичности, такие как этанол). Потенциально опасные контаминанты и остаточные вещества в растительных лекарственных средствах 2.1 Общие соображения Растительные лекарственные средства – растительная продукция, отнесенная в государственной регуляторной системе к средствам медицинского назначения. Это могут быть «лекарственное растительное сырье», «материалы растительного происхождения», «растительные фармацевтические субстанции» и «готовые растительные препараты»/«лекарственные растительные препараты». В некоторых странах определенные виды лекарственного растительного сырья и материалов растительного происхождения могут также использоваться в качестве продуктов питания или их ингредиентов. Поэтому встречающиеся далее термины адаптированы таким образом, чтобы отражать обе регуляторные категории: растительные лекарственные средства и продукты питания. В таблице 1 приведены примеры потенциально опасных контаминантов и остаточных веществ, которые могут встретиться в растительных лекарственных средствах. Эта сводная таблица включает информацию о возможных источниках контаминантов и остаточных веществ, а также об этапах производства, на которых есть возможность обнаружить эти вещества. Некоторые из контаминантов или остаточных веществ в растительных лекарственных средствах расцениваются как неизбежные. Контаминанты в растительных лекарственных средствах делятся на физико-химические и биологические. Важными остаточными веществами в растительных лекарственных средствах могут быть различные агрохимикаты и некоторые органические растворители. Следует избегать контаминации и контролировать ее с помощью таких мер обеспечения качества, как Надлежащая практика культивирования и сбора лекарственных растений (GACP) и Надлежащая производственная практика (GMP) для растительных лекарственных средств. Химические и микробиологические контаминанты могут быть результатом использования в качестве удобрений человеческих экскрементов, навоза и сточных вод. Согласно Руководству ВОЗ по Надлежащей практике культивирования и сбора лекарственных растений (GACP) [3], человеческие экскременты в качестве удобрений использовать запрещается, а навоз для этого должен тщательно перегнить. В попавших в компост сточных водах могут быть токсичные или другие химические контаминанты, в том числе растворители, источником которых является продукция, предназначенная для домашних хозяйств или промышленного применения. Поэтому с канализацией в сельскохозяйственных зонах также следует обращаться осторожно. Следует контролировать посторонние включения. Подавляющее большинство потенциально опасных контаминантов и остаточных веществ обнаруживается в лекарственном растительном сырье и материалах растительного происхождения. Это приводит к их попаданию в растительные фармацевтические субстанции и готовые растительные лекарственные средства. В результате обработки после сбора (например, после высушивания) содержание некоторых контаминантов и остаточных веществ, которое присутствовало в лекарственном растении, может измениться. А в процессе производства их содержание может измениться в растительных фармацевтических субстанциях, таких как экстракты, и в готовых лекарственных растительных препаратах. Каждый контаминант и каждое остаточное вещество описаны в двух разделах ниже. Некоторые выражают обеспокоенность в связи с достижениями биотехнологии, которые в будущем могут применяться к лекарственным растениям, которые будут производиться с помощью технологий ДНК. Эта область требует постоянного отслеживания вероятных модификаций и разработки новой нормативно-правовой базы. Однако этот вопрос лежит за пределами данного руководства. Таблица 1. Классификация потенциально опасных контаминантов и остаточных веществ в РЛС Контаминанты Общая классификация Группа Подгруппа Конкретные примеры Возможные источники Этап производстваa Химические контаминанты Токсичные и опасные материалы Токсичные металлы и неметаллы Свинец, кадмий, ртуть, хром (мышьяк, нитрит) Загрязненная почва и вода, в ходе культивирования/ роста, в процессе производства 1,2,3,4 СОЗ Диоксин, альдрин, хлордан, ДДТ, дильдрин, эндрин, гептахлор, мирекс Загрязненный воздух, почва и вода, в ходе культивирования/ роста 1,2,3,4 Радионуклиды 137Cs, 134Cs Воздух, почва, вода в ходе культивирования/ роста 1,2,3,4 Биологические токсины Микотоксины Обработка после сбора, транспортировка и хранение 2,3,4 Бактериальные эндотоксины Обработка после сбора, транспортировка и хранение 1,2,3,4 Биологические контаминанты Микро-организмы Бактерии Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, виды Salmonella, виды Shigella, Escherichia coli Почва, обработка после сбора, транспортировка и хранение 1,2,3,4 Грибы Дрожжевые, плесневые Обработка после сбора, транспортировка и хранение 1,2,3,4 Животные Паразиты Простейшие: амеба; гельминты: нематода Почва, экскременты; земледелие/культивирование с использованием только органических удобрений, процесс производства 1,3,4 Насекомые Тараканы и их части Обработка после сбора, транспортировка и хранение 1,2,4 Другие Мышиные экскременты, земляные черви, клещи Обработка после сбора, транспортировка и хранение 1,2,4 Растворители Органические растворители Ацетон, метиловый спирт, этиловый спирт, бутиловый спирт Почва и вода, в ходе культивирования/ роста, в процессе производства 1,2,3,4 Остаточные вещества Общая классификация Группа Подгруппа Конкретные примеры Возможные источники Этап производстваa С/х химические остаточные вещества Пестициды Инсектициды Карбамат, хлоргидрокарбонаты, фосфорорганические инсектициды Воздух, почва, вода, в ходе культивирования/ роста, обработки после сбора 1,2,3,4 Гербициды 2,4-Д, 2,4,5-T Воздух, почва, вода, в ходе культивирования/ роста, обработки после сбора 1,2,3,4 Фунгициды Дитиокарбамат Воздух, почва, вода, в ходе культивирования/ роста 1,2,3,4 Фумиганты Химические Окись этилена, фосфин, бромистый метил, диоксид серы Обработка после сбора 2,3,4 Средства для борьбы с болезнями растений Противо-вирусные Тиаметоксам В ходе культивирования 1,2,3,4 Остаточные растворители Органические растворители Ацетон, метиловый спирт, этиловый спирт, бутиловый спирт Процесс производства 3,4 a – этапы производства, на которых обнаруживаются контаминанты: 1 – лекарственные растения, 2 – материалы растительного происхождения, 3 – растительные фармацевтические субстанции, 4 – готовые лекарственные растительные препараты. 2.2 Химические контаминанты 2.2.1 Токсичные металлы и неметаллы Контаминирование материалов растительного происхождения токсичными субстанциями, такими как мышьяк, может происходить по разным причинам. Это и загрязнение окружающей среды (например, выбросы контаминантов с фабрик, этилированный бензин, грязная вода, в том числе, сточные воды, которые попадают в реки, озера и моря, а также некоторые пестициды), и состав почвы, и удобрения. Контаминация материалов растительного происхождения ведет к контаминации препаратов в ходе разных этапов процесса производства. Широкое применение пестицидов, содержащих мышьяк и ртуть, прекратилось всего несколько лет назад, а в некоторых странах они все еще используются. Поскольку токсичные субстанции в большом количестве встречаются в природе, они с определенной долей вероятности могут быть во многих продуктах питания. В связи с этим важно отметить, что сопутствующий прием лекарственных растительных препаратов теоретически может увеличить концентрацию токсичных металлов, потребляемых людьми, даже если соблюдаются самые современные практические руководства. 2.2.2 Стойкие органические загрязняющие вещества К СОЗ относятся органические химические вещества, такие как синтетические ароматические хлоргидрокарбонаты, которые мало растворимы в воде и стойки или стабильны под воздействием солнечного света, влажности, воздуха и высоких температур. Раньше их часто использовали в сельском хозяйстве в качестве пестицидов. Эти вещества все еще производятся непреднамеренно, в виде побочных продуктов горения и промышленных процессов. Во многих странах использование в сельском хозяйстве стойких пестицидов, таких как ДДТ и гексахлорбензол (ГХБ), запрещено уже много лет. Однако их все еще находят в зонах, где эти вещества применяли раньше. Часто они контаминируют лекарственные растения, которые растут неподалеку. Также многие такие вещества все еще применяют в целях здравоохранения, например, для контроля переносчиков болезней, таких как малярийные комары, и часто это происходит вблизи сельскохозяйственных земель. Остаточные пестициды могут попасть по воздуху в близко расположенное место, где соберут урожай лекарственных растений, и контаминировать его. Поэтому следует тщательно проверять качество лекарственных растений, которые выращиваются в зонах, где все еще применяются стойкие пестициды. Стокгольмская Конвенция по стойким органическим загрязнителям на данный момент включает ДДТ и 11 других СОЗ, в том числе диоксин (серьезный канцероген), альдрин, хлордан, дильдрин, эндрин, гептахлор, мирекс, токсафен и гексахлорбензол. 2.2.3 Контаминация радиоактивными веществами Избежать воздействия некоторого количества ионизирующего излучения невозможно, поскольку многие источники радиации, в том числе радионуклиды, встречаются в земле и атмосфере по естественным причинам [24]. Опасная контаминация может быть результатом чрезвычайного происшествия, связанного с утечкой радиоактивных веществ, а может иметь другие источники. ВОЗ в тесном сотрудничестве с несколькими другими международными организациями разработали руководство, которое предназначено для случаев широкого распространения контаминации радионуклидами в результате серьезного ЧП [25]. В качестве примера таких радионуклидов можно привести долгоживущие и короткоживущие продукты деления, актиниды и продукты активации. Как правило, основные характеристики и интенсивность излучения радионуклидов могут сильно различаться и зависят от таких факторов, как источник (это может быть реактор, завод по регенерации облучённого топлива, завод по производству тепловыделяющих элементов для ядерного реактора, блок для производства изотопов или что-то еще) [26]. В настоящем руководстве подчеркивается, что риск для здоровья от растительных лекарственных средств, которые были случайно контаминированы радионуклидами, зависит не только от того, какой именно в препарате радионуклид и каков уровень контаминации, но и от дозировки и длительности приема рассматриваемого препарата. При проведении испытаний на радиоактивные вещества в материалах растительного происхождения и растительных лекарственных препаратах важно обдумать вопрос наличия соответствующей методологии и оборудования. Государствам – членам ВОЗ было бы полезно сотрудничать с теми странами, где есть подходящие оборудованные исследовательские лаборатории. Следует полностью избегать перекрестной контаминации радионуклидами чистых материалов растительного происхождения на всех этапах производства, транспортировки и хранения. 2.2.4 Микотоксины и эндотоксины Микотоксины Микотоксины в растительном материале могут приводить как к острым состояниям, так и к хроническим проблемам со здоровьем. Обычно микотоксины – это вторичные продукты обмена веществ; они не летучи, обладают относительно низкой молекулярной массой, и могут секретироваться на или в материал растительного происхождения. Считается, что микотоксины играют двоякую роль: с одной стороны, они убивают микроорганизмы, конкурирующие с грибами в среде, а с другой, они помогают паразитическим грибам захватывать ткани растения-хозяина. Наиболее часто встречаются микотоксины, вырабатываемые видами грибов, включающими Aspergillus, Fusarium и Penicillium. Микотоксины делятся на четыре основные группы, а именно: афлатоксины, охратоксины, фумонизины и трихотецены, – и все они оказывают токсическое действие. Афлатоксины очень подробно изучены Международным агентством по изучению рака и отнесены к 1-ой группе опасности (вещества, канцерогенные для человека) [27]. Эндотоксины Эндотоксины обнаруживаются, в основном, в наружных мембранах определенных грамотрицательных бактерий и высвобождаются, только когда нарушается целостность мембран или уничтожается клетка. Они представляют собой комплексные молекулы липополисахаридов, которые вызывают антигенный ответ, влияют на сопротивляемость бактериальным инфекциям и приводят к другим последствиям. Поэтому следует проводить испытания на присутствие эндотоксинов в растительных лекарственных формах, предназначенных для парентерального применения, соблюдая все фармакопейные требования на государственном, региональном или международном уровне. 2.2.5 Растворители, встречающиеся как контаминанты Часто в воде для орошения, питья или промышленного использования в виде контаминантов встречаются растворители, не используемые для производства растительных лекарственных средств, но применяемые в других отраслях промышленности. С этой водой они на разных этапах выращивания и обработки попадают в лекарственные растения и материалы растительного происхождения. 2.3 Биологические контаминанты 2.3.1 Микробиологические контаминанты Лекарственное растительное сырье и материалы растительного происхождения обычно содержат большое количество бактерий и плесневых грибов, которые часто попадают в них из почвы или органических удобрений. Естественная микрофлора лекарственных растений представлена большим разнообразием бактерий и плесневых грибов, однако часто в ней преобладают аэробные спорообразующие бактерии. Дополнительной причиной контаминации и размножения микроорганизмов может быть сложившаяся на данный момент практика сбора урожая и производства, транспортировки и хранения растительных лекарственных средств. Количество микроорганизмов может расти из-за неспособности контролировать влажность при транспортировке и хранении растительных лекарственных средств, а также температуру жидких лекарственных форм и готовых растительных препаратов. Присутствие Escherichia coli, видов Salmonella и плесневых грибов может указывать на низкое качество практик производства и сбора. Контаминировать лекарственные средства патогенными бактериями может также зараженный персонал, осуществляющий сбор, обработку после сбора и собственно производство. Следует контролировать этот вопрос с помощью применения самых современных руководств по практике, таких как GACP и GMP. 2.3.2 Контаминация паразитами Паразиты, например, простейшие и нематоды, а также их яйца, могут попасть в растительные лекарственные средства в ходе культивирования и могут вызывать зоонозы, особенно если используются неперегнившие экскременты животных. Контаминация паразитами может также произойти во время обработки и производства, если задействованный персонал не соблюдает личную гигиену. 2.4 Остаточные сельскохозяйственные химикаты Основные остаточные сельскохозяйственные химические вещества в растительных лекарственных средствах – результат применения пестицидов и фумигантов. Пестициды можно разделить на группы по назначению: • инсектициды; • фунгициды и нематоциды; • гербициды; • прочие пестициды (например, средства для уничтожения аскарид, моллюсков и грызунов). В качестве примера фумигантов можно привести окись этилена, этиленхлоргидрин, бромистый метил и диоксид серы. 2.4.1 Остаточные пестициды Материалы растительного происхождения могут содержать остаточные пестициды, которые скапливаются там в результате таких принятых в сельском хозяйстве действий, как опрыскивание, обработка почв в ходе культивирования и использование фумигантов при хранении. Поэтому рекомендуется, чтобы в каждой стране, где производят материалы растительного происхождения, была хотя бы одна контрольная лаборатория, где возможно провести определение пестицидов с помощью соответствующего метода. 2.4.1.1 Классификация пестицидов Существуют разные классификации пестицидов [28, 29]. Для специалистов по аналитической химии наиболее полезна классификация на основании химического состава или структуры, например: • хлоргидрокарбонаты и имеющие к ним отношение пестициды: гексахлорциклогексан (ГХЦГ) или гексахлорбензол (ГХБ), линдан, метоксихлор; • гербициды на основе хлорированной феноксиалкановой кислоты: 2,4-Д, 2,4,5-T; • органофосфорные пестициды: карбофенотион, хлорпирифос и хлорпирифос-метил, кумафос, деметон, дихлофос, диметоат, этион, фенхлорфос, малатион, паратион-метил, паратион; • карбаматные инсектициды: карбарил; • карбамоил-бензимидазоловые пестициды: беномил, карбендазим; • дитиокарбаматные фунгициды: фербам, манеб, набам, тирам, цинеб, цирам; • аминокислотные гербициды: глифозат; • неорганические пестициды: фосфид алюминия, арсенат кальция; • прочие: бромпропилат, хлорпикрин, этилендибромид, окись этилена, бромистый метил, диоксид серы; • пестициды растительного происхождения: экстракт табачного листа, цветы и экстракт Pyrethrum; корни и ротеноиды Derris и Lonchocarpus. Долгое остаточное действие имеют только хлоргидрокарбонаты и имеющие к ним отношение пестициды (например, ГХЦГ), а также ряд органофосфорных пестицидов (например, карбофенотион). Несмотря на то, что во множестве стран применение многих стойких пестицидов прекращено, остаточные вещества могут все еще сохраняться в окружающей среде (например, ДДТ (см. раздел 2.2.2)). Поэтому следует настаивать на регистрации всех случаев использования пестицидов, чтобы таким образом осуществлялся наименее затратный контроль качества лекарственных растений и продукции из них. Пестициды, действие которых основано на меди, например, медный купорос и смеси медного купороса и гашеной извести, часто использовались раньше и все еще сохраняют популярность – это эффективные фунгициды. Хотя медь и является необходимым для растений питательным веществом, обязательно нужно контролировать ее содержание, поскольку при проглатывании в больших количествах, около 70 мг/сутки, она оказывает серьезное нежелательное воздействие на здоровье. Вероятность подвергнуться воздействию меди также повышается из-за того, что медь легко накапливается в живых организмах и в природе, а значит, вероятно, будет сохраняться в материалах растительного происхождения, подобно тяжелым металлам. Остаточное действие большинства других пестицидов очень короткое. Поэтому в местах, где длительность воздействия пестицидов неизвестна, рекомендуется в качестве метода предварительного скрининга проводить испытания материалов растительного происхождения на наличие органических соединений хлора и фосфора (см. также приложение 6, раздел 1). Возможно, это поможет понять, где могли использоваться пестициды. 2.4.2. Посторонние остаточные пестициды (см. раздел 2.2.2) 2.5 Остаточные растворители При производстве растительных лекарственных средств используется ряд органических растворителей. Эти растворители могут обнаруживаться в растительных фармацевтических субстанциях и готовых лекарственных растительных препаратах как остаточные вещества обработки. Остаточные растворители следует контролировать с помощью GMP и контроля качества. ICH (CPMP/ICH 283/95) классифицирует растворители в соответствии с потенциальным риском на: • класс 1 (растворители, использования которых следует избегать, например, бензол); • класс 2 (растворители с ограниченным токсическим потенциалом, такие как метиловый спирт или гексан); • класс 3 (растворители с низким токсическим потенциалом, такие как этиловый спирт). Принципы, которыми следует руководствоваться при оценке безопасности растительных лекарственных средств с точки зрения контаминантов и остаточных веществ Общий подход – соблюдение требований надлежащей практики Соблюдение GACP и GMP имеет огромную важность для производства качественных растительных лекарственных средств. Обязательно неукоснительно придерживаться GACP и GMP на протяжении всего процесса производства: от выращивания до продажи готовой продукции. Поэтому для того, чтобы произвести качественную продукцию для местного и международного рынка, данное руководство следует использовать в сочетании с GACP и GMP. Посторонние включения Посторонние включения, обнаруживаемые в образце растительного сырья и материалов растительного происхождения, должны соответствовать рамкам, установленным в фармакопеях на государственном, региональном или международном уровне. Посторонние включения – это насекомые и прочая животная контаминация, в том числе экскременты животных, а также другие виды растений. Как правило, как постороннее включение рассматривается все, что не является допустимым образцом материала из лекарственного растения хорошего качества. Образцы резко бывают идеальными, некоторое количество посторонних включений присутствует всегда. Однако не следует пропускать образцы с ядовитыми, опасными или способными нанести какой-то другой вред посторонними включениями. Гарантировать, что контаминация сведена к минимуму, поможет соблюдение GACP. Удаление крупных посторонних включений из целых и нарезанных растений часто выполняется вручную после макроскопического исследования. Также следует проверять на наличие посторонних материалов готовую продукцию. Контаминанты 3.3.1 Мышьяк и токсичные металлы Максимальные количества токсичных металлов и неметаллов в материалах растительного происхождения можно дать на основании значений переносимого временного потребления (PTI). Эти значения следует устанавливать в масштабе региона или страны. Примеры приведены в разделе A.4 приложения 3. Как правило, не ожидается, что количество тяжелых металлов, воздействующих на популяцию, значительно увеличится из-за контаминантов в применяемых растительных лекарственных средствах. Однако следует понимать, что тяжелые металлы, содержащиеся в растительных лекарственных средствах, прибавляются к получаемым с пищей, поэтому контаминацию тяжелыми металлами рекомендуется сводить к минимуму. В целом, было бы желательно гармонизировать пределы для токсичных металлов и стандарты, поскольку это дало бы ряд преимуществ, в том числе облегчило бы международную торговлю. 3.3.2 Стойкие органические загрязняющие вещества СОЗ представлены сотнями химических веществ, которые нерастворимы в воде и долго сохраняются или остаются стабильными в окружающей среде. Обычно они разносятся по всему миру, поскольку устойчивы к распаду. В случае проглатывания они потенциально способны причинить вред человеку и животным. Поскольку некоторые из них все еще производятся и применяются во многих странах, они не исчезнут из окружающей среды в ближайшее время. На международном уровне подписанты Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязнителям пытаются контролировать производство и выбросы пестицидов в своих странах, а также заменять эти пестициды на менее опасные вещества. 3.3.3 Радиоактивные контаминанты Количество облучения зависит от потребления радионуклидов, а серьезность последствий, в свою очередь, зависит от других переменных, таких как возраст, кинетика обмена веществ и вес человека, проглотившего радионуклиды (это также называется «переводной коэффициент дозы радиоактивного облучения»). Уровень контаминации можно понизить в ходе процесса производства. Поэтому в данном руководстве не предлагается никаких предельных значений для радиоактивной контаминации. Если есть какие-то опасения, материалы растительного происхождения следует испытывать в соответствии с государственными и региональными стандартами в индивидуальном порядке. При таком процессе в качестве основания для государственного нормативного документа о пределах содержания радиоактивных контаминантов можно использовать управление рисками, но не оценку риска. 3.3.4 Токсины микроорганизмов Следует проводить испытания на микотоксины и, в соответствующих случаях, на эндотоксины, используя надлежащим образом валидированный и чувствительный метод. Количества таких токсинов должны быть ниже предельных значений, установленных в государственных и региональных стандартах. Рекомендуется, чтобы анализы на микотоксины проводились предельно внимательно и в соответствии с руководствами по надлежащей практике, такими как «Надлежащая практика ВОЗ для государственных лабораторий, осуществляющих контроль качества фармацевтической продукции» [30]. 3.3.5 Микробиологические контаминанты 3.3.5.1 Бактерии В растительных лекарственных средствах, предназначенных для приема внутрь не должно присутствовать бактерий родов Salmonella и Shigella, ни в коем случае и ни на каком из этапов производства. Следует также проверять растительные лекарственные средства на присутствие других микроорганизмов, количество которых должно вписываться в пределы, установленные в фармакопее государственного, регионального или международного уровня. В разных фармакопеях разные требования к испытаниям. Следует изучить эти варианты, прежде чем будет принято решение о соответствующем испытании для выбранных материалов растительного происхождения и лекарственных растительных препаратов. 3.4 Остаточные вещества 3.4.1 Остаточные пестициды Предельные количества остаточных пестицидов следует устанавливать, опираясь на рекомендации, которые уже разработаны для продуктов питания и кормов для животных на встрече Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и ВОЗ, посвященной остаточным пестицидам (JMPR) [26]. В этих рекомендациях указано допустимое суточное потребление (ADI) и описана методика анализа для оценки конкретных остаточных пестицидов. Однако на данный момент не существует стандартных процедур для оценки предельно допустимого содержания остаточных веществ (MRL) применительно к лекарственным растениям, поэтому вероятно, что для подготовки модели могут использоваться методы, которые применяются для продуктов питания. Такой подход будет применяться, если идентичное с точки зрения ботаники лекарственное растение употребляется в пищу. Изначально Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН и ВОЗ устанавливали значения MRL на основании исследований, проводимых под надзором WHOPES (Схема ВОЗ по оценке пестицидов), и создания GAP [21] по использованию пестицидов для ряда продовольствия и по использованию комбинаций пестицидов с разными видами продуктов питания. Если попавший в список продовольственный товар (название растения-источника и его части, которая используется в пищу) с точки зрения ботаники идентичен рассматриваемой части лекарственного растения и имеет установленное значение MRL для конкретного пестицида, соответствующее MRL можно рассматривать как MRL для определенного необработанного материала растительного происхождения. В таком случае MRL для рассматриваемого материала растительного происхождения может быть позднее вычислено путем создания соответствующей формулы, с помощью которой будет учитываться коэффициент для высушивания растительного материала. Комиссия Codex Alimentarius приняла перечень одобренных пестицидов для специй, MRL для них показано в таблице 4 (см. раздел 4.5) [31]. Если рассматриваемое лекарственное растение идентично употребляемому в пищу, но речь идет о такой его части, которая отличается от перечисленных для еды, или же само растение не идентично перечисленным, можно попробовать вычислить MRL для материалов растительного происхождения с помощью подходов, которые описаны далее. 3.4.1.1 Предельно допустимое содержание остаточных пестицидов (MRL) в материалах растительного происхождения Токсикологическая оценка остаточных пестицидов в материалах растительного происхождения должна опираться на вероятное потребление материала пациентами. Если не проводится полная оценка рисков и есть практические соображения, рекомендуется, чтобы, в общем случае, потребление остаточных веществ из материалов растительного происхождения не превышало 1 % потребления из всех возможных источников, в том числе с пищей и питьевой водой [2]. Поскольку количество остаточных пестицидов может меняться в процессе производства, очень важно определить фактическое количество остаточных веществ, попадающее в организм с готовой лекарственной формой. Поскольку растительные лекарственные средства могут применяться для лечения от хронических заболеваний или для профилактики, рекомендуется, чтобы соблюдался подход Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН к определению MRL. 3.4.1.2 Приемлемое содержание остаточных веществ (ARL) Приемлемое содержание остаточных веществ (в мг пестицида на кг материала растительного происхождения) можно вычислить по максимальному значению допустимого суточного потребления (ADI) пестицида для человека, рекомендованному Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН и ВОЗ, и среднесуточному потреблению (MDI) материала растительного происхождения. В некоторых странах и/или регионах на государственном уровне установлены требования к предельному содержанию остаточных веществ в материалах растительного происхождения. Если таких требований нет, можно пользоваться другими источниками информации, такими как другие фармакопеи и прочие публикации. Вопрос приемлемости оценки рисков, проведенной с использованием значений ARL, нужно исследовать более подробно. Примеры приводятся в разделе 4 приложения 6. Если специальных требований не установлено, можно воспользоваться следующей формулой, основанной на вычисленном Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН и ВОЗ допустимом суточном потреблении: ARL = (ADI × E × 60)/(MDI × 100), где: ADI – максимально допустимое суточное потребление пестицида (мг/кг массы тела); E – коэффициент извлечения, который определяется экспериментально и указывает на коэффициент переноса пестицида из материала растительного происхождения в лекарственную форму; MDI – среднесуточное потребление материала растительного происхождения в кг; 60 – средний вес взрослого человека в кг, который возможно понадобится скорректировать для определенной группы пациентов, населения определенной страны и т.д.; 100 – коэффициент потребления, отражающий требование, что из материала растительного происхождения допускается получать не более 1 % всех потребляемых остаточных пестицидов. 3.4.2 Посторонние остаточные пестициды Согласно информации Комитета по остаточным пестицидам Комиссии Codex Alimentarius, в некоторых специях обнаруживаются ДДТ и ГХЦГ. Для этих соединений, также как и для других пестицидов в продовольствии, рекомендуется установить предельно допустимое содержание остаточных посторонних соединений (EMRL), а не MRL. 3.4.3 Остаточные растворители Для описания допустимого с фармацевтической точки зрения потребления остаточных растворителей предлагается использовать термин «допустимая суточная доза» (PDE), чтобы не возникало путаницы с отличающимися значениями ADI для той же субстанции [22]. Рекомендуемые методы анализа Описанные в этом разделе методы анализа приводятся в качестве примера подходящих методов для обнаружения избранных контаминантов и остаточных веществ в растительных лекарственных средствах, в основном, в материалах растительного происхождения. В соответствующих случаях также описаны методы анализа подходящие для разных промежуточных продуктов и разных этапов производства растительных лекарственных средств, например, для экстрактов и готовых лекарственных растительных препаратов. Помимо описания методов анализа в соответствующих случаях добавлены некоторые примеры из опыта разных стран, касающегося общих предельных значений для контаминантов и остаточных веществ. И то, и другое следует учитывать в качестве основы для разработки требований по пределам и методологий на государственном и региональном уровне. На данный момент ВОЗ не может порекомендовать пределы содержания контаминантов и остаточных веществ в силу их большого разнообразия и отсутствия единого мнения на их счет. Кроме того, в процедурах испытаний невозможно учесть все возможные примеси. Однако если о возникновении каких-то примесей известно, следует разработать для них валидированные методы. Описанные методы анализа следует использовать в соответствующих случаях, только на определенных этапах производства и в индивидуальном порядке. Анализ растительных лекарственных средств не ограничивается теми методами, которые обсуждаются здесь; доступны и другие техники проведения испытаний. Подробная информация о методах анализа, таких как объемный анализ, описаны в Международной фармакопее [4, 5]. При выборе метода анализа обязательно учитывать этап производства, на котором проходит анализ, и среду, в которой испытывается растительное средство (например, семена, содержащие масло, или готовые препараты). Если требуется, метод нужно адаптировать. Метод определения контаминантов и остаточных веществ следует валидировать для соответствующей среды. Хотя в приложениях к этому руководству и описаны во всех подробностях избранные методы, это не всегда наиболее современные и совершенные с технической точки зрения методы. Здесь даются некий выбор и рекомендации, но на применение указанных методов в определенных странах могут повлиять наличие технологий и ресурсов, в том числе человеческих и денежных. Если в каком-либо районе какой-либо страны какие-либо ограничения мешают проводить необходимые анализы растительной продукции, рекомендуется, чтобы для этих целей были доступны, по крайней мере, официальные лаборатории других государств или регионов. При выборе методов для всех анализов следует соблюдать Руководство по надлежащей практике для государственных лабораторий, осуществляющих контроль качества фармацевтической продукции, в том числе применять меры обеспечения качества. Все выбранные методы следует соответствующим образом валидировать в соответствии с этим руководством [30]. В приложениях описано следующее: • Приложение 3 – определение мышьяка и токсичных металлов, • Приложение 4 – определение афлатоксинов, • Приложение 5 – определение микроорганизмов, • Приложение 6 – определение остаточных пестицидов, • Приложение 7 – список культуральных сред и штаммов, • Приложение 8 – список реактивов и растворов. 4.1 Определение мышьяка и токсичных металлов (приложение 3) Как правило, с помощью количественных испытаний и испытаний на предельное содержание точно определяют концентрации токсичных металлов в форме примесей и контаминантов. Последние неизменно присутствуют в испытуемых образцах, например, растительных лекарственных средств и соответствующих лекарственных растительных препаратов. В государствах – членах ВОЗ могут решить, какие использовать испытания: количественные или на предельное содержание. Их выбор будет зависеть от свойств, присущих образцу, и конкретных контаминантов или остаточных веществ. Эти факторы следует рассматривать в индивидуальном порядке. Другим фактором будет то, что определенные методы, которые выбираются, чтобы с их помощью контролировать содержание тяжелых металлов, должны быть актуальными и отвечать всем требованиям регионального и государственного уровня. Несколько примеров предлагаемых государственных пределов содержания мышьяка и токсичных металлов в лекарственных растительных препаратах различных типов приводятся в таблице 2. Числовые показатели для стран основаны на информации, предоставленной государственными органами здравоохранения. Таблица 2. Примеры государственных пределов содержания мышьяка и токсичных металлов в растительных лекарственных средствах и лекарственных растительных препаратах Мышьяк (As) Свинец (Pb) Кадмий (Cd) Хром (Cr) Ртуть (Hg) Медь (Cu) Общее количество токсичных металлов в пересчете на свинец Растительные лекарственные средства Канада сырые материалы растительного происхождения 5 ppm 10 ppm 0,3 ppm 2 ppm 0,2 ppm готовые растительные препараты 0,01 мг/ сутки 0,02 мг/сутки 0,006 мг/ сутки 0,02мг/ сутки 0,02 мг/ сутки Китай материалы растительного происхождения 2 ppm 10 ppm 1 ppm 0,5 ppm 20 ppm Малайзия готовые растительные препараты 5 мг/кг 10 мг/кг 0,5 мг/кг Корея материалы растительного происхождения 30 ppm Сингапур готовые растительные препараты 5 ppm 20 ppm 0,5 ppm 150 ppm Таиланд материалы растительного происхождения, готовые растительные препараты 4 ppm 10 ppm 0,3 ppm Рекомендации ВОЗ [2] 10 мг/кг 0,3 мг/кг Другие лекарственные растительные препараты Проект предложения Государственного санитарного управления США (заготовки пищевых добавок)a 5 ppm 10 ppm 0,3 ppm 2 ppm Проект предложения Государственного санитарного управления США (готовые пищевые добавки)a 0,01 мг/ сутки 0,02 мг/ сутки 0,006 мг/ сутки 0,02 мг/ сутки 0,02 мг/ сутки а – с более подробной информацией по пищевым добавкам можно ознакомиться в [32]. Металлы широкое распространены в природе и свободно встречаются в почве и воде. Часто они входят в состав определенных пестицидов (см. также раздел 4.5). Как правило, если есть возможность, для анализа металлов следует всегда стремиться к использованию самых лучших и самых новых методов. Однако очень важно сделать так, чтобы все методы прошли полную валидацию, и не забывать, что нужно валидировать первоначальную матрицу растительной продукции. Это настоятельное требование рекомендуется соблюдать как органам управления, так и компаниям/заявителям, указывающим такие методы в документах для подачи в государственные регуляторные органы для регистрации лекарственных средств. Испытания на предельное содержание широко применяются к фармацевтическим препаратам, которые принято проверять на хлориды, сульфаты, мышьяк и тяжелые металлы. Поэтому они будут очень полезны и для испытаний растительных лекарственных средств и соответствующих препаратов. Во многих случаях испытания на предельное содержание также можно модифицировать, чтобы они обладали такой правильностью, которая позволила бы оценивать фактическое количество токсичного металла с большой точностью. Необходимость включения в программу испытаний анализов на токсичные металлы и критериев приемлемости нужно изучать на разных стадиях развития растения. При этом следует опираться на знания о виде лекарственного растения, его росте или выращивании, а также о процессе производства. Процедуры для контроля следует выбирать с учетом следующей информации: выбор между испытанием на предельное содержание и специализированным количественным методом будет зависеть от того, до какой степени необходимо контролировать конкретный материал, например, исходное сырье; выбор должен быть обоснованным. В целом, если о содержании тяжелых металлов в материалах растительного происхождения ничего неизвестно, рекомендуется качественно и количественно определить его в нескольких сериях, предпочтительно собранных в разные годы. Полученные в итоге данные следует использовать для установления пределов, соответствие которым, установленное с помощью подходящего испытания на предельное содержание, будет указывать, что количество тяжелых металлов приемлемое. 4.2 Определение радиоактивных контаминантов 4.2.1 Метод измерения После серьезного чрезвычайного происшествия, связанного с утечкой радиоактивных веществ, окружающая среда может быть контаминирована взвешенными в воздухе радиоактивными материалами, которые могут оседать на листья лекарственных растений. Объёмную удельную радиоактивность и тип радиоактивной контаминации могут определить в лабораториях радиационного контроля в большинстве государств – членов ВОЗ. Объёмную удельную радиоактивность изотопов в лекарственном растительном сырье должны оценивать в компетентных государственных лабораториях радиационной гигиены, принимая во внимание соответствующие рекомендации международных организаций, таких как Codex Alimentarius, Международное агентство по атомной энергии (МАГАТЭ), Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН и ВОЗ. Поскольку радионуклиды, которые попадают в окружающую среду в результате случайных выбросов, разнятся в зависимости от источника выброса, пока что общего метода измерений не существует. Однако в случае, если такая контаминация станет источником беспокойства, подозрительные образцы могут быть проанализированы в любой компетентной лаборатории. Техники анализа для лабораторий подробно описаны МАГАТЭ. 4.3 Определение афлатоксинов (приложение 4) Определение афлатоксинов следует проводить после подходящей процедуры очистки, в ходе которой надо соблюдать особую осторожность, чтобы не подвергнуться влиянию этих опасных и токсичных субстанций самому и не контаминировать рабочее место или окружающую среду в целом. В силу вышесказанного в государствах-членах следует создать свои надлежащие практики для государственных контрольных лабораторий и GMP, соответственно. Испытания нужны только для препаратов, в которых раньше уже встречались афлатоксины. Согласно описаниям для некоторых видов продовольственных продуктов, таких как орехи и кукуруза, характерны некоторые особенности распространения контаминантов, поэтому существуют определенные проблемы со взятием проб (особенно это касается афлатоксинов). Возможно, эти особенности понадобится принимать во внимание при выборе проб, например, с т.з. отбора проб и выбора их размера, а также при проведении анализа [33, 34]. Испытания на афлатоксины разработаны так, чтобы с их помощью обнаруживалось возможное присутствие афлатоксинов B1, B2, G1 и G2, которые являются высокотоксичными контаминантами в любом материале растительного происхождения. Во врезке 1 ниже представлены некоторые образцы предлагаемых государственных пределов для афлатоксинов в различных типах растительных препаратов. Числовые показатели для стран основаны на информации, предоставленной государственными органами здравоохранения. Врезка 1. Материалы растительного происхождения, растительные фармацевтические субстанции и лекарственные растительные препараты Аргентинаa Метод определения: основанная на ВЭЖХ техника с использованием колонки с моноклональными антителами для аффинной хроматографии. • Для лекарственного растительного сырья, материалов растительного происхождения и растительных фармацевтических субстанций, используемых для настоев растительных чаев 20 μг/кг для афлатоксинов B1 + B2 + G1 + G2, при условии, что афлатоксина B1 ≤ 5 μг/кг. • Для готовых лекарственных растительных препаратов для приема внутрь или для наружного применения. Ноль на 1 грамм. Германияb • Любые материалы, применяемые в производстве лекарственных средств (в том числе лекарственных растительных препаратов) 2 μг/кгc для афлатоксина B1 или 4 μг/ кгc для суммы афлатоксинов B1, B2, G1 и G2. (Определение уровня содержания афлатоксинов обязательно должно опираться на процедуры отбора проб, в которых учитывается потенциальная неоднородность распределения материала). a Фармакопея Аргентины, том 1, 7-е издание, г. Буэнос-Айрес, Министерство здравоохранения, 2003. b Постановление о запрете применения загрязненных афлатоксинами веществ при изготовлении лекарственных средств (Aflatoxin VerbotsV) от 19 июля 2000 года. Федеральная законодательная газета, часть I, № 33. Бонн, 25 июля 2000 года. c В пересчете на минимум на 88 % сухое вещество. 4.4 Определение микробиологических контаминантов (приложение 5) 4.4.1 Пределы микробиологической контаминации в материалах растительного происхождения, растительных фармацевтических субстанциях и готовых лекарственных растительных препаратах В зависимости от предполагаемого использования материалов растительного происхождения, а также лекарственных препаратов из них, устанавливаются разные пределы содержания микробиологических контаминантов. Некоторые примеры приводятся здесь. 4.4.1.1 Сырые лекарственные растения и материалы растительного происхождения, предназначенные для дальнейшей обработки Предельные значения для микробиологической контаминации сырых лекарственных растений и материалов растительного происхождения, предназначенных для дальнейшей обработки (в т. ч. для дополнительной деконтаминации путем физической или химической обработки), взяты из рабочих версий руководств, составленных международной консультативной группой [35], и приводятся для необработанных материалов растительного происхождения, собранных в приемлемых с точки зрения гигиены условиях: • Escherichia coli: максимум 104 на грамм; • пропагулы плесени: максимум 105 на грамм; • шигеллы, ноль на грамм или мл. 4.4.1.2 Материалы растительного происхождения, которые прошли предварительную обработку Предельные значения для материалов растительного происхождения, которые прошли предварительную обработку (например, кипятком, как это происходит с растительными чаями (herbal teas) и настоями) или используются в качестве лекарственных форм для наружного применения: • аэробные бактерии: максимум 107 на грамм; • дрожжевые и плесневые грибы: максимум 104 на грамм; • Escherichia coli: максимум 102 на грамм; • другие кишечные бактерии: максимум 104 на грамм; • клостридии: ноль на 1 грамм; • сальмонеллы: ноль на 1 грамм; • шигеллы: ноль на 1 грамм. 4.4.1.3 Другие материалы растительного происхождения для приема внутрь Предельные значения для других материалов растительного происхождения для приема внутрь: • аэробные бактерии: максимум 105 на грамм; • дрожжевые и плесневые грибы: максимум 103 на грамм; • Escherichia coli: максимум 10 на грамм; • другие кишечные бактерии: максимум 103 на грамм; • клостридии: ноль на 1 грамм; • сальмонеллы: ноль на 1 грамм; • шигеллы: ноль на 1 грамм. 4.4.1.4 Растительные лекарственные средства, в которые перед использованием добавляется кипяток Предельные значения для растительных лекарственных средств, в которые перед использованием добавляется кипяток: • аэробные бактерии: максимум 107 на грамм; • дрожжевые и плесневые грибы: максимум 104 на грамм; • Escherichia coli: максимум 10 на грамм; • другие кишечные бактерии: максимум 103 на грамм; • клостридии: ноль на 1 грамм; • сальмонеллы: ноль на 1 грамм; • шигеллы: ноль на 1 грамм. 4.4.1.5 Другие растительные лекарственные средства Предельные значения для других растительных лекарственных средств: • аэробные бактерии: максимум 105 на грамм; • дрожжевые и плесневые грибы: максимум 103 на грамм; • Escherichia coli: ноль на 1 грамм; • другие кишечные бактерии: максимум 103 на грамм; • клостридии: ноль на 1 грамм; • сальмонеллы: ноль на 1 грамм; • шигеллы: ноль на 1 грамм. 4.5 Определение остаточных пестицидов (приложение 6) В таблице 3 приводятся некоторые примеры государственных и региональных вариантов предельного содержания различных остаточных пестицидов. В качестве справочного материала в таблице 4 представлен список одобренных пестицидов для специй и соответствующие им значения MRL, принятые Комиссией Codex Alimentarius. Таблица 3. Примеры государственных и региональных вариантов предельного содержания различных остаточных пестицидов Субстанции Пределы Евр. фарм.a (мг/кг) Фарм. Японииb (ppm) USPc и Фарм. Аргентиныc (мг/кг) ацефат 0,1 алахлор 0,05 0,02 альдрин и дильдрин (сумма) 0,05 0,05 азинфос-метил 1 1,0 бром 50 бромофос-этил 0,05 бромофос-метил 0,05 бромпропилат 3 3,0 хлордан (сумма цис-, транс- и оксихлордана) 0,05 0,05 хлорфенвинфос 0,5 0,5 хлорпирифос 0,2 хлорпирифос-этил 0,2 хлорпирифос-метил 0,1 0,1 хлортал-диметил 0,01 цифлутрин (сумма) 0,1 λ-цихалотрин 1 циперметрин и изомеры 1 1,0 ДДТ (сумма о,п’-ДДЕ, п,п’-ДДЕ, о,п’-ДДТ, п,п’-ДДТ, о,п’-ТДЕ, п,п’-ТДЕ) 1,0 ДДТ (сумма п,п’- ДДТ о,п’-ДДТ п,п’- ДДД и п,п’- ДДЕ) 0,2 ДДТ (сумма п,п’- ДДТ, о,п’-ДДТ, п,п’- ДДЕ, и п,п’- ТДЕ) 1,0 дельтаметрин 0,5 диазинон 0,5 0,5 дихлофлуанид 0,1 дихлофос 1 1,0 дикофол 0,5 диметоат и ометоат (сумма) 0,1 Дитиокарбамат (в пересчете на CS2) 2 2,0 эндосульфан (сумма изомеров и эндосульфана сульфата) 3 3,0 эндрин 0,05 0,05 этион 2 2,0 фенхлорофос (сумма фенхлорофоса и фенхлорофос-оксона) 0,1 фенитротион 0,5 0,5 фенпропатрин 0,03 фенсульфотион (сумма фенсульфотиона, фенсульфотион-оксона, фенсульфотион-оксон-сульфона и фенсульфотион-сульфона) 0,05 фенвалерат 1,5 1,5 флуцитринат 0,05 τ-флувалинат 0,05 фонофос 0,05 0,05 гептахлор (сумма гептахлора, цис-гептахлорэпоксида и транс-гептахлорэпоксида) 0,05 гептахлор (сумма гептахлора и гептахлорэпоксида) 0,05 гексахлорбензол 0,1 0,1 гексахлорциклогексан (сумма изомеров α-, β-, γ- и ε-) 0,3 изомеры гексахлорциклогексана (сумма α, β, γ и δ) 0,2 изомеры гексахлорциклогексана (кроме γ) 0,3 линдан (γ-гексахлорциклогексан) 0,6 0,6 малатион 1,0 малатион и малаоксон (сумма) 1 мекарбам 0,05 метакрифос 0,05 метамидофос 0,05 метидатион 0,2 0,2 метоксихлор 0,05 мирекс 0,01 монокротофос 0,1 паратион 0,5 паратион-этил и параоксон-этил (сумма) 0,5 паратион-метил 0,2 паратион-метил и параоксон-метил (сумма) 0,2 пендиметалин 0,1 пентахлоранизол 0,01 перметрин и изомеры (сумма) 1 перметрин 1,0 фосалон 0,1 0,1 фосмет 0,05 пиперонилбутоксид 3 3,0 пиримифос-этил 0,05 пиримифос-метил (сумма пиримифос-метила и N-дезэтил-пиримифос-метила) 4 пиримифос-метил 4,0 процимидон 0,1 профенофос 0,1 протиофос 0,05 пиретрины (сумма цинерина I, цинерина II, джасмолина I, джасмолина II, пиретрина I и пиретрина II ) 3 пиретрины (сумма) 3,0 квиналфос 0,05 квинтоцен (сумма квитоцена, пентахлоранилина и метилпентахлорфенилсульфида) 1 1,0 s-421 0,02 текназол 0,05 тетрадифон 0,3 винклозолин 0,4 a Применимо к материалам растительного происхождения, описанным в 5 издании Евр. фарм., если в соответствующей монографии не указано иного. Источник: «PHARMEUROPA», том 18, № 4, октябрь 2006 г. b На данный момент применимо только к 5 видам материалов растительного происхождения (женьшеня корни; женьшеня корни, порошок; красного женьшеня корни; сенны листья; сенны листья, порошок), которые описаны в фармакопее Японии, XIV. c Значения из Фармакопеи США и Фармакопеи Аргентины, т.1. Таблица 4. Список одобренных пестицидов для специйa и соответствующие им значения MRL (Комиссия Codex Alimentarius, 2005 г.)b Пестицид (номер CCPR) Группа или подгруппа специй MRL (мг/кг) Ацефат (095) Вся группа 028c 0,2 (*) Азинфос-метил (002) Вся группа 028c 0,5 (*) Хлорпирифос (017) Семена 5 Плоды или ягоды 1 Корни или корневища 1 Хлорпирифос-метил (090) Семена 1 Плоды 0,3 Корни или корневища 5 Циперметрин (118) Плоды или ягоды 0,1 Корни или корневища 0,2 Диазинон (22) Семена 5 Плоды 0,1 (*) Корни или корневища 0,5 Дихлофос (025) Вся группа 028c 0,1 (*) Дикофол (026) Семена 0,05 (*) Плоды или ягоды 0,1 Корни или корневища 0,1 Диметоат (027) Семена 5 Плоды или ягоды 0,5 Корни или корневища 0,1 (*) Дисульфотон (074) Вся группа 028c 0,05 (*) Эндосульфан (032) (всего) Семена 1 Плоды или ягоды 5 Корни или корневища 0,5 Этион (034) Семена 3 Плоды или ягоды 5 Корни или корневища 0,3 Фенитротион (037) Семена 7 Плоды или ягоды 1 Корни или корневища 0,1 (*) Ипродион (111) Семена 0,05 (*) Корни или корневища 0,1 (*) Малатион (049) Семена 2 Плоды или ягоды 1 Корни или корневища 0,5 Металаксил (138) Семена 5 Метамидофос (100) Вся группа 028c 0,1 (*) Паратион (058) Семена 0,1 (*) Плоды или ягоды 0,2 Корни или корневища 0,2 Паратион-метил (059) Семена 5 Плоды или ягоды 5 Корни или корневища 3 Перметрин (120) Вся группа 028c 0,05 (*) Фентоат (128) Семена 7 Форат (112) Подгруппа семян 0,5 Плоды или ягоды 0,1 (*) Корни или корневища 0,1 (*) Фосалон (060) Семена 2 Плоды 2 Корни или корневища 3 Пиримикарб (101) Семена 5 Пиримифос-метил (086) Подгруппа семян 3 Подгруппа плодов 0,5 Квинтоцен (064) Подгруппа семян 0,1 Плоды или ягоды 0,02 Корни или корневища 2 Винклозолин (159) Вся группа специиc 0,05 (*) (*) На пределе или около предела определения. a определения остатков остаются такими же, как рекомендованные для конкретного пестицида в других продовольственных культурах (http://www.codexalimentarius.net/mrls/pesТДЕs/pest_ref/MRLs_Spices_e.pdf). b Отчет Объединенной программы Всемирной организации по продовольствию и ВОЗ по стандартам для продуктов питания, Комиссия Codex Alimentarius, 28-я сессия, июль 2005 г. (http://www.codexalimentarius.net/download/report/644/al28_41e.pdf). c группа A28 в версии, измененной на 36-й сессии Комитета Codex Alimentarius по остаточным пестицидам (CCPR).  5. Список литературы 1. WHO Traditional Medicine Strategy: 2002–2005. Geneva, World Health Organization, 2002 (WHO/EDM/TRM/2002.1). 2. Quality control methods for medicinal plant materials. Geneva, World Health Organization, 1998. 3. WHO guidelines on good agricultural and field collection practices (GACP) for medicinal plants. Geneva, World Health Organization, 2003. 4. International pharmacopoeia, 4th ed., Vol. 1. Geneva, World Health Organization, 2006. 5. International pharmacopoeia, 4th ed., Vol. 2. Geneva, World Health Organization, 2006. 6. Good manufacturing practices for pharmaceutical products: main principles. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-seventh report. Geneva, World Health Organization, 2003 (WHO Technical Report Series, No. 908) Annex 4. (Это руководство также входит в Quality assurance of pharmaceuticals: a compendium of guidelines and related materials, Vol. 2, 2nd updated ed.: good manufacturing practices and inspection. Geneva, World Health Organization, 2007.) (Это руководство также опубликовано отдельно: WHO guidelines for Good Manufacturing Practices (GMP) for herbal medicines. Geneva, World Health Organization, 2007.) 7. Good manufacturing practices: updated supplementary guidelines for manufacture of herbal medicines. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Fortieth report. Geneva, World Health Organization, 2006 (WHO Technical Report Series, No. 937) Annex 3. (Это руководство также входит в Quality assurance of pharmaceuticals: a compendium of guidelines and related materials, Vol. 2, 2nd updated ed.: good manufacturing practices and inspection. Geneva, World Health Organization, 2007.) (Это руководство также опубликовано отдельно: WHO guidelines for Good Manufacturing Practices (GMP) for herbal medicines. Geneva, World Health Organization, 2007.) 8. Guide to good storage practices for pharmaceutical products. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-seventh report. Geneva, World Health Organization, 2003 (WHO Technical Report Series, No. 908) Annex 9. 9. Good trade and distribution practices for pharmaceutical starting materials. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-eighth report. Geneva, World Health Organization, 2004 (WHO Technical Report Series, No. 917) Annex 2. 10. General guidelines for methodologies on research and evaluation of traditional medicine. Geneva, World Health Organization, 2 000 (WHO/EDM/TRM/2 000.1). 11. Guidelines for assessment of herbal medicines. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-fourth report. Geneva, World Health Organization, 1996 (WHO Technical Report Series, No. 863) Annex 11. (Это руководство также входит в Quality assurance of pharmaceuticals: a compendium of guidelines and related materials, Vol. 1. Geneva, World Health Organization, 1997.) 12. WHO monographs on selected medicinal plants, Vol. 1. Geneva, World Health Organization, 1999. 13. WHO monographs on selected medicinal plants, Vol. 2. Geneva, World Health Organization, 2002. 14. Codex Alimentarius Code of Practice, general principles of food hygiene, 2nd ed. Rome, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, 2001 (Codex Alimentarius GL 33). 15. Codex Alimentarius Guidelines for the production, processing, labelling and marketing of organically produced food. Rome, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, 2001 (Codex Alimentarius GL 32, Rev. 1). 16. Codex Alimentarius Code for hygienic practice for spices and dried aromatic plants. Rome, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, 1995 (Codex Alimentarius CAC/RCP 42). 17. Control and safe trade of starting materials for pharmaceutical products. Geneva, World Health Organization (http://www.who.int/medicines/publications/qa_starter/en/index.html). 18. WHO pharmaceutical starting materials certification scheme (SMACS): guidelines on implementation. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-eighth report. Geneva, World Health Organization, 2004 (WHO Technical Report Series, No. 917) Annex 3. 19. Good distribution practices for pharmaceutical products. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Fortieth report. Geneva, World Health Organization, 2006 (WHO Technical Report Series, No. 937) Annex 5. 20. starting WHO pharmaceutical materials certification scheme (SMACS): guidelines on implementation. Report of the WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Geneva, World Health Organization, 2004 (WHO Technical Report Series, No. 917 (http://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/regulation_legislation/certification/en/index.html). 21. Pesticide residues in food – methods of analysis and sampling. Codex Alimentarius. Vol. 2A, Part 1, 2nd ed. Rome, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, 2 000. 22. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH Harmonized Tripartite Guideline, Impurities: Guidelines for Residual Solvents (Q3C (R3)) (http://www.ich.org/cache/compo/363-272-1.html#Q3C). 23. International Programme on Chemical Safety. Assessing human health risks of chemicals: derivation of guidance values for health-based exposure limits. Geneva, World Health Organization, 1994. (Environmental Health Criteria 170.) 24. Facts about low-level radiation. Vienna, International Atomic Energy Agency, 1986. 25. Derived intervention levels for radionuclides in food. Guidelines for application after widespread radioactive contamination resulting from a major radiation accident. Geneva, World Health Organization, 1988. 26. Codex Alimentarius Commission. Guide. Codex maximum limits for pesticide residues, Part 2, April 1992. Rome, Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1992 (неопубликованный документ Всемирной организации по продовольствию № CX/PR2-1992; можно получить распечатку или диск с документом во Всемирной организации по продовольствию). 27. IARC Working Group, International Agency for Research on Cancer (IARC). Some naturally occurring substances: food items and constituents. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans. Vol. 56, Lyon, France, World Health Organization, 1993. 28. Public health impact of pesticides used in agriculture. Geneva, World Health Organization, 1990. 29. Official herbicide recommendations for vegetable crops, herbs and medicinal plants. The Hague, International Society for Horticultural Science, 1981. 30. Good practices for national pharmaceutical control laboratories. In: WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-sixth report. Geneva, World Health Organization, 2002 (WHO Technical Report Series, No. 902). 31. Report of Joint FAO/WHO food standards programme, Codex Alimentarius Commission, 28th Session, July, 2005. Rome, Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2005 (http://www.codexalimentarius.net/download/ report/644/al28_41e.pdf). 32. NIS International Draft Standard (Draft Standard NSF 173-2001). Ann Arbor, Michigan, National Sanitation Foundation International, 2001. 33. Sampling plans for aflatoxin analysis in peanuts and corn. Rome, Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1993 (FAO Food and Nutrition Paper 55). 34. Commission Directive 98/53/EC of 16 July 1998, European Commission, 1998. 35. International Consultative Group on Food Irradiation. Consultation on microbiological criteria for foods to be further processed including by irradiation. Geneva, World Health Organization, 1989: 21 (неопубликованный документ ВОЗ № WHO/EHE/FOS/89.5; можно получить по запросу из Отдела глобального и комплексного здравоохранения в аспекте окружающей среды, ВОЗ, Швейцария, 1211, г. Женева, 27). Государственные и региональные фармакопеи: Европейская фармакопея, 5-е издание, г. Страсбург, EDQM, Совет Европы, 2004. Фармакопея Аргентины, т. 1, 7-е издание, г. Буэнос-Айрес, Министерство здравоохранения, 2003. Фармакопея Японии, 14-е изд. (на английском языке), г. Токио, Министерство здравоохранения, труда и благосостояния Японии, 2001. Фармакопея Кореи, 8-е издание (на английском языке), г. Сеул, Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств Кореи, 2002. Фармакопея Китайской Народной Республики, т. 1 (на английском языке), г. Пекин, изд-во «Кэмикал Индастри Пресс», 2005. Фармакопея Китайской Народной Республики, т. 2 (на английском языке), г. Пекин, изд-во «Кэмикал Индастри Пресс», 2005. Тайская растительная фармакопея, т. 1, г. Бангкок, Департамент медицинских наук Министерства общественного здравоохранения, 1998. Тайская растительная фармакопея, т. 2, г. Бангкок, Департамент медицинских наук Министерства общественного здравоохранения, 2000. Тайская фармакопея, т. 1, г. Бангкок, Департамент медицинских наук Министерства общественного здравоохранения, 1987. Фармакопея США № 28 и Национальный формуляр №23, г. Роквилль, Мэриленд, Фармакопейная конвенция США, 2004.   Приложение 1. Список участников консультации ВОЗ по контаминантам и остаточным веществам в растительных лекарственных средствах, Милан, Ловено-ди-Менаджо, Италия, 12–14 июля 2004 года Участники Профессор Ahmad Alkofahi, декан факультета фармации, Научно-технологический университет Иордании, г. Ирбид, Иордания; Доктор Claudine Allemann, Комплементарные и растительные лекарственные средства, Swissmedic, г. Берн, Швейцария; Доктор Maurizio Amigoni, заместитель генерального директора Генерального директората по здравоохранению, Ломбардия, г. Милан, Италия; Доктор Ruslan Aspan, заместитель по контролю средств народной медицины, косметической продукции и комплементарных лекарственных средств, Государственное управление по контролю лекарственных средств и продуктов питания (NADFC), г. Джакарта, Индонезия; Доктор Shakhnoz Azimova, Институт химии растительных веществ, г. Ташкент, Узбекистан; Доктор Bosco Chen Bloodworth, начальник фармацевтической лаборатории, Аналитический научный центр, Управление медицинских наук, Сингапур (содокладчик); Профессор Gabriele Caccialanza, заместитель декана факультета фармакологии, Павийский университет, г. Павия, Италия; Г-жа Anna Caizzi, директор, Защита потребителей и поддержка коммерческой системы, Ломбардия, г. Милан, Италия; Доктор Majid Cheraghali, и. о. заместителя, Департамент по продуктами питания и лекарственным средствам, Министерство здравоохранения, г. Тегеран, Иран (сопредседатель); Доктор Alessandro Discalzi, аппарат генерального директора, Генеральный директорат по делам семьи и социальной солидарности, Ломбардия, г. Милан, Италия; Доктор Peter Eagles, председатель, Совет по контролю лекарственных средств, г. Претория, ЮАР; Профессор Harry Fong, Центр сотрудничества ВОЗ по народной медицине, Колледж фармации, Иллинойский университет в Чикаго, г. Чикаго, Иллинойс, США; Профессор Daniela Giachetti, Департамент наук об окружающей среде, Сиенский университет, г. Сиена, Италия; Доктор Yukihiro Goda, начальник, Подразделение фармакогнозии, фитохимии и наркотических веществ, Государственный институт медицинских наук, Министерство здравоохранения, труда и благосостояния, г. Токио, Япония; Доктор Sue Harris, Управление по контролю лекарственных средств, Министерство здравоохранения, г. Лондон, Великобритания (содокладчик); Доктор Konstantin Keller, директор, Федеральный институт лекарственных средств и медицинской продукции, г. Бонн, Германия (сопредседатель); Г-н Robert Law, фармацевт, подразделение китайской медицины, Министерство здравоохранения, специальный административный регион Гонконг, Китай; Доктор Lin Ruichao, директор, подразделение китайской фармакологии и природных препаратов, Государственное управление по контролю продуктов питания и лекарственных средств, г. Пекин, Китай; Профессор Emilio Minelli, Центр сотрудничества ВОЗ по народной медицине, Центр исследований в области медицинской биоклиматологии, биотехнологий и лекарственных средств природного происхождения, Миланский государственный университет, г. Милан, Италия; Доктор Mihyune Oh, официальный рецензент, Подразделение по стандартизации растительных лекарственных препаратов, Управление по контролю продуктов питания и лекарственных средств, г. Сеул, Корея; Доктор Ines Rizzo, департамент микробиологии, Государственный институт лекарственных средств (INAME), г. Буэнос-Айрес, Аргентина; Доктор David B. Roll, директор, подразделение по диетическим добавкам, Департамент информации и разработки стандартов, Фармакопея США, г. Роквилль, Мэриленд, США Профессор Sergio Serrano, Центр сотрудничества ВОЗ по народной медицине, Центр исследований в области медицинской биоклиматологии, биотехнологий и лекарственных средств природного происхождения, Миланский государственный университет, г. Милан, Италия; Г-жа Lucia Scrabbi, Центральный административный узел по комплементарной медицине, отдел планирования, Планы, программы, оценки и нужды, Генеральный директорат здравоохранения, Ломбардия, г. Милан, Италия; Профессор Umberto Solimene, Директор, Центр сотрудничества ВОЗ по народной медицине, Центр исследований в области медицинской биоклиматологии, биотехнологий и лекарственных средств природного происхождения, Миланский государственный университет, Г. Милан, Италия; Доктор Moideen Sulaikah, главный ассистент директора, Государственное бюро по контролю фармацевтических препаратов, Министерство здравоохранения, Селангор, Малайзия; Доктор Raymond Tsang, менеджер, Подразделение по лицензиям на пользование участками и по координации соблюдения требований, Директорат по лекарственным средствам природного происхождения, Министерство здравоохранения Канады, г. Скарборо, Онтарио, Канада; Доктор Wang Guorong, исполнительный вице-генеральный секретарь, Комиссия Китайской фармакопеи, г. Пекин, Китай; Доктор Prapai Wongsinkongman, лаборатория фитохимии, Институт исследования лекарственных растений, Департамент медицинских наук, Министерство общественного здравоохранения, г. Нонтхабури, Таиланд; Доктор Hashim Ubale Yusufu, заместитель директора и начальника, Техническая служба, Государственное агентство по администрированию и контролю обращения лекарственных средств, Гарки Абуджа, Нигерия; Доктор Michael Wierer, Европейская фармакопея, Совет Европы, г. Страсбург, Франция. Секретариат консультации Г-жа Elisabetta Minelli, отдел международных отношений, Центр сотрудничества ВОЗ по народной медицине, Центр исследований в области медицинской биоклиматологии, биотехнологий и лекарственных средств природного происхождения, Миланский государственный университет, г. Милан, Италия. Секретариат ВОЗ Доктор Mohamed Bin Shahna, Основные лекарственные средства и биологические препараты, Региональное бюро ВОЗ для стран Восточного Средиземноморья, Наср-сити, Египет; Доктор Margaret Chan, Директор, Департамент общественного здравоохранения и окружающей среды, устойчивого развития и обеспечения благоприятного состояния окружающей среды, ВОЗ, г. Женева, Швейцария; Доктор Sabine Kopp, ученый, отдел обеспечения качества и безопасности лекарственных средств, Департамент по основным лекарственным средствам и политике в области фармацевтической деятельности, ВОЗ, г. Женева, Швейцария; Г-жа Yukiko Maruyama, ученый, Народная медицина, Департамент по основным лекарственным средствам и политике в области фармацевтической деятельности, ВОЗ, г. Женева, Швейцария; Доктор Samuel W. Page, ученый, Химическая безопасность, Департамент по защите окружающей среды, ВОЗ, г. Женева, Швейцария; Г-н Raymond Tsai, технический сотрудник, Народная медицина, Департамент по основным лекарственным средствам и политике в области фармацевтической деятельности, ВОЗ, г. Женева, Швейцария; Доктор Xiaorui Zhang, координатор, Народная медицина, Департамент по основным лекарственным средствам и политике в области фармацевтической деятельности, ВОЗ, г. Женева, Швейцария. Приложение 2: Общие сведения технического характера Общие вопросы, которые следует принять во внимание В тексте везде используется метрическая система. Температура указана в градусах Цельсия (°C). Обычно, если нет других указаний, испытания проводятся при комнатной температуре (между 15 и 25 °C, в некоторых климатических зонах до 30 °C). Вся лабораторная посуда для испытаний должна быть соответствующего качества. Мерные и титровальные сосуды следует калибровать при комнатной температуре. Когда в тексте упоминается водяная баня без указания температуры, это значит, что вода должна быть кипящей (около 100 °C). Если нет других указаний, все описанные для испытания растворы изготавливают из дистиллированной и деминерализованной воды соответствующей степени чистоты. Реактивы и растворы Используемые реактивы и растворы должны соответствовать требованиям, содержащимся в приложении 8 «Реактивы и растворы». Обозначаются они следующим образом: реактив – R, испытуемый раствор – TS; титрованный раствор – VS. Прецизионность измерений Количества и объемы Количества и объемы материалов и реактивов, используемых в испытаниях, обязательно измерять достаточно точно. А именно: 20,0 значит «не меньше 19,5 и не больше 20,5», 2,0 значит «не меньше 1,95 и не больше 2,05», 0,20 значит «не меньше 0,195 и не больше 0,205». Температура Температура указывается аналогично количествам и объемам. Под условиями хранения, которые описываются общими словами, имеются в виду следующие эквивалентные температуры: В холодильнике = 0 – -6 °C В холодном или прохладном месте = 6–15 °C При комнатной температуре = 15–25 °C, в некоторых климатических зонах до 30 °C. Значения pH Результаты измерения pH указываются с прецизионностью, аналогичной указанию количеств и объемов. Подсчет результатов Следует рассчитывать результаты испытаний и количественных определений на один знак после запятой больше, чем требуется, а затем округлять в большую или меньшую сторону в соответствии со следующими рекомендациями: – если последняя цифра от 5 до 9, к предыдущей прибавляется 1; – если последняя цифра 4 или меньше, предыдущая цифра не изменяется. Другие вычисления, например, при стандартизации титрованных растворов, следует проводить аналогично. Если перед тем, как растолочь материал в порошок, который будет использоваться для проведения определений, его предстоит высушить, следует внести в расчеты поправку на потерю в массе при высушивании, а содержание действующего вещества следует вычислять с точки зрения невысущенной пробы. Установление предельных значений Разумные предельные значения можно установить с помощью простых статистических методов, например, метода контрольных карт [1, 2]. Результаты анализа около 20 последовательных серий объединяют в общий пул и вычисляют общее среднее и предел, соответствующий трем средним квадратическим отклонениям (±3σ). (Такие расчеты применимы, если анализируется больше одной отдельной или независимой пробы из 1 серии [3, 4]). Растворимость Если в процедуре проведения испытаний конкретного растительного материала не указано иного, примерную растворимость материалов растительного происхождения следует определять при температуре 20 °C. Растворимость выражается в «частях», представляющих количество миллилитров (мл) растворителя, необходимое для растворения 1 г твердого вещества. Иногда растворимость указывается описательно: Вещество растворимо очень легко менее 1 ч. Вещество растворимо легко 1–10 ч. Вещество растворимо 10–30 ч. Вещество растворимо умеренно 30–100 ч. Вещество растворимо мало 100–1 000 ч. Вещество растворимо очень мало 1 000–10 000 ч. Вещество практически не растворимо более 10 000 ч. Хранение Материалы растительного происхождения обязательно хранить в заданных условиях, чтобы не произошло контаминации и потери основных свойств. Упаковка Упаковка и ее укупорка не должны вступать в физическое или химическое взаимодействие с материалом так, чтобы это как-то могло повлиять на его качество. Общие требования к проницаемости упаковки обычно выражаются следующими описательными терминами: Хорошо укупоренная упаковка должна в обычных условиях использования, транспортировки и хранения обеспечивать защиту содержимого от попадания посторонних веществ и не допускать потери содержимого. Плотно укупоренная упаковка должна в обычных условиях использования, транспортировки и хранения обеспечивать защиту содержимого от попадания посторонних веществ и не допускать потери, выветривания, расплывания или испарения содержимого. Если упаковка предназначена для того, чтобы ее открывали и закрывали несколько раз, обязательно, чтобы после повторного укупоривания она была воздухонепроницаемой. Герметично укупоренная упаковка должна в обычных условиях использования, транспортировки и хранения обеспечивать защиту содержимого от попадания посторонних веществ и не допускать потери содержимого, а также быть непроницаемой для воздуха или любого другого газа. Упаковка с контролем первого вскрытия – упаковка, снабженная специальным элементом, по которому сразу видно, открывали ее уже или еще нет. Защита от света Материалы растительного происхождения, которые требуется защищать от воздействия света, следует хранить в светонепроницаемой упаковке, которая либо в силу свойств, присущих материалу, из которого она сделана, либо благодаря специальному покрытию защищает содержимое от воздействия света. Иди же упаковку с содержимым можно поместить в соответствующий светонепроницаемый (матовый) чехол и/или хранить ее в защищённом от света месте. Температура Материалы, которые нужно хранить при температурах, отличающихся от комнатной (от 15 до 25 °C или, в зависимости от климатических условий, до 30 °C), следует снабжать соответствующей этикеткой. Влажность При необходимости низкую влажность можно поддерживать, положив в упаковку обезвоживающее вещество, при условии, что оно не будет непосредственно контактировать с лекарственным средством. Следует с осторожностью подходить к открыванию таких упаковок в сырой или влажной среде. Размер частей при нарезке Материалы растительного происхождения используются либо целыми, либо нарезанными, либо в форме порошка. Нарезанные материалы растительного происхождения получают путем резки или дробления на маленькие кусочки. Куски ранжируют по размеру в соответствии с размером ячеек сита, сквозь которые сможет пройти материал, и описывают следующим образом: Размер отверстия (мм) Крупная нарезка 4,00 Средняя нарезка 2,80 Мелкая нарезка 2,00 Степень измельчения порошка и размер сита Порошки Грубость или тонкость помола порошка определяют в соответствии с номинальным размером отверстий сита, через которое проходят частицы порошка, в мкм, и описывают следующим образом: Описание Размер частиц Грубый помол (2 000/355) Все частицы проходят через сито размером 2,00 мм и не более 40 % через сито 0,355 мм Умеренно грубый помол (710/250) Все частицы проходят через сито размером 0,710 мм и не более 40 % через сито 0,250 мм Умеренно тонкий помол (355/180) Все частицы проходят через сито размером 0,355 мм и не более 40 % через сито 0,180 мм Тонкий помол (180) Все частицы проходят через сито размером 0,180 мм Очень тонкий помол (125) Все частицы проходят через сито размером 0,125 мм Сита Проволочные сита, которые используются для просеивания измельченных в порошок материалов растительного происхождения, классифицируются по номерам, указывающим на номинальный размер ячеек сетки в мкм. Сита изготавливают из проволоки с одинаковым круглым поперечным сечением. Определяющие параметры для сит следующие: Номер сита Номинальный размер диаметр отверстия Номинальный диаметр проволоки Примерная площадь грохочения (μм) (μм) (μм) (%) 2 000 2,00 0,90 48 710 0,710 0,450 37 500 0,500 0,315 38 355 0,355 0,224 38 250 0,250 0,160 37 212 0,212 0,140 36 180 0,180 0,125 35 150 0,150 0,100 36 125 0,125 0,090 34 90 0,090 0,063 35 75 0,075 0,050 36 45 0,045 0,032 34 Рекомендованные в данном руководстве сита были отобраны из соответствующих стандарту ISO 565, 1990 г. Единицы измерения Названия и символы для обозначения единиц измерения, которые используются в данном руководстве, соответствуют применяемым в Международной фармакопее [5] и Международной системе единиц (СИ), разработанной Генеральной конференцией по мерам и весам (CGPM) в сотрудничестве с другими международными организациями [6, 7]. Общие рекомендации по отбору проб Достоверность любых выводов, сделанных на основании анализа пробы, будет зависеть от того, насколько она показательна для всей серии. Общие рекомендации по отбору проб фармацевтических материалов для контроля качества даны в тридцать девятом отчете Комиссии экспертов ВОЗ по спецификациям для фармацевтических препаратов [3]. В силу специфичности характеристик материалов растительного происхождения, в частности, в силу их неоднородности, для отбора проб требуются специализированные процедуры работы с такими материалами. При отборе и подготовке усредненной пробы серии материала следует соблюдать нижеописанные процедуры. Рекомендуемые процедуры Отбор проб материала в нерасфасованном виде Каждую упаковку или упаковочную единицу проверяют на соответствие фармакопейным монографиям или другим требованиям к упаковке и маркировке. Проверяют состояние упаковки и отмечают любые дефекты, которые могут повлиять на качество или стабильность содержимого (физические повреждения, влага и т. д.). Пробы из поврежденных упаковок берут в индивидуальном порядке. Если первоначальная проверка показывает, что серия однородная, пробы отбирают следующим образом. Если в серии 5 упаковок или упаковочных единиц, пробу берут из каждой. Если в серии 6-50 единиц, пробы отбирают из 5. Если в серии более 50 единиц, отбирают 10 %, количество единиц округляют до ближайшего числа, кратного 10. Например, если в серии 51 единица, понадобится отобрать пробы из 6 упаковок, как если бы это была партия из 60 единиц. После вскрытия упаковки содержимое выбранных для взятия проб единиц проверяют на: • органолептические характеристики (цвет, текстура и запах); • вид материала (сырой, нарезанный, раздробленный, спрессованный); • наличие примесей, посторонние включения (песок, частицы стекла, грязь), плесень или признаки разложения; • присутствие насекомых; • упаковочный материал из некачественной или разрушающейся упаковки. Из каждой отобранной упаковки осторожно, чтобы избежать разделения материала на части, берут три первоначальных пробы. Пробы должны быть из верхней, средней и нижней части упаковки. Если материал упакован в мешки или тюки, три таких пробы следует отобрать руками: первую с глубины не менее 10 см от верха, вторую и третью из середины и снизу, сделав разрез на одной из сторон упаковки. Пробы семян следует брать щупом для зерна. Если материал упакован в коробки, следует сначала взять пробу из верхнего слоя, затем вынуть приблизительно половину содержимого коробки и взять вторую пробу. Затем, вынув еще часть материала, следует взять еще одну пробу из нижней части коробки. Масса образцов должна быть одинаковой, насколько это возможно. Три первоначально отобранных пробы следует объединить в один пул, который следует тщательно перемешать. Усредненную пробу получают с помощью квартования. Из достаточно хорошо перемешанного пула формируют ровную кучу квадратной формы, которую делят на 4 равные части по диагонали. Отбирают 2 противостоящие по диагонали части и тщательно перемешивают. Процедуру повторяют до получения пробы нужного размера (±10 %). Это 100-200 г для цветков и до 10 кг для определенных корней. Любой оставшийся материал возвращают к серии. С помощью такой же процедуры квартования усредненную пробу делят на окончательные пробы, уделяя внимание тому, чтобы каждая порция была показательна для всего материала в нерасфасованном виде. Окончательные пробы подвергают испытаниям следующих характеристик: • степень фрагментации (ситовый анализ); • подлинность и количество примесей; • влажность и зольность; • количество действующих веществ (если возможно). Часть каждой окончательной пробы следует сохранить в качестве материала сравнения, который также может при необходимости применяться для повторных испытаний. Отбор проб материала в потребительской упаковке Из каждой большой упаковки (ящик, коробка и т. д.), выбранной для взятия проб, произвольно берут 2 пользовательских упаковки. Если серия маленькая (1–5 ящиков), отбирают 10 пользовательских упаковок. Готовят объединенный образец путем смешивания содержимого отобранных пользовательских упаковок и продолжают, как описано выше, до получения окончательной пробы. Список литературы: 1. Quality control methods. Remington: the science and practice of pharmacy, 19th ed. Easton, PA, MACK, 1995:118–119. 2. Lachman L et al. Quality control charts. The theory and practice of industrial pharmacy. Philadelphia, Lea & Febiger, 1986:817–824. 3. WHO guidelines for sampling of pharmaceutical products and related materials. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirtyninth report. Geneva, World Health Organization, 2005 (WHO Technical Report Series, No. 929) Annex 4. 4. Supplementary guidelines on good manufacturing practices: validation. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Fortieth report. Geneva, World Health Organization, 2006 (WHO Technical Report Series, No. 937): Annex 4. 5. The international pharmacopoeia, 4th ed. Vol. 1 and Vol. 2. Geneva, World Health Organization. 2006. 6. Lowe DA. Guide to international recommendations on names and symbols for quantities and on units of measurement. Geneva, World Health Organization, 1975. 7. The SI for the health professions. Geneva, World Health Organization, 1977. Приложение 3. Определение мышьяка и токсичных металлов A. Испытания на предельное содержание A.1 Испытание на предельное содержание мышьяка A.2 Испытание на предельное содержание кадмия и свинца A.3 Испытание на предельное содержание всех токсичных металлов в пересчете на свинец A.4 Испытание на предельное содержание токсичных металлов в пересчете на свинец для экстрактов B. Определение конкретных токсичных металлов B.1 Определение кадмия, меди, железа, свинца, никеля и цинка B.2 Определение мышьяка и ртути A. Испытания на предельное содержание A.1 Испытание на предельное содержание мышьяка Мышьяк в изобилии встречается в природе, поэтому в растительных лекарственных средствах его находят так же часто, как и в продуктах питания, где мышьяк – распространенное вещество. Широко применяемый метод анализа основан на озолении среды растения, после чего проводится сравнительное колориметрическое испытание с помощью специального прибора. В описанном ниже методе применяется колориметрический анализ, и нет бумаги, пропитанной токсичным бромидом ртути (II). Используется раствор N-N-диэтилметилдитиокарбамата в пиридине, который реагирует с мышьяковистым водородом с образованием красно-фиолетового комплекса. Предельное значение выражается в пересчете на оксид мышьяка (III) (As2O3). Прибор Используют прибор, показанный на рис. A3.1. Приблизительно 30 мм высоты выходной трубки B заполняют стекловатой F, равномерно смачивают стекловату смесью равных объемов TS свинца (II) ацетата и воды, аккуратно вытягивают излишки смеси через нижний конец. Вставляют трубку вертикально в центр резиновой пробки H и прикрепляют ее к бутыли-источнику A, так чтобы небольшое отверстие E в нижнем конце трубки B находилось немного ниже пробки. На верхнем конце B присоединяют резиновую пробку J, чтобы трубка C стояла вертикально. Нижний конец выходной трубки C уравнивают с нижним концом резиновой пробки J. Рис. A3.1 Прибор для испытания на предельное содержание мышьяка A – бутыль-источник (емкость до начала изгиба к горлышку: приблизительно 70 мл), B – выходная трубка, C – стеклянная трубка (внутренний диаметр: 5,6 мм, конец той части, которая будет вставляться в поглощающую трубку D, вытянут до 1 мм в диаметре), D – поглощающая трубка (внутренний диаметр: 10 мм), E – небольшое отверстие, F – стекловата (приблизительно 0,2 г), G – отметка на 5 мл, H и J – резиновые пробки, ID – внутренний диаметр, Все измерения даны в мм. Подготовка испытуемого раствора Если нет других указаний, выполняют следующие действия. Примеры для женьшеня, измельченного в порошок женьшеня и красного женьшеня Готовят испытуемый раствор с 1,0 г смолотого в мелкий порошок женьшеня (или красного женьшеня) в соответствии с нижеописанным методом и проводят испытание с помощью вышеописанного прибора. Метод Берут навеску пробы, как указано в монографии, и помещают в тигель из платины, кварца или фарфора. Прибавляют 10 мл раствора магния нитрата гексагидрата в этиловом спирте (95) (1 к 10), выжигают этиловый спирт, постепенно нагревают и озоляют пробу. Если после данной процедуры все еще будет оставаться обугленный материал, его смачивают небольшим количеством азотной кислоты и прокаливают для озоления так же, как описано выше. После охлаждения добавляют 3 мл хлористоводородной кислоты, нагревают на водяной бане, чтобы растворился остаток. Полученная смесь – испытуемый раствор. Стандартные растворы • Абсорбирующий раствор для мышьяковистого водорода Растворяют 0,50 г N,N-диэтилдитиокарбамата серебра в пиридине, чтобы получить 100 мл смеси. Этот раствор хранят в бутылке с притертой стеклянной пробкой в защищенном от света, прохладном месте. • Стандартный базовый раствор мышьяка К точной навеске в 0,100 г размолотого в мелкий порошок стандартного реактива оксида мышьяка (III), высушенного при 105 °C в течение 4 часов, прибавляют 5 мл раствора гидроксида натрия (1 к 5) для растворения. Прибавляют разбавленной серной кислоты для нейтрализации, прибавляют еще 10 мл разбавленной серной кислоты, прибавляют свежевскипяченной и охлажденной воды до получения точно 1 000 мл. • Стандартный раствор мышьяка Пипеткой набирают 10 мл стандартного базового раствора мышьяка, прибавляют 10 мл разбавленной серной кислоты, доводят свежевскипяченной и охлажденной водой до объема точно 1 000 мл. Каждый мл полученного раствора содержит 1 μг оксида мышьяка (III) (As2O3). Стандартный раствор мышьяка готовят непосредственно перед применением, хранят в бутылке с притертой стеклянной пробкой. Процедура Если нет иных указаний, продолжают работу с использованием вышеописанного прибора. Одновременно изготавливают стандартный образец цвета. Помещают испытуемый раствор в бутыль A и, при необходимости, смывают раствор с внутренних стенок небольшим количеством воды. Прибавляют 1 каплю TS метилового оранжевого, затем, после нейтрализации TS аммиака, раствором аммиака (NH4OH) или разбавленной хлористоводородной кислотой, прибавляют 5 мл разбавленной хлористоводородной кислоты (1 к 2), прибавляют 5 мл TS калия йодида и оставляют отстояться на 2-3 минуты. Прибавляют 5 мл TS олова хлорида (II) и оставляют отстояться на 10 минут. Доводят водой до объема 40 мл, прибавляют 2 г цинка для анализа на мышьяк и немедленно присоединяют к бутыли A резиновую пробку H с вставленными трубками B и C. Переносят 5 мл абсорбирующего раствора для мышьяковистого водорода в поглощающую трубку D, вставляют конец трубки C в нижнюю часть трубки D, затем помещают бутыль A до начала изгиба стенки в воду, температура которой поддерживается на отметке 25 °C, и оставляют отстояться на 1 час. Отсоединяют трубку D, пиридином доводят объем до 5 мл (при необходимости), и смотрят, какого цвета стал абсорбирующий раствор. Полученный цвет должен быть не более интенсивным, чем стандартный образец цвета. Изготовление стандартного образца цвета Точно отмеряют 2 мл стандартного раствора мышьяка в бутыль-источник A. Прибавляют 5 мл разбавленной хлористоводородной кислоты (1 к 2) и 5 мл TS калия йодида и оставляют отстояться на 2-3 минуты. Прибавляют 5 мл TS ацидиктина (acidictin) хлорида (II), оставляют отстояться при комнатной температуре на 10 минут, а затем продолжают следовать указаниям, данным выше. Полученный цвет соответствует 2 μг оксида мышьяка (III) (As2O3) и используется как стандарт. Примечания. Прибор, реактивы и испытуемые растворы, используемые в испытаниях, не должны содержать мышьяка или могут содержать его в очень маленьком количестве. При необходимости поводят контрольное определение с холостой пробой. Подробное описание реактивов и растворов приводится в приложении 8. A.2 Испытание на предельное содержание кадмия и свинца Процедура Прибор Прибор представляет собой сосуд для озоления, который имеет вид высокого тигля из прозрачного кварцевого стекла (DIN 12904) высотой 62 мм, диаметром 50 мм и емкостью 75 мл с крышкой из прозрачного кварцевого стекла. Используются следующие материалы: • смесь для озоления: 2 весовые части TS азотной кислоты (~1 000 г/л) и 1 весовая часть TS перхлорной кислоты (~1 170 г/л). • материалы сравнения: листья оливы (Olea europaea) и сенной порошок . Тщательно очищают сосуд для озоления и все остальное оборудование, которое будет использоваться для определения, с помощью TS азотной кислоты (~1 000 г/л), хорошо ополаскивают водой несколько раз и сушат при температуре 120 °C. Подготовка пробы Для мокрого озоления в открытой системе помещают точную навеску 200–250 мг высушенного на воздухе, мелко нарезанного и тщательно перемешанного материала растительного происхождения в очищенный кварцевый тигель. Прибавляют 1,0 мл смеси для озоления, закрывают тигель крышкой без надавливания и помещают его в печь с контролируемой температурой и таймером (под управлением компьютера, если возможно). Медленно нагревают до 100 °C и поддерживают эту температуру до 3 часов; затем нагревают до 120 °C и поддерживают эту температуру 2 часа. Очень медленно поднимают температуру до 240 °C, избегая потери материала вследствие слишком бурной реакции, особенно когда температура проходит диапазон 160–200 °C, поддерживают температуру 240 °C 4 часа. Растворяют полученный сухой неорганический остаток в 2,5 мл TS азотной кислоты (~1 000 г/л) и используют для определения тяжелых металлов. Каждую пробу следует анализировать параллельно с холостой пробой. Метод Содержание свинца и кадмия можно определить с помощью инверсионной вольтамперометрии или атомно-абсорбционной спектрофотометрии. A.3 Испытание на предельное содержание всех токсичных металлов в пересчете на свинец Когда используется этот метод, тяжелые металлы представляют собой металлические включения, которые темнеют под воздействием TS натрия сульфида в кислом растворе; их количество выражается в пересчете на свинец (Pb). Изготовление раствора пробы и холостого раствора Испытуемый раствор Помещают такое количество пробы, как указано в монографии, в кварцевый или фарфоровый тигель, неплотно прикрывают крышкой, обугливают содержимое путем постепенного прокаливания. Когда остынет, прибавляют 2 мл азотной кислоты и 5 капель серной кислоты, осторожно нагревают до появления белого дыма и сжигают в пепел, прокаливая при температуре между 500 °C и 600 °C. Остужают, прибавляют 2 мл хлористоводородной кислоты, выпаривают до сухости на водяной бане, смачивают остаток 3 каплями хлористоводородной кислоты, прибавляют 10 мл горячей воды, нагревают в течение 2 минут. Затем прибавляют 1 каплю TS фенолфталеина, прибавляют TS аммиака каплю за каплей, пока раствор не примет бледно-красный цвет, прибавляют 2 мл разбавленной уксусной кислоты, фильтруют, при необходимости, и смывают состав со стенок емкости 10 мл воды. Переносят отфильтрованный раствор и смывы со стенок емкости в пробирку Несслера, водой доводят до объема 50 мл. В результате получается испытуемый раствор. Контрольный раствор Выпаривают смесь из 2 мл азотной кислоты, 5 капель серной кислоты, 2 мл хлористоводородной кислоты на водяной бане, затем доводят до сухости на песочной бане, а остаток смачивают 3 каплями хлористоводородной кислоты. После этого продолжают, как описано выше для испытуемого раствора, затем прибавляют стандартный раствор свинца в таком объеме, как указано в монографии, и достаточным количеством воды доводят до объема 50 мл. Процедура Прибавляют по 1 капле TS натрия сульфида как к испытуемому раствору, так и к контрольному, тщательно перемешивают и оставляют отстояться на 5 минут. Затем сравнивают цвет растворов, рассматривая пробирки сверху вниз или на просвет на белом фоне. Испытуемый раствор не должен быть окрашен сильнее, чем контрольный. A.4 Испытание на предельное содержание токсичных металлов в пересчете на свинец для экстрактов Испытуемый раствор Озоляют 0,3 г экстрактов до пепла, согревают 3 мл разбавленной хлористоводородной кислоты, фильтруют. Смывают остаток двумя порциями воды по 5 мл. Нейтрализуют объединенный фильтрат и смывы путем добавления TS аммиака, при необходимости фильтруют, прибавляют 2 мл разбавленной уксусной кислоты и водой доводят до объема 50 мл. Проводят испытание на предельное содержание тяжелых металлов, используя этот раствор как испытуемый. Контрольный раствор Поступают с 3 мл разбавленной хлористоводородной кислоты так же, как описано выше для изготовления испытуемого раствора, прибавляют 3 мл стандартного раствора свинца (1 ppm), доводят водой до объема 50 мл. Процедура Прибавляют по 1 капле TS натрия сульфида как к испытуемому раствору, так и к контрольному, тщательно перемешивают и оставляют отстояться на 5 минут. Затем сравнивают цвет растворов, рассматривая пробирки сверху вниз или на просвет на белом фоне. Испытуемый раствор должен быть окрашен не сильнее, чем контрольный. B. Определение конкретных токсичных металлов Для определения количества или концентрации определенных тяжелых металлов используется атомно-абсорбционная спектрометрия (АА). Принцип АА основан на том, что атомы в состоянии покоя поглощают световые волны определенной длины, характеризующей конкретный атом, когда свет проходит через слой атомного пара элемента, который подлежит определению. С рекомендованными закрытыми сосудами для озоления под высоким давлением, а также с микроволновым лабораторным оборудованием обязательно обращаться с осторожностью. Сотрудники, работающие с оборудованием, должны быть хорошо знакомы с правилами безопасности и инструкциями по эксплуатации, предоставленными производителем. Процедура Прибор Обычно прибор состоит из источника света, атомизатора пробы, спектроскопа, фотометра и регистрирующей системы, а также следующего: • Колба для озоления – колба из политетрафторэтилена вместимостью около120 мл, снабженная воздухонепроницаемой укупоркой, клапаном для регулировки давления в емкости и трубкой из политетрафторэтилена для отвода газа. Хороший пример – «Digestion Vessel Assembly P/N ZZ 1 000» (установка с сосудом для озоления); • Система для обеспечения воздухонепроницаемости колб, которая закручивает крышки с одинаковой силой. Например, «CEM Capping station» (установка для завинчивания крышек). • Микроволновая печь с магнетронной частотой 2 450 МГц, с возможностью регулировки мощности от 0 до 630 ± 70 В с шагом в 1 %, программируемым компьютером, покрытым политетрафторэтиленом резонатором с вытяжным вентилятором с изменяемой скоростью вращения, поворотным диском и вытяжными трубками для отвода пара. • Атомно-абсорбционный спектрометр, оснащенный соответствующей лампой для каждого элемента в качестве источника излучения, а также дейтериевой лампой в качестве корректора фона. Также система оборудована атомизатором проб, которые бывают 3 типов: пламенные, электрохимические и холодного пара. • графитовая печь (атомизатор электрохимического типа) используется для атомизации кадмия, меди, железа, свинца, никеля и цинка. Например, «Vapour Generation Accessory» (генератор пара). • автоматизированная система непрерывного гидридного генерирования атомного пара для испытаний на мышьяк и ртуть. Метод Всю лабораторную посуду и лабораторное оборудование перед использованием очищают раствором (10 г/л) азотной кислоты R в воде, не содержащей диоксида углерода R. Испытуемый раствор В колбу для мокрого озоления помещают указанное количество субстанции, которую предстоит оценивать (приблизительно 0,5 г препарата в форме порошка или 0,5 г жирного масла). Прибавляют 3 мл азотной кислоты R, 1 мл пероксида водорода R и 1 мл хлористоводородной кислоты R. Закрывают колбу, чтобы она стала воздухонепроницаемой. Помещают колбы для мокрого озоления в микроволновую печь. Озоление выполняют в 3 шага, следуя такой процедуре: 7 колб с испытуемым раствором нагревают на 80 % мощности в течение 15 мин; на 100 % мощности в течение 5 мин; затем на 80% мощности в течение 20 мин. После этого цикла оставляют колбы остыть на воздухе и в каждую добавляют по 4 мл серной кислоты R. Повторяют озоление. После остывания на воздухе открывают каждую колбу для мокрого озоления и переливают прозрачный, бесцветный раствор в 50-миллилитровую мерную колбу. Ополаскивают каждую колбу для мокрого озоления 2 объемами воды R по 15 мл, собирают смывы в мерную колбу. Прибавляют 1 мл раствора нитрата магния R с концентрацией 10 г/л и 1 мл раствора дигидрофосфат аммония R с концентрацией 100 г/л, доводят до объема 50 мл водой R. Холостой раствор Смешивают 3 мл азотной кислоты R, 1 мл пероксида водорода R (30%) и 1 мл хлористоводородной кислоты R в колбе для мокрого озоления. Проводят озоление так же, как описано для испытуемого раствора. B.1 Определение кадмия, меди, железа, свинца, никеля и цинка Измеряют содержание кадмия (Cd), меди (Cu), железа (Fe), свинца (Pb), никеля (Ni) и цинка (Zn) методом стандартных добавок с использованием растворов сравнения каждого из тяжелых металлов. Подходящие параметры приборов указаны в таблице A3.1. Поглощение компенсационной жидкости (холостой раствор) вычитают из значения, полученного для испытуемого раствора. Таблица A3.1. Параметры приборов для определения тяжелых металлов Cd Cu Fe Ni Pb Zn Длина волны нм 228,8 324,8 248,3 232 283,5 213,9 Ширина спектральной щели нм 0,5 0,5 0,2 0,2 0,5 0,5 Ток на лампе с полым катодом мА 6 7 5 10 5 7 Температура прокаливания °C 800 800 800 800 800 800 Температура атомизации °C 1 800 2 300 2 300 2 500 2 200 2 000 Корректор фона вкл. вкл. вкл. вкл. вкл. вкл. Скорость потока азота л/мин 3 3 3 3 3 3 B.2 Определение мышьяка и ртути Измеряют содержание мышьяка (As) и ртути (Hg), сопоставляя с растворами сравнения, содержащими эти элементы в известной концентрации, с помощью автоматизированной системы непрерывного гидридного генерирования атомного пара. Поглощение компенсационной жидкости (холостой раствор) автоматически вычитается из значения, полученного для испытуемого раствора. Мышьяк Раствор пробы К 19 мл испытуемого раствора или холостого раствора (описаны выше) прибавляют 1 мл раствора калия йодида R с концентрацией 200 г/л. Оставляют испытуемый раствор при комнатной температуре примерно на 50 мин или при температуре 70 °C примерно на 4 мин. Кислотный реактив Хлористоводородная кислота, не содержащая тяжелых металлов R. Восстанавливающий реактив Раствор натрия тетрагидробората R (6 г/л) в растворе натрия гидроксида R (5 г/л). Допускается использовать прибор с параметрами из таблицы A3.2. Ртуть Раствор пробы Испытуемый раствор или холостой раствор, как описано выше. Кислотный реактив Раствор хлористоводородной кислоты, не содержащей тяжелых металлов R (515 г/л). Восстанавливающий реактив Раствор (10 г/л) олова хлорида R или натрия тетрагидробората в разбавленной хлористоводородной кислоте R. Допускается использовать прибор с параметрами из таблицы A3.2. Таблица A3.2. Параметры приборов для определения мышьяка и ртути As Hg Длина волны нм 193,7 253,7 Ширина спектральной щели нм 0,2 0,5 Ток на лампе с полым катодом мА 10 4 Скорость потока кислотного реактива мл/мин 1,0 1,0 Скорость потока восстановителя мл/мин 1,0 1,0 Скорость потока раствора пробы мл/мин 7,0 7,0 Абсорбционная ячейка кварцевая (с нагревом) кварцевая (с нагревом) Корректор фона вкл. вкл. Скорость потока азота л/мин 0,1 0,1 Нагрев 800 °C 100 °C Приложение 4. Определение афлатоксинов Перед испытаниями на афлатоксины всегда требуется проводить соответствующую процедуру очистки, в ходе которой нужно соблюдать особую осторожность, чтобы не подвергнуть опасности персонал, рабочую зону или окружающую среду воздействию опасных и токсичных веществ. Поэтому в государствах-членах ВОЗ следует соответствующим образом адаптировать существующие надлежащие практики для государственных лабораторий контроля качества фармацевтических препаратов и GMP. Испытания необходимы только для продукции, для которой характерна контаминация афлатоксинами. Испытания на афлатоксины Назначение этих испытаний – обнаруживать афлатоксины B1, B2, G1 и G2, которые могут быть в пробе и являются высокотоксичными контаминантами в любом материале растительного происхождения. Метод испытания Для нижеописанного метода не требуется использовать токсичные растворители, такие как хлороформ и дихлорметан. Для определения афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 используют многофункциональные колонки, в которых есть липофильные и заряженные активные участки, и ВЭЖХ с детектированием по флуоресценции. Преимущества многофункциональных колонок следующие: • высокая степень извлечения афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 (выше 85 %); • до применения колонку можно хранить (про запас) при комнатной температуре достаточно долго. Стандартные растворы афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 (2,5 нг/мл) Базовый стандартный раствор Для получения базового стандартного раствора с концентрацией 20 μг/мл в стеклянную колбу помещают точную навеску в 1,0 мг каждого из кристаллических афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 и растворяют в 50 мл раствора толуола и ацетонитрила (9:1) путем активного встряхивания. Этот стандартный раствор можно хранить в плотно запечатанной упаковке, покрытой алюминиевой фольгой, в темноте, в холодильнике при температуре 4 °C. Рабочий стандартный раствор 0,5 мл базового стандартного раствора доводят раствором толуола и ацетонитрила (9:1) до объема 200 мл (рабочий стандартный раствор с концентрацией 50 нг/мл). Стандартный раствор 1,0 мл рабочего стандартного раствора доводят раствором толуола и ацетонитрила (9:1) до объема 20 мл (готовый стандартный раствор с концентрацией 2,5 нг/мл). Стандартный раствор для анализа с помощью ЖХ Переносят 0,25 мл готового стандартного раствора (описан выше) в стеклянную пробирку для центрифуги и выпаривают до сухости при температуре 40 °C или под потоком воздуха и азота. Чтобы дериватизировать афлатоксины B1 и G1 (предколоночная дериватизация), к оставшемуся в пробирке прибавляют 0,1 мл раствора трифторуксусной кислоты (TFA), плотно закупоривают и активно встряхивают пробирку. Оставляют отстояться при комнатной температуре на 15 мин (в темноте). Прибавляют в пробирку 0,4 мл раствора ацетонитрила и воды (1:9). Часть раствора пробы (20-μл) из пробирки подвергают анализу с помощью ЖХ. Подготовка пробы Материал растительного происхождения для испытания размалывают в кофемолке до однородной консистенции и экстрагируют 50 г испытуемой пробы в 400 мл смеси ацетонитрила и воды (9:1) путем активного встряхивания в стеклянной колбе с пробкой в течение 30 минут или с помощью механического устройства для смешивания в течение 5 минут. Пропускают раствор через фильтровальную бумагу или центрифугируют. 5 мл фильтрата или верхнего очищенного центрифугированием слоя переносят в многофункциональную колонку (например, в картриджную колонку «MultiSep #228 cartridge column» (Romer Labs) или в колонку Autoprep MF-A (Showa-denko)) и пропускают через нее со скоростью потока 1 мл/мин. Афлатоксины, присутствующие в пробе, проходят через колонку как первый элюат. В качестве испытуемого раствора отбирают первый 1 мл раствора, выходящий из колонки. Выпаривают 0,5 мл испытуемого раствора в стеклянной пробирке для центрифуги до сухости при температуре 40 °C или под потоком воздуха и азота, чтобы удалить растворитель. Чтобы дериватизировать афлатоксины B1 и G1 (предколоночная дериватизация), к оставшемуся в пробирке прибавляют 0,1 мл раствора трифторуксусной кислоты (TFA). Пробирку плотно закупоривают и активно встряхивают. Оставляют отстояться при комнатной температуре на 15 мин (в темноте). Прибавляют 0,4 мл раствора ацетонитрила и воды (1:9). Часть раствора пробы (20-μл) из пробирки подвергают анализу с помощью ЖХ. Метод Условия ЖХ В качестве подвижной фазы используется смесь ацетонитрила, метилового спирта и воды (1:3:6). Дегазируют подвижную фазу ультразвуком. Присоединяют колонку для жидкостной хроматографии, заполненную октадецилсиликагелем (ODS) (внутренний диаметр 4,6 мм × 250 мм, 3–5 μм), например «Inertsil ODS-3» (4,6 мм × 250 мм, 3 μм). Выдерживают температуру 40 °C и скорость потока 1 мл/мин. Афлатоксины и их производные детектируются на волне возбуждения и на волне испускания, на 365 нм и 450 нм, соответственно. Объем вводимой пробы – 20 μл. Если пик одной из примесей перекрывает пик, соответствующий афлатоксинам, рекомендуется использовать альтернативные условия ЖХ, которые описаны ниже. Альтернативные условия ЖХ Подвижная фаза – метиловый спирт и вода (3:7). Дегазируют подвижную фазу ультразвуком. Присоединяют колонку из фторопласта для жидкостной хроматографии, например, «Wako-pack Fluofix 120E» (4,6 мм × 250 мм, 5 μм). Выдерживают температуру 40 °C и скорость потока 1 мл/мин. Афлатоксины и их производные детектируются на волне возбуждения и на волне испускания, на 365 нм и 450 нм, соответственно. Объем вводимой пробы – 20 μл. Толкование результатов Сравнивают время удерживания, площадь или высоту пиков афлатоксина на хроматограммах. Если они превосходят полученные для стандартного раствора этого афлатоксина, следует считать, что проверка на присутствие афлатоксина в растворе пробы дала положительный результат. Приложение 5. Определение микроорганизмов A. Общее количество аэробных бактерий и грибов (суммарно) A.1 Предварительная обработка испытуемого материала растительного происхождения A.2 Процедуры испытаний A.3 Подтверждение продуктивности среды для культивирования, антибактериальных свойств субстанций и валидности счетных методов B. Испытания на конкретные микроорганизмы B.1 Предварительная обработка проверяемых материалов B.2 Процедуры испытаний на кишечные и некоторые другие грамотрицательные бактерии Определение бактерий Количественная оценка Escherichia coli Штаммы Salmonella Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Клостридии Шигеллы B.3 Валидация испытаний на определенные микроорганизмы A. Общее количество аэробных бактерий и грибов (суммарно) В соответствии с нижеописанной процедурой испытаний, общее количество аэробных бактерий и грибов (суммарно) в проверяемом материале растительного происхождения определяется с помощью одного из следующих методов: мембранной фильтрации, подсчета на чашке Петри или серийных разведений. Количество аэробных бактерий и грибов (плесневых и дрожжевых) определяется общим числом жизнеспособных аэробных микроорганизмов. Обычно для определенного лекарственного средства устанавливается максимально допустимое количество аэробных бактерий и грибов, и если их общее количество оказалось выше установленного, то такой материал следует отбраковать, не проводя никакие дальнейшие испытания. A.1 Предварительная обработка испытуемого материала растительного происхождения В зависимости от характеристик, присущих необработанному материалу растительного происхождения, его измельчают, переводят в суспензию или эмульсию с помощью подходящего метода и исключают любые антибактериальные свойства путем разбавления, нейтрализации или фильтрации. Для получения суспензии из испытуемого образца или для его разбавления используют либо фосфатный буфер с pH 7,2, либо фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном c pH 7,0, либо жидкую среду, применяемую в испытании. Чтобы проводимая обработка была приемлемой, должны соблюдаться особые требования, которые существуют для некоторых материалов. Некоторые примеры таких требований приводятся далее. A.1.1 Материалы, содержащие танины и антибактериальные вещества В некоторых растительных фармацевтических субстанциях сложно определить количество микробов. Например, в таких субстанциях, которые содержат танины или эфирные масла. Как уже упоминалось выше, если испытуемый образец проявляет противомикробную активность или содержит антибактериальные вещества, любые такие характеристики следует устранить. Для испытания берут смесь из нескольких порций лекарственного средства в нерасфасованном виде, набранных в случайном порядке, или из достаточного количества упаковок. Если испытуемые образцы разбавлены жидкой средой, испытание следует проводить быстро. A.1.2 Водорастворимые материалы Если нет иных указаний в процедуре проведения анализа конкретного материала, растворяют 10 г или разбавляют 10 мл растительного материала лактозным бульоном или другой подходящей средой, которая доказанно не оказывает противомикробное действие в условиях проведения испытания. Доводят той же средой до объема 100 мл. (Следует отметить, что для некоторых материалов понадобится использовать объем больше). При необходимости корректируют pH суспензии приблизительно до 7. A.1.3 Нерастворимые в воде не содержащие жиров материалы Если в процедуре проведения анализа конкретного материала нет иных указаний, суспендируют 10 г или 10 мл растительного материала в лактозном бульоне или другой подходящей среде, которая доказанно не оказывает противомикробного действия в условиях проведения испытания; доводят до объема 100 мл той же средой. (Следует отметить, что для некоторых материалов понадобится использовать больше среды). При необходимости разделяют материал на части и гомогенизируют суспензию механическим способом. Чтобы облегчить растворение, допускается добавить подходящее ПАВ, например, раствор полисорбата 20 R или 80 R (1 мг на мл). При необходимости корректируют значение pH суспензии приблизительно до 7. A.1.4 Жиросодержащие материалы Если в процедуре проведения анализа конкретного материала нет иных указаний, гомогенизируют 10 г или 10 мл растительного материала с 5 г полисорбата 20 R или 80 R. При необходимости нагревают до температуры, не превышающей 40 °C. (Иногда может понадобиться нагреть образец до 45 °C (на как можно более короткий срок)). Тщательно перемешивают, поддерживая температуру с помощью водяной бани или в печи. Прибавляют 85 мл лактозного бульона или другой подходящей среды, которая достоверно не оказывает никакого противомикробного действия в условиях испытания, при необходимости нагревают до температуры, не превышающей 40 °C. Поддерживают эту температуру столько, сколько необходимо, чтобы сформировалась эмульсия, стараясь, чтобы нагревание закончилось как можно быстрее; в любом случае процесс не должен длиться больше 30 минут. При необходимости корректируют pH эмульсии приблизительно до 7. A.2 Процедуры испытаний Подсчет на чашке Петри Бактерии Используют чашки Петри диаметром 9–10 см. На одну чашку при температуре не выше 45 °C помещают смесь 1 мл предварительно обработанного растительного материала и примерно 15 мл жидкого соево-казеинового агара. В качестве альтернативы материал распределяют по поверхности затвердевшей среды в чашке Петри. При необходимости материал разбавляют, чтобы предположительное количество колоний было не больше 300. Подготавливают минимум 2 чашки Петри с одним и тем же разведением, переворачивают и инкубируют при 30–35 °C в течение 48–72 часов (за исключением случаев, когда более надежные результаты можно получить за более короткое время). Считают количество образовавшихся колоний и вычисляют результаты, используя чашку с наибольшим количеством колоний (максимум до 300). Грибы Используют чашки Петри диаметром 9–10 см. На одну чашку при температуре не выше 45 °C помещают смесь из 1 мл предварительно обработанного растительного материала и примерно 15 мл жидкого агара Сабуро с глюкозой с добавлением антибиотиков (также используется картофельный агар с декстрозой с антибиотиками). В качестве альтернативы материал распределяют по поверхности затвердевшей среды в чашке Петри. При необходимости разбавляют материал, как описано выше, чтобы предположительное количество колоний было не больше 100. Подготавливают минимум 2 чашки Петри с одним и тем же разведением и инкубируют без переворачивания при 20–25 °C в течение 5 суток (за исключением случаев, когда более надежные результаты можно получить за более короткое время). Считают количество образовавшихся колоний и вычисляют результаты, используя чашку с наибольшим количеством колоний (максимум до 100). Мембранная фильтрация Используют мембранные фильтры с номинальным размером пор, не превышающим 0,45 μм, которые обладают доказанной эффективностью в удерживании бактерий, например, фильтры из нитроцеллюлозы используются для водных, масляных и слабоалкогольных растворов, а фильтры из ацетата целлюлозы лучше для растворов с высоким содержанием спирта. Нижеописанная техника предполагает применение фильтровальных дисков диаметром около 50 мм. Если диаметр дисков отличается от указанного, объемы разведений и смывов корректируют в соответствии с разницей. Стерилизуют надлежащим способом прибор для фильтрации и мембрану, поскольку раствор вводится, фильтруется и анализируется с соблюдением асептики, затем мембрана переносится на культуральную среду. Подробное описание метода Помещают 10 мл раствора, или количество, содержащее 1 г материала, в два прибора для мембранной фильтрации и тут же фильтруют. При необходимости разбавляют предварительно обработанный материал, чтобы ожидаемое количество колоний составило 10-100 штук. Промывают каждую мембрану – пропускают три раза подряд или больше приблизительно по 100 мл соответствующей жидкости, например, фосфатного буферного раствора с натрия хлоридом и пептоном с pH 7,0. Если материал жирный, может добавляться подходящее ПАВ, например, полисорбат 20 R или 80 R. Переносят один из мембранных фильтров, который изначально предназначался для подсчета бактерий, на поверхность чашки с соево-казеиновым агаром, а другой, который изначально предназначался для подсчета грибов, на поверхность чашки с агаром Сабуро с глюкозой с добавлением антибиотиков. Инкубируют чашки в течение 5 суток (за исключением случаев, когда более надежные результаты можно получить за другое время). Чашку для бактерий – при температуре 30–35 °C, для грибов – при 20–25 °C. Считают количество сформировавшихся колоний. Вычисляют количество микроорганизмов на грамм или миллилитр анализируемого материала; при необходимости число бактерий и грибов можно вычислять отдельно. Серийные разведения Готовят серию из 12 пробирок, каждая из которых содержит 9–10 мл соево-казеиновой среды. В каждую из 3 пробирок из: • первой группы прибавляют 1 мл раствора разбавленного (1:10) и гомогенизированного материала (содержащего 0,1 г или 0,1 мл образца), который получен согласно описанию в данном руководстве (см. раздел B.2); •второй группы прибавляют 1 мл разбавленного (1:100) материала; • третьей группы прибавляют 1 мл разбавленного (1:1 000) материала; • последней группы прибавляют 1 мл разбавителя. Инкубируют пробирки при температуре 30–35 °C в течение 5 суток, как минимум. В пробирках последней группы роста микроорганизмов наблюдаться не должно. В силу характеристик, присущих испытуемому материалу, если результат сложно интерпретировать или он неточный, микроорганизмы пересевают в жидкую или твердую среду и оценивают результаты после дополнительного периода инкубации. Определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов на грамм или на мл материала по таблице A5.1. Если число пробирок, в которых наблюдаются колонии микроорганизмов, в первой колонке – 2 или меньше, вероятнее всего количество микроорганизмов на грамм или мл меньше 100 (таблица A5.1). Таблица A5.1. Определение общего количества аэробных бактерий и грибов (суммарно) Кол-во пробирок с ростом микроорганизмовa Наиболее вероятное количество микро-организмов в г или мл 100 мг или 0,1 мл на пробирку 10 мг или 0,01 мл на пробирку 1 мг или 0,001 мл на пробирку 3 3 3 >1 100 3 3 2 1 100 3 3 1 500 3 3 0 200 3 2 3 290 3 2 2 210 3 2 1 150 3 2 0 90 3 1 3 160 3 1 2 120 3 1 1 70 3 1 0 40 3 0 3 95 3 0 2 60 3 0 1 40 3 0 0 23 a Количества в мг или мл обозначают первоначальное количество растительного материала. A.3 Подтверждение продуктивности среды для культивирования, антибактериальных свойств субстанций и валидности счетных методов Метод Обычно используют нижеперечисленные штаммы (см. также приложение 7): Staphylococcus aureus NCIMB 8625 (ATCC 6538-P, CIP 53.156) или NCIMB 9518 (ATCC 6538, CIP 4.83, IFO 13276) Bacillus subtilis NCIMB 8054 (ATCC 6633, CIP 52.62, IFO 3134) Escherichia coli NCIMB 8545 (ATCC 8739, CIP 53.126, IFO 3972) Candida albicans ATCC 2091 (CIP 1180,79, IFO 1393) или ATCC 10 231 (NCPF 3179, CIP 48.72, IFO 1594) Clostridia botulinum ATCC 19297 (NCTC 7272) Clostridium perfringens ATCC 13124 (NCTC 8239) Clostridium tetani ATCC e19406 (NCTC 279) Позволяют штаммам расти в отдельных пробирках с соево-казеиновой средой: аэробным бактериям – 18–24 часа при температуре 30–35 °C, Candida albicans – 48 часов при 20–25 °C. Чтобы добиться особой селективности, часто добавляют антибиотики. Разбавляют по порции каждой из культур фосфатным буферным раствором с натрия хлоридом и пептоном, pH 7,0, или фосфатным буфером, pH 7,2, чтобы подготовить испытуемые суспензии, содержащие 50–200 жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ) (микроорганизмов) на мл. Ростовые свойства сред проверяют, высевая по 1 мл каждого микроорганизма на каждую из сред. Испытуемые среды считаются удовлетворительными, если после инкубации в течение 5 суток при указанной температуре наблюдаются явные признаки роста микроорганизмов во всех средах, на которые их высевали. Если количество испытуемых организмов в испытуемом образце меньше 1/5 количества без испытуемого образца, это обязательно нужно исправить с помощью разбавления, фильтрации, нейтрализации или инактивации. Для подтверждения стерильности среды и разбавителя, а также соблюдения правил асептики при выполнении испытания, применяют метод из раздела «Общее количество аэробных бактерий и грибов» со стерильным фосфатным буферным раствором с натрия хлоридом и пептоном, pH 7,0, или фосфатным буферным раствором, pH 7,2 в качестве контроля. Роста микроорганизмов наблюдаться не должно. Чтобы валидировать метод, количество испытуемого микроорганизма, определенное этим методом, не должно отличаться от количества, подсчитанного для посевного материала, больше, чем в 10 раз. B. Испытания на конкретные микроорганизмы Испытания на микроорганизмы следует проводить, когда это необходимо: с исходными растительными материалами, промежуточными продуктами, готовыми препаратами. Кишечные бактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии: Escherichia coli, Salmonella и Staphylococcus aureus, – включаются в анализ как целевые штаммы. Условия проведения испытаний на контаминацию микробами разработаны так, чтобы возможность случайно контаминировать материалы во время испытания была минимальной, а принимаемые меры предосторожности ни в коем случае не должны отрицательно повлиять на микроорганизмы, которые возможно присутствуют в пробе. B.1 Предварительная обработка проверяемых материалов Информация об отборе проб и подготовке испытуемого раствора дана в разделе «Общее количество аэробных бактерий и грибов» (раздел A.2), в том числе там затрагивается тема удаления любых антибактериальных субстанций, которые могут присутствовать в пробе. B.2 Процедуры испытаний на кишечные и некоторые другие грамотрицательные бактерии Определение бактерий Гомогенизируют предварительно обработанный материал и инкубируют при температуре 30–37 °C в течение времени, достаточного для регенерации бактерий, но не для размножения микроорганизмов (обычно это 2-5 часов). Встряхивают емкость, переносят аликвоты гомогенизированного материала, эквивалентные 1 г или 1 мл, на 100 мл бульона Мосселя для обогащения энтеробактерий и инкубируют при температуре 35–37 °C 18–48 часов. Пересевают на чашку с агаром Мосселя и инкубируют при 35–37 °C в течение 18–48 часов. На чашке не должно наблюдаться роста колоний грамотрицательных бактерий. Количественная оценка Высевают на соответствующее количество бульона Мосселя для обогащения энтеробактерий соответствующее количество гомогенизированного материала, как описано в разделе «Определение бактерий» выше. При необходимости разбавляют надлежащим образом, чтобы проба содержала 1 г, 0,1 г и 10 μг (или 1 мл, 0,1 мл и 10 μл) рассматриваемого материала. Инкубируют при температуре 35–37 °C в течение 24–48 часов. Пересевают каждую из культур на чашки с агаром Мосселя, чтобы выделение было избирательным. Инкубируют при 35–37 °C 18–24 часа. Положительный результат – рост хорошо развитых колоний грамотрицательных бактерий, обычно красного или красноватого цвета. Отмечают минимальное количество материала, которое дает положительный результат. Определяют вероятное количество бактерий по таблице A5.2. Таблица A5.2. Определение кишечных бактерий и некоторых других грамотрицательных бактерий Результат для каждого количества или объема Наиболее вероятное кол-во бактерий в г или мл 1,0 г или 1,0 мл 0,1 г или 0,1 мл 0,01 г или 0,01 мл + + + >102 + + – <102, но >10 + – – <10, но >1 – – – <1 Escherichia coli Переносят содержащий 1 г или 1 мл исследуемого материала гомогенизированный материал в лактозном бульоне, подготовленный и инкубированный как описано выше, к 100 мл бульона Мак-Конки и инкубируют при 43–45 °C в течение 18–24 часов. Пересевают на чашку с агаром Мак-Конки и инкубируют при 43–45 °C 18–24 часа. Рост красных, обычно немукоидных колоний грамотрицательных палочек, иногда окруженных красноватой зоной преципитации, указывает на возможное присутствие E. coli. Это можно подтвердить по образованию индола при 43,5–44,5 °C или с помощью биохимических реакций. Материал считается соответствующим требованиям, если не обнаружено описанных колоний или подтверждающие биохимические реакции показывают отрицательный результат. Виды Salmonella Раствор, суспензию или эмульсию предварительно обработанного материала, подготовленного как описано выше, инкубируют при 35–37 °C в течение 5–24 часов (в зависимости от того, сколько времени необходимо для обогащения среды). Первое испытание Переносят 10 мл обогащенной культуры в 100 мл бульона с тетратионатом, бриллиантовым зеленым и жёлчью и инкубируют при температуре 42–43 °C в течение 18–24 часов. Пересевают минимум на две из трех перечисленных агаровых сред: дезоксихолат-цитрат агар, ксилоза-лизин-дезоксихолат агар и агар с бриллиантовым зелёным. Инкубируют при 35–37 °C в течение 24–48 часов. Если развились колонии, подходящие под описание в таблице A5.3, проводят второе испытание. Второе испытание Все колонии, у которых наблюдаются характеристики, описанные в таблице A5.3, пересевают глубинным способом на поверхность трёхсахарного агара с солями железа. Сначала засевают наклонную поверхность среды, а затем прокалывают твёрдую питательную среду той же иглой, что использовалась для посева, после чего инкубируют при 35–37 °C в течение 18–24 часов. Результат указывает на присутствие бактерий вида Salmonella, если культура в глубине слоя (но не на поверхности среды) меняет цвет с красного на желтый, обычно это сопровождается газообразованием с появлением сероводорода в агаре или без этого. Результат подтверждают с помощью соответствующих биохимических и серологических испытаний. Испытуемый материал считается соответствующим требованиям, если описанные культуры не появляются в первом испытании или результат биохимических и серологических испытаний отрицательный. Таблица A5.3. Описание колоний Salmonella, вырастающих на разных культуральный средах Среда Описание колонии Дезоксихолат-цитрат агар Хорошо развитая, бесцветная Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар Хорошо развитая, красная, с черными центрами или без Агар с бриллиантовым зелёным Маленькая, прозрачная и бесцветная, или матовая, розовая или белая (часто в окружении зоны, цвет которой варьируется от розового до красного). Pseudomonas aeruginosa Проводят предварительную обработку испытуемых материалов, как описано в разделе A.1, но с использованием фосфатного буферного раствора с натрия хлоридом и пептоном, pH 7,0, или другой подходящей среды, которая доказанно не оказывает противомикробного действия в условиях испытания, на замену лактозному бульону. Засевают 100 мл соево-казеиновой среды количеством полученных таким образом раствора, суспензии или эмульсии, содержащим 1 г или 1 мл рассматриваемого материала. Перемешивают и инкубируют при 35–37 °C в течение 24–48 часов. Пересевают на чашку с цетримидным агаром и инкубируют при 35–37 °C в течение 24–48 часов. Материал считается соответствующим требованиям, если не обнаружено никакого роста микроорганизмов. Если наблюдается рост колоний грамотрицательных палочек, обычно с зеленоватым свечением, проводят пробу на оксидазу и проверяют на рост в соево-казеиновой среде при 42 °C. Может использоваться следующий метод. Помещают 2 или 3 капли свежеприготовленного раствора N,N,N’,N’-тетраметил-п-фенилендиамида дигидрохлорида R с концентрацией 0,01 г/мл на фильтровальную бумагу и мазком наносят предполагаемую колонию. Считается, что результат анализа положительный, если в течение 5-10 секунд появляется фиолетовое окрашивание. Материал соответствует требованиям, если культуры описанного типа не вырастают, либо подтверждающий биохимический анализ дает отрицательный результат. Staphylococcus aureus Подготавливают обогащенную культуру, как описано для Pseudomonas aeruginosa. Пересевают на подходящую среду, например, на агар Байрда Паркера. Инкубируют при 35–37 °C в течение 24–48 часов. Материал считается соответствующим требованиям, если не обнаруживается никакого роста микроорганизмов. На присутствие Staphylococcus aureus могут указывать черные колонии грамположительных кокков, часто окруженные чистыми зонами. Подтвердить присутствие каталазоположительных кокков можно, например, с помощью испытаний на коагулазу и ДНКазу. Материал считается соответствующим требованиям, если культуры описанного типа не вырастают, либо подтверждающий биохимический анализ дает отрицательный результат. Виды Clostridium По 10 г (10 мл) материала растительного происхождения, субстанции или препарата, которые предстоит анализировать, помещают в два подходящих сосуда, в каждом из которых по 100 мл среды с отварным мясом, непосредственно перед использованием разогретой на несколько минут до 100 °C и затем охлажденной до 37 °C. Чтобы дифференцировать образующие и не образующие споры микроорганизмы, один из сосудов сразу же запечатывают слоем стерильного парафина или агар-агара, а другой сосуд перед запечатыванием в течение 30 минут нагревают при 65 °C. Инкубируют оба сосуда при температуре 35–37 °C и проверяют каждые 24 часа в течение срока до 4 суток. В сосуде, который не грели после инокуляции, будут размножаться образующие споры микроорганизмы. Если роста не наблюдается ни в одном из сосудов, значит, клостридий и других анаэробных бактерий в пробе нет. Если в пробе обнаруживаются образующие споры анаэробные микроорганизмы (таблица A5.4), культуры высевают, по два раза каждую, на половину поверхности чашек с 5% средой из агара и дефибринированной крови овцы. Инкубируют при 37 °C в течение 48 часов, одну чашку в анаэробных условиях, другую в аэробных, чтобы убедиться, что в аэробных условиях не будут расти никакие микроорганизмы. Таблица A5.4. Характеристики видов Clostridium на среде с отварным мясом Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Кусочки мяса не перевариваются; образуется много газа, выпадает белый осадок Кусочки мяса не перевариваются, становятся розового цвета. Кусочки мяса не перевариваются; ощущается запах горелой органики После истечения 24 и 48 часов осматривают внешний вид колоний и тип и распространенность гемолиза, а также под микроскопом с помощью окрашивания по Граму или окрашивания спор проверяют на образование спор. Полученные результаты сравнивают с описанием в таблице A5.5, чтобы провести дальнейшее определение вида обнаруженных клостридий. Таблица A5.5. Характеристики видов Clostridium на 5% среде из агара и дефибринированной крови овцы Clostridium botulinum Clostridium perfringens Clostridium tetani Колонии Неправильной формы, прозрачные с крупчатой поверхностью и нечетким, бахромчатым, распространяющимся краем Большие, круглые, выпуклые, полупрозрачные, гладкие по всем краям Прозрачные с длинными перьевидными распространяющимися отростками Гемолиз + Двойная зона + Споры Овальные, по центру, субтерминально расположенные Отсутствуют Сферической формы, расположение терминальное («барабанная палочка») Shigella Нижеописанный метод взят из Руководства ВОЗ по борьбе с эпидемиями, вызываемыми Shigella dysenteriae типа 1. Прямой посев на чашки с агаром Используют 2 или 3 петли для посева материала растительного происхождения, растительной фармацевтической субстанции или готового растительного лекарственного препарата, которые предстоит протестировать. Инкубируют чашки при температуре 35–37 °C в течение 18–24 часов. Высевают на универсальную среду для чашек Петри с низкой селективностью и на среду со средней или высокой селективностью. В качестве среды с низкой селективностью рекомендуется использовать агар Мак-Конки. В литературе сообщалось, что для S. dysenteriae типа 1 (Sd1) особенно хорош агар Мак-Конки с добавлением 1 мкг теллурита калия на мл. Высевают небольшое количество пробы. Инкубируют при температуре 35–37 °C в течение 18–24 часов. В качестве среды со средней или высокой селективностью для выделения шигелл рекомендуется ксилоза-лизин-дезоксихолат (XLD) агар. Подходящая замена – дезоксихолат-цитрат агар (DCA). Примечание. SS-агар для выделения сальмонелл и шигелл не используют, так как он часто ингибирует рост Sd1. Перед использованием в каждодневной работе следует проверять качество каждой новой серии среды путем высевания на нее изученных стандартных штаммов и наблюдения за их ростом и характеристиками образующихся колоний. Определение колоний на среде для чашек Петри Колонии, которые предположительно образованны шигеллами, выглядят следующим образом: • на агаре Мак-Конки: выпуклые, бесцветные, 2–3 мм; • на ксилоза-лизин-дезоксихолат агаре: красные, гладкие, 1–2 мм; • на дезоксихолат-цитрат агаре: бесцветные, прозрачные, 2–3 мм. Находят хорошо отделенные друг от друга колонии, которые имеют характерный внешний вид, чтобы перенести из каждой среды на чашке для дальнейшего тестирования, и оставляют пометку на дне чашки Петри. По возможности сотрудник с опытом в опознавании Shigella должен заниматься обучением тех работников лаборатории, у кого такого опыта нет. Высевание на агар Клиглера с железом Отбирают из среды на чашках три имеющие характерный вид колонии и высевают в агар Клиглера с железом (KIA) следующим способом: протыкают столбик питательной среды в пробирке, а затем штрихуют наклонную часть зигзагом. Внимательно маркируют пробирки. Если используются пробирки с KIA с закручивающимися крышками, проверяют, что крышки закручены некрепко. Инкубируют в течение ночи. Наутро рассматривают реакции в пробирках с KIA. В пробирках, в которых предположительно есть шигеллы, нижняя часть среды будет кислой (желтой), а наклонная поверхность среды – щелочной (красной). В них не будет ни газа (пузырьков или трещин в агаре), ни сероводорода (черного вдоль линии прокола). Также для идентификации шигелл можно использовать трёхсахарный агар с солями железа (TSI). Будут наблюдаться такие же реакции, как и при применении KIA. B.3 Валидация испытаний на конкретные микроорганизмы При необходимости, испытуемые штаммы, перечисленные в таблице A5.6, выращивают на указанных средах отдельно при 30–35 °C в течение 18–24 часов. Разбавляют порцию каждой из культур фосфатным буферным раствором с натрия хлоридом и пептоном, pH 7,0, так чтобы испытуемая суспензия содержала около 103 микроорганизмов на мл. Смешивают равные объемы каждой из суспензий и используют около 0,4 мл (приблизительно 102 микроорганизма каждого из штаммов) в качестве инокулята в испытаниях на Escherichia coli, виды Salmonella, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, при необходимости в присутствии материала, который оценивается. Этот метод испытаний должен давать положительный результат для соответствующего штамма микроорганизмов. Таблица A5.6. Валидация испытаний для определения конкретных микроорганизмов в пробе растительного происхождения Микроорганизм Номер штаммаa Среда Escherichia coli Например, NCIMB 8545 (ATCC 8739, CIP 53.126, IFO 3972) лактозный бульон Pseudomonas aeruginosa Например,NCIMB 8626 (ATCC 9027, CIP 82.118) соево-казеиновая среда Salmonella typhimurium Нет рекомендуемого номера штамма. Можно использовать штаммы бактерий, не оказывающие патогенного действия на человека, например, Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80,39) лактозный бульон Clostridium botulinum Например, ATCC 19297 (NCTC 7272) среда из вареного мяса Clostridium perfringens Например, ATCC 13124 (NCTC 8239) среда из вареного мяса Clostridium tetani Например, ATCC e19406 (NCTC 279) среда из вареного мяса Staphylococcus aureus Например, NCIMB 8625 (ATCC 6538 P, CIP 53.156) или NCIMB 9518 (ATCC 6538, CIP 4.83, IFO 13276) соево-казеиновая среда a см. приложение 7. Информация о других микроорганизмах рассматривается в разделе A.3. Приложение 6. Определение остаточных пестицидов Содержание Общая информация 1. Определение общего количества хлора и фосфора 2. Определение хлоридов 3. Определение фосфатов 4. Качественное и количественное определение хлорорганических пестицидов 5. Анализ эфиров в органофосфорных соединениях 6. Определение конкретных остаточных пестицидов в лекарственном растительном материале 7. Определение остаточного десметрина, прометрина и симазина 8. Определение конкретных хлорорганических, органофосфорных и пиретроидных остаточных пестицидов Общая информация Методы определения остаточных пестицидов В качестве основного метода определения остаточных пестицидов рекомендуется использовать хроматографию (в основном, колоночную и газовую). Эти методы можно сочетать с масс-спектрометрией (MS). Пробы экстрагируют в соответствии со стандартной процедурой, примеси удаляют с помощью распределительной и адсорбционной хроматографии, а наличие достаточно широкого спектра пестицидов определяют за 1 раз. Некоторые пестициды достаточно хорошо проходят процедуры экстракции и очистки, извлечение некоторых не так велико, а некоторые в результате бывают потеряны окончательно. После хроматографии разделение может не всегда быть полным, пестициды могут распадаться и образовывать метаболиты, а многие продукты обмена веществ все еще остаются неизвестными. Следовательно, пока что, в силу ограничений техники анализа и неполноты знаний о взаимодействиях пестицидов с окружающей средой, невозможно в любых обстоятельствах использовать единый набор методов с удовлетворительным результатом. Как правило, методологию рекомендуется подгонять под тип материала растительного происхождения, который проходит испытание, и могут понадобиться модификации для разных видов проб, включая семена, листья, растительные масла, экстракты, готовые лекарственные препараты, а также для проб с разным содержанием жидкости. Кроме того, спектр пестицидов, на которые предстоит проверять пробу, зависит от того, какие именно пестициды применяли к растительному материалу и о применении каких стойких пестицидов в регионе в прошлом имеются данные. По этим причинам желательно проверять растительные материалы, о которых ничего не известно, на присутствие разнообразных соединений, а не только на отдельные пестициды. Для этой цели подходит ряд методов. Пестициды, в молекулы которых входит хлор, например, можно обнаружить путем измерения общего содержания органического хлора; количество инсектицидов, содержащих фосфат, можно определить с помощью анализа на общее содержание органического фосфора, тогда как пестициды, в которых есть мышьяк и свинец, можно обнаружить по общему содержанию мышьяка или свинца, соответственно. Точно так же общее содержание связанного сероуглерода в образце послужит информацией о присутствии или отсутствии в пробе остаточных веществ дитиокарбаматных фунгицидов. При использовании таких общих методов важно обязательно уделять внимание тому, чтобы гарантировать отсутствие нежелательного влияния на результаты присутствия в составе растений определенных соединений, содержащих целевые химические элементы. Если известно, какой пестицид воздействовал на растительный материал, или это можно определить подходящим способом, следует проводить определение остаточного количества этого конкретного пестицида. Общие вопросы методологии анализа Анализ проб следует проводить как можно скорее после отбора, пока не успело произойти никаких физических или химических изменений. Если предполагается, что хранение будет долгим, предпочтительно хранить пробы в воздухонепроницаемой упаковке при отрицательных температурах. Также может представлять проблему содержание воды в пробах, в некоторых имеющих официальный статус фармакопеях содержание воды при определении хлорорганических и пиретроидных инсектицидов ограничено 15 % и ниже. Воздействие света может приводить к разложению многих пестицидов, поэтому рекомендуется защищать от него пробы и любые экстракты и растворы. Тип используемого материала для упаковки или обертки не должен взаимодействовать с пробой или влиять на результаты анализа. Растворители и реактивы, используемые с методом анализа, не должны содержать веществ, которые могут вмешиваться в реакцию, влиять на результаты эксперимента или провоцировать разложение остаточного пестицида в пробе. Обычно необходимо использовать специально очищенные или свежедистиллированные в полностью стеклянном дистилляторе растворители. Следует провести контрольное определение с холостыми пробами с растворителями, концентрируя и тестируя их, как описано в процедуре испытаний рассматриваемого растительного материала. Для отделения нежелательного материала от пробы следует использовать самые простые и быстрые процедуры (очистки), чтобы сэкономить время, если предстоит анализировать большое количество проб. Процесс концентрирования растворов следует проводить с большой внимательностью, особенно на этапе выпаривания последних следовых количеств растворителя, чтобы не терялись остаточные пестициды. Поэтому часто последние следовые количества растворителя удалять не рекомендуется. Чтобы замедлить потерю относительно летучих пестицидов, особенно при выпаривании остатков растворителя, можно добавить такие вещества, как минеральное масло или другие масла с низкой летучестью, которые могут сохранить раствор. Однако, хотя такие вещества и подходят для колориметрических анализов, добавлять их при использовании методов газовой хроматографии обычно нежелательно. Может понадобиться выпарить нестойкие к температурному воздействию соединения, используя ротационный вакуумный испаритель. Определение общего количества хлора и фосфора В большинстве пестицидов содержится органически связанный хлор или фосфор. Процедура Подготовка проб Смалывают растительный материал в мелкий порошок и экстрагируют в смеси воды и ацетонитрила R. Большинство пестицидов растворимо в этой смеси, тогда как большинство составляющих клеток (например, целлюлоза, белки, аминокислоты, крахмал, жиры и родственные соединения) растворимы умеренно, и поэтому пестициды удаляются. Также может быть раствориться ряд полярных или умеренно полярных веществ, поэтому необходимо перенести пестициды в петролейный эфир R. Если пестициды содержат хлор, дальнейшая очистка требуется редко, но если они содержат фосфор, то может понадобиться дополнительная очистка с помощью колоночной хроматографии со смесями петролейного эфира R и эфира R в качестве элюента. Подготовка колонки В качестве носителя используют активированный при 650 °C Флорисил R для анализа на остаточные пестициды (PR), 60/100 меш (или эквивалент). Если этот материал поставляется в нерасфасованном виде, сразу после вскрытия его переносят в 500-миллилитровую стеклянную банку или бутылку со стеклянной пробкой или фольгированной по нижней стороне накручивающейся крышкой. Хранят в темном месте. Перед использованием нагревают до температуры не ниже 130 °C, охлаждают до комнатной температуры в десикаторе и через 2 суток снова нагревают до 130 °C. Подготавливают колонку с Флорисилом (внешний диаметр – 22 мм), в которой после отстаивания должно быть 10 см активированного Флорисила и 1 см натрия сульфата безводного R поверх него. Предварительно смачивают колонку 40–50 мл петролейного эфира R. Помещают под колонку мерную колбу, в которой будет собираться элюат. Метод Измельчают материал так, чтобы частицы проходили через сито № 710 или 840, и тщательно перемешивают. Помещают 20–50 г измельченной пробы в блендер, прибавляют 350 мл ацетонитрила R с 35 % воды (к 350 мл воды прибавляют достаточно ацетонитрила R, чтобы получить 1 000 мл). Смешивают 5 минут на высокой скорости. Выполняют вакуумную фильтрацию в 500-миллилитровую отсосную колбу через подходящую воронку диаметром 12 см, в которую помещен бумажный фильтр. Переносят фильтрат в 250-миллилитровый мерный цилиндр и записывают объем. Переносят фильтрата измеренного объема в 1-литровую сепараторную воронку и аккуратно прибавляют 100 мл петролейного эфира R. Активно встряхивают 1–2 минуты, прибавляют 10 мл натрия хлорида (400 г/л) TS и 600 мл воды. Держат сепараторную воронку горизонтально и энергично перемешивают содержимое в течение 30–45 секунд. Позволяют разделиться на слои, отбрасывают водный слой и аккуратно промывают слой растворителя двумя порциями воды по 100 мл. Отбрасывают смывы, переносят слой растворителя в 100-миллилитровый цилиндр со стеклянной пробкой, записывают объем. Прибавляют около 15 г натрия сульфата безводного R и активно встряхивают. Нельзя, чтобы реактив и экстракт контактировали больше 1 часа. Переносят экстракт напрямую в колонку с Флорисилом; при необходимости сначала сокращают объем до 5–10 мл. Пропускают через колонку не быстрее 5 мл в минуту. Тщательно промывают цилиндр двумя порциями петролейного эфира R по 5 мл, переносят их в колонку, при необходимости промывают еще несколькими маленькими порциями петролейного эфира R, а затем элюируют с той же скоростью с 200 мл эфира/петролейного эфира TS1. Меняют колбу-приемник и элюируют еще с 200 мл эфира/петролейного эфира TS2. Еще раз меняют колбу-приемник и эллюируют еще с 200 мл эфира/петролейного эфира TS3. Выпаривают каждый элюат до соответствующего требованиям объема для дальнейшего тестирования. • Первый элюат содержит хлорированные пестициды (альдрин, ДДЕ, ТДЕ (ДДД), о,п’- и п,п’-ДДТ, ГХЦГ, гептахлор, гептахлора эпоксид, линдан, метоксихлор), полихлорированные дифенилы (ПХД) и фосфатированные пестициды (карбофенотион, этион и фенхлорфос). • Второй элюат содержит хлорированные пестициды (дильдрин и эндрин) и фосфатированные пестициды (паратион-метил и паратион). • Третий элюат содержит фосфатированные пестициды (малатион). Сжигание органического вещества Сжигание органического вещества с кислородом – подготовительный шаг для определения хлора и фосфора. Пестицид экстрагируют из пробы и, при необходимости, очищают. Экстракт концентрируют, выпаривают до сухости, переносят на держатель пробы, сжигают в подходящей конической колбе с кислородом. Образовавшиеся при сжигании газы затем абсорбируются в подходящий раствор. Поглощенный раствором хлор определяют как хлорид, а фосфор как ортофосфат, в обоих случаях используется колориметрия. Прибор Сжигание выполняют в 1-литровой конической колбе из боросиликатного стекла, в пробку которой впаян кусочек платиновой проволоки диаметром около 1 мм. К свободному концу проволоки присоединен кусочек сетки из платины размером 1,5 × 2 см, чтобы иметь возможность держать пробу чистой от поглощающей жидкости во время сжигания. Держатель пробы для остаточных веществ, содержащих хлор Для маленького количества твердого материала используют держатель пробы из кусочка не содержащей галогенидов фильтровальной бумаги длиной около 5 см и шириной около 3 см; для маленького количества жидкости предпочтителен держатель пробы в форме конуса из ацетатцеллюлозной пленки. Конус готовят следующим образом: в тканых перчатках вырезают из пленки по подходящему картонному шаблону круг диаметром 4 см. Вручную скрепляют два края, чтобы получить конус. Запечатывают соединенные края под воздействием температуры, чтобы шов был около 5 мм шириной. Погружают шов в ацетон R примерно на половину ширины на 10 секунд. Вынимают и тут же сушат потоком горячего воздуха. С помощью пинцета промывают конус, окуная его в 1-литровый лабораторный стакан с теплым TS натрия гидроксида (~240 г/л) в течение 10 секунд при температуре около 60 °C. Тщательно споласкивают конус водой и оставляют высохнуть на куске алюминиевой фольги. Помещают каждый конус в чистую воронку (диаметром 65 мм). Держатель пробы для остаточных веществ, содержащих фосфор В качестве держателя пробы используют квадрат не содержащей галогенидов фильтровальной бумаги размером около 4 см. Сжигание остаточных веществ, содержащих хлор Переносят аликвоту подготовленного в соответствии с приведенным выше описанием экстракта на держатель пробы, помещенный в воронку с растворителем, который не растворит держатель. Дают растворителю испариться. В резиновых перчатках убирают из воронки держатель пробы и его сухое содержимое, сворачивают держатель, чтобы получился маленький конверт площадью около 1 см2. Конверт закрепляют на платиновой сетке. Вставляют в верхнюю часть держателя, между слоями, узкую полоску фильтровальной бумаги, примерно 1×3 см, чтобы использовать как фитиль. Прибавляют в колбу для сжигания 30 мл воды. Увлажняют водой горлышко колбы. Заполняют колбу кислородом через трубку, конец которой находится сразу над поверхностью жидкости. Поджигают свободный конец полоски из фильтровальной бумаги и сразу же затыкают колбу пробкой. Крепко удерживают пробку на месте. Когда начинается активное горение, колбу наклоняют, чтобы не полностью прогоревший материал не упал в жидкость. Сразу после того, как сжигание закончится, колбу активно встряхивают в течение 10 минут, чтобы растворить продукты горения. Помещают на край колбы небольшое количество воды и аккуратно вынимают пробку. Ополаскивают пробку, платиновую проволоку, платиновую сетку и стенки колбы водой. Переносят жидкость из колбы и смывы в 50-миллилитровую мерную колбу и доводят до объема водой. Сжигание остаточных веществ, содержащих фосфор Окунают держатель пробы из фильтровальной бумаги в метанольный раствор гидроксида натрия (TS), а затем суспендируют в потоке нагретого воздуха. Сразу после этого переносят аликвоту подготовленного как указано выше экстракта около 0,2 мл на держатель пробы с помощью 0,2-мл порций хлороформа R с использованием микропипетки. Позволяют растворителю испариться с бумаги, сворачивают ее, чтобы получился маленький конверт площадью около 1 см2. Закрепляют конверт на середине платиновой сетки. Вставляют узкую полозку фильтровальной бумаги, примерно 1 × 3 см, в верхнюю часть держателя, между слоями, чтобы использовать как фитиль. Прибавляют в колбу для сжигания 10 мл TS серной кислоты(~37 г/л) и продолжают процедуру сжигания, как описано выше. Переносят раствор и использованную при смывании жидкость в 25-миллилитровую мерную колбу и доводят до объема водой. Определение хлоридов Прибор Определение проводят со спектрофотометром, способным измерять поглощение при длине волны в 460 нм, с абсорбционной кюветой с длиной оптического пути в 2 см и 10 см. Метод Помещают 15 мл полученного в результате сжигания раствора в 50-мл коническую колбу с 1 мл VS железа(III)-аммония сульфата (0,25 моль/л) и 3 мл TS тиоцианата ртути. Взбалтывают содержимое колбы круговыми движениями и оставляют отстояться на 10 минут. Переносят порцию раствора в 2-см кювету и измеряют поглощение при 460 нм, при этом в кювете для сравнения налита вода. Считывать результаты следует быстро, чтобы избежать абсорбции хлоридов из воздуха. Подготавливают стандартный раствор натрия хлорида R с 5 μг хлорида на мл. Переносят аликвоты (0 мл, 2 мл, 4 мл, 6 мл, 8 мл и 10 мл) этого раствора в серию 50-мл конических колб и доводят до 15 мл водой. Проявляют цвет и измеряют поглощение, как описано выше. Строят график поглощения с точки зрения содержания хлорида в разведениях в μг на мл и путем вставки в этот график определяют содержание хлорида в растворах испытуемого материала. Определение фосфатов Фосфорномолибденовокислый метод основан на реакции ионов фосфата с молибдатом аммония с формированием молибденофосфатного комплекса, который потом восстанавливается до интенсивно окрашенного в синий молибденового комплекса. Интенсивность окрашивания измеряют спектрофотометрическим способом. Описанный метод применяется для определения любых фосфатов, которые прошли предварительное разделение. В большинстве проб фосфаты присутствуют естественным образом, часто они не удаляются из проб в ходе процедур очистки. В силу этого обстоятельства, нужно провести определение всех проб, даже тех, где нет фосфатосодержащих пестицидов, чтобы узнать фоновое содержание фосфатов. Экстракты большинства материалов, не контаминированных фосфатами, содержат около 0,05–0,1 мг/кг фосфора. Поэтому, если полученные результаты попадают в этот диапазон, нельзя считать, что есть контаминация органофосфатами. Прибор Определение выполняется с применением спектрофотометра, который может измерять поглощение при длине 820 нм, с абсорбционной кюветой с длиной оптического пути в 1 см. Метод Помещают 7 мл раствора, полученного в результате сжигания, в 50-мл калиброванную пробирку. Прибавляют 2,2 мл TS серной кислоты (300 г/л) и хорошо перемешивают раствор. Прибавляют 0,4 мл TS молибдата аммония (40 г/л) и взбалтывают раствор круговыми движениями. Затем прибавляют 0,4 мл TS амино-нафтол-сульфоновой кислоты и снова взбалтывают круговыми движениями. Нагревают раствор до 100 °C на 12 минут (± 2 минуты), охлаждают и переносят порцию раствора в 1-см кювету. Измеряют поглощение при 820 нм, при этом в кювете для сравнения налита вода. Подготавливают стандартные разведения с известными количествами фосфата и измеряют поглощение, как описано выше. Строят график поглощения с точки зрения содержания фосфата в разведениях в μг на мл и путем вставки в этот график определяют содержание фосфата в растворах испытуемого материала. Качественное и количественное определение хлорорганических пестицидов Подготовка проб Помещают 20 г (точную навеску) измельченного в порошок растительного материала (сито № 180) в 500-мл лабораторный стакан (высокий), смешивают с 98 мл воды и оставляют для мацерации минимум на 30 минут. Прибавляют 200 мл ацетона R; полученный в итоге объем экстрагента составит 295 мл. Экстрагируют в течение 5 минут, пока остывает, с помощью высокоскоростного миксера. Используя слабый вакуум, фильтруют гомогенизированную смесь через фарфоровый фильтр (воронка Бюхнера, диаметр 70 мм) с фильтровальной бумагой в 250-мл мерный цилиндр, так чтобы процесс занимал не дольше 1 минуты, а затем измеряют объем (V) фильтрата в мл. Метод Переносят фильтрат, подготовленный в соответствии с описанием, которое приведено выше, в 500-мл сепараторную воронку. Прибавляют количество хлорида натрия R, эквивалентное в граммах 1/10 объема фильтрата, затем прибавляют 100 мл дихлорметана R. Активно встряхивают в течение 5 минут, дают фазам разделиться и отбрасывают нижний (водный) слой. Высушивают фазу ацетон-дихлорметана, переносят в 500-мл коническую колбу, прибавляют 25 г натрия сульфата безводного R, время от времени взбалтывают круговыми движениями. Затем фильтруют раствор в 500-мл колбу с притертой стеклянной пробкой, используя стеклянную воронку (диаметром 100 мм) с очищенной стекловатой и натрия сульфат безводный R. Споласкивают сепараторную воронку, коническую колбу и стеклянную воронку дважды 10 мл этил ацетата R. Прибавляют 5 мл 2,2,4-триметил пентана R и концентрируют первичный экстракт до объема 2 мл в ротационном вакуумном испарителе на водяной бане с температурой 30–40 °C. Удаляют оставшийся растворитель несильной струей воздуха. Для проведения очистки с помощью гель-хроматографии замачивают 50 г подходящих гранул (например, Bio-Beads™ S-X3) в смеси для элюирования из циклогексана R и этила ацетата R (1:1) и выливают в хроматографическую колонку (длиной 600 мм, диаметром 25 мм), которая модифицирована для работы с вакуумным насосом. Ополаскивают слой геля смесью для элюирования без доступа воздуха. Растворяют экстракт в колбе с 5 мл этила ацетата R. Прибавляют 2 г натрия сульфата безводного R, аккуратно взбалтывают круговыми движениями и прибавляют 5 мл циклогексана R. Пропускают полностью растворившийся первичный экстракт через скоростной фильтр в 10-мл пробирку и сразу же затыкают притертой стеклянной пробкой. Затем переносят 5 мл фильтрата в колонку с гелем. Элюируют смесью для элюирования со средней скоростью 5 мл/мин. Первыми через колонку проходят компоненты растительного материала, затем действующие вещества пестицидов. Обязательно определять фракционирование для каждой из колонок с использованием подходящих субстанций сравнения. Отбрасывают первую фракцию, которая содержит примеси (около 100 мл). Собирают хлорорганические пестициды, появляющиеся в следующей порции элюата (около 70 мл) в колбу с притертой стеклянной пробкой. Прибавляют 10 мл 2,2,4-триметил пентана R и концентрируют раствор до объема примерно 5 мл, используя ротационный вакуумный испаритель и водяную баню с температурой 30–40 °C. Пипетируют еще 5 мл 2,2,4-триметил пентана R в колбу и тщательно выпаривают раствор до объема 1 мл (полное высыхание недопустимо). Вычисляют количество растительного материала, в граммах, в очищенном экстракте по следующей формуле: V/590×вес пробы в граммах, где V = объем фильтрата. Для дальнейшей очистки переносят 1 г ранее деактивированного силикагеля для колоночной хроматографии (70-230 меш), содержащего 1,5 % воды, в хроматографическую колонку (длина – 25 см, внутренний диаметр – 7 мм). Помещают поверх содержимого колонки 10 мм натрия сульфата безводного R и покрывают очищенной стекловатой. Перед использованием промывают колонку 5 мл гексана R. Позволяют растворителю достигнуть поверхности наполнителя колонки, затем пипеткой количественно переносят очищенный экстракт, полученный с помощью гель-хроматографии, из колбы в подготовленную колонку с силикагелем и ополаскивают 1 мл гексана R. Отставляют колбу для последующего элюирования. Элюируют все остаточные вещества полихлорированных бифенилов из колонки 10 мл гексана R в 10-мл мерную колбу для сбора элюата (элюат 0). Прибавляют в колбу 2 мл смеси для элюирования из толуола R и гексана R (35:65) и взбалтывают круговыми движениями. Количественно переносят раствор в колонку. В другую 10-мл мерную колбу элюируют большинство хлорорганических пестицидов из колонки с силикагелем 6 мл той же смеси для элюирования. Доводят содержимое колбы до объема смесью для элюирования (элюат 1). Ополаскивают колбу 2 мл толуола R и количественно переносят смывы в колонку. Собирают элюат в третью 10-мл мерную колбу, прибавляют в эту колбу 8 мл толуола R, взбалтывают круговыми движениями и переносят раствор в колонку с силикагелем; элюируют оставшиеся хлорорганические пестициды в ту же колбу. Доводят содержимое колбы до объема толуолом R (элюат 2). Оценивают испытуемые растворы с помощью капиллярной газовой хроматографии с электронозахватным детектором (ECD). Подтверждают результаты, полученные для основной колонки (1-я разделительная система), по второй колонке для капиллярной хроматографии, с другой полярностью (2-я разделительная система). Определение с помощью газовой хроматографии Для измерений используется капиллярный газовый хроматограф с электронозахватным детектором. В качестве газа-носителя – гелий R, в качестве вспомогательного газа для определения – смесь аргона R и метана R (95:5). Первая разделительная система Колонка из кварцевого стекла длиной 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, набита химически связанной неподвижной фазой из 5%-фенил-95%-метил-полисилоксана. Температурная программа: • нагревают до 60 °C на 0,5 минуты; • повышают температуру со скоростью 30 °C в минуту до 160 °C и поддерживают эту температуру в течение 2 минут; • повышают температуру со скоростью 2 °C в минуту до 250 °C и поддерживают эту температуру в течение 5 минут. Используют для ввода раствора пробы устройство с делением/без деления потока и поддерживают температуру отверстия для ввода пробы 240 °C. Вводят пробу со скоростью 1 μл за 30 секунд (без деления потока). Температура детектора должна составлять 300 °C. Вторая разделительная система Колонка из кварцевого стекла, длиной 15 м, внутренний диаметр 0,25 мм, набита химически связанной неподвижной фазой из 7%-цианопропил-7%-фенил-86%-метил-полисилоксана. Температурная программа: • нагревают до 60 °C на 12 секунд; • повышают температуру со скоростью 30 °C в минуту до 180 °C и поддерживают эту температуру в течение 1 минуты; • повышают температуру со скоростью 2 °C в минуту до 250 °C и поддерживают эту температуру в течение 5 минут. Используют для ввода раствора пробы инжектор для ввода проб непосредственно в колонку. Температура детектора должна составлять 300 °C. Для качественной и количественной оценки хлорорганических пестицидов в испытуемых растворах применяют метод внешнего стандартного образца с растворами сравнения следующих пестицидов: α-, β-, γ- и δ-гексахлорциклогексан (ГХЦГ); гексахлорбензол; квинтоцен; альдрин; дильдрин; эндрин; α- и β-эндосульфан; эндосульфана сульфат; гептахлор, гептахлорэпоксид; камфехлор; ТДЕ, ДДЕ и ДДТ (и о,п’-, и п,п’-изомеры); метоксихлор. Измеряют высоту пика пестицидов, полученную на хроматограммах, и вычисляют концентрацию остаточных веществ (в мг/кг) по следующей формуле: (H_t×10)/w×w_r/h_r , где ht = высота пика испытуемого раствора в мм, w = количество пробы в очищенном экстракте (г), wr = количество пестицида в нг во введенном растворе сравнения, hr = высота пика раствора сравнения в мм. Анализ эфиров органофосфорных соединений Несмотря на то, что большинство органофосфорных соединений быстро распадается, в государствах – членах ВОЗ могут решить все равно проводить анализы на такие вещества в силу того, что они вредны, если присутствуют в значительных концентрациях. Испытания могут быть более актуальными для растительных лекарственных средств, которые принимаются в больших количествах и часто. Процедуры экстракции и очистки могут проводиться так, как описано выше, но для определения требуется пламенно-ионизационный детектор для веществ, содержащих фосфор (P-FID). Определение конкретных остаточных пестицидов в материале растительного происхождения Общие рекомендации Для полного определения тщательно перемешивают 1 кг растительного материала. Для получения достоверных результатов хроматографии выполняют одно или несколько из нижеперечисленных действий: • повторяют разделение с использованием другой колонки; • используют другую разделительную систему; • используют другую систему детектирования; • совмещают техники разделения; • подготавливают производные вещества; • проводят хроматографию со смесью пробы и субстанции сравнения; • подготавливают пробу иначе; • используют фракционное разделение в ходе очистки растительного экстракта с помощью колоночной хроматографии; • сопоставляют коэффициенты разделения материала и субстанции сравнения. До количественного определения материала, который предстоит анализировать, проверяют, наблюдается ли линейное отношение между значениями, полученными для субстанции сравнения, и ее концентрацией в диапазоне от 0,1 до 2 стандартных концентраций, или подготавливают другой диапазон концентраций, или оценивают результаты по кривой сравнения. Для хроматографического определения используют любые подходящие механизированные или выполняемые вручную техники. Растворы сравнения хранят в защищенном от света месте, чтобы избежать разложения. Используют стеклянные сосуды со стеклянными пробками, которые держат в упаковках, пропитанных используемым растворителем, чтобы избежать повышения концентрации веществ в растворе из-за испарения. Проверяют, нет ли потери влаги из-за испарения, взвешивая сосуды через определенный интервал. Степень извлечения Степень извлечения (R) – процент изначально добавленного в растительный материал материала сравнения, который удается определить нижеописанным методом. Определение остаточного десметрина, прометрина и симазина Подготовка экстракта растительного материала Помещают 10 г измельченного в порошок растительного материала в 500-мл коническую колбу и прибавляют 125 мл хлороформа R. Встряхивают смесь в течение 60 минут и фильтруют с пониженным давлением через фильтровальную бумагу (со средней скоростью фильтрации) в круглодонную колбу. Смывают остаток тремя последовательными порциями хлороформа R по 25 мл. Метод Концентрируют объединенные фильтраты до объема 3–5 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя и водяной бани с температурой 40 °C. Переносят экстракт в колонку для хроматографии, подготовленную согласно описанию, ополаскивая круглодонную колбу дважды 5 мл хлороформа R. Подготовка хроматографической колонки Используют стеклянную трубку (внутренний диаметр – 20–22 мм) с суженным отверстием и защищенную чашкой из спеченного стекла (например, P10 или P16, стеклянный фильтр G4; или P40, стеклянный фильтр G3). Заполняют колонку хлороформом R, а затем заливают в нее слой очищенного оксида алюминия R толщиной 100 мм. Материал-носитель должен оставаться покрытым хлороформом R. После переноса экстракта и смывов в колонку элюируют 150 мл хлороформа R со скоростью 1–2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу. Процесс первой очистки завершают, когда из колонки больше не капает элюат. Выпаривают элюат до сухости с помощью ротационного вакуумного испарителя и водяной бани с температурой 40 °C. К остатку прибавляют10 мл петролейного эфира R и переносят смесь в хроматографическую колонку со слоем очищенного алюминия оксида R толщиной 50 мм в петролейном эфире R. Элюируют смесь 90 мл петролейного эфира R, используемого для ополаскивания круглодонной колбы, со скоростью 1–2 капли в секунду. Элюат отбрасывают. Растворяют любой остаток, который не растворился в петролейном эфире R, в 10 мл смеси из 60 объемов хлороформа R и 40 объемов петролейного эфира R и переносят раствор в колонку. Ополаскивают круглодонную колбу еще дважды 10 мл смеси растворителей. Переносят использованную для ополаскивания жидкость в колонку. Элюируют 120 мл той же смеси растворителей со скоростью 1–2 капли в секунду и собирают элюат в круглодонную колбу. Процесс второй очистки завершают, когда элюат больше не капает из колонки. Выпаривают элюат до сухости с помощью ротационного вакуумного испарителя и водяной бани с температурой 40 °C. Для подготовки очищенного экстракта к определению методом газовой хроматографии растворяют остаток в достаточном количестве ацетона R, чтобы получить 10 мл. Если нужен очень чистый экстракт, продолжают, как описано ниже. К остатку прибавляют 10 мл петролейного эфира R и 10 мл диметил сульфоксида R. Встряхивают и переносят смесь в сепараторную воронку. Дважды экстрагируют слой диметил сульфоксида 10 мл петролейного эфира R. Отбрасывают экстракт петролейного эфира. Затем прибавляют к слою диметил сульфоксида 100 мл воды и экстрагируют трижды, каждый раз с 20 мл хлороформа R. Экстрагируют объединенные экстракты с хлороформом дважды 20 мл воды и выпаривают их до сухости с помощью ротационного вакуумного испарителя и водяной бани с температурой 40 °C. Переносят остаток и смесь 10 мл петролейного эфира R и 10 мл VS хлористоводородной кислоты (1 моль/л) в сепараторную воронку и экстрагируют смесь сначала 10 мл, а затем 5 мл VS хлористоводородной кислоты (1 моль/л). Отбрасывают слой петролейного эфира и корректируют pH объединенных водных растворов до значения между 7 и 8 VS натрия гидроксида (1 моль/л). Трижды экстрагируют раствор, каждый раз с 20 мл хлороформа R. Высушивают объединенные экстракты с хлороформом натрия сульфатом безводным R и фильтруют в круглодонную колбу, ополаскивая воронку трижды 10,0-мл порциями хлороформа R. Выпаривают фильтрат до сухости с помощью ротационного вакуумного испарителя и водяной бани с температурой 40 °C. Растворяют остаток в достаточном количестве ацетона R, чтобы получить 10 мл особо чистого экстракта, который будет использоваться в определении методом газовой хроматографии. Полученные экстракты используют, как указано в таблице A6.1 для следующих растительных материалов. Таблица A6.1. Экстракты для использования с конкретными материалами растительного происхождения № Материал № Материал 1 Flores Calendulae 10 Fructus Foeniculi 2 Flores Chamomillae 11 Herba Millefolii 3 Folia Melissae 12 Herba Plantaginis lanceolatae 4 Folia Menthae piperitae 13 Radix Althaeae 5 Folia Salviae 14 Radix Althaeae 6 Folia Thymi 15 Radix Levistici 7 Fructus Carvi 16 Radix Petroselini 8 Fructus Coriandri 17 Radix Valerianae 9 Fructus Cynobasti Для материалов № 1 и 2 используют особо чистые экстракты (см. выше); для материалов № 3–17 – очищенные (см. выше). Определение степени извлечения Подготавливают 5 отдельных проб, используя для этого каждую из нижеперечисленных процедур. 1. Для подготовки раствора S2 сначала растворяют отдельно по 0,04 г каждой из субстанций сравнения, десметрина R, прометрина R и симазина R, в достаточном количестве ацетона R, чтобы получить 100 мл раствора. Затем помещают по 5 мл каждого из растворов в 100-миллилитровую мерную колбу и доводят смесь до объема ацетоном R (S2). Помещают 10 г измельченного в порошок растительного материала в 500-мл коническую колбу и прибавляют 1 мл раствора S2. Встряхивают полученную смесь механическим способом в течение 60 минут; при необходимости, повторяют операцию вручную, а затем следуют указаниям в разделе «Подготовка экстракта растительного материала». Для определения путем газовой хроматографии используют очищенный или особо чистый экстракт, в соответствии с указаниями процедуры испытания соответствующего растительного материала. 2. Обрабатывают 10 г измельченного в порошок растительного материала, как описано в разделе «Подготовка экстракта растительного материала» (см. выше). Для определения путем газовой хроматографии используют очищенный или особо чистый экстракт, в соответствии с указаниями процедуры испытания каждого конкретного растительного материала. Вычисляют степень извлечения (R) в процентах по следующей формуле: (2(a-b))/с, где a = среднее количество 5 остаточных веществ, полученных с помощью процедуры 1, в мг/кг; b = среднее количество 5 остаточных веществ, полученных с помощью процедуры 2, в мг/кг; c = количество субстанций сравнения, содержащееся в растворе S2 во время процедуры 1, в мг. Степень извлечения должна вписываться в диапазон 70–120 %. Это зависит от конкретного препарата. Определение методом газовой хроматографии Проводят определение в соответствии с международной фармакопеей. Прибор Оборудование состоит из: • стеклянной колонки длиной 1,2 м со внутренним диаметром 2 мм; • подходящей жидкой неподвижной фазы; • подходящего диатомитового носителя. В качестве газа-носителя используют азот R; скорость потока – 30 мл/мин. Температура блока ввода пробы должна поддерживаться на уровне 230 °C, колонка – 190 °C, а детектор, селективный по отношению к азоту, – 300 °C. Кроме того: • объем раствора пробы для введения: 2,0 μл; • характеристики разделения: h ± 1,2 × 10-3 для десметрина R; RS ± 1,2 для прометрина R и симазина R; • относительное стандартное отклонение (прецизионность хроматографической системы): sr. ≤ 0,05 для десметрина R, прометрина R и симазина R. Метод Хроматограмма T. Для определения характеристик разделения вводят раствор S2 (изготовление раствора S2 описано в разделе «Определение степени извлечения»). Хроматограммы A1–A5. Для определения относительного стандартного отклонения вводят раствор S2 и повторяют определение 5 раз. • Хроматограмма S2. Для определения степени извлечения вводят 1 мл раствора S2. Доводят 1 мл раствора S2 до объема 10 мл ацетоном R и вводят полученный раствор для хроматографического определения. Пики на хроматограмме возникают в следующей последовательности: прометрина, симазина, десметрина. • Хроматограмма P2. Вводят очищенный или особо чистый экстракт. Определение проводят со внешним стандартом: a = 0, 0005. Чтобы перевести полученные единицы в проценты по весу, умножают концентрацию в мг/кг на 104. Максимальное допустимое количество остаточных веществ (десметрина, прометрина и симазина) в совокупности составляет 2 мг/кг растительного материала. Определение конкретных хлорорганических, органофосфорных и пиретроидных остаточных пестицидов В зависимости от того, какая проверяется субстанция, описанную ниже процедуру может понадобиться модифицировать, иногда довольно значительно. В любом случае, возможно, что понадобится использовать в дополнение к нижеперечисленному еще одну колонку с другой полярностью или другой метод определения (например, масс-спектрометрию) или какой-то другой метод (например, иммунохимический), чтобы подтвердить полученные результаты. Эта процедура валидна только для анализа проб материалов растительного происхождения, содержащих менее 15 % воды. Пробы с более высоким содержанием можно высушить, при условии, что процедура высушивания доказанно не приводит к значимым изменениям содержания пестицидов. Подготовка проб Экстракция К 10 г рассматриваемой субстанции, измельченной в крупнодисперсный порошок, прибавляют 100 мл ацетона R и оставляют отстояться на 20 минут. Прибавляют 1 мл раствора, содержащего 1,8 μг/мл карбофенотиона R в толуоле R. Гомогенизируют с помощью высокоскоростного блендера в течение 3 мин. Фильтруют и промывают остаток на фильтре двумя порциями ацетона R (каждая по 25 мл). Объединяют фильтрат и смывы и нагревают с помощью ротационного испарителя при температуре, не превышающей 40 °C, пока растворитель почти полностью не выпарится. К остатку прибавляют несколько миллилитров толуола R и снова нагревают, пока не будет полностью удален ацетон. Растворяют остаток в 8 мл толуола R. Фильтруют через мембранный фильтр (45 μм), ополаскивают колбу и фильтруют толуолом R, доводят до объема 10,0 мл тем же растворителем (раствор A). Очистка Хлорорганические, органофосфорные и пиретроидные инсектициды Анализируют с помощью эксклюзионной хроматографии. Процедура хроматографирования может быть выполнена с использованием следующего: • колонка из нержавеющей стали длиной 0,30 м с внутренним диаметром 7,8 мм, набитая сополимером стирола с дивинилбензолом R (5 μм); • в качестве подвижной фазы – толуол R; скорость потока – 1 мл/мин. Рабочие характеристики колонки Вводят 100 μл раствора, содержащего метиловый красный R (0,5 г/л) и орацетовый синий 2R (0,5 г/л) в толуоле R, и продолжают хроматографирование. Колонка считается походящей, только если после элюирования около 10,3 мл цвет элюата меняется с оранжевого на голубой. При необходимости, колонку калибруют, используя раствор, содержащий инсектицид, на который предстоит проводить анализ, с подходящей концентрацией с самой низкой молекулярной массой (например, дихлофос) и с самой высокой молекулярной массой (например, дельтаметрин) в толуоле R. Определяют, какая фракция элюата содержит оба инсектицида. Очистка испытуемого раствора Вводят подходящий объем раствора A (от 100 μл до 500 μл) и продолжают хроматографирование. Собирают фракцию, которая, как уже проверено, содержит оба инсектицида (раствор B). Органофосфорные инсектициды обычно проходят через колонку в диапазоне между 8,8 мл и 10,9 мл элюата. Хлорорганические и пиретроидные – между 8,5 мл и 10,3 мл. • Хлорорганические и пиретроидные инсектициды В хроматографическую колонку, длина которой составляет 0,10 м, а внутренний диаметр – 5 мм, помещают кусочек обезжиренной ваты и 0,5 г силикагеля, обработанного следующим образом: силикагель для хроматографии R прогревают в печи при температуре 150 °C в течение минимум 4 часов. Дают остыть и по капле добавляют количество воды R, соответствующее 1,5 % веса используемого силикагеля. Активно встряхивают до исчезновения агломератов, затем продолжают встряхивать еще 2 часа в механическом встряхивателе. Проводят кондиционирование колонки 1,5 мл гексана R. Также допускается использование заранее заполненных колонок, содержащих около 0,5 г походящего силикагеля, при условии, что перед этим они прошли валидацию. Концентрируют раствор B в потоке гелия для хроматографии R или азота без примеси кислорода R почти до сухости и доводят до соответствующего объема толуолом R (200 μл до 1 мл в соответствии с объемом, который вводился при подготовке раствора B). Количественно переносят в колонку и хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы 1,8 мл толуола R. Собирают элюат (это раствор C). Количественный анализ Органофосфорные инсектициды Исследуют с помощью газовой хроматографии, используя в качестве внутреннего стандартного образца карбофенотион R. Может оказаться необходимо использовать второй внутренний стандартный образец, чтобы обнаружить возможную интерференцию с пиком карбофенотиона. Испытуемый раствор Концентрируют раствор B в потоке гелия для хроматографии R почти до сухости и доводят до 100 μл толуолом R. Раствор сравнения Подготавливают минимум 3 раствора в толуоле R со всеми инсектицидами, которые предстоит определять, и карбофенотионом в концентрациях, подходящих для построения калибровочной кривой. Процедура хроматографирования может осуществляться с использованием: • колонки из плавленого кварца длиной 30 м со внутренним диаметром 0,32 мм, внутренние стенки которой покрыты слоем поли(диметил)силоксана R толщиной 0,25 μм; • водорода для хроматографии R в качестве газа-носителя. При условии соответствующей валидации могут также использоваться другие газы: гелий для хроматографии R или азот для хроматографии R; • фосфор-азотного пламенно-ионизационного или атомно-эмиссионного детектора. Поддерживают температуру колонки 80 °C в течение 1 мин, затем поднимают ее со скоростью 30 °C/мин до 150 °C, поддерживают 150 °C в течение 3 мин, затем снова поднимают со скоростью 4 °C/мин до 280 °C и поддерживают эту температуру в течение 1 мин. Поддерживают температуру инжекторного порта 250 °C и детектора 275 °C. Вводят выбранный объем каждого раствора. Если хроматограммы сняты в указанных условиях, значения относительного времени удерживания совпадают с указанными в таблице A6.2. Вычисляют содержание каждого из инсектицидов по площадям пиков и концентрациям растворов. Таблица A6.2. Значения относительного времени удерживания органофосфорных инсектицидов Субстанция Относительное время удерживания дихлофос 0,20 фонофос 0,50 диазинон 0,52 паратион-метил 0,59 хлорпирифос-метил 0,60 пиримифос-метил 0,66 малатион 0,67 паратион 0,69 хлорпирифос 0,70 метидатион 0,78 этион 0,96 карбофенотион 1,00 азинфос-метил 1,17 фозалон 1,18 Примечание. Разница значений времени удерживания очень мала. Если необходимо различить два очень близких значения, понадобится дальнейшая разработка подходящего метода. Хлорорганические и пиретроидные инсектициды Исследуют с помощью газовой хроматографии, используя в качестве внутреннего стандартного образца карбофенотион. Может быть необходимо использовать второй внутренний стандартный образец, чтобы обнаружить возможную интерференцию с пиком карбофенотиона. Испытуемый раствор Концентрируют раствор C в потоке гелия для хроматографии R или азота без примеси кислорода R почти до сухости и доводят до объема 500 μл толуолом R. Раствор сравнения Подготавливают минимум три раствора в толуоле R со всеми инсектицидами, которые предстоит определять, и карбофенотионом в концентрациях, подходящих для построения калибровочной кривой. Процедура хроматографирования может осуществляться с использованием: • колонки из плавленого кварца длиной 30 м со внутренним диаметром 0,32 мм, внутренние стенки которой покрыты слоем поли(диметил)(дифенил)силоксана R толщиной 0,25 μм; • водорода для хроматографии R в качестве газа-носителя. При условии соответствующей валидации могут также использоваться другие газы: гелий для хроматографии R или азот для хроматографии R; • фосфор-азотного пламенно-ионизационного или атомно-эмиссионного детектора; • детектора по захвату электронов; • устройства, позволяющего вводить пробы непосредственно в колонку без нагревания. Поддерживают температуру колонки 80 °C в течение 1 мин, затем поднимают ее со скоростью 30 °C/мин до 150 °C, поддерживают 150 °C в течение 3 мин, затем снова поднимают со скоростью 4 °C/мин до 280 °C и поддерживают эту температуру в течение 1 мин. Поддерживают температуру инжекторного порта 250 °C и детектора 275 °C. Вводят выбранный объем каждого раствора. Если хроматограммы сняты в указанных условиях, значения относительного времени удерживания совпадают с указанными в таблице A6.3. Вычисляют содержание каждого из инсектицидов по площадям пиков и концентрациям растворов. Таблица A6.3. Значения относительного времени удерживания хлорорганических и пиретроидных инсектицидов Субстанция Относительное время удерживания α-гексахлорциклогексан 0,44 гексахлорбензол 0,45 β-гексахлорциклогексан 0,49 линдан 0,49 δ-гексахлорциклогексан 0,54 ɛ-гексахлорциклогексан 0,56 гептахлор 0,61 альдрин 0,68 цис-гептахлор-эпоксид 0,76 о,п’-ДДЕ 0,81 α-эндосульфан 0,82 дильдрин 0,87 п,п’-ДДЕ 0,87 о,п’-ДДД 0,89 эндрин 0,91 В-эндосульфан 0,92 о,п’-ДДТ 0,95 карбофенотион 1,00 п,п’- ДДТ 1,02 цис-перметрин 1,29 транс-перметрин 1,31 циперметринa 1,40 фенвалератa 1,47 и 1,49 дельтаметрин 1,54 a У субстанции наблюдается несколько пиков. Приложение 7. Список сред и штаммов, используемых в микробиологическом анализе Питательные среды Нижеперечисленные среды соответствуют требованиям, но допускается использовать и другие среды, если они обладают подобными питательными свойствами и селективностью для микроорганизмов, которые предстоит анализировать. Список реактивов и растворов см. в приложении 8. Агар Байрда Паркера Процедура Растворяют 10 г панкреатического гидролизата казеина R, 5 г говяжьего экстракта R, 1 г растворимого в воде экстракта дрожжей R, 5 г хлорида лития R, 20 г агара R, 12 г глицина R и 10 г пирувата натрия R в достаточном количестве воды, чтобы получить 950 мл. Нагревают до кипения на 1 минуту, часто встряхивают и корректируют pH до 6,6–7,0 VS натрия гидроксида (0,5 моль/л). Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут, охлаждают до 45–50 °C и прибавляют 10 мл стерильного раствора теллурита калия R концентрацией 0,01 г/мл и 50 мл эмульсии яичного желтка. Агар с бриллиантовым зелёным Процедура Растворяют 10 г высушенного пептона R (мясо и казеин), 3 г растворимого в воде экстракта дрожжей R, 5 г натрия хлорида R, 10 г лактозы R, 10 г сахарозы R, 20 г агар-агара R, 0,08 г фенолового красного R и 12,5 мг бриллиантового зеленого R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. Нагревают до кипения на 1 минуту, затем корректируют pH до 6,7–7,1 VS натрия гидроксида (0,5 моль/л). Непосредственно перед использованием стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут, охлаждают до 50 °C и разливают по чашкам Петри. Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном (pH 7,0) Процедура Растворяют 3,56 г калия дигидрофосфата R, 7,23 г двузамещённого фосфорнокислого натрия R, 4,30 г натрия хлорида R и 1 г высушенного пептона R (мясо и казеин) в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. Можно добавить полисорбат 20 R или полисорбат 80 R, 0,001–0,01 г/мл. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Соево-казеиновый агар Процедура Растворяют 15 г панкреатического гидролизата казеина R, 3 г папаинового гидролизата соевого шрота R, 5 г натрия хлорида R и 15 г агара R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 7,1–7,5. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Цетримидный агар Процедура Растворяют 20 г панкреатического гидролизата желатина R, 1,4 г магния хлорида R, 10 г калия сульфата R, 0,3 г цетримида R, 13,6 г агара R и 10 мл глицерола R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. Встряхивая, нагревают до кипения на 1 мин. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 7,0–7,4. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Среды с отварным мясом Процедура Часть I: Смешивают 454,0 г измельченного говяжьего сердца (нежирного) с 1 000 мл воды (очищенной) и прибавляют 25 мл натрия гидроксида (1 M). Нагревают до кипения и кипятят 20 минут на медленном огне, часто помешивая. Остужают и проверяют pH, который должен составлять 7,2; при необходимости корректируют pH. Фильтруют через несколько слоев марли, отжимая из нее лишнюю жидкость. Распределяют частички мяса, чтобы они слегка просохли и помещают в соответствующие емкости. Часть II: Фильтруют жидкость, полученную по завершении части I, через три листка грубой фильтровальной бумаги, чтобы жидкость стала прозрачной. Затем фильтруют через 1 кусок более мелкопористой фильтровальной бумаги (подойдет Ватман № 1 или эквивалент). Растворяют в фильтрате следующие ингредиенты: пепсиновый гидролизат животных тканей (20,0 г), декстрозы моногидрат (2,0 г) и натрия хлорид (5,0 г). Доводят водой (очищенной) до объема 1 000 мл. Заливают жидкость в сосуды в соотношении примерно 4-5 частей жидкости на одну часть мяса. pH после стерилизации: 7,2 +/- 0,1. Среда из агара и дефибринированной крови овцы (5%) (среда из кровяного агара) Процедура Соево-казеиновый агар разогревают и остужают до 45–50 °C на водяной бане, прибавляют достаточное количество дефибринированной крови овцы, чтобы она составила 5 %, и перемешивают. Дезоксихолат-цитрат агар Процедура Растворяют 10 г говяжьего экстракта R, 10 г высушенного пептона R (мясного), 10 г лактозы R, 20 г натрия цитрата R, 1 г железа (III) цитрата R, 5 г натрия дезоксихолата, 13,5 г агара R и 20 мг нейтрального красного R в достаточном количестве воды, чтобы получить1 000 мл. Постепенно нагревают до кипения на 1 минуту, охлаждают до 50 °C и корректируют pH до 7,1–7,5 VS натрия гидроксида (0,05 моль/л). Разливают в чашки Петри. В автоклаве не нагревают. Обогатительный питательный бульон для энтеробактерий (бульон Мосселя) Процедура Растворяют 10 г панкреатического гидролизата желатина R, 5 г глюкозы гидрата R, 20 г дегидратированой бычьей желчи R, 2 г калия дигидрогенфосфата R, 8 г двузамещённого фосфорнокислого натрия R и 15 мг бриллиантового зеленого R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. Нагревают до кипения на 30 минут и сразу же охлаждают. Корректируют pH VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) до 7,0–7,4. Агар Клиглера с железом (KIA) Процедура Растворяют агар-агар в мясопептонном бульоне, или, в качестве альтернативы, в бульоне из говяжьего экстракта, путем нагревания на кипящей водяной бане или на пару при 100° C. Доводят расплавленный питательный агар до температуры 80 °C на водяной бане. Прибавляют и растворяют лактозу, пептон, протеозопептон, NaCl, глюкозу, сульфат железа (II) и натрия тиосульфат, хорошо перемешивают. Корректируют pH до 7,4. Прибавляют 6 мл 0,5% раствора фенолового красного и хорошо перемешивают. Распределяют по пробиркам с завинчивающейся крышкой (15 × 150 или 16 × 160 мм) в количестве по 5–6 мл и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 минут. Оставляют среду остыть и схватиться с наклоном в 2,5 см; высота столбика среды должна составлять 2,5 см. Записывают номер серии и дату изготовления на этикетке, затем хранят при комнатной температуре, не превышающей 25 °C. Мясопептонный бульон можно заменить добавлением 10 г пептона, 3 г говяжьего экстракта, 3 г экстракта дрожжей, и 1 литра дистиллированной воды. Лактозный бульон Процедура Растворяют 3 г говяжьего экстракта R, 5 г панкреатического гидролизата желатина R и 5 г лактозы R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 6,7–7,1. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Агар Мак-Конки Процедура Растворяют 17 г панкреатического гидролизата желатина R, 3 г высушенного пептона R (мясо и казеин), 10 г лактозы R, 5 г натрия хлорида R, 1,5 г солей желчных кислот R, 13,5 г агара R, 30 мг нейтрального красного R и 1 мг кристаллического фиолетового R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 6,9–7,3. Нагревают до кипения на 1 мин, постоянно встряхивая, затем стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Бульон Мак-Конки Процедура Растворяют 20 г панкреатического гидролизат желатина R, 10 г лактозы R, 5 г дегидратированой бычьей желчи R и 10 мг бромкрезолового пурпурного R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 7,1–7,5. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 минут. Агар Сабуро с глюкозой с добавлением антибиотиков Процедура Растворяют 10 г высушенного пептона R (мясо и казеин), 40 г глюкозы гидрата R и 15 г агара R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. TS уксусной кислоты (~60 г/л) корректируют pH до 5,4–5,8. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Непосредственно перед использованием прибавляют стерильные растворы 0,10 г бензилпенициллина натрия R и 0,1 г тетрациклина R на литр среды или, в качестве альтернативы, перед стерилизацией прибавляют 0,05 г хлорамценикола R на литр среды. Соево-казеиновая среда Процедура Растворяют 17 г панкреатического гидролизата казеина R, 3 г папаинового гидролизата соевого шрота R, 5 г натрия хлорида R, 2,5 г гидроортофосфата калия R и 2,5 г глюкозы гидрата R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 7,1–7,5. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 минут. Бульон с тетратионатом, бриллиантовым зеленым и жёлчью Процедура Растворяют 8,6 г высушенного пептона R, 8 г дегидратированой бычьей желчи R, 6,4 г натрия хлорида R, 20 г кальция карбоната RI, 20 г калия тетратионата R и 0,07 г бриллиантового зеленого R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 6,8–7,2. Нагревают до момента кипения; не разогревают. Трёхсахарный агар с солями железа Процедура Растворяют 3 г говяжьего экстракта R, 3 г растворимого в воде экстракта дрожжей, 20 г высушенного пептона R (казеина и говядины), 5 г натрия хлорида R, 10 г лактозы R, 10 г сахарозы R, 1 г глюкозы гидрата R, 0,3 г железа(III)-аммония цитрата коричневого R, 0,3 г натрия тиосульфата R, 25 мг фенолового красного R и 12 г агара R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. Встряхивая, нагревают до кипения на 1 мин. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 7,2–7,6. Распределяют по пробиркам и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 минут. Оставляют пробирки со столбиками среды застывать наклонно. Агар Мосселя Процедура Растворяют 3,0 г растворимого в воде экстракта дрожжей R, 7,0 г панкреатического гидролизата желатина R, 1,5 г солей желчных кислот R, 10,0 г лактозы R, 5,0 г натрия хлорида R, 10,0 г глюкозы гидрата R, 15,0 г агара R, 30 мг нейтрального красного R и 2,0 мг кристаллического фиолетового R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. Нагревают до кипения и корректируют pH до 7,2–7,6 VS натрия гидроксида (0,05 моль/л). В автоклаве не нагревают. Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар Процедура Растворяют 3,5 г ксилозы R, 5 г L-лизина R, 7,5 г лактозы R, 7,5 г сахарозы R, 5 г натрия хлорида R, 3 г растворимого в воде экстракта дрожжей R, 0,08 г фенолового красного R, 13,5 г агара R, 2,5 г натрия дезоксихолата R, 6,8 г натрия тиосульфата R и 0,8 г железа(III)-аммония цитрата коричневого R в достаточном количестве воды, чтобы получить 1 000 мл. VS натрия гидроксида (0,05 моль/л) корректируют pH до 7,2–7,6. Нагревают до момента кипения, остужают до 50 °C и разливают в чашки Петри. В автоклаве не нагревают. Штаммы микроорганизмов Все штаммы микроорганизмов, упомянутые в тексте, подходят для применения. Допускается также использовать и другие штаммы, если они обладают подобными свойствами. Обозначения штаммов и адреса, по которым их можно получить, перечислены в таблице A7.1. Таблица A7.1. Адреса, по которым можно получить штаммы микроорганизмов Обозначение Адрес ATCC Американская коллекция типовых культур, 12301 Парк-Лон-драйв, Роквилль, Мэриленд 20852, США CIP Коллекция культур института Пастера, Департамент государственной коллекции культур микроорганизмов (CNCM), 25, Рю-дю-Доктёр-Ру, F 75015 Париж, Франция IFO Институт ферментации, Осака (IFO), штаммы микроорганизмов, Подразделение коллекции культур, Центр биологических ресурсов (NBRC) Национального института технологии и оценки (NITE), Департамент биотехнологии, NITE, 2-5-8, Кадзуса-каматари, Кисарадзу-сити, Тиба 292-0818, Япония NCIMB Национальная коллекция промышленных и морских бактерий, 23 Сент-Мачар-драйв, Абердин AB24 3RY, Шотландия NCPF Национальная коллекция патогенных грибов, Экспертная лаборатория по микологии Санитарно эпидеиологической службы (PHLS), Кингсдаун, Бристоль BS2 8EL, Великобритания NCTC Национальная коллекция типовых культур, Центральная лаборатория системы здравоохранения, 61 Колиндейл-авеню, Лондон NW9 5HT, Великобритания Приложение 8. Перечень реактивов и растворов Ниже описаны реактивы, испытуемые растворы и титрованные растворы, упомянутые в данном документе. Реактивы обозначены R, испытуемые растворы – TS, а титрованные растворы – VS. Концентрация растворов реактивов выражается в г/л, то есть в граммах безводного вещества на литр воды или растворителя (он указан). Если растворитель не указан, используется вода, очищенная от минеральных солей. Процедуры подготовки испытуемых растворов, которые требуют особой внимательности, приведены подробно. Буква d указывает на относительную плотность d 20/20, то есть плотность измеряется в воздухе при 20 °C по сравнению с водой при 20 °C. Для штаммов указаны номера цветовых показателей (CI). Уксусная кислота, ледяная, R. C2H4O2; d ~1,048. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS уксусной кислоты (~300 г/л). Раствор уксусной кислоты ледяной R, содержащий около 300 г C2H4O2 на литр (приблизительно 5 моль/л); d ~ 1,037. TS уксусной кислоты (~60 г/л). TS уксусной кислоты (~300 г/л), разбавленный до содержания около 60 г C2H4O2 на литр (приблизительно 1 моль/л); d ~ 1,008. Уксусная кислота разбавленная 6 г ледяной уксусной кислоты доводят водой до объема 100 мл (1 моль/л). Ацетон R. C3H6O Подходящий доступный для приобретения реактив. Ацетонитрил R. Метилцианид, C2H3N. Описание Прозрачная, бесцветная жидкость. Смешиваемость Легко растворим водой. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS кислотного олова (II) хлорида Растворяют 8 г олова (II) хлорида безводного в 500 мл хлористоводородной кислоты. Хранят в бутылках со стеклянной пробкой. Используют в течение 3 месяцев. TS смеси афлатоксинов Процедура Подготавливают рабочий стандартный образец смеси в смеси 98 объемов хлороформа R и 2 объемов ацетонитрила R, содержащий по 0,5 μг каждого из афлатоксинов B1 и G1 на мл и 0,1 μг каждого из афлатоксинов B2 и G2 на мл. Примечание. Афлатоксины очень токсичны, работая с ними, следует соблюдать осторожность. Рекомендуется соблюдать требования государственного законодательства. Подходящий доступный для приобретения рабочий стандартный образец. Агар R Подходящий доступный для приобретения реактив. Алюминия хлорид R. AlC13*6H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Алюминия оксид, очищенный, R. Al2O3 Подходящий доступный для приобретения реактив для колоночной хроматографии. 1,2,4-Аминонафтолсульфоновая кислота R. C10H9NO4S Описание Порошок от белого до коричневато-розового цвета. Растворимость В воде растворим умеренно. TS аминонафтолсульфоновой кислоты Процедура Прибавляют 0,25 г 1,2,4-аминонафтолсульфоновой кислоты R к 100 мл свежеприготовленного TS метабисульфита натрия (150 г/л) с механическим перемешиванием. Помешав 15 минут, прибавляют 0,5 г натрия сульфита безводного R. Помешав еще 5 минут, фильтруют смесь. Хранение Хранят в бутылке из коричневого стекла. Примечание. Этот реактив следует готовить заново еженедельно. Раствор аммиака NH4OH (R или TS) Водный раствор аммиака. Подходящий доступный для приобретения реактив. Специфическая плотность – около 0,90; плотность: 0,908 г/мл; содержание аммиака: 28–30 %. TS аммиака 400 мл раствора аммиака водой доводят до объема 1 000 мл (10 %). TS аммиака (~100 г/л). TS аммиака (~260 г/л) разбавляют примерно до 100 г NH3 на литр (приблизительно 6 моль/л); d 0,956. Аммония дигидрофосфат R. (NH4)H2PO4. Одноосновный фосфат аммония. Белый кристаллический порошок или бесцветные кристаллы, легко растворим в воде. Железа(III)-аммония цитрат коричневый R. Железоаммонийный цитрат коричневый; растворимый цитрат железа. Содержит около 9 % NH3, 16,5–18,5 % Fe и около 65 % гидратированной лимонной кислоты. Описание Красновато-коричневые гранулы, гранатово-красные прозрачные чешуйки или коричневато-желтый порошок; без запаха или со слабым запахом NH3. Очень легко впитывает влагу. Растворимость В воде растворим очень легко; в TS этилового спирта (~750 г/л) практически не растворим. Хранение Хранят в хорошо укупоренной упаковке в защищенном от света месте. Подходящий доступный для приобретения реактив. Аммония молибдат R. (NH4)6Mo7O24*4H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. TS аммония молибдата (40 г/л). Раствор аммония молибдата R, содержащий около 40 г (NH4)6Mo7O24*4H2O на литр. Аммония оксалат R. C2H8N2O4*H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. TS аммония оксалата (25 г/л). Раствор аммония оксалата R, содержащий около 27 г C2H8N2O4 на литр. Аммония тиоцианат R. CH4N2S Подходящий доступный для приобретения реактив. TS аммония тиоцианата (75 г/л) Раствор аммония тиоцианата R, содержащий около 75 г CH4N2S на литр (приблизительно 1 моль/л). Аргон R. Ar Содержит не меньше 999,95 мл Ar на литр. Подходящий доступный для приобретения реактив. AsTS мышьяка разбавленный 10 μг мышьяка на 1 мл. Процедура 1 мл концентрированного AsTS мышьяка доводят достаточным количеством воды до объема 100 мл. Примечание. Разбавленный AsTS мышьяка обязательно должен быть свежеприготовленным. AsTS мышьяка концентрированный Процедура Растворяют 0,132 г мышьяка триоксида R в 6 мл TS натрия гидроксида (~80 г/л) при слабом нагревании. Разбавляют остывший раствор 20 мл воды, прибавляют 50 мл TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л) и достаточное количество воды, чтобы получить 100 мл. Мышьяка триоксид R. As2O3 Подходящий доступный для приобретения реактив. Говяжий экстракт R. Остатки говяжьего бульона, полученные в результате экстрагирования свежей, качественной и нежирной говядины путем ее варки в воде и выпаривания бульона при низкой температуре и, обычно, при пониженном давлении до образования густых пастообразных остатков. Подходящий доступный для приобретения реактив. Бензилпенициллин натрия R. C16H17N2NaO4S Качество должно соответствовать монографии Международной фармакопеи, т. 2, с. 51. Соли желчных кислот R Описание Концентрат говяжьей желчи, основной составляющей которого является натрия дезоксихолат, определяется как холевая кислота. Растворимость Растворимы в воде и в TS этилового спирта (~750 г/л). Кислотность pH раствора, концентрация которого 0,02 г/мл, составляет 5,8–6,2. Подходящий доступный для приобретения реактив. Бриллиантового зеленого R. Малахитовый зеленый G; основной зелёный 1; C.I. 42040; C27H34N2O4S. Описание Мелкие кристаллы с золотым отблеском. Растворимость Растворим в воде и в TS этилового спирта (~750 г/л). Подходящий доступный для приобретения реактив. AsTS брома Процедура Растворяют 30 г калия бромида R в 40 мл воды, прибавляют 30 г брома R и достаточным количеством воды доводят до 100 мл. Раствор должен отвечать требованиям следующего испытания. Выпаривают 10 мл раствора почти до сухости на водяной бане, прибавляют 50 мл воды, 10 мл AsTS хлористоводородной кислоты (~250 г/л) и достаточное количество AsTS олова (II) хлорида, чтобы восстановить оставшийся бром, затем проводят обычное испытание на мышьяк. Цвет полученного пятна должен быть не интенсивнее, чем цвет пятна от стандартного раствора, концентрацией 1 μg/мл. Это значит, что количество мышьяка не превышает 1 μg/мл. Бромкрезоловый пурпуровый R. C21H16Br2O5S Подходящий доступный для приобретения реактив. Кальция карбонат R1. CaCO3 Подходящий доступный для приобретения реактив. Карбофенотион. C11H16ClO2PS3. O,O-Диэтил S-[[(4-хлорфенил)тио]метил]-фосфордитионат. Желтоватая жидкость, практически не растворима в воде, смешивается с органическими растворителями. d 25/4: около 1,27. Подходящий доступный для приобретения реактив. Цетримид R. Содержит не меньше 96,0 % и не больше 101,0 % алкилтриметил аммония бромида (расчёт по C17H38BrN в пересчёте на сухое вещество). Описание Белый или почти белый, объемный, сыпучий порошок; издает легкий характерный запах. Растворимость Растворим в двух частях воды; легко растворим в TS этилового спирта (~750 г/л). Подходящий доступный для приобретения реактив. Хлорамценикол R. C11H12Cl2N2O5. Качество должно соответствовать монографии Международной фармакопеи, т. 2, с. 64. Хлороформ R. CHCl3 Подходящий доступный для приобретения реактив. Кристаллический фиолетовый R. C25H30ClN3 Подходящий доступный для приобретения реактив. Циклогексан R. C6H12 Подходящий доступный для приобретения реактив. Десметрина R. C9H17N5S. 2-метил-меркапто-4-метил-амино-6-изопропиламино-S-триазин. Доступный для приобретения реактив, подходящий для применения в качестве материала сравнения. Дихлорметан R. Метиленхлорид, CH2Cl2 Описание Прозрачная, бесцветная и маловязкая жидкость. Смешиваемость Хорошо смешивается с TS этилового спирта (~750 г/л) и эфиром R. Диапазон температур кипения Не меньше 95 % дистиллируется в диапазоне 39-41 °C. Остаток после выпаривания После выпаривания на водяной бане и высушивания при 105 °C остается не больше 0,5 мг/мл. Подходящий доступный для приобретения реактив. Диметил сульфоксид R. C2H6OS Описание Бесцветная жидкость; без запаха или с несильным неприятным запахом. Массовая плотность (ρ20) 1,10 кг/л. Подходящий доступный для приобретения реактив. Диметиловый желтый R. C.I. 11020; 4-диметиламиноазобензол; C14H15N3. Предупреждение. Диметиловый желтый R – канцероген. Описание В умеренно кислых спиртовых растворах дает красный цвет, в слабокислых и щелочных – желтый. Однородность Применяют метод тонкослойной хроматографии, в качестве сорбента – силикагель G, в качестве подвижной фазы дихлорметан R. Используют 10 μл раствора в дихлорметане R (0,1 мг/мл). Вынимают пластинку из хроматографической камеры и оставляют высохнуть на воздухе. На хроматограмме должно быть только одно пятно. Подходящий доступный для приобретения реактив. Гидроортофосфат калия R. K2HPO4 Подходящий доступный для приобретения реактив. Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты R. C10H14N2Na2O8*2H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Двузамещённый фосфорнокислый натрий R. Na2HPO4*12H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Этиловый спирт R Подходящий доступный для приобретения реактив. TS этилового спирта (~750 г/л) Подходящий доступный для приобретения реактив. Эфир R. C4H10O Подходящий доступный для приобретения реактив. TS1 эфир/петролейный эфир Процедура 60 мл эфира R доводят достаточным количеством дистиллированного петролейного эфира R до объема 1 000 мл. TS2 эфир/петролейный эфир Процедура 150 мл эфира R доводят достаточным количеством дистиллированного петролейного эфира R до объема 1 000 мл. TS3 эфир/петролейный эфир Процедура 500 мл эфира R доводят достаточным количеством дистиллированного петролейного эфира R до объема 1 000 мл. Этил ацетат R. C4H8O2 Подходящий доступный для приобретения реактив. Железа (III)-аммония сульфат R. FeH4NO8S2*12H2O Этот реактив не должен содержать хлоридов. Подходящий доступный для приобретения реактив. VS железа(III)-аммония сульфата (0,25 моль/л). Железа(III)-аммония сульфат R, растворяют в TS азотной кислоты (~750 г/л), чтобы в 1 000 мл содержалось 120,5 г FeH4NO8S2*12H2O. Процедура Растворяют 120,5 г железа(III)-аммония сульфата R в достаточном количестве TS азотной кислоты (~750 г/л), чтобы получить 1 000 мл раствора. Этот реактив не должен содержать хлоридов. Сульфат железа (II). FeSO4*7H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Флорисил R Подходящий доступный для приобретения материал для колоночной хроматографии. Глюкозы гидрат R. Моногидрат α-D-глюкопиранозы, C6H12O6*H2O. Содержит не меньше 99,0 % и не больше 101,5 % C6H12O6 в пересчёте на сухое вещество. Описание Бесцветные кристаллы или белый кристаллический или гранулированный порошок; без запаха. Растворимость Растворим в примерно 1 части воды и примерно в 60 частях TS этилового спирта (~750 г/л); больше растворим в кипящей воде и в кипящем TS этилового спирта (~750 г/л). Кислотность Растворяют 5 г в 50 мл не содержащей углекислого газа воде R. Для нейтрализации требуется не больше 0,5 мл VS не содержащего карбонатов натрия гидроксида (0,02 моль/л), в качестве индикатора – TS фенолфталеина/этилового спирта. Удельное вращение Растворяют 100 мг предварительно высушенного до постоянного веса глюкозы гидрата R в 1 мл воды, прибавляют несколько капель TS аммиака (~100 г/л); [a](20°C)/D= от + 52 до + 53°. Растворимый крахмал или сульфиты Растворяют 1 г глюкозы гидрата R в 10 мл воды и прибавляют 1 каплю TS йода; жидкость должна окраситься в желтый цвет. Потеря в массе при высушивании Высушивают до постоянной массы при температуре 105 °C; должно теряться не меньше 80 мг/г и не больше 100 мг/г. Сульфатная зола Не больше 1,0 мг/г. Количественное определение Растворяют точную навеску около 0,1 г в 50 мл воды, прибавляют 30 мл VS йода (0,1 моль/л) и 10 мл TS натрия карбоната (50 г/л) и оставляют на 20 минут. Прибавляют 15 мл TS хлористоводородной кислоты (~70 г/л) и оттитровывают излишки йода VS натрия тиосульфата (0,1 моль/л), в качестве индикатора используют крахмал TS. Проводят контрольное определение с холостой пробой и вносят все нужные поправки. Каждый мл VS йода (0,1 моль/л) эквивалентен 9,008 мг C6H12O6. Глицерин R. Пропан-1,2,3-триол с малым количеством воды, C3H8O3. Должен содержать не менее 970 г C3H8O3 на кг. Описание Прозрачная, практически бесцветная, сиропоподобная и гигроскопичная жидкость; без запаха. Смешиваемость Смешивается с водой и TS этилового спирта (~750 г/л); практически не смешивается с эфиром R и хлороформом R. Массовая плотность (ρ20) Не меньше 1,256 кг/л. Показатель преломления (n 20/D) Не меньше 1,469. Акролеин и другие восстанавливающие субстанции Смешивают 1 мл глицерина R с 1 мл TS аммиака (~100 г/л) и нагревают на водяной бане при температуре 60 °C в течение 5 минут; жидкость не должна стать желтой. Снимают с водяной бани и прибавляют 3 капли TS нитрата серебра (40 г/л); жидкость не должна окрашиваться в течение 5 минут. Сульфатная зола Не больше 0,5 мг/мл. Подходящий доступный для приобретения реактив. Глицин R. Аминоуксусная кислота, C2H5NO2 Подходящий доступный для приобретения реактив. Гелий R. He. В 1 литре содержится не меньше 999,95 мл He. Подходящий доступный для приобретения реактив. Гелий для хроматографии. He Содержит не меньше 99,995 объемных процентов He. Подходящий доступный для приобретения реактив. Гексана. C6H14 Бесцветная, воспламеняющаяся жидкость, практически не растворима в воде, смешивается с этиловым спиртом и с эфиром. d 20/D: от 0,659 до 0,663. n 20/D: от 1,375 до 1,376. Диапазон температур дистилляции Не меньше 95 % дистиллируется в диапазоне от 67 °C до 69 °C. Подходящий доступный для приобретения реактив. Гексана R. n-Гексан, C6H14 Описание Бесцветная, маловязкая, легко воспламеняющаяся жидкость. Диапазон температур кипения Полностью дистиллируется в диапазоне 1 °C между 67,5 и 69,5 °C. Массовая плотность (ρ20) 0,658–0,659 кг/л. Показатель преломления (n 20/D) 1,374–1,375. Подходящий доступный для приобретения реактив. Хлористоводородная кислота R. HCl Подходящий доступный для приобретения реактив. VS хлористоводородной кислоты (1 моль/л). TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л) разбавляют водой, чтобы в 1 000 мл содержалось 36,47 г HCl. Метод стандартизации Точную концентрацию раствора 1 моль/л определяют следующим образом. Растворяют точную навеску натрия карбоната R безводного около 1,5 г (предварительно высушивают при 270 °C в течение 1 часа) в 50 мл воды и титруют раствором хлористоводородной кислоты, используя в качестве индикатора TS метилоранж/этиловый спирт. Каждые 52,99 мг натрия карбоната R безводного эквивалентны 1 мл VS хлористоводородной кислоты (1 моль/л). TS хлористоводородной кислоты (~420 г/л). d ~1,18. Подходящий доступный для приобретения реактив. AsTS хлористоводородной кислоты (~ 250 г/л). TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л), отвечающий требованиям испытаний A и B, которые описаны ниже. A 10 мл TS хлористоводородной кислоты доводят до объема 50 мл достаточным количеством воды, прибавляют 5 мл TS аммония тиоцианата (75 г/л) и сразу же перемешивают; смесь не должна становиться цветной. B К 50 мл TS хлористоводородной кислоты прибавляют 0,2 мл AsTS брома, выпаривают на водяной бане до объема 16 мл. При необходимости, чтобы на протяжении всего процесса выпаривания в смеси присутствовал излишек AsTS брома, подтвержденный окрашиванием, прибавляют еще AsTS брома. Прибавляют 50 мл воды и 5 капель AsTS олова (II) хлорида, проводят общее испытание на мышьяк. Цвет пятна не должен быть интенсивнее, чем пятно стандартного образца объемом 0,2 мл, что доказывает, что количество мышьяка не превышает 0,05 μg/мл. TS хлористоводородной кислоты (~ 250 г/л). Раствор TS хлористоводородной кислоты (~420 г/л) в воде, содержащий приблизительно 250 г HCl на литр; d ~1.12. Раствор дихлорида олова в хлористоводородной кислоте (~ 250 г/л), AsTS Процедура 1 мл AsTS олова (II) хлорида доводят достаточным количеством AsTS хлористоводородной кислоты (~250 г/л) до объема 100 мл. TS хлористоводородной кислоты (~ 70 г/л) Процедура 260 мл TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л) доводят достаточным количеством воды до объема 1 000 мл (приблизительно 2 моль/л); d ~1,035. Хлористоводородная кислота разбавленная R 23,6 мл хлористоводородной кислоты доводят водой до объема 100 мл (10 %). Водород для хроматографии. H2 Содержит не меньше 99,95 объемных процентов H2. Подходящий доступный для приобретения реактив. Индофеноловый голубой R. C.I. 49700; C18H26N2O. Описание Фиолетово-черный порошок. Растворимость Практически не растворим в воде; растворим в хлороформе R. Однородность Применяют метод тонкослойной хроматографии, в качестве сорбента – силикагель G, в качестве подвижной фазы – дихлорметан R. Используют 10 μл раствора в дихлорметане R с концентрацией 0,1 мг/мл и дают подняться растворителю. После достают пластинку из хроматографической камеры и оставляют высохнуть на воздухе. На хроматограмме должно быть только одно пятно. Подходящий доступный для приобретения реактив. Йод R. I2 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS йода Процедура Растворяют 2,6 г йода R и 3 г калия йодида R в достаточном количестве воды, чтобы получить 100 мл (приблизительно 0,1 моль/л). VS йода (0,1 моль/л). Йод R и калия йодид R растворяют в воде, чтобы в 1 000 мл раствора было 25,38 г I2 и 36,0 г KI. Метод стандартизации Точную концентрацию раствора 0,1 моль/л определяют путем титрования 25,0 мл VS натрия тиосульфата (0,1 моль/л), в качестве индикатора используют TS крахмала. Железа (III) цитрат R. Цитрат железа (III), C6H5FeO7*H2O. Подходящий доступный для приобретения реактив. Лактоза R. C12H22O11 Подходящий доступный для приобретения реактив. Свинца ацетат R. C4H6O4Pb*3H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. TS свинца ацетата (80 г/л). Раствор свинца ацетата R в свежевскипяченной воде, содержащий около 80 г C4H6O4Pb на литр (приблизительно 0,25 моль/л). TS свинца (II) ацетата 9,5 г свинца (II) ацетата тригидрата доводят свежевскипяченной и остывшей водой до объема 100 мл. Хранят в плотно укупоренных бутылках (0,25 моль/л). Лития хлорид R. LiCl Описание Белые, легко впитывающие воду кристаллы или гранулы. Растворимость Легко растворим в воде; растворим в ацетоне R и TS этилового спирта (~ 750 г/л). Хранение Хранят в плотно укупоренной упаковке. Подходящий доступный для приобретения реактив. L-лизин R. C6H14N2O2 Описание Кристаллические иглы или шестиугольные пластинки. Растворимость Растворим в воде; очень мало растворим в TS этилового спирта (~750 г/л); нерастворим в эфире R. Температура плавления Около 213 °C, с разложением. Удельное вращение Растворяют 0,2 г в 10 мл TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л); [a](20°C)/D= около +21,5°. Подходящий доступный для приобретения реактив. Магния хлорид R. MgCl2*6H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Магния нитрат R. Mg(NO3)2 См. Магния нитрата гексагидрат. Магния (II) нитрата гексагидрат R. Mg(NO3)2*6H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Ртути (II) бромид R. HgBr2 Подходящий доступный для приобретения реактив. AsTS ртути (II) бромида Процедура Растворяют 5 г ртути (II) бромида R в достаточном количестве TS этилового спирта (~ 750 г/л), чтобы получить100 мл. Бумага, пропитанная раствором бромида ртути (II), AsR Процедура Используют гладкую, белую фильтровальную бумагу плотностью 65–120 г/м2. Толщина бумаги в мм численно должна быть приблизительно эквивалентна указанной выше плотности, разделенной на 400. Замачивают кусочки фильтровальной бумаги не меньше 25 мм в ширину в AsTS ртути (II) бромида, сливают лишнюю жидкость, подвешивают бумагу на неметаллической нити и дают высохнуть в защищенном от света месте. Хранение Бумагу, пропитанную раствором бромида ртути (II), AsR, хранят в укупоренных бутылках в темноте. Примечание. Бумагу, на которую попали лучи солнца или пары аммиака использовать запрещается, поскольку пятно на ней либо слишком бледное, либо вообще не появляется. Ртути (II) тиоцианат R. C2HgN2S2 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS ртути (II) тиоцианата. Насыщенный раствор ртути (II) тиоцианата R в TS этилового спирта (~ 750 г/л). Ртуть R. Hg Подходящий доступный для приобретения реактив. Метан R. CH4 Подходящий доступный для приобретения реактив. Метиловый спирт R. CH4O Подходящий доступный для приобретения реактив. Метилоранж R. Натриевая соль 4’-диметил-аминоазобензол-4-сульфoкислоты, C14H14N3NaO3S. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS метилоранжа Растворяют 0,1 г метилоранжа в 100 мл воды, при необходимости фильтруют. TS метилоранжа/этилового спирта Процедура Растворяют 0,04 г метилоранжа R в достаточном количестве TS этилового спирта (~ 150 г/л), чтобы получить 100 мл. Метиловый красный. C.I. 13020, 2-(4-Диметил-амино-фенилазо)бензойная кислота. C15H15N3O2. Темно-красный порошок или фиолетовые кристаллы, практически не растворим в воде, растворим в спирте. Подходящий доступный для приобретения реактив. Нейтральный красный R. C.I. 50040; C.I. Основный красный; C15H17ClN4. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS азотной кислоты (~750 г/л) Процедура Разбавляют 750 мл TS азотной кислоты (~1 000 г/л) достаточным количеством воды, чтобы получить 1 000 мл (приблизительно 12 моль/л). TS азотной кислоты (~ 1 000 г/л). d ~ 1,41. Подходящий доступный для приобретения реактив. Азотная кислота R. HNO3 (концентрация: 69–70 %, плотность: около 1,42 г/мл) Подходящий доступный для приобретения реактив. Азот. N2 Азот, отмытый и высушенный. Подходящий доступный для приобретения реактив. Азот для хроматографии Содержит не меньше 99,95 объемных процентов N2. Подходящий доступный для приобретения реактив. Азот, не содержащий кислорода Азот R, из которого путем пропускания через щелочной раствор пирогаллола R удален кислород. Азот R. N2 Подходящий доступный для приобретения реактив. Орацетовый синий 2R. CI 61110, 1-Амино-4-(фениламино)антрацен-9,10-дион. C20H14N2O2. Температура плавления: около 194 °C. Подходящий доступный для приобретения реактив. Бычья желчь, дегидратированная, R. Дегидратированная, очищенная свежая желчь. Подходящий доступный для приобретения реактив. Панкреатический гидролизат казеина R. Подходящий доступный для приобретения реактив. Панкреатический гидролизат желатина R. Подходящий доступный для приобретения реактив. Папаиновый гидролизат соевого шрота R. Подходящий доступный для приобретения реактив. Пептон, высушенный, R. Доступен ряд пептонов из казеина, мяса, говядины или смеси перечисленного. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS перхлорной кислоты (~ 1170 г/л). d ~ 1,67. Подходящий доступный для приобретения реактив. Петролейный эфир R. Подходящий доступный для приобретения реактив. Фенолфталеин R. C20H14O4. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS фенолфталеина. Растворяют 1 г фенолфталеина в 100 мл этилового спирта R. TS фенолфталеина/этилового спирта. Процедура Растворяют 1,0 г фенолфталеина R в достаточном количестве TS этилового спирта (~ 750 г/л), чтобы получить100 мл. Феноловый красный R. Фенолсульфофталеин, C19HI4O5S. Подходящий доступный для приобретения реактив. Фосфатный буферный раствор, pH 7,2 Смешивают 50 мл TS калия дигидрогенфосфата (0,2 моль/л) для буферного раствора и 34,7 мл VS натрия гидроксида (0,2 моль/л) и доводят водой до объема 200 мл. Поли(диметил)(дифенил)силоксан Содержит 95 % метиловых и 5 % фенольных групп. DB-5, SE52. Неподвижная фаза для газовой хроматографии. Подходящий доступный для приобретения материал для колоночной хроматографии. Поли(диметил)силоксан Силиконовый каучук (метиловый). Кремнийорганический полимер, выглядит как полужидкая, бесцветная смола. Подходящий доступный для приобретения материал для колоночной хроматографии. Полисорбат 20 R. Качество должно соответствовать монографии Международной фармакопеи, т. 4, с. 202. Полисорбат 80 R. Качество должно соответствовать монографии Международной фармакопеи, т. 4, с. 202. Калия бромид R. KBr Подходящий доступный для приобретения реактив. Калия дигидрогенфосфат R. KH2PO4 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS калия дигидрогенфосфата (0,2 моль/л) 27,22 г калия дигидрогенфосфата доводят водой до объема 1 000 мл. Калия гидроген фталат R. C8H5KO4 Подходящий доступный для приобретения реактив. Калий гидроксид. KOH Подходящий доступный для приобретения реактив. Калия йодид R. KI Подходящий доступный для приобретения реактив. TS калия йодида 16,5 г калия йодида доводят водой до объема 100 мл. Хранят в светонепроницаемой упаковке. Готовят перед использованием (1 моль/л). Калия йодид AsR Калия йодид R, который отвечает требованиям следующего испытания: растворяют 10 г калия йодида R в 25 мл TS хлористоводородной кислоты (~ 250 г/л) и 35 мл воды. Прибавляют 2 капли TS олова (II) хлорида. Проводят общее испытание на мышьяк. Не должно быть видимых пятен. Калия сульфaт R. K2SO4 Подходящий доступный для приобретения реактив. Калия теллурит R. K2TeO3 (примерно) Подходящий доступный для приобретения реактив. Калия тетратионат R. K2S4O6 Подходящий доступный для приобретения реактив. Прометрин R. C10H19N5S Доступный для приобретения реактив, подходящий для применения в качестве материала сравнения. Пропиленгликоль R. Пропандиол, C3H8O2 Подходящий доступный для приобретения реактив. 2-Пропанол R. Изопропиловый спирт; C3H8O Подходящий доступный для приобретения реактив. Пирогаллол R. C6H6O3. Бензол-1,2,3-триол Белые кристаллы, под воздействием воздуха и света становятся коричневатыми, очень легко растворимы в воде, спирте и эфире, мало растворимы в углерода дисульфиде. Коричневеют под воздействием воздуха, водных растворов и, быстрее, щелочных растворов из-за поглощения кислорода. Температура плавления: около 131 °C. Хранят в защищенном от света месте. Подходящий доступный для приобретения реактив. Раствор пирогаллола щелочной Растворяют 0,5 г пирогаллола R в 2 мл не содержащей углекислого газа воды R. Растворяют 12 г калия гидроксида R в 8 мл не содержащей углекислого газа воды R. Непосредственно перед использованием смешивают эти два раствора. Силикагель G Описание Мелкий, белый, однородный порошок, средний размер частиц – 10–44 μм, содержит около 130 г полуводного кальция сульфата на кг. Содержание кальция сульфата Помещают точную навеску около 0,25 г в колбу с притертой стеклянной пробкой, прибавляют 3 мл TS хлористоводородной кислоты (~ 70 г/л) и 100 мл воды. Активно встряхивают в течение 30 минут. Фильтруют через фильтр из пористого стекла и промывают остаток. Используя фильтрат и смывы, проводят количественное определение кальция методом комплексометрии (Международная фармакопея, т. 1, с. 128). Каждый мл VS динатрия эдетата (0,05 моль/л) эквивалентен 7,26 мг CaSO4*1/2H2O (молекулярная масса 145,1 г/моль). pH Встряхивают 1 г с 10 мл не содержащей углекислого газа воды R в течение 5 минут. Измеряют pH потенциометрическим методом (Международная фармакопея, т. 1, с. 96); pH должен быть около 7. Подготовка Суспендируют 30 г силикагеля в 60 мл воды, активно встряхивают в течение 30 секунд. Аккуратно покрывают чистые пластинки слоем в 0,25 мм с помощью прибора для нанесения сорбента. Оставляют покрытые сорбентом пластинки высыхать на воздухе. Разделительная способность На слой сорбента отдельно наносят по 10 μл растворов концентрацией 0,10 мг/мл, содержащих, соответственно, индофенолового синего R, судана красного G R и диметилового желтого R в толуоле R. Дают подняться тому же растворителю на 10 см. На хроматограмме должно быть три четко разделенных пятна: от индофенолового синего возле точек нанесения, от диметилового желтого по центру хроматограммы, а от судана красного G между ними. Силикагель R Подходящий доступный для приобретения материал для колоночной хроматографии. Нитрат серебра R. AgNO3 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS нитрата серебра (40 г/л). Раствора нитрата серебра R, содержащий около 42,5 г AgNO3 на литр (приблизительно 0,25 моль/л). Симазин R. C7H12CIN5 Доступный для приобретения реактив, подходящий для использования в качестве материала сравнения. Натронная известь R Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия карбонат R. Na2CO3*10H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия карбонат, безводный, R. Na2CO3 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS натрия карбоната (50 г/л). Раствор натрия карбоната R, содержащий около 50 г Na2CO3 на литр (приблизительно 0,5 моль/л). Натрия хлорид R. NaCl Подходящий доступный для приобретения реактив. TS натрия хлорида (400 г/л). Раствор натрия хлорида R, содержащий около 400 г NaCl на литр. Натрия цитрата R. C6H5Na3O7*2H2O. Качество субстанции должно соответствовать требованиям монографии Международной фармакопеи, т. 3, с. 192. Натрия дезоксихолат R. C23H39NaO4. Содержит не меньше 90 % C23H39NaO4. Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия гидроксид R. NaOH Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия гидроксид (1 M) Растворяют 162 г натрия гидроксида в 150 мл не содержащей углекислого газа воды R, остужают раствор до комнатной температуры и фильтруют через уплотненный бумажный фильтр. Разбавляют 54,5 мл прозрачного фильтрата не содержащей углекислого газа водой R, чтобы получить 1 000 мл. Стандартизация Точную навеску около 5 г калия гидроген фталата, который перед этим был слегка раздроблен и высушен при 120 °C в течение 2 часов, растворяют в 75 мл не содержащей углекислого газа воде R. Прибавляют 0,1 мл TS фенолфталеина, титруют раствором натрия гидроксида до получения постоянной розовой окраски. Каждые 204,2 мг калия гидроген фталата эквивалентно 1 мл VS натрия гидроксида (0,1 M). Хранение Растворы щелочных гидроксидов поглощают углекислый газ из воздуха. Поэтому их следует хранить в бутылках с подходящими не стеклянными плотно прилегающими пробками. Бутылки снабжают специальными поглотительными трубками с натронной известью. Примечание Растворы с меньшей концентрацией (например, 0,1 M, 0,01 M) готовят путем количественного разбавления точно измеренных объемов 1 M раствора достаточным количеством не содержащей углекислого газа воды R до получения требуемой концентрации. Часто проводят перестандартизацию раствора. VS натрия гидроксида (1 моль/л). Натрия гидроксид R растворяют в воде, чтобы получить раствор, содержащий 40,01 г NaOH в 1 000 мл. Метод стандартизации. Определяют точную концентрацию раствора 1 моль/л следующим образом: высушивают около 5 г калия гидроген фталата R при температуре 105 °C в течение 3 часов и берут точную навеску. Если калия гидроген фталат имеет форму крупных кристаллов, перед высушиванием их следует раздробить. Растворяют калия гидроген фталат в 75 мл не содержащей углекислого газа воды R и титруют с раствором натрия гидроксида, используя TS фенолфталеина/этилового спирта в качестве индикатора. Каждые 0,2042 г калия гидроген фталата эквивалентны 1 мл VS натрия гидроксида (1 моль/л). Стандартные растворы натрия гидроксида следует часто перестандартизовывать. Хранение Растворы щелочных гидроксидов поглощают углекислый газ из воздуха, поэтому их следует хранить в бутылках с подходящими не стеклянными плотно прилегающими пробками. Бутылки снабжают специальными поглотительными трубками с натронной известью R. VS натрия гидроксида (0,5 моль/л). Натрия гидроксид R, растворенный в воде, чтобы получить раствор, содержащий 20,00 г NaOH на 1 000 мл. Метод стандартизации Определяют точную концентрацию раствора, используя метод, описанный для VS натрия гидроксида (1 моль/л). VS натрия гидроксида (0,05 моль/л). Натрия гидроксид R, растворенный в воде, чтобы получить раствор, содержащий 2,000 г NaOH на 1 000 мл. Метод стандартизации Определяют точную концентрацию раствора, используя метод, описанный для VS натрия гидроксида (1 моль/л). VS натрия гидроксида (0,02 моль/л), не содержащий углерода. Натрия гидроксид R, растворенный в воде, чтобы получить раствор, содержащий 0,8001 г NaOH на 1 000 мл. Метод стандартизации Определяют точную концентрацию раствора, используя метод, описанный для VS натрия гидроксида (1 моль/л). TS натрия гидроксида (~ 240 г/л). Раствор натрия гидроксида R, содержащий около 240 г NaOH на литр не содержащей углекислого газа воды R. TS натрия гидроксида метанольный Процедура Растворяют 2,5 г натрия гидроксида R в 10 мл не содержащей углекислого газа воды R. Прибавляют 1 мл пропиленгликоля R и доводят до 100 мл метиловым спиртом R. Натрия метабисульфит R. Na2O5S2 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS натрия метабисульфита (150 г/л) Раствор натрия метабисульфита R, содержащий около 150 г Na2O5S2 на литр. Натрия пируват R. C3H3NaO2 Описание Практически белый или белый порошок или кристаллический порошок. Растворимость Растворим в воде. Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия сульфат, безводный, R. Na2SO3. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS натрия сульфида. Na2S Растворяют 5 г натрия сульфида девятиводного в смеси 10 мл воды и 30 мл глицерина. Или растворяют 5 г натрия гидроксида в смеси из 30 мл воды и 90 мл глицерина, половину объема этого раствора насыщают сульфидом водорода, пока жидкость охлаждается, а затем смешивают с оставшейся половиной. Хранят в хорошо заполненных светонепроницаемых бутылках. Реактив используют в течение 3 месяцев. Натрия сульфид девятиводный R. Na2S*9H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия сульфит, безводный, R. Na2SO3 Подходящий доступный для приобретения реактив. Натрия тетрагидроборат R. NaBH4 Гигроскопичные кристаллы, легко растворимы в воде, растворимы в этиловом спирте. Натрия тиосульфата R. Na2S2O3*5H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. VS натрия тиосульфата (0,1 моль/л). Натрия тиосульфата R, растворенный в воде, чтобы получить раствор, в 1 000 мл которого содержится 15,82 г Na2S2O3. Метод стандартизации Точную концентрацию 0,1 моль/л раствора определяют следующим способом: переносят 30,0 мл VS калия дихромата (0,0167 моль/л) в колбу со стеклянной пробкой и разбавляют 50 мл воды. Прибавляют 2 г калия йодида R и 5 мл TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л), укупоривают и оставляют на 10 минут. Разбавляют 100 мл воды и оттитровывают высвободившийся йод раствором натрия тиосульфата, используя в качестве индикатора крахмал TS. Растворы натрия тиосульфата следует часто перестандартизовывать. Олова (II) хлорид R. SnCl2*2H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. AsTS олова (II) хлорида Процедура Готовят из TS олова (II) хлорида. Добавляют равный объем TS хлористоводородной кислоты (~250 г/л), кипятят до достижения первоначального объема, фильтруют через фильтровальную бумагу с мелким зерном. Испытание на мышьяк К 10 мл AsTS олова (II) хлорида прибавляют 6 мл воды и 10 мл AsTS хлористоводородной кислоты(~250 г/л), дистиллируют 16 мл. К дистилляту прибавляют 50 мл воды и 2 капли AsTS олова (II) хлорида и проводят обычное испытание на мышьяк. Цвет полученного пятная не должен быть интенсивнее, чем цвет пятна от 1 мл стандартного образца. Это будет означать, что количество мышьяка не превышает 1 μг/мл. Крахмал R Подходящий доступный для приобретения реактив. Крахмал, растворимый, R Подходящий доступный для приобретения реактив. TS крахмала Процедура Смешивают 0,5 г крахмала R или крахмала R растворимого с 5 мл воды, прибавляют этот раствор, постоянно помешивая, к достаточному количеству воды, чтобы получить около 100 мл; кипятят в течение нескольких минут, охлаждают и фильтруют. Примечание TS крахмала должен быть свежеприготовленным. Сополимер стирола с дивинилбензолом Пористые, жесткие гранулы пространственно сшитого полимера. Есть разные типы с разным размером гранул. Разброс размеров гранул указывается после названия реактива в тех испытаниях, где он используется. Подходящий доступный для приобретения материал. Сахароза R. C12H22O11 Подходящий доступный для приобретения реактив. Судан красный G R. 1-(4-(фенилазо)фенилазо)-2-нафтол; судан III; растворитель красный 23; C.I. 26100; C22H16N4O. Описание Красновато-коричневый порошок. Растворимость Практически не растворим в воде; растворим в хлороформе R. Подходящий доступный для приобретения реактив. Серная кислота R. H2SO4 Подходящий доступный для приобретения реактив. TS серной кислоты (~1760 г/л). d ~ 1,84. Подходящий доступный для приобретения реактив. TS серной кислоты (~300 г/л) Процедура Прибавляют 171 мл TS серной кислоты (~ 1760 г/л) к достаточному количеству воды, чтобы получилось 1 000 мл (приблизительно 3 моль/л). TS серной кислоты (~ 37 г/л) Процедура Прибавляют 21,5 мл TS серной кислоты (~ 1760 г/л) к достаточному количеству воды, чтобы получилось 1 000 мл (приблизительно 0,375 моль/л). Тетрациклин R. C22H24N2O8 Подходящий доступный для приобретения реактив. N,N,N’,N’-Тетраметил-п-фенилендиамина дигидрохлорид R. C10H16N2*2HCl. Описание Беловато-серые кристаллы. Подходящий доступный для приобретения реактив. Толуол R. C7H8. Метилбензол Прозрачная, бесцветная, воспламеняющаяся жидкость, очень мало растворима в воде, смешивается со спиртом. d 20/20: от 0,865 до 0,870, температура кипения: около 110 °C. Подходящий доступный для приобретения реактив. Трифторуксусная кислота (TFA). CF3COOH Подходящий доступный для приобретения реактив. 2,2,4-Триметил пентан R. C8H18 Подходящий доступный для приобретения реактив. Вода, не содержащая углекислого газа R. Вода, которая активно кипела в течение нескольких секунд, и во время охлаждения и хранения защищена от воздействия атмосферы. Экстракт дрожжей, растворимый в воде, R Подходящий доступный для приобретения реактив. Цинк R, Zn; гранулы, порошок или пыль. Подходящий доступный для приобретения реактив. Цинк, AsR, гранулированный. Гранулированный цинк R, который отвечает требованиям следующих испытаний: Предельное содержание мышьяка Прибавляют 10 мл AsTS раствор дихлорида олова в хлористоводородной кислоте (~ 250 г/л) к 50 мл воды и проводят обычное испытание на мышьяк: берут 10 г гранулированного цинка R и позволяют реакции идти в течение 1 часа; в результате не должно получаться видимого пятна. Испытание на чувствительность Повторяют испытание на мышьяк с добавлением 0,1 мл разбавленного AsTS мышьяка; в результате должно получиться еле заметное, но отчетливое пятно желтого цвета. Цинка ацетат R. C4H6O4Zn*2H2O Подходящий доступный для приобретения реактив. TS цинка ацетата/алюминия хлорида Процедура Растворяют 200 г цинка ацетата R и 5 г алюминия хлорида R в достаточном количестве воды, чтобы получить1 000 мл.