Рекомендации по оценке культур клеток

животных, используемых в качестве

субстратов для производства биопрепаратов,

а также по описанию характеристик банков

клеток

Аббревиатуры

1. Введение

2. Историческая справка

3. Сфера действия

4. Определения

5. Общие положения

5.1 Виды субстратов клеток животных

5.2 Потенциальные риски и уменьшение рисков, связанных с биопрепаратами,

производимыми в культурах клеток животных

Часть A. Общие рекомендации по производству всех типов клеточных культур

А.1 Надлежащая производственная практика

A.2 Принципы надлежащей практики культивирования клеток

A.3 Отбор исходных материалов

A.4 Аттестация банков клеток производителем

А.5 Криосохранение и создание банков клеток

Часть B. Рекомендации по описанию характеристик банков клеток на основе

субстратов клеток животных

B.1 Общие положения

B.2 Подлинность

B.3 Стабильность

B.4 Стерильность

B.5 Жизнеспособность

B.6 Характеристики роста

B.7 Гомогенность

B.8 Туморогенность

B.9 Онкогенность

B.10 Цитогенетика

B.11 Микробные агенты

B.12 Краткое описание испытаний, используемых для анализа и описания характеристик

субстратов клеток животных

Авторы

Список литературы

Приложение 1

Испытания на вирусы крупного рогатого скота в сыворотке, используемой для

производства банков клеток

Приложение 2

Протокол испытаний на туморогенность с использованием бестимусных голых мышей

для оценки клеток млекопитающих

Приложение 3

Протокол испытаний на онкогенность для оценки ДНК клетки и лизатов клеток

Аббревиатуры

ALS антилимфоцитарная сыворотка

ATCC Американская коллекция типовых культур

ATG антитимоцитарный глобулин

ATS антитимоцитарная сыворотка

BAV5 аденовирус типа 5 крупного рогатого скота

БЦЖ бацилла Кальметта-Герена

п.о. пара оснований

BPIV3 вирус парагриппа типа 3 крупного рогатого скота

BPV парвовирус крупного рогатого скота

BRSV респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота

BSE губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота

BTV вирус блютанга

BVDV вирусная диарея крупного рогатого скота

CCL непрерывная (постоянная) клеточная линия

CEF фибробласты куриного зародыша

CHO яичник китайского хомячка

CJD болезнь Крейтцфельда-Якоба

CPE цитопатический эффект

CTL цитотоксический Т-лимфоцит

CWD хронический вастинг-синдром

DCL линия диплоидных клеток

EBV вирус Эпштейна-Барра

ECB расширенный банк клеток (extended cell bank)

EFSA Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов

ELISA иммуносорбентный ферментный анализ

EMA Европейское агентство по лекарственным средствам

EOP получаемый в конце производственного цикла

EOPC клетка, получаемая в конце производственного цикла

EPIC-PCR ПЦР с использованием праймеров к экзону и прилежащему к нему интрону

FBS фетальная бычья сыворотка

FDA Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами

(США)

FFI фатальная семейная бессонница

GBR уровень риска BSE, характерный для географического региона

GMP надлежащая производственная практика

GSS синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера

HCP защечный мешок хомяка

HDC диплоидная клетка человека

HEK мезонефрос человека

ВИЧ вирус иммунодефицита человека

HLA антиген лейкоцитов человека

IBR вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

ICH Международная конференция по гармонизации технических требований к

регистрации лекарственных средств для применения у человека

IFA иммунофлуоресцентный анализ

IFN интерферон

LCMV вирус лимфоцитарного хориоменингита

MAbs моноклональные антитела

MCB главный банк клеток

MDCK клетки Мадин-Дарби почек собак

mRNA информационная РНК

miRNA микро-РНК

МПС массовое параллельное секвенирование

NAT технология амплификации нуклеиновых кислот

NCL национальная контрольная лаборатория

NK натуральная (клетка-) киллер

NOD не страдающий ожирением больной диабетом

NRA национальный регуляторный орган

OIE Всемирная организация здравоохранения животных

PBS фосфатно-солевой буферный раствор

PCC первичная культура клеток

ПЦР полимеразная цепная реакция

PDL уровень удвоения популяции

PERT усиленная препаратом активность обратной транскриптазы (product-enhanced

reverse transcriptase)

PMCA циклическая амплификация неправильно свернутого белка

PrP белок приона

RCB стандартный банк клеток

rcDNA остаточная клеточная ДНК

rDNA получаемый при помощи технологии рекомбинантной ДНК

REO3 реовирус 3-го типа

RFLP полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

RT обратная транскриптаза

SCID тяжелый комбинированный иммунодефицит

SCL линия стволовых клеток

СПФ свободный от специфических патогенов

STR короткий тандемный повтор

SV вирус обезьян

TCID

средняя инфекционная доза в тканевой культуре

ПЭМ просвечивающая электронная микроскопия

TPD

доза, вызывающая образование опухоли в 50% случаев (tumour-producing dose at

the 50% end-point)

ТГЭ трансмиссивная губчатая энцефалопатия

vCJD вариантная болезнь Крейтцфельда-Якоба

VNTR варьирующееся число тандемных повторов

VSV вирус везикулярного стоматита

WCB рабочий банк клеток

1. Введение

Клеточные субстраты представляют собой клетки, используемые для производства

биопрепаратов. Достоверно известно, что как сами клеточные субстраты, так и события,

связанные с клеточным ростом, могут влиять на характеристики и безопасность

производимых биопрепаратов. Поэтому чтобы определить вопросы, вызывающие

опасения, и разработать систему контроля качества, учитывающую данные вопросы,

необходимо полное понимание характеристик клеточных субстратов.

Последние достижения, связанные с использованием и контролем качества новых

субстратов клеток животных, в особенности постоянных (непрерывных) клеточных линий

(CCL) и клеток насекомых, поставили на повестку дня пересмотр требований ВОЗ

(Требования к использованию клеток животных в качестве субстратов для производства

биопрепаратов) 1. Чтобы упростить решение регуляторных/научных вопросов,

связанных с использованием культур клеток животных (в том числе клеток человека) в

качестве субстратов для производства биопрепаратов, ВОЗ инициировала пересмотр

требований к клеточным субстратам путем утверждения Исследовательской группы ВОЗ

по клеточным субстратам. Термин «клетки животных» относится к клеткам, получаемым

от организмов, которые относятся к царству животных. Настоящий документ является

результатом работы Исследовательской группы, которая включала в себя множество

консультаций с отдельными экспертами и экспертными организациями в данной области.

После получения комментариев от указанных выше экспертов и организаций, а также от

приглашенных рецензентов, была продолжена работа по пересмотру настоящих

рекомендаций, которые были в итоге представлены на заседании Экспертного комитета

ВОЗ по биологической стандартизации в 2010 г. Во время разработки настоящего

документа во внимание принимались схожие руководства по данной теме,

опубликованные другими авторитетными организациями, и была предпринята попытка,

по мере возможности, согласовать текст настоящего документа с другими действующими

руководствами.

Настоящий документ представляет собой руководство для национальных

регуляторных органов (NRA), национальных контрольных лабораторий (NCL) и

производителей по основным принципам и, в ряде случаев, подробным методикам,

которые следует использовать при описании характеристик клеток животных,

используемых в производстве биопрепаратов. Хотя полномочия по принятию решений

принадлежат национальным регуляторным органам, им рекомендуется консультироваться

с экспертами национальных контрольных лабораторий в данной области.

2. Историческая справка

Исторически самые большие опасения, касающиеся безопасности биопрепаратов,

получаемых из клеток животных, были связаны с возможным присутствием

контаминантов микробного происхождения и, в некоторых случаях, со свойствами и

компонентами самих клеток, таких как ДНК и белки.

Например, в 1954 г. разрабатывалась экспериментальная аденовирусная вакцина, и

в качестве клеточного субстрата было решено использовать «нормальные» клетки, а не

человеческие опухолевые клетки (HeLa) 2. В то время о биологическом механизме

(механизмах) возникновения рака было известно довольно мало, поэтому сложно было

проанализировать и дать научную количественную оценку канцерогенного риска для

пациентов, связанного с введением вакцины, произведенной на основе клеток HeLa. Хотя

понятие «нормальных» клеток не было на тот момент определено, было принято решение

использовать первичные культуры клеток (PCC), получаемых от таких животных, как

обезьяны, хомяки, а также из оплодотворенных куриных яиц, для научных исследований и

разработок в области вакцин 3.

Первые требования к клеточным субстратам были опубликованы ВОЗ в 1959 г. и

касались использования первичных культур клеток, получаемых из почек клинически

здоровых обезьян, для производства инактивированной полиомиелитной вакцины 4.

Данные требования были пересмотрены и заново опубликованы в 1966 г. 5.

Впоследствии для производства других вирусных вакцин стали использовать другие

первичные культуры клеток.

В 1960-ых годах были получены диплоидные клетки человека (HDC), и они были

предложены в качестве альтернативы первичным культурам клеток, получаемых из почек

обезьян, для производства полиомиелитной и других вирусных вакцин. В основу

использования диплоидных клеток человека легли следующие связанные с ними

возможности:

■ возможность осуществлять криогенное сохранение клеток при низких уровнях

удвоения популяции (PDL);

■ возможность создавать криосохраненные банки клеток и описывать их

характеристики, с тем чтобы в дальнейшем расширять банки и иметь возможность

использовать их в качестве источника клеток в течение многих десятилетий;

■ возможность проводить всесторонние испытания размороженных клеток перед

их использованием для производства вакцин;

■ возможность демонстрировать отсутствие в клетках детектируемых занесенных

агентов и отсутствие потенциала к образованию опухолей при введении

иммуносупрессированным животным.

Таким образом, диплоидные клетки человека удовлетворяли всем существовавшим

на тот момент критериям. Утверждалось, что поскольку диплоидные клетки человека

являются нормальными, и могут быть стандартизованы, могут испытываться и

использоваться в течение многих лет, они значительно лучше первичных культур клеток.

Однако преимущества диплоидных клеток человека были признаны не сразу, в

основном потому, что некоторые члены научного сообщества опасались, что диплоидные

клетки человека могут содержать латентные и неизвестные онкогенные вирусы человека,

и что такие потенциальные вирусы ставят под угрозу здоровье реципиентов вакцины,

производимой на основе диплоидных клеток человека. Множество конференций и

дебатов, в которых обсуждались новые данные, в итоге привели к тому, что диплоидные

клетки человека стали использоваться в качестве субстрата для производства вирусных

вакцин и продолжают использоваться многими производителями в настоящее время для

производства вакцин, безопасность и эффективность которых подтверждается данными

многолетних исследований. В это же время были введены понятия главного банка клеток

(MCB) и рабочего банка клеток (WCB), а также процедура описания характеристик

клеточного субстрата 6, 7.

Понимание биологии опухолевых клеток было в то время гораздо более

ограниченным, чем сейчас, так же как и имевшиеся в наличии технические средства.

Поэтому сторонники использования диплоидных клеток человека для производства

вакцин использовали следующие четыре аргумента, чтобы доказать «нормальность» и,

следовательно, безопасность этих клеток: отсутствие в них детектируемых занесенных

агентов, ограниченный срок жизни диплоидных клеток человека; диплоидная природа

диплоидных клеток человека и отсутствие способности к образованию опухолей в

различных тест-системах in vivo.

Для того чтобы обеспечить высокую степень уверенности в стабильности четырех

указанных характеристик, первоначальные испытания при выпуске партий для каждой

серии вакцины, полученной из диплоидных клеток человека, включали испытания

клеточного субстрата на занесенные агенты, кариологические испытания и испытания

туморогенности 8,9. Основной вопрос, который рассматривался в стандартных

испытаниях туморогенности, это наличие контаминации или трансформации клеточной

культуры, используемой в производстве препарата, которые приводили бы к появлению в

клеточной культуре смеси из «нормальных» и туморогенных клеток. Позднее было

установлено, что испытания на туморогенность не обладали достаточной

чувствительностью для обнаружения низких уровней содержания туморогенных клеток,

поэтому повторные испытания хорошо охарактеризованной клеточной линии,

создаваемой для формирования банка клеток, были сочтены нецелесообразным расходом

подопытных животных и времени. Поэтому в итоге испытания туморогенности стали

требоваться только для описания характеристик главного банка клеток (использующего

клетки, чей возраст соответствует предполагаемой продолжительности жизни in vitro,

необходимой для производства препарата, или превышает ее) как для диплоидных клеток

человека, так и для непрерывных клеточных линий 10, 11.

В 1970-ых годах возникла необходимость в проведении клинических исследований

интерферона альфа в большем количестве, чем могло быть произведено из первичных

клеток лимфоцитов человека. В качестве альтернативного клеточного субстрата для

производства ИФН-α были предложены опухолевые клетки человека (Namalwa),

выращенные in vitro. Основные опасения, связанные с использованием клеток Namalwa,

касались возможного содержания в них генома вируса Эпштейна-Барра (EBV),

встроенного в клеточную ДНК, и передачи либо целого вируса либо ДНК, содержащей

элементы вируса, реципиентам препаратов на основе ИФН-α. Тем не менее, к концу 1970-

ых годов регуляторные агентства разрешили проведение клинических исследований

препарата с участием людей, и он в итоге был зарегистрирован в ряде стран. Среди

наиболее важных причин, повлиявших на это решение, был тот факт, что ИФН, в

противоположность живым вирусным вакцинам, не реплицируется, и ИФН-α

использовался как терапевтическое, а не как профилактическое средство, поэтому оценка

соотношения риска-пользы для него была иная. Кроме того, технологии значительно

усовершенствовались и позволили выполнять тщательную очистку ИФН-α , а также

валидацию процедуры очистки, благодаря которой демонстрировалось отсутствие EBV и

клеточной ДНК в конечном препарате в пределах возможностей количественного

определения, доступных на тот момент, что способствовало снижению рисков.

В 1980-ых годах развитие науки и техники позволило получать рекомбинантные

белки (с использованием технологии рекомбинантной ДНК) и моноклональные антитела

(MAb). В качестве субстратов было решено использовать клетки животных, обладающие

возможностью непрерывного роста in vitro (CCL), поскольку их достаточно легко

трансфектировать и конструировать. Кроме того, в отличие от первичных культур клеток

и диплоидных клеток человека, непрерывные клеточные линии быстро растут и

достигают высокой плотности, а также экспрессируют различные продукты в высоких

концентрациях. Для производства препаратов на основе рекомбинантной ДНК стали

широко использоваться клеточные линии СНО (клетки яичников китайских хомячков), а

для производства MAb понадобились различные гибридомы. Использование подобных

клеток в качестве субстратов для производства широкого спектра биопрепаратов,

имеющих потенциально большое значение, вновь вызвало опасения, связанные с

безопасностью. По итогам множества конференций был достигнут научный консенсус, и

определены три основных вызывающих беспокойство аспекта, связанные с субстратами

клеток животных: ДНК, вирусы и трансформирующие белки. В 1986 г. ВОЗ создала

Исследовательскую группу по клеточным субстратам, которая должна была заняться

более подробным изучением вопросов, связанных с клеточными субстратами.

Исследовательская группа пришла к выводу, что непрерывные клеточные линии не

следует исключать из рассмотрения в качестве субстратов для производства

биопрепаратов, и что непрерывные клеточные линии, в целом, являются приемлемыми

для данных целей при условии предоставления доказательств, что в процессе

производства устраняются потенциальные контаминирующие вирусы, патогенные для

человека, и до приемлемого уровня сокращается содержание ДНК и/или элиминируется ее

биологическая активность 12. Причина, по которой Исследовательская группа посчитала

инфекционные агенты основным фактором риска, во многом объясняется

зарегистрированными на тот момент случаями заражения вирусами и развития

заболеваний по вине контаминированных биопрепаратов (например, заражение гепатитом

В и ВИЧ через фактор свертывания крови VIII). В 1987 г. были опубликованы требования

ВОЗ к непрерывным клеточным линиям, используемым для производства биопрепаратов

13. В 1988 г. ВОЗ пересмотрела требования с учетом анализа новых данных и повысила

приемлемый уровень остаточной клеточной ДНК до 10 нг на одну дозу парентерального

препарата. Кроме того, было отмечено, что бета-пропиолактон (агент, инактивирующий

вирус), также может нивелировать биологическую активность ДНК. Поэтому

использование данного агента предоставляет дополнительные гарантии безопасности,

даже если содержание ДНК на одну дозу препарата является значительным 1.

В течение 1990-ых и в начале 2000-х множество непрерывных клеточных линий

исследовались с точки зрения возможного использования в качестве клеточных

субстратов для производства новых разрабатываемых биопрепаратов, поскольку

аналогично клеточным линиям, описанным выше, непрерывные клеточные линии имели

значительные преимущества при использовании в производстве (например, быстрый рост

и высокий уровень экспрессии). К ним относятся линии опухолевых клеток: HeLa,

используемые для производства вакцин против ВИЧ с вектором на основе

аденоассоциированного вируса; PER.C6 для производства вакцин против гриппа и вакцин

против ВИЧ; клетки Мадин-Дарби почек собак (MDCK) для производства вакцин против

гриппа и 293ORF6 – для производства вакцин против ВИЧ. Позднее было предложено

использовать в производстве биопрепаратов линии клеток насекомых и стволовых клеток

(SCL), эти клетки ставят ряд сложных задач, связанных с их исследованием и описанием

их характеристик.

Приемлемость определенного типа клеток (первичных, диплоидных, стволовых

или перевиваемых (постоянных)) в качестве субстрата для производства отдельных

биопрепаратов зависит от множества факторов, среди которых важным является глубокое

знание основных биологических характеристик типов клеток. Важно понимать, что

туморогенный потенциал непрерывных клеточных линий – это только один из множества

факторов, которые требуют рассмотрения, остальные зависят от степени, в которой

производственный процесс сокращает или сводит к нулю связанные с клетками факторы

риска. Анализ всех доступных данных помогает определить, можно ли теоретически

одобрить препарат, произведенный в определенном клеточном субстрате.

Настоящие рекомендации предоставляют собой руководство для производителей,

национальных регуляторных органов и национальных контрольных лабораторий по

оценке культур клеток животных, используемых в качестве субстратов для производства

биопрепаратов, а также при описании характеристик банков клеток

По сравнению с предыдущими требованиями, опубликованными ВОЗ в

Приложении 1 к Серии технических отчетов №878, в настоящий документ были внесены

следующие изменения:

■ обновлены общие рекомендации к производственному процессу, применимые ко

всем типам клеточных культур;

■ добавлена информация по оценке новых клеточных субстратов, таких как клетки

насекомых и стволовые клетки;

■ расширен раздел с определениями, в который были включены новые термины и

новая информация, и раздел был перенесен ближе к началу документа;

■ изменена структура документа: добавлено больше справочной вводной

информации, и указана применимость отдельных разделов к различным видам

клеточных субстратов;

■ добавлен новый раздел по стратегиям сокращения рисков при производстве

биопрепаратов;

■ добавлен раздел по надлежащей практике работы с культурами клеток;

■ обновлен раздел по отбору исходных материалов, и в Приложение 1 включено

подробное описание методов, используемых для проверки сыворотки на

содержание бычьих вирусов;

■ обновлен раздел по проведению испытаний на туморогенность, и в Приложение

2 включен примерный протокол для модели бестимусной лысой мыши;

■ добавлена информация по исследованию онкогенности туморогенных клеточных

лизатов, и в Приложение 3 включен примерный протокол испытания;

■ требования, касающиеся приемлемых уровней содержания остаточной клеточной

ДНК, являются специфическими для разных видов препаратов, поэтому они не

рассматриваются отдельно в настоящем документе;

■ обновлены рекомендации по проведению испытаний микробных агентов.

3. Сфера действия

Настоящие рекомендации заменяют собой предыдущие Рекомендации ВОЗ или

Рекомендации, описывающие процедуры использования субстратов клеток животных для

производства биопрепаратов 1, 13.

Некоторые рекомендации также могут быть полезны для контроля качества

определенных биопрепаратов в процессе их производства, но в сферу действия

настоящего документа не входят рекомендации к испытаниям по контролю качества при

выпуске препаратов. Также в сферу действия настоящего документа не входит оценка

рисков в рамках предрегистрационной экспертизы. Данную информацию можно найти в

требованиях или рекомендациях, касающихся отдельных видов препаратов.

При производстве инновационных лекарственных препаратов в последнее время

все чаще стали использоваться клетки, модифицированные при помощи технологии

рекомбинантной ДНК. Вопросы, связанные с подобными препаратами, рассматриваются в

других руководствах 1, 10, 14, 15. Однако в настоящем документе рассматривается ряд

общих вопросов, которые относятся, в том числе, к генетически модифицированным и

другим клеточным субстратам.

В настоящих рекомендациях целенаправленно не рассматриваются препараты,

производимые в оплодотворенных куриных яйцах, микробных клетках (т.е. бактериях и

дрожжах) и клетках растений. Из сферы действия настоящего документа также

исключаются цельные жизнеспособные клетки животных, например, стволовые клетки,

если они используются в терапевтических целях посредством прямой трансплантации

пациентам или если они преобразуются в линиях стволовых клеток, которые в

дальнейшем используются в качестве терапевтического средства при трансплантации. В

этом случае следует обсуждать необходимые испытания по описанию характеристик

культур клеток с национальными регуляторными органами/национальными

контрольными лабораториями. Однако для линий стволовых клеток, используемых для

производства таких биопрепаратов, как факторы роста и вакцины, должны соблюдаться

настоящие рекомендации.

Некоторые из общих рекомендаций, приведенные в настоящем документе (см.

разделы с А.1 по А.5) применимы ко всем субстратам клеток животных. Более

специфичные руководящие указания для первичных культур клеток содержатся в

соответствующих документах, опубликованных ВОЗ (например, производство

полиомиелитной вакцины с использованием первичной культуры клеток почек обезьян)

4, 5.

Клеточные субстраты следует разрабатывать и использовать в соответствии с

применимыми требованиями национальных регуляторных органов/национальных

контрольных лабораторий.

В целом, Надлежащей производственной практикой (GMP) не предусмотрено

повторное тестирование материалов, разрешенных для дальнейшего использования в

производстве, поэтому в случае проведения подобного тестирования необходимо

предоставить соответствующее обоснование. Таким образом, сфера действия настоящего

руководства распространяется на клеточные субстраты, используемые для создания новых

банков клеток. Особые обстоятельства, в которых целесообразно проводить повторное

тестирование уже созданных и разрешенных для использования банков клеток, следует

обсуждать с уполномоченными национальными регуляторными органами/национальными

контрольными лабораториями.

4. Определения

Представленные ниже определения относятся к терминам, используемым в настоящем

документе. Эти термины могут иметь иное значение в других контекстах.

Занесенный агент: контаминирующие микроорганизмы, содержащиеся в

клеточной культуре или исходных материалах, к которым относятся бактерии, грибы,

микоплазмы/спироплазмы, микобактерии, риккетсии, простейшие, паразиты, возбудители

трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE) и вирусы, которые были ненамеренно

занесены в процесс производства биологического препарата.

Источником данных контаминантов могут быть элементы, унаследованные от клеточной линии,

исходные материалы, используемые в культуральной среде для размножения клеток (в банках

клеток, в производственном процессе или на предшествующих им этапах), окружающая среда,

персонал, оборудование и т.д.

Биологический лекарственный препарат: биологический лекарственный

препарат – это синоним термина биопрепарат, описанного в Серии технических отчетов

ВОЗ. Применение понятия «биопрепарат» к лекарственной субстанции, используемой в

терапевтических, профилактических и диагностических целях, основывается на

различных критериях, связанных с ее источником, возможностью описания ее

характеристик при помощи одних только физико-химических методов, необходимостью

проведения биологических испытаний или произвольными системами классификации,

применяемыми регуляторными органами. В документах ВОЗ, и в настоящем документе в

том числе, перечень субстанций, которые считаются биопрепаратами, основывается на их

более раннем определении в качестве «субстанций, чьи характеристики не могут быть

полностью описаны при помощи одних только физико-химических методов, и для

которых необходимо выполнение каких-либо биологических испытаний» 16. Однако

повышение возможностей и применимости физико-химических аналитических методов,

совершенствование контроля над биологическими и биотехнологическими методами

производства, а также более широкое применение химического синтеза к макромолекулам

не позволяют свести определение биопрепарата к одному отдельному критерию,

связанному с методами анализа, источником субстанции или методом производства. Тем

не менее, многие биопрепараты производят с использованием систем культур in vitro.

Разработчикам таких лекарственных средств, которые не подпадают под определение

биологических лекарственных препаратов, представленное в данном документе, следует

проконсультироваться с соответствующими национальными регуляторными органами по вопросу

классификации препарата и процессу подачи и рассмотрения регистрационной заявки.

Биотерапевтический препарат: в настоящем документе под данным термином

понимается биологическое лекарственное средство, предназначенное для лечения

заболеваний человека.

Банк клеток: совокупность подходящих контейнеров с однородным по составу

содержимым, хранимых при строго определенных условиях. В каждом контейнере

содержится аликвота одного пула клеток.

Содержимое индивидуальных контейнеров (например, ампулы, флаконы) должно быть

репрезентативными по отношению к пулу клеток, из которого их отбирают, и должно

замораживаться в один и тот же день и при использовании одной и той же процедуры,

оборудования и реактивов.

Культура клеток: процесс, посредством которого клетки выращиваются in vitro

при определенных и контролируемых условиях, при этом клетки больше не организуются

в ткани.

Клеточная линия: тип клеточной популяции с установленными

характеристиками, которую получают посредством последовательного

субкультивирования первичной клеточной популяции, на основе которой можно

создавать банк клеток.

Для создания клеточной линии могут использоваться этапы клонирования и субклонирования.

Термин «клеточная линия» предполагает, что культуры клеток этой линии состоят из линий

дифференцировки некоторых из тех клеток, которые изначально присутствовали в первичной

культуре.

Посевной фонд клеток: определенное количество хорошо охaрактеризованных

клеток, которые замораживают и хранят при определенных условиях, например, в паровой

или жидкой фазе жидкого азота, в аликвотах однородного состава, полученных из одной и

той же ткани или клетки, одна или более из которых будут использоваться для создания

главного банка клеток. Посевной фонд клеток также иногда называют заготовкой для

главного банка клеток (pre-МСВ) или посевным материалом. Он может создаваться в

соответствии с правилами GMP или в соответствии с научно-исследовательскими

условиями, устанавливаемыми производителем.

Клеточный субстрат: клетки, используемые для производства биопрепарата.

Клетки могут быть представлены в виде первичных клеток или клеточных линий, и могут

выращиваться в монослое или суспензионной культуре. Примерами клеточных субстратов могут

служить первичные клетки почек обезьян, клетки MRC-5, CHO и Vero.

Клетки, используемые для получения основных компонентов готового препарата (например, клетки

Vero, используемые для получения вируса методами реверсивной генетики для его последующего

использования в посевном материале для производства вакцин) считаются

«предпроизводственными» клеточными субстратами. Клетки, используемые для производства

нерасфасованного готового препарата (например, пакующие клеточные линии для производства

векторов для генной терапии, клетки Vero для производства вакцин или клетки СНО для экспрессии

рекомбинантного белка) считаются «производственными» клеточными субстратами.

Непрерывная (постоянная) клеточная линия (CCL): клеточная линия,

фактически обладающая способностью к неограниченному удвоению популяции. Её часто

называют «бессмертной» клеточной линией, и в прошлом иногда называли стабильной

клеточной линией.

Линия диплоидных клеток (DCL): клеточная линия с ограниченным сроком

жизни in vitro, в которой хромосомы объединены в пары (эуплоидная клеточная линия) и

имеют структуру, идентичную хромосомам того вида, от которого они было получены.

Данное определение описывает стандартные хромосомные препараты, однако отдельные линии

диплоидных клеток человека могут иметь генетические вариации, проявляющиеся в отличающемся

от стандарта характере исчерченности при окраске красителем Гимза. Также могут иметь место

различия в экспрессии генов.

Настоящее определение основано на накопленном опыте и текущем понимании поведения

нестволовых клеток человека in vitro.

Инфекционность ДНК: способность клеточной ДНК приводить к развитию

вирусной инфекции после введения этой ДНК в соответствующие клетки. Вирусный

геном может быть интегрированным или внехромосомным.

Эндогенный вирус: вирус, чей геном присутствует в клеточном субстрате в

интегрированном виде. Эндогенные вирусы присутствуют в геноме животного, от

которого получают клетки. Они могут кодировать или не кодировать интактный или

инфекционный вирус.

Клетки, получаемые в конце производственного цикла (EOPC): клетки,

которые собирают в конце или после завершения производственного цикла (ЕОР).

В некоторых случаях клетки, используемые в производстве, размножают в пилотных масштабах или

в условиях коммерческого производства.

Расширенный банк клеток (ECB): клетки МСВ или WCB, культивируемые до

момента достижения предполагаемого клеточного возраста in vitro, необходимого для

производства препарата, или в течение более длительного срока.

Функциональная целостность: культура сохраняет ожидаемые функциональные

характеристики, связанные с предполагаемым применением препарата, при определенных

условиях (например, экспрессия секретируемого продукта на постоянном уровне,

продукция ожидаемого урожая вируса).

Иммортализированный: имеющий фактически неограниченную способность к

удвоению популяции.

Индикаторные клетки: клетки, получаемые от разных видов и используемые в

испытании in vitro на занесенные агенты. Индикаторные клетки амплифицируют

занесенные вирусы и тем самым облегчают их обнаружение. Как правило, к ним

относятся линия диплоидных клеток человека (например, MRC-5), линия клеток почек

обезьян (например, клетки Vero) и линия клеток, взятых из той же самой ткани и того же

самого вида, что и банк клеток. Целью этих клеточных линий является «индикация»

вирусной инфекции в банке клеток либо за счет наблюдения цитопатического эффекта

(СРЕ) во время или после соответствующего периода наблюдения или за счет

гемадсорбции и/или гемагглютинации в конце периода наблюдения. Поэтому их

называют «индикаторными» клетками. Индикаторные клетки могут применяться для

проверки банка клеток либо посредством совместного культивирования, либо

посредством пересева клеточных лизатов или истощенных супернатантов культуры (spent

culture supernatants) из банка клеток на индикаторные клетки.

Клеточный возраст in vitro: период времени после оттаивания флакона

(флаконов) МСВ и до получения резервуара с клетками, готовыми для использования в

производстве, который измеряется истекшим периодом времени, уровнем удвоения

популяции клеток или уровнем пассажей клеток, субкультивированных с использованием

определенной процедуры разведения культуры.

Латентный вирус: вирус считается латентным, если вирусный геном присутствует

в клетке без признаков активной репликации, однако может быть реактивирован.

Главный банк клеток: определенное количество хорошо охарактеризованных

клеток животного или другого источника происхождения, полученных из посевного

фонда клеток на определенном уровне удвоения популяции или уровне пассажей,

распределенных во множество контейнеров, криосохраненных и хранимых в

замороженном состоянии при определенных условиях, например, в жидкой или паровой

фазе жидкого азота, и представленных аликвотами однородного содержимого. Главный

банк получают из одного, равномерно перемешанного пула клеток. В некоторых случаях,

например, при работе с генно-инженерными клетками, главный банк клеток можно

получать из отдельного клона клеток, созданного при определенных условиях. Однако

чаще всего главный банк клеток получают не из клона. Оптимальным считается

использование главного банка клеток для создания рабочих банков клеток.

Онкогенность: способность бесклеточного агента, например, химического

вещества, вируса, нуклеотидной последовательности вируса, вирусного гена (генов) или

внутриклеточного элемента (элементов) вызывать образование опухолей в клетках

животных.

Понятие онкогенности отличается от понятия туморогенности (см. «Туморогенность»). Опухоли,

возникающие при онкогенности, появляются из клеток организма-хозяина, тогда как при

туморогенности опухоли образуются из инокулированных клеток.

Родительские клетки: клетки, которые подвергаются обработке с целью

получения клеточного субстрата. В случае с гибридомами под родительскими клетками

обычно понимаются клетки, которые будут подвергаться слиянию.

Манипуляции могут быть совсем простыми, как, например, размножение первичной клеточной

культуры для получения клеток раннего пассажа, или более сложными, например, получение

гибридомы или трансфицированного клона. Оба процесса используются для создания посевного

фонда клеток. Понятие родительские клетки может относиться к клеткам на любом этапе,

предшествующем созданию посевного фонда. Примерами родительских клеток являются клетки

WI-38 и MRC-5 на очень раннем пассаже, клетки Vero на 121 пассаже и клетки СНО перед

введением ДНК-конструкции для получения рекомбинантной клетки. В определенных случаях

(например, в случае с миеломными клетками) может существовать линия дифференцировки

идентифицированных стабильных родительских клонов; таким образом, термин «родительские

клетки», как правило, означает клетки, используемые непосредственно перед созданием посевного

фонда клеток.

Пассаж: процесс переноса клеток (сопровождаемый или не сопровождаемый их

разведением) из одного сосуда для культивирования клеток в другой сосуд с целью их

размножения, который повторяют до тех пор, пока не будет получено количество клеток,

достаточное для производственных целей.

Данный термин синонимичен понятию «субкультура». Культуры клеток одной клеточной линии с

одинаковым числом пассажей, полученные в различных лабораториях, не обязательно являются

идентичными из-за различий питательных сред, используемых для культивирования клеток,

индекса разведения и других переменных параметров, которые могут повлиять на клетки. Этот

аспект более важен для линий стволовых клеток и непрерывных клеточных линий, чем для линий

диплоидных клеток. Предпочтительным методом оценки возраста клеточной линии является

подсчет числа удвоения популяции, который следует, при возможности, использовать вместо

метода подсчета числа пассажей. Однако иногда можно оценивать длительность культивирования

непрерывных клеточных линий по числу пассажей при определенной плотности посева на каждом

пассаже или по количеству дней.

Удвоение популяции: двукратное увеличение количества клеток.

Уровень удвоения популяции: общее число удвоений популяции клеточной

линии или штамма с момента начала ее культивирования in vitro. Формула расчета

удвоения популяции в течение одного пассажа:

число удвоения популяции = log10 (N/No) х 3,33

где N = количество клеток в сосуде для размножения клеток в конце периода размножения

клеток и No = количество клеток, высеянных в сосуд для размножения клеток 17. Для

проведения подобного подсчета лучше всего использовать число жизнеспособных клеток

или закрепленных клеток (attached cells).

Первичная культура: культура, в основе которой лежат клетки, ткани или органы,

полученные непосредственно из одного или нескольких организмов. Культура клеток

считается первичной до тех пор, пока ее не пересеивают в первый раз. Затем она

становится клеточной линией, если клетки будут продолжать пересеивать хотя бы

несколько раз.

Культура клеток для производства: серия клеточных культур, используемых в

биологическом производстве, которые были получены из одного или нескольких

контейнеров WCB или, в случае с первичными культурами клеток, из тканей одного или

нескольких животных.

Остаточная клеточная ДНК (rcDNA): ДНК клеточного субстрата,

присутствующая в готовом препарате.

Свободный от специфических патогенов (СПФ): животные, свободные от

специфических патогенных возбудителей, выращиваемые в условиях, позволяющих

сохранить это состояние. Для выращивания животных СПФ обычно используются

безопасные с биологической точки зрения объекты. Условия выращивания подобных

животных предусматривают постоянную проверку состояния их здоровья. Статус СПФ

дает гарантии, что выращиваемые животные не инфицированы специфическими

патогенами. Животные СПФ не являются ни «свободными» от заболеваний, ни

устойчивыми к заболеваниям; они могут быть носителями других патогенов за

исключением тех, от которых они свободны.

Линия стволовых клеток: постоянная клеточная линия, получаемая из стволовых

клеток, a не из нормальной или больной дифференцированной ткани.

Трансмиссивная губчатая энцефалопатия: трансмиссивные губчатые

энцефалопатии (TSE) представляют собой группу смертельных нейродегенеративных

заболеваний, к которым относятся классическая и вариантная болезнь Крейтцфельда-

Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (GSS), фатальная семейная

бессонница (FFI) и куру, поражающие человека, губчатая энцефалопатия крупного

рогатого скота (BSE), поражающая крупный рогатый скот, хронический вастинг-синдром

(CWD), поражающая мулов, оленей и лосей, и скрейпи, поражающая овец и коз.

Туморогенность: способность клеточной популяции, инокулированной в

животную модель, образовывать опухоль посредством пролиферации в месте введения

и/или в отдаленном участке за счет метастазирования.

Понятие туморогенность отличается от понятия онкогенности (см. Онкогенность).

Стандартный банк клеток ВОЗ (RCB): криосохраненный фонд клеток,

полученный из одного гомогенного пула клеток, образованного при определенных

условиях и прошедшего испытания по описанию характеристик. Целью создания

подобного банка является его использование в качестве хорошо охарактеризованного

посевного материала для создания главного банка клеток, которые будут подробно

охарактеризованы производителями и которые с большой долей вероятности будут

отвечать требованиям настоящего руководства.

Рабочий банк клеток: определенное количество хорошо охарактеризованных

клеток животного или иного источника происхождения, полученных из главного банка

клеток или при определенном уровне удвоения популяции или уровне пассажей,

распределенных во множество контейнеров, криосохраненных и хранимых в

замороженном состоянии при определенных условиях, например, в жидкой или паровой

фазе жидкого азота, и представленных аликвотами однородного содержимого. Рабочий

банк клеток получают из одного, равномерно перемешанного пула клеток. Один или

несколько контейнеров рабочего банка клеток используют для каждой культуры клеток

для производства.

5. Общие положения

5.1 Виды субстратов клеток животных

5.1.1 Первичные культуры клеток (PCC)

Первичные культуры клеток сыграли значительную роль в развитии биологии, и, в

особенности, вирусологии. Первичные культуры клеток, полученные из разных

источников, на протяжении десятилетий использовались во всем мире для производства

живых и инактивированных вирусных вакцин для применения у человека. Например,

первичные культуры клеток, полученные из почек обезьян, используются для

производства инактивированной и пероральной полиомиелитной вакцин с 1950-ых годов.

Большие успехи в контроле над вирусными заболеваниями, такими как

полиомиелит, корь, паротит и краснуха, были достигнуты благодаря широкому

использованию вакцин, полученных в первичных культурах клеток, в том числе

первичных культурах клеток куриных эмбрионов и почек обезьян, собак, кроликов и

хомяков, а также клеток других тканей.

Первичные культуры клеток представляют собой жизнеспособные клетки из

дезагрегированных тканей, которые инициируют как культуры клеток in vitro, обычно как

адгезивные культуры клеток. В них могут присутствовать клетки разных типов, и

первичная культура может представлять собой сложную смесь клеток, характеристики

которых могут зависеть от процесса и условий их сбора, дезагрегации и внесения в

культуру in vitro. Не все клетки в составе первичной культуры обладают способностью к

репликации. Особенное внимание следует уделять утверждению хорошо

воспроизводимых процедур дезагрегации ткани, обработки клеток и инициации культуры,

а также воспроизводимых условий культивирования и питательной среды.

Первичные культуры клеток, полученные из клеток диких животных, обычно

имеют высокий риск вирусной контаминации. Например, культуры, полученные из клеток

почек обезьян, могут быть контаминированы одним или несколькими занесенными

агентами, в том числе вирусами обезьян.

Если первичные культуры клеток необходимы для производства определенного

биопрепарата, частоту выявления контаминированных культур клеток можно

существенно сократить посредством тщательного скрининга животных, являющихся

источником клеток, на отсутствие подобных вирусов. Вирусы можно обнаружить при

помощи методов молекулярной диагностики, например, полимеразной цепной реакции

(ПЦР), и проверки животных на наличие циркулирующих антител к этим вирусам.

Настоятельно рекомендуется использовать животных, выращенных в тщательно

контролируемой колонии, особенно это касается животных, свободных от специфических

патогенов. Тем не менее, по мере того, как становятся доступными подходящие

альтернативные клеточные субстраты, первичные культуры клеток, вероятно, все реже

будут использоваться в будущем. ВОЗ поощряет замену опытов на животных как с точки

зрения этики 18, так и в интересах постоянного улучшения безопасности и качества

препаратов.

5.1.1.1 Преимущества первичных культур клеток

 Первичные культуры клеток относительно просты в получении при использовании

простой среды и бычьей сыворотки.

 Они, как правило, обладают большой чувствительностью к разнообразным

вирусам, некоторые из которых являются цитопатическими.

5.1.1.2 Недостатки первичных культур клеток

 Для них более велика вероятность контаминации инфекционными агентами, чем

для линий диплоидных клеток или непрерывных клеточных линий.

 Качество культур, полученных от разных животных, и их чувствительность к

вирусам  варьируются.

 Хотя культуры клеток, полученных от приматов, широко использовались в

прошлом, в последнее время становится все сложнее получать подобные клетки и

обосновывать использование животных для этих целей.

 Для первичных культур клеток нельзя провести такие же подробные анализы, как

для линий диплоидных клеток или непрерывных клеточных линий.

5.1.2 Линии диплоидных клеток (DCL)

Целесообразность использования линий диплоидных клеток человека для производства

вирусных вакцин была продемонстрирована в 1960-ых годах. Опыт, полученный для

полиомиелитной пероральной вакцины и других вирусных вакцин, которые успешно

применялись для вакцинации миллиардов детей во многих странах мира, ясно показывает,

что подобные субстраты могут использоваться для производства безопасных и

эффективных вакцин 3.

Ниже описаны основные свойства линий диплоидных клеток, полученных от

человека (например, WI-38, MRC-5) и обезьян (т.е. FRhL-2):

■ эти клетки получают путем пересева первичных культур, которые создавались как

клеточные линии, сохраняющие стабильные характеристики после многократного

удвоения популяции;

■ они имеют ограниченную способность к последовательному размножению, которое

заканчивается старением – состоянием, при котором культура прекращает

реплицироваться; клетки остаются жизнеспособными и сохраняют метаболическую

активность, но могут претерпевать морфологические и биохимические изменения,

некоторые из которых начинают проявляться до того, как останавливается репликация;

■ они не являются туморогенными;

■ они имеют цитогенетические характеристики, характерные для диплоидных клеток, с

низкой вероятностью нарушения числа или структуры хромосом, пока не наступает

старение.

С 1960-ых гг. был накоплен значительный объем данных о цитогенетике WI-38 и

MRC-5, и были опубликованы диапазоны ожидаемой вероятности хромосомных

нарушений 19, 20. Аналогичные данные были получены и для FRhL-2 21. Благодаря

современным цитогенетическим методам исследования (например, высокоразрешающему

бэндингу хромосом, сравнительной геномной гибридизации) 22, 23 было

продемонстрировано наличие незначительных хромосомных нарушений, которые раньше

было невозможно обнаружить. Последние исследования показали, что субпопуляции

линий диплоидных клеток, полученных от человека, и имеющих подобные нарушения,

могут появляться и исчезать со временем, что они не являются туморогенными, и что их

старение происходит так же, как и старение доминантной популяции. Поэтому

стабильный кариотип может и не быть настолько важной характеристикой, как было

принять считать раньше.

5.1.2.1 Преимущества линий диплоидных клеток

■ Линии диплоидных клеток можно подробно охарактеризовать и стандартизировать.

■ Производство может основываться на системе криосохраненных банков клеток, что

позволяет обеспечить постоянство свойств и воспроизводимость клеточных популяций.

■ Система банков клеток, как правило, состоит из банков клеток на определенном уровне

удвоения популяции или уровне пассажа и обычно включает главный банк клеток и

рабочий банк клеток.

■ В отличие от непрерывных клеточных линий и линий стволовых клеток,

рассматриваемых ниже, линии диплоидных клеток не являются туморогенными и поэтому

не связаны с потенциальными рисками для безопасности, которые характерны для

непрерывных клеточных линий и линий стволовых клеток.

5.1.2.2 Недостатки линий диплоидных клеток

■ Линии диплоидных клеток не просто использовать в крупномасштабном производстве,

несмотря на то, что их культивируют в биореакторе на микроносителе или при помощи

многослойного метода.

■ В целом они более требовательны в отношении питательных веществ, чем другие

клеточные субстраты.

■ Их бывает сложно адаптировать к культивированию в бессывороточной среде.

■ Линии диплоидных клеток сложнее поддаются трансфекции и инженерии, чем

непрерывные клеточные линии, и перед началом инженерных манипуляций их

необходимо иммортализировать (например, они не позволяют создавать векторы для

вакцин, для которых требуется комплементация, поскольку их нельзя сконструировать

таким образом, чтобы они сразу экспрессировали комплементарные белки).

5.1.3 Непрерывные клеточные линии (CCL)

Некоторые непрерывные клеточные линии используются для производства безопасных и

эффективных биопрепаратов и вакцин с 1989-ых гг.

Непрерывные клеточные линии имеют фактически бесконечную

продолжительность жизни in vitro, и их получают при помощи следующих методов:

■ последовательный пересев первичной культуры клеток, полученных из опухоли

животного или человека (например, клетки HeLa);

■ трансформация нормальной клетки с ограниченной продолжительностью жизни с

помощью онкогенного вируса или вирусной последовательности (например, В-

лимфоциты, трансформированные при помощи вируса Эпштейна-Барра или

трансфицированные вирусными последовательностями, например, такие как клетки

PER.C6);

■ последовательный пересев первичной культуры клеток, полученных из нормальной

ткани, в результате которого образуется доминантная клеточная популяция с фактически

бесконечной продолжительностью жизни,  процесс, который часто называют спонтанной

трансформацией (например, Vero, BHK-21, CHO, MDCK, Hi5);

■ слияние миеломной клетки и антителообразующего В-лимфоцита для получения

гибридомной клеточной линии;

■ использование генов с эктопической экспрессией, вовлеченных в прохождение

клеточного цикла, например, гена теломеразы hTERT, для достижения бесконечной

репликации нормальных клеток человека.

Непрерывные клеточные линии могут иметь стабильное модальное число

хромосом (например, MDCK, Vero), и хотя кариотип отдельных клеток в культуре может

в определенный момент отличаться, диапазон числа хромосом на одну клетку будет, как

правило, соответствовать определенным пределам. Однако другие непрерывные

клеточные линии, например, высокотуморогенные клетки, в том числе HeLa, могут иметь

разное модальное число хромосом и более широкий дрейф (drift) по диапазону числа

хромосом на одну клетку.

На раннем этапе создания клеточной линии могут наблюдаться сильно

различающиеся кариотипы и изменения кариотипа. Однако при последовательном

пересеве, предположительно по мере образования доминантной клеточной популяции,

может появляться специфический хромосомный компонент.

5.1.3.1 Преимущества непрерывных клеточных линий

■ Непрерывные клеточные линии можно подробно охарактеризовать и стандартизировать.

■ Производство непрерывных клеточных линий может основываться на системе банков

клеток, что позволяет обеспечить постоянство свойств и воспроизводимость

восстанавливаемых клеточных популяций в течение бесконечного длительного периода

времени.

■ Непрерывные клеточные линии обычно проще культивировать, чем линии диплоидных

клеток при использовании стандартных питательных сред.

■ Большинство непрерывных клеточных линий можно адаптировать к культивированию в

бессывороточной среде.

■ Непрерывные клеточные линии обычно можно культивировать на микроносителях при

крупномасштабном производстве в биореакторах.

■ Некоторые линии можно адаптировать к культивированию в суспензионных культурах

при крупномасштабном производстве в биореакторах.

5.1.3.2 Недостатки непрерывных клеточных линий

■ Непрерывные клеточные линии могут экспрессировать эндогенные вирусы, и некоторые

из них являются туморогенными в животных моделях иммуносупрессии.

■ Необходимо учитывать теоретические риски, идентифицированные исследовательской

группой в 1986 г. (например, нуклеиновые кислоты, трансформирующие белки и вирусы).

5.1.4 Линии стволовых клеток

Стволовые клетки отличаются от других типов клеток тем, что поддерживают

доминирующую популяцию стволовых клеток, и в то же время сохраняют способность

производить клетки-предшественники дифференцированных клеток почти всех тканей

человеческого тела (т.е. они плюрипотентны). Плюрипотентные линии стволовых клеток

обладают явной способностью генерировать клетки, характерные для тканей всех трех

зародышевых листков, и возможно способны образовывать in vitro модели любой ткани

человеческого тела. На момент написания данных Рекомендаций (2010 г.) выделено два

типа линий плюрипотентных стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки

человека и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Они сочтены

потенциально полезными для производства биологических препаратов. Клетки сохраняют

свойство плюрипотентности на протяжении многочисленных циклов деления. Линии

стволовых клеток могут быть получены из тканей эмбриона на ранней стадии развития,

тканей плода или взрослой ткани. Обычно для того, чтобы при выращивании линий

стволовых клеток in vitro клетки оставались недифференцированными, требуется

специализированная среда и окружающие условия, такие как матрица для прикрепления

клеток. Наряду с тем, что большинство научных исследований стволовых клеток

направлены на трансплантацию стволовых клеток в терапевтических целях, также

предпринимались попытки исследовать ряд различных линий стволовых клеток в качестве

субстрата для производства биологических препаратов.

Были определены ключевые вопросы культивирования и контроля линий таких

клеток 24. Они охватывают не только основные моменты, общие для поддержания всех

клеточных линий, но и необходимость этического регулирования вопроса о согласии

донора и пристального внимания к периодическому подтверждению фенотипа, отсутствия

недиплоидных клеток и сохранения плюрипотентности.

Недавно было доказано, что кондиционированная среда от линии стволовых клеток

может иметь восстановительные свойства. Такие препараты, произведенные из

эмбриональных стволовых клеток человека, продемонстрировали способность оказывать

регенерирующее действие, включая восстановление в моделях инфаркта

миокарда у животных 25. Это дает возможность использовать стволовые клетки как

субстрат для производства ряда различных биологически активных молекул. Линии

стволовых клеток могут, в некотором смысле, рассматриваться как диплоидные, но

считается, что они обладают неограниченным сроком жизни, в отличие от культур

диплоидных фибробластов человека. Известно, что в культурах эмбриональных

стволовых клеток человека при клонировании возникают клетки с хромосомными

отклонениями. Хотя диплоидность и неизмененная природа считаются необходимыми

предварительными условиями для применения в качестве клеточной терапии,

трансформированные линии стволовых клеток могли бы рассматриваться как одна из

форм непрерывных клеточных линий для производства биологических препаратов.

Поскольку линии стволовых клеток не подпадают ни под одну из уже обсуждавшихся

категорий субстратов, в настоящем документе они рассматриваются как отдельная

категория.

5.1.4.1 Преимущества линий стволовых клеток

■ Характеристики линий стволовых клеток поддаются точному

определению, а условия культивирования – стандартизации.

■ Производство может строиться на основе системы банков клеток, которая

обеспечивает постоянство свойств и воспроизводимость восстанавливаемых

популяций клеток на протяжении неограниченного времени.

■ Некоторые линии стволовых клеток могут быть приспособлены для

выращивания в виде суспензионной культуры для крупномасштабного

производства в биореакторах.

■ Линии стволовых клеток могут вырабатывать уникальные белки, которые

могут быть потенциально полезны в качестве биотерапии.

■ Линии стволовых клеток обладают потенциалом создавать клетки и

подобные тканям структуры, которые могут экспрессировать вещества, на

настоящий момент не поддающиеся культивированию in vitro.

5.1.4.2 Недостатки линий стволовых клеток

■ Обычно используемые при работе с линиями стволовых клеток

технологии пересева довольно трудоемкие.

■ Линии стволовых клеток могут производить факторы роста, оказывающие

неизученное воздействие на зрелые клетки/ткани.

■ Линиям стволовых клеток обычно требуется сложная среда, сопряженная

с риском заражения трансмиссивной губчатой энцефалопатией.

■ То, что дифференцированные клетки очень быстро развиваются, также

значит, что их сложно контролировать in vitro.

■ На данный момент опыт использования линий стволовых клеток в

качестве клеточного субстрата для производства биологических препаратов очень

невелик.

5.2 Потенциальные риски, связанные с произведенными в

культурах клеток животных биологическими препаратами, и

сокращение этих рисков

Основные возможные риски, связанные с использованием биопрепаратов,

произведенных на основе клеток животных, напрямую связаны с контаминантами клеток.

Эти риски можно разделить на три категории, а именно:

■ вирусы и другие инфекционные агенты;

■ нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) клеток;

■ стимулирующие рост белки.

Также теоретически возможно присутствие произведенных клетками

ингибирующих или токсических веществ. Далее следует краткое изложение оценки риска

каждой из категорий. Более подробно эта тема рассматривается в других публикациях,

посвященных рискам, связанным с контаминирующими ДНК и факторами роста 26–35.

В 2010 году национальные регуляторные органы и ВОЗ получили новую

информацию о присутствии последовательностей ДНК цирковируса свиней в живых

ослабленных вакцинах против ротавирусной инфекции. После обнаружения этих

последовательностей с помощью продвинутых аналитических методов встал ряд сложных

вопросов (например, об оценке потенциального риска, специфичном тестировании вакцин

и широком использовании этих продвинутых методов для определения характеристик

клеточных субстратов вакцин). Возможности новой технологии, которая использовалась в

данном случае (т.е. массового параллельного (глубокого) секвенирования (МПС)),

позволяют выявить присутствие занесенных агентов, которые могут быть упущены

другими существующими методами. Поскольку введение данных методов в повседневное

использование имеет как преимущества, так и сложности и риски, национальным

регуляторным органам нужно быть готовыми к подобным ситуациям. В таких условиях

следует уделить внимание оценке рисков и возможному введению программ по их

снижению.

5.2.1 Вирусы и другие возбудители инфекционных заболеваний

Возможность заражения вирусами и другими возбудителями инфекционных

заболеваний, которые могут обнаружиться в клеточных субстратах, уже долгое время

является поводом для беспокойства. В 1986 году Исследовательская группа ВОЗ

рассматривала этот вопрос и обратила внимание на то, что, как описано ниже, клетки

различаются по своей способности переносить вирусные возбудители болезней, которые

являются патогенными для человека.

С того момента, как в 1950-е годы впервые был разработан способ создания вакцин

от полиомиелита из первичной культуры клеток почек африканских зеленых мартышек,

были произведены миллиарды доз. Но поскольку в клетках почек макак-резусов были

найдены такие вирусы, как SV40, потребовались контрольные мероприятия, чтобы

исключить или по возможности снизить риск заражения, связанный с получением вакцин

из содержащих эти вирусы клеток. Дополнительные контрольные меры могут

понадобиться по мере того, как будут обнаруживаться новые возбудители инфекций, и

разрабатываться технологии для их обнаружения.

Лимфоциты и макрофаги человекоподобных и низших приматов могут быть

носителями скрытых вирусов, таких как возбудители герпеса и ретровирусы.

Непрерывные линии негематогенных клеток человекоподобных и низших приматов могут

содержать либо вирусы, либо их гены, встроенные в ДНК. В любом случае вирус может

проявиться в условиях культивирования in vitro.

Клетки и ткани птиц могут скрывать в себе экзогенные и эндогенные ретровирусы,

но нет доказательств передачи болезней людям через препараты, изготовленные из

данных субстратов. Например, из яиц, содержащих вирус лейкоза птиц, за много лет было

произведено большое количество вакцин против желтой лихорадки, но на протяжении

долгой истории использования этих препаратов для вакцинации людей не было отмечено

признаков заражения. Тем не менее, следует максимально сократить возможность

заражения человека ретровирусами птиц с помощью контрольных мер при производстве.

Грызуны могут быть переносчиками экзогенных и эндогенных ретровирусов,

вируса лимфоцитарного хориоменингита, хантавирусов, и ряда других потенциально

зоонозных вирусов. Хотя сообщалось о случаях заражения урожаев клеток,

предназначенных для производства биотерапевтических препаратов и полученных из

культур овариальных клеток китайского хомячка, вирусами грызунов 35–37, нет

свидетельств, что ими были заражены биологические препараты, выпущенные в

обращение. Если и происходило заражение, эти вирусы обнаруживались до выпуска на

рынок в ходе контроля качества продукции в соответствии с Надлежащей

производственной практикой. Также важно отметить, что не было сообщений о передаче

возбудителя инфекции пациентам, получавшим рекомбинантные белковые препараты,

произведенные на основе клеток животных.

Последнее время для производства вакцин используются клетки насекомых, и

различные линии их клеток могут использоваться для создания биологических препаратов

в будущем. В линиях клеток насекомых постоянно встречаются характерные для них

вирусы, большая часть которых неизвестна и/или еще не изучена. Многие линии клеток

насекомых содержат эндогенные транспозоны и подобные ретровирусам частицы, и

некоторые из них показывают положительные анализы на усиленную

продуктом обратную транскриптазу (PERT).

Диплоидные клетки человека используются для производства вакцин уже многие

годы. Хотя изначально высказывались опасения, что такие клетки могут содержать

скрытые возбудители человеческих болезней, о случаях обнаружения подобных

эндогенных вирусов не сообщалось, и было доказано, что произведенные из этого класса

клеточных субстратов вакцины не содержат вирусных контаминантов.

В свете различий в способности вышеупомянутых типов клеток переносить

вирусы, вызывающие заболевания человека, крайне важно исследовать клетки,

используемые в производстве биологических препаратов, на наличие возбудителей

инфекций настолько тщательно, насколько это возможно.

При использовании линий диплоидных клеток, линий стволовых клеток или

непрерывных клеточных линий в производстве следует применять систему банков клеток.

Характеристики банков клеток следует описывать так, как указано в настоящем

документе. В дополнение к стандартным испытаниям, которые проводятся на протяжении

многих лет, важную часть оценки банка клеток составляют меры, направленные на

идентификацию вирусов путем тестирования на последовательности вирусных генов или

других маркеров, особенно не обнаруживаемых иными способами.

Когда на присутствие вирусов проверяются клетки, полученные от грызунов или

птиц, основной акцент в оценке рисков следует делать на результатах исследований, в

ходе которых делаются попытки заражения вирусом целевых клеток или клеток

животных. Риск для получающих конечный препарат людей не следует оценивать,

опираясь только лишь на ультраструктурные или биохимические/биофизические признаки

присутствия в клетках вирусов или подобных им возбудителей заболеваний.

Отсутствие поддающихся обнаружению инфекционных агентов в конечном

препарате должно подтверждаться в ходе всего производственного процесса, включая

отбор и тестирование клеток и исходных материалов, любые используемые процедуры

очистки и анализы промежуточного или готового препарата. При необходимости,

валидация процедур очистки должна подтверждать надлежащее сокращение количества

соответствующих модельных вирусов при использовании значительного коэффициента

безопасности 14. Это обычно необходимо для препаратов на основе рекомбинантных

белков.

Могут существовать еще не открытые микробные агенты, для обнаружения

которых на данный момент не достаточно сведений или нет технической возможности. По

мере того, как будут открывать такие агенты, важно решить, нужно ли перепроверять

банки клеток на их присутствие. Как правило, повторное тестирование уже выпущенных

материалов не предусмотрено Надлежащей производственной практикой, поэтому для

проведения такого тестирования понадобилось бы обоснование. Положительные

результаты такой экспертизы следует обсудить с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Когда бы ни были получены новые

данные, которые могут повлиять на качество, безопасность или эффективность

биологического препарата, в обязанности производителя входит предоставление

национальному регуляторному органу всей относящейся к делу информации, которая

имеется у него на данный момент. Чтобы облегчить любые действия регуляторных

органов, которые могут понадобиться, следует представить также подтверждение и анализ

полученных данных, проведенную самим производителем оценку риска и план

исследования и действий. Также, по всей вероятности, будут разрабатываться и новые

методы тестирования. По мере того, как они будут становиться доступными и проходить

валидацию, производителям и национальным регуляторным органам/национальным

контрольным лабораториям следует рассматривать их на предмет применимости к

определению характеристик и контролю качества новых субстратов клеток животных.

5.2.2 ДНК клеток

Остаточная клеточная ДНК в биологических препаратах изучалась многими

исследовательскими группами с 1980-х годов, поэтому рекомендации претерпели ряд

изменений. В последних Рекомендациях ВОЗ (Серия технических докладов ВОЗ №878)

1 установлена верхняя граница содержания остаточной клеточной ДНК в 10 нг на

парентеральную дозу. Хотя в прошлом и была доказана обоснованность данного значения,

оно, как указывается ниже, не принимает во внимание такие важные факторы, как размер

фрагментов ДНК и какие-либо этапы процесса производства, которые потенциально

могут привести к инактивации ДНК. Поэтому при определении допустимого содержания

остаточной клеточной ДНК важно принимать во внимание не только лимит в 10 нг на

парентеральную дозу, но также и другие факторы.

Первичные культуры клеток и линии диплоидных клеток многие годы успешно

используются для производства вирусных вакцин, и остаточная клеточная ДНК,

возникающая в результате использования этих клеток, не считалась (и не считается)

представляющей серьезную угрозу. Тем не менее, ввиду использования непрерывных

клеточных линий, срок жизни которых, по-видимому, не ограничен, предположительно,

из-за нарушения работы контролирующих рост генов, и благодаря разработкам

туморогенных или получаемых из опухолей клеточных препаратов, считается, что ДНК

таких клеток теоретически может передавать некоторым клеткам получателя

биопрепарата способность к неконтролируемому росту и онкогенный потенциал. Хотя

риск, связанный с такой ДНК, и рассчитывался на основании определенных

предположений и некоторых экспериментальных данных, оценить фактический риск не

было возможности до недавнего времени, когда были получены предварительные,

данные, собранные с помощью новых экспериментальных систем, которые позволяют

количественно измерить риски 38.

Потенциальный риск ДНК обусловлен обоими типами ее биологической

активности: инфекционностью и онкогенностью. Инфекционность может объясняться

присутствием генома инфекционного вируса, встроенным в ДНК клетки субстрата 39–

41. Вирусный геном может представлять собой как ДНК-вирус, в интегрированном

состоянии или вне хромосом, так и геном ретровируса на провирусной стадии.

Инфекционность обоих типов вирусных ДНК была показана in vitro и в некоторых

случаях in vivo 39, 40. Онкогенное действие ДНК могло бы стать результатом ее

способности вызывать трансформацию нормальных клеток, и, предположительно,

придавать им туморогенные свойства. Основной механизм, при посредничестве которого

такое могло бы произойти, это введение активного доминантного онкогена (например,

myc, активированного ras), поскольку такие онкогены могли бы непосредственно

трансформировать нормальную клетку. Другие механизмы могли бы быть связаны с

трансформацией остаточной клеточной ДНК за счет инсерционного мутагенеза, и были

сочтены менее вероятными, поскольку частота интеграции ДНК обычно низкая 42.

Частота же интеграции в нужный сайт, например, для инактивации гена, подавляющего

образование опухолей, или активации протоонкогена, соответственно, еще ниже 32.

Созданная в 1986 г. Исследовательская группа ВОЗ занималась оценкой риска,

связанного с онкогенным действием остаточной клеточной ДНК, присутствующей в

биологических препаратах для применения у человека 12. Оценка риска на основе

анализа действия вирусного онкогена в животной модели показала, что воздействие in

vivo 1 нг остаточной клеточной ДНК, при условии содержания 100 копий

активированного онкогена на один геном, приводило к возникновению трансформации у

одного из 10

реципиентов 27. На основании этой оценки и других данных, доступных в

1986 г., Исследовательская группа ВОЗ заключила, что можно пренебречь риском,

ассоциируемым с присутствием остаточной клеточной ДНК в препарате, когда количество

ДНК ≤100 пг на парентеральную дозу. В 1998 г. эти требования были пересмотрены с

учетом новых данных, и допустимая норма содержания остаточной клеточной ДНК

выросла до 10 нг на дозу.

Результаты исследований на мышах, в которых использовались клонированные

клеточные онкогены, также свидетельствуют о том, что риск возникновения

злокачественной трансформации в результате воздействия ДНК клетки, скорее всего,

очень низок 34, 43. Тем не менее, по самым последним данным, клонированная ДНК

клеточных онкогенов может вызывать образование опухолей у определенных штаммов

мышей при содержании ниже 1 нг. Кроме того, отдельные онкогены тоже могут проявлять

биологическую активность 44 и инициировать процесс возникновения опухоли. В свете

этих данных и недавно полученных свидетельств того, что кодирование генов для

определенных видов микроРНК может иметь онкогенное действие in vitro 45–48,

повышая, таким образом, количество потенциальных доминантных клеточных онкогенов,

онкогенный риск ДНК нужно принимать во внимание, когда рассматривается

возможность использования туморогенных клеток для производства биологических

препаратов. Это особенно важно для живых ослабленных вирусных вакцин, ДНК которых

невозможно инактивировать при помощи химических методов, и единственным

возможным способом снижения биологической активности ДНК представляется

расщепление нуклеазой и уменьшение количества ДНК.

Помимо онкогенной активности ДНК следует учитывать также и ее

инфекционность. Поскольку вирусный геном, после попадания в организм может

распространяться и производить множество заразных частиц, риск, связанный с

инфекционностью, вероятнее всего, превышает риск, связанный с онкогенностью. Геном

вируса полиомы заразен для мышей в количестве около 50 пг 49, а в недавнем отчете

было показано, что 1 пг копии ретровируса на провирусной стадии заразен in vitro 50.

Поскольку такие малые количества ДНК могут быть биологически активны, следует

закладывать содержание остаточной клеточной ДНК в расчеты оценки безопасности,

когда используются туморогенные клеточные субстраты, особенно в производстве живых

вирусных вакцин.

Таким образом, в отношении остаточной клеточной ДНК следует принимать во

внимание следующее: (i) любое уменьшение количества контаминирующей ДНК в

процессе производства; (ii) любое уменьшение размера контаминирующей ДНК в

процессе производства; и (iii) любую химическую инактивацию биологической

активности контаминирующей ДНК в процессе производства. Препарат может быть

расценен национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией

как представляющий допустимый риск, связанный с ДНК клеточного субстрата, на

основании условий (i) и/или (ii) и/или (iii), если данные подтверждают, что было

достигнуто допустимое содержание остаточной клеточной ДНК. Например, данные

показывают, что биологическую активность ДНК могут подавить расщепление ДНК

нуклеазой или химическая инактивация ДНК антивирусным средством, бета-

пропиолактоном 38, 50, 51. Следовательно, данные процедуры могут предоставить

дополнительные гарантии сокращения риска, связанного с ДНК.

Для таких производимых в туморогенных клеточных субстратах препаратов, как

моноклональные антитела и субъединичные вакцины, необходимо подтвердить очистку

от ДНК (удалением и/или инактивацией) в результате процесса производства. Для этого

может потребоваться валидация основных этапов инактивации или удаления. Например,

следует получить данные по действию инактивирующих ДНК веществ в условиях

производства, чтобы можно было сделать однозначный вывод касательно их способности

инактивировать ДНК в конкретном препарате.

В отдельных случаях ДНК непрерывной клеточной линии может представлять

серьезный риск, поскольку содержит такие специфические элементы, как

последовательности ДНК инфекционных ретровирусов на провирусной стадии. В таком

случае меры, предпринимаемые для сокращения риска, связанного с остаточной

клеточной ДНК, такие как уменьшение размера ее фрагментов, следует согласовать с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

Созданная в 1986 г. Исследовательская группа ВОЗ постановила, что следует

считать несущественными риски, связанные с остаточной клеточной ДНК в препаратах

для перорального применения. Это заключение было основано на экспериментально

полученных данных, показывающих, что ДНК вируса полиомы не заразна при

пероральном применении 49. Основное требование для таких препаратов – удалить

потенциально контаминирующие вирусы. Недавно были опубликованы новые данные по

абсорбции ДНК из препаратов, вводимых пероральным путем 52. В ходе исследований

по получению этих данных было показано, что вероятность абсорбции ДНК при

пероральном введении значительно ниже, чем при внутримышечном. Однако специфика

производственного процесса и лекарственная форма конкретного препарата должны быть

рассмотрены национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией.

Не было опубликовано никаких данных об эффективности абсорбции ДНК при

введении через нос по сравнению с парентеральным введением. Однако имеющиеся

данные дают основание предполагать, что при введении через нос абсорбция ДНК

происходит менее эффективно, чем при внутримышечном введении 53. Пределы

содержания ДНК в конкретных препаратах должны устанавливаться после консультации с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

В целом, допустимые пределы содержания остаточной клеточной ДНК в

определенных препаратах следует согласовывать с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией, учитывая характеристики клеточного

субстрата, планируемое назначение биологического препарата, и, что самое главное,

влияние процесса производства на размер, количество и биологическую активность

фрагментов остаточной клеточной ДНК. Поскольку биотехнологические препараты

поддаются высокой степени очистки, в большинстве случаев удавалось сократить

содержание в них остаточной клеточной ДНК до <10 нг на дозу, а во многих случаях и до

<10 пг на дозу. Для определения общего содержания остаточной ДНК, также как и для

классификации остаточных фрагментов ДНК по размеру, используется количественная

ПЦР на короткие ампликоны. Следует отметить, что полученные другими методами

результаты могут отличаться по малым фрагментам или ДНК, которая была обработана

инактивирующими веществами. Какой бы метод не применялся, он должен пройти

валидацию. Некоторые препараты, особенно определенные живые вирусные вакцины,

сложно поддаются очистке без значительной потери в удельной активности, поэтому

количество остаточной клеточной ДНК в таких готовых препаратах может быть

значительно выше, чем 10 нг на дозу. Такие случаи считаются исключительными и

должны обсуждаться с национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией.

5.2.3 РНК клеток

Хотя кодирующая белок РНК до настоящего момента не считалась фактором риска

для биологических препаратов, поскольку имеет нестабильную природу и не имеет

механизмов самовоспроизведения, тот факт, что недавно были описаны более стабильные

и обладающие способностью изменять экспрессию генов малые молекулы некодирующей

РНК, микроРНК, может потребовать проведения повторной оценки риска. Неизвестно,

могут ли молекулы микроРНК встраиваться в клетки in vivo. Однако как ранее уже

указывалось, поскольку определенные гены микроРНК могут быть онкогенными, ДНК,

содержащие такие последовательности генов, может быть необходимо рассматривать

вместе с онкогенами при оценке риска, связанного с остаточной клеточной ДНК (см.

Раздел B.9 об онкогенных свойствах). Поскольку эта сфера научных исследований еще

только развивается, в настоящий момент невозможно сделать какие-либо выводы о риске

микроРНК и дать рекомендации относительно контроля ее содержания.

5.2.4 Факторы роста

Клетки, используемые в производстве биологических препаратов, могут выделять

факторы роста, но риски, которые несут в себе эти вещества, ограничены, так как их

действие по усилению роста обычно преходящее и обратимое, они не могут

самовоспроизводиться, и многие из них быстро инактивируются in vivo. В

исключительных условиях факторы роста могут способствовать онкогенезу, но даже в

этом случае опухоли, по-видимому, сохраняют зависимость от постоянного поступления

фактора роста. Таким образом, контаминация фактором роста в стандартной

концентрации, о наличии которой известно, не представляет серьезного риска при

изготовлении биологических препаратов, производимых в культурах клеток животных.

Однако некоторые линии стволовых клеток могут вырабатывать более активные факторы

роста и в большей концентрации по сравнению с непрерывной клеточной линией. Это

следует принимать во внимание при разработке дизайна исследований по определению

характеристик препарата. Процесс производства следует проектировать в соответствии с

любыми обнаруженными проблемами для безопасности.

Часть A. Общие рекомендации по производству всех типов

клеточных культур

A.1 Надлежащие производственные практики

Следует соблюдать основополагающие принципы Надлежащей производственной

практики для биологических препаратов. Требования и рекомендации разработаны

национальными регуляторными органами (например, Европейским агентством по

лекарственным средствам (EMA), Управлением по контролю за пищевыми продуктами и

лекарственными средствами (FDA)) и другими организациями (например,

Международной конференцией по гармонизации технических требований к регистрации

лекарственных средств для применения у человека (ICH)). Надлежащая производственная

практика должна применяться, начиная с этапа создания банка клеток, и на всем

протяжении работы.

При подготовке клеточного субстрата передовой практикой считается создание

главного и рабочего банков клеток с несколькими уровнями (см. раздел A.5.2), чтобы

обеспечить надежный и стабильный источник клеток, который может быть полностью

охарактеризован и протестирован на предмет безопасности перед использованием в

производстве. По определению нельзя распространять эти требования к банкам на

первичные культуры клеток. Однако некоторые производители используют объединенные

и криосохраненные первичные культуры, что позволяет провести тестирование партии

перед выпуском, как и для системы банков клеток с несколькими уровнями. Стратегию

поставки первичных клеток или тех первичных клеток, которые восстановлены после

криосохранения, следует основывать на качестве и безопасности, которые могут быть

подтверждены для конечного препарата, согласно общим используемым

производственным процессам и мерам контроля.

A.2 Принципы надлежащей практики культивирования клеток

A.2.1 Основные сведения о клетках и системах культивирования

Следует соблюдать принципы Надлежащей практики культивирования клеток во

всем – от выбора источника до создания банка и подготовки клеточных культур

(например, 54, 55 для линий стволовых клеток). Фундаментальные свойства линий,

которые нужно учитывать при разработке культур клеток для производства или

испытаний, следующие:

■ аутентичность, включая идентичность, источник происхождения и

генотипические/фенотипические характеристики;

■ отсутствие контаминации другой клеточной линией;

■ отсутствие микробиологической контаминации;

■ стабильность и функциональная целостность при длительном

пассировании in vitro.

Важный основополагающий принцип работы со всеми типами клеток – отсутствие

у донора каких-либо трансмиссивных заболеваний или болезней неопределенной

этиологии, таких как болезнь Крейтцфельда-Якоба у людей или губчатая энцефалопатия у

крупного рогатого скота. Национальный регуляторный орган/национальная контрольная

лаборатория могут позволить определенные исключения в отношении здоровья донора

(например, для клеток миеломы или других опухолей).

Характеристики клеток в культуре могут поменяться в ответ на изменение условий

культивирования или в неизменных условиях при длительном пассировании. Четыре

используемых в производстве типа клеточных культур (первичная культура клеток, линия

диплоидных клеток, линия стволовых клеток, и непрерывная клеточная линия)

отличаются по своему потенциалу стабильности. Поэтому может понадобиться адаптация

подходов к описанию характеристик этих клеток с учетом подобных различий.

Культуры клеток выращивают в условиях in vitro, которые значительно отличаются

от условий in vivo, и не удивительно, что клетки могут полностью или частично

измениться в результате культивирования in vitro и обработки. Важно осознавать, что в

условиях культивирования клеток могут возникнуть вариации, реакцией на которые могут

быть неуловимые изменения в биологии клетки. Поэтому необходимо попытаться

контролировать основные известные переменные факторы, которые могли бы оказать

значительное влияние на культуру. Следует, по возможности, указывать данные о

химическом составе и чистоте среды и специфических добавок (сыворотки, факторов

роста, аминокислот и других способствующих росту компонентов). В соответствующих

случаях следует перед использованием определять биологическую активность среды и

добавок. Новые серии реактивов для культивирования клеток должны сопровождаться

протоколами испытаний и сертификатами о происхождении, чтобы можно было на основе

утвержденной спецификации оценить, насколько они подходят для работы. Не

рекомендуется использовать сыворотку или другие реактивы, свойства которых плохо

поддаются определению, в производстве новых биологических препаратов на основе

культуры клеток, и, по возможности, следует искать альтернативные субстанции с

определенным химическим составом. Тем не менее, учитывая, что на данный момент

наше понимание биологии клетки не полно, необходимо взвесить преимущества (более

высокая воспроизводимость результатов и снижение риска), которые дает использование

среды с определенным составом, относительно возможных недостатков такой среды

культивирования, которая может не обеспечивать все биологические нужды клеток. Если

сохраняется необходимость использования сложных биологических реактивов, таких как

фетальная бычья сыворотка, их следует подвергать тщательному контролю с помощью

отбора серий перед использованием, когда это только возможно. Такой же тщательный

отбор должен, в соответствующих случаях, применяться и к поверхностям для

культивирования клеток: специализированным сосудам для культивирования или

покрытиям поверхности.

Неустойчивость физических параметров культивирования, таких как pH,

температура, влажность и состав газа, может оказать значительное влияние на рабочие

показатели и жизнеспособность клеток. Эти параметры следует устанавливать в

допустимых пределах, а также калибровать с помощью соответствующего оборудования и

отслеживать. Помимо этого, любые подготовленные в лаборатории реактивы для

культивирования должны документироваться, проходить контроль качества и

выпускаться в соответствии с установленной спецификацией.

A.2.2 Манипуляции при культивировании клеток

Обработка in vitro может подвергнуть клетки дополнительному физическому или

биохимическому стрессу, который может повлиять на качество готового препарата.

Следует позаботиться о том, чтобы свести манипуляции с клетками к минимуму,

принимая во внимание специфику процесса производства. В любом случае, следует

продемонстрировать стабильность технологического процесса.

A.2.2.1 Отделение от субстрата и пересев

Растворы для диссоциации могут оказать негативное воздействие на клетки, если

не сократить время их воздействия. Процедуры сбора и пассирования клеток следует

выполнять так, чтобы их можно было воспроизвести, и тем самым обеспечить

неизменность качества монослоя культуры при сборе, времени инкубации, температуры,

скорости и времени центрифугирования и плотности посева клеток, при которой они

сохраняют жизнеспособность после пассирования.

A.2.2.2 Криосохранение

(см. раздел A.5.1)

A.2.2.3 Контаминация

При создании первичных культур клеток важно учитывать микробиологический

статус отдельного донора, колонии, стада или стаи донорских особей. Чтобы избежать

внезапного нарушения процесса производства и угрозы заражения реципиентов

препарата, важно свести к минимуму возможность контаминирования культур клеток. По

этой причине следует сократить количество манипуляций и открытых технологических

операций с клетками, учитывая специфику процесса производства. Очень большое

значение имеют тщательное применение асептического метода и обеспечение должного

контроля над окружающими условиями и качеством воздуха при обработке культур

клеток и приготовлении питательной среды. Применение каких-либо антибактериальных

препаратов в ходе биологического процесса нежелательно, но существует серьезное

исключение: для первичной культуры клеток может быть необходимо применение

антибиотик(ов) и противогрибкового(ых) препарата(ов). Также антибиотики могут

использоваться в некоторых системах селекции клеточных линий. Если использовались

антибиотики, то при проведении испытаний на стерильность следует учитывать

возможное ингибирующее действие антибиотиков на контаминирующие организмы. Не

следует использовать в производстве клеточных культур пенициллин или другие β-

лактамные антибиотики.

A.2.3 Подготовка персонала

Очень большое значение для обеспечения соответствия процессов производства

стандартам Надлежащей практики имеет обучение персонала всем процедурам

культивирования клеток. Сотрудников следует обучать основополагающим принципам

работы с клетками, чтобы они понимали процессы, происходящие при культивировании, и

могли опознать явления и изменения, которые могут повлиять на качество клеток 54.

Ключевые процедуры, которым следует уделять внимание при обучении персонала

надлежащей практике работы с культурами клеток, включают пассирование клеток,

подготовку стерильной среды, техническое обслуживание и использование боксов

биологической безопасности, инкубаторов, а также криосохранение.

Культуры клеток должны подготавливать сотрудники, которые не работали в

течение того же дня с животными или инфекционными микроорганизмами. Более того,

культуры клеток не должны готовить сотрудники, знающие о наличии у себя заразного

заболевания. Имеющий дело с клетками персонал должен проходить проверку перед

допуском к работе, чтобы оценить остаточный риск.

A.2.4 Разработка и клонирование клеточных линий

Если клеточная линия подвергается какому-либо процессу, который может оказать

значительное влияние на ее характеристики, такие как туморогенность, ее следует

рассматривать как новую (т.е. другую) линию и добавлять к ее названию суффикс или

код, имеющий соответствующее значение. В этом случае один из главных банков клеток

следует готовить из культуры, прошедшей обработку. Виды обработки, после которых

может понадобиться такое повторное создание банка клеток, включают клонирование

клеток и манипуляции с генами. При внесении любого(ых) изменения(ий) в процесс

культивирования клеток следует наглядно показать, что это не повлияет на качество

препарата, и согласовать такие изменения с национальным регуляторным органом. При

производстве моноклональных антител особенно важно клонировать культуру гибридом

так, чтобы обеспечить выделение единственного продукта, поскольку включение более

одного типа клеток-гибридом может привести к появлению смеси антител различной

специфичности и классов.

На практике, принятой у отдельных производителей, клонирование и отбор могут

незначительно отличаться. Такие различия следует согласовывать с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

На ранних стадиях развития клеточной линии может использоваться ряд различных

систем рекомбинантных векторов и клеточных линий. По существу, это

исследовательская деятельность, но используемые клеточные линии и векторы должны

происходить из сертифицированных источников с подробно описанными

характеристиками и клеток из должным образом подготовленного посевного фонда или

главного банка клеток. Обычно это клетки хозяина и векторы собственной разработки.

Наиболее перспективное сочетание клетки и вектора после трансфекции культуры

рекомбинантной ДНК будет использовано для создания большого количества клонов (от

нескольких сотен до тысяч). Дальше эти клоны обычно сортируются по продуктивности, и

клетки (10-50 штук) с наиболее высокими показателями по этому параметру отбираются

для дальнейшей оценки. Затем в ходе дальнейших испытаний будет отобрано еще

меньшее количество клеток (1-5) для создания небольших заготовок для банка клеток.

Окончательный отбор, обычно на основании стабильности характеристик и возможностей

масштабирования, проходит перед созданием главного или рабочего банков клеток. На

протяжении всего процесса (также как и для создания главного банка клеток)

используются только питательная среда и другие важные реактивы с полностью

изученными характеристиками, источник которых можно отследить. На соответствующих

стадиях процесса разработки запасы всех клонов, с которыми ведется работа, проходят

криосохранение (см. рисунок A3.1).

Рисунок A3.1

Упрощенная схема разработки линии генномодифицированных клеток

В процессе клонирования культуры клеток следует отбирать отдельные клетки для

расширения популяции. Процедуру клонирования следует сопровождать подробной

документацией, содержащей указание происхождения изначальной культуры, протокол

клонирования и описание используемых реактивов. В результате одного цикла

клонирования методом серийных разведений от отдельных клеток не обязательно начнут

появляться новые клетки; следует выполнить еще ряд этапов по субклонированию. В

качестве альтернативы или в дополнение к серийному разведению процедура

клонирования может включать более современные технологии, например, сортировку

отдельных клеток и перенос их в лунки планшетов (single-cell sorting and arraying) или

выделение колонии из разбавленных посевов на полутвердую питательную среду (colony-

picking from dilute seeds into semi-solid media). В любом случае процедура клонирования

должна сопровождаться подробной документацией, включающей детальное описание

методов визуализации и/или соответствующие статистические данные. Для белков,

полученных с помощью трансфекции культуры рекомбинантной плазмидной ДНК,

достаточно одного полностью подтвержденного документально цикла клонирования, при

условии, что препарат демонстрирует гомогенность и единообразие характеристик на

протяжении процесса производства и в течение определенного времени жизни клетки

после его завершения.

Важно тщательно фиксировать в документации факт создания клонов, присваивая

каждому уникальный идентификатор. На раннем этапе работы следует с помощью

криосохранения создать посевные фонды клеток, содержащие значительное количество

клонов. Затем эти клоны можно будет параллельно сравнивать с культурой родительских

клеток, чтобы выявить наилучшие по всем характеристикам клетки для производства

желаемого препарата. Критерии, используемые для оценки отобранного для производства

1-5 клонов

Заготовка(и) для

банка клеток

Отбор по качеству

Отобранная комбинация

клетки и вектора

Отбор по другим критериям,

включая стабильность и

возможность масштабирования

Отбор по продуктивности

Процедура

клонирования

клона, должны включать геномную и фенотипическую стабильность, скорость роста,

достижимые уровни выхода продукта, а также однородность/стабильность препарата.

Оценка предварительно претендующих на дальнейший отбор клонов должна содержать

достаточно информации, чтобы производитель мог сделать на ее основе выбор наиболее

перспективного(ых) клона(ов) для последующей разработки. При оценке клонов клеток,

созданных с помощью генной инженерии, в эти критерии также следует включать

стабильность интегрированной рекомбинантной ДНК. Детали процесса могут различаться

из-за ряда факторов, включая природу клетки-хозяина, желаемые характеристики

препарата, местные процедуры производителя.

Важно помнить о том, что даже после клонирования одной клетки эпигенетическая

изменчивость может привести к тому, что клонированная культура будет

демонстрировать признаки гетерогенности (т.е. содержать больше одного клона). Это не

должно препятствовать использованию такой культуры в производстве, за исключением

случаев, когда наблюдаются признаки нестабильности, которые могли бы негативно

сказаться на качестве и/или безопасности конечного препарата.

A.2.5 Особые вопросы, касающиеся типов нервных клеток

В некоторых клетках отмечалось размножение возбудителей трансмиссивной

губчатой энцефалопатии (ТГЭ). На момент написания феномен наблюдался только для

высокоспецифичных пар возбудителей и клеток; не было обнаружено ни одной клеточной

линии, которая воспроизводила бы все возбудители, однако была описана одна линия,

которая, похоже, может быть подвержена заражению многими штаммами скрепи. Хотя

возникновение явления нельзя предугадать, если линия не выделяет прионный белок

(PrP), то можно предположить, что ее невозможно заразить, и опыт, накопленный к

данному моменту, показывает, что обычно инфекции не наблюдается или ее сложно

поддерживать в таких линиях. С другой стороны, клетки, которые можно заразить,

включают линии фибробластов, а также нейроны. Клетки получают от мышей и крыс,

потому что возбудителем инфекции в испытаниях обычно выступает адаптированная к

мышам скрепи. Тот факт, что определенные клетки поддаются заражению определенными

возбудителями, подтверждает теорию, что клеточные линии могут быть заражены. Таким

образом, воздействие источников потенциально контаминированного материала на клетки

вызывает беспокойство. Поскольку степень риска сложно оценить, в отношении

требований безопасности и ТГЭ рекомендуется концентрировать внимание на отборе и

документировании реактивов и других материалов для культивирования, которые тесно

контактируют с клетками, чтобы гарантировать отсутствие заражения. Тактика для

достижения этого описана в разделе B.11.4.

A.3 Отбор исходных материалов

A.3.1 Введение

Все материалы, и особенно полученное от человека или животных сырье, которые

могут при производстве биологических препаратов стать первичным источником

занесенных агентов, должны при необходимости подвергаться оценке риска и

тестированию. Пристальное внимание следует уделять источникам сырья, его получению,

манипуляциям с ним, тестированию и контролю качества. Все материалы биологического

происхождения для культивирования клеток, которые близко контактируют с клетками во

время создания культур, выделения новой клеточной линии (если имеет место), процедур

создания банков (если имеют место) и производства, следует подвергать

соответствующим испытаниям, как указано в процедуре оценки рисков, чтобы установить

их качество и отсутствие микробиологической контаминации и оценить пригодность к

использованию в производстве. Важно оценить микробиологические риски, которые несет

каждый полученный от людей или животных реактив, используемый в процессе

культивирования. Эта оценка должна охватывать (I) географическое происхождение

сырья; (II) вид, от которого получено сырье; (III) общую опасность микробиологического

загрязнения, включая изучение анамнеза человека, от которого получены реактивы; (IV)

условия содержания/скрининга животных-доноров; (V) испытания, которым подвергнут

препарат, включая протоколы испытаний (если имеются); и (VI) объем процедур по

подготовке, очистке и стерилизации (если имели место), которые были использованы для

удаления или инактивации контаминантов 56. Угрозу для безопасности препарата могут

также представлять и другие реактивы биологического, но не животного происхождения.

Они рассматриваются далее, в разделе A.3.4.

Сегодня технология производства рекомбинантных белков позволяет использовать

множество материалов, которые раньше получали непосредственно из животных

источников или от человека. Хотя эта технология исключает очевидные риски заражения

от доноров, следует проанализировать процесс производства рекомбинантных белков,

чтобы обнаружить какие-либо материалы биологического происхождения и любые

связанные с ними угрозы, с которыми возможно придется иметь дело.

Национальный регуляторный орган/национальная контрольная лаборатория

должны одобрить источник(и) получаемого от животных сырья, такого как сыворотка или

трипсин. Это сырье должно соответствовать требованиям, изложенным в Руководстве по

оценке инфекционности ТГЭ в тканях 57. Сырье следует подвергать соответствующим

испытаниям качества и анализам на отсутствие контаминации микроорганизмами, чтобы

оценить допустимость его использования в производстве. Источник сырья должен быть

подтвержден документально, чтобы гарантировать, что оно происходит из местности с

допустимым уровнем микробиологического риска (например, где нет ящура или губчатой

энцефалопатии крупного рогатого скота). Также следует собрать материалы об истории

получения, производстве, контроле качества сырья и любой окончательной или

дополнительной обработке, которая может негативно сказаться на качестве и

безопасности сырья (например, смешивание и аликвотирование серий сыворотки).

Следует обеспечить меры контроля, чтобы предотвратить перекрестную контаминацию

одного материала другим (например, полученное от крупного рогатого скота сырье в

препарате свиного происхождения).

По мере целесообразности приветствуется сокращение использования или

исключение из производственного процесса сырья, полученного от животных и людей.

Если это обоснованно, то для некоторых видов сырья человеческого или животного

происхождения, используемых в качестве культуральной среды, таких как инсулин или

трансферрин, валидацию производственного процесса по устранению вирусов можно

заменить проверкой на вирусы.

Наиболее вероятную микробиологического угрозу для клеток в процессе

культивирования представляют полученные от животных реактивы, такие как трипсин и

сыворотка, которые могут быть серьезно повреждены или полностью испорчены в ходе

механической стерилизации, включая нагревание и иррадиацию. Известно, что серии

таких реактивов, как трипсин и бычья сыворотка, подвержены заражению видами

Mycoplasma и иногда более чем одним вирусом. Определенные контаминанты также

демонстрируют способность заражать клетки в культуре. Окружающая среда при

обработке является распространенным источником микробиологической контаминации, и

ее следует контролировать, чтобы свести к минимуму такой риск и предотвратить рост

контаминантов.

A.3.2 Сыворотка и другое получаемое от крупного рогатого скота сырье,

используемое в качестве культуральной среды

Источник(и) бычьей сыворотки должны быть одобрены национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией. Ответственность за

обеспечение качества сыворотки, используемой для создания банков клеток и

биологических препаратов, несет производитель биологических препаратов. Качество

можно гарантировать разными способами. Производитель препарата может проводить

анализы на занесенные агенты и инактивировать сыворотку после приобретения у

производителя сыворотки. Или же производитель препарата может аттестовать

определенного продавца сыворотки и закупать ее только после тщательных регулярных

проверок поставщиков, чтобы убедиться, что они правильно организовали производство,

контроль качества и валидацию, необходимые для достижения такого уровня качества

сыворотки, который требуется для производства биологических препаратов. В некоторых

случаях можно счесть достаточными протоколы испытаний. Оптимальной может стать

некая комбинация изложенных подходов, а выбранную стратегию следует рассмотреть

при оценке риска. Также рекомендуется проконсультироваться с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

Сыворотку и другие полученные от крупного рогатого скота материалы следует

тестировать на занесенные агенты, такие как бактерии, грибки, микоплазмы и вирусы,

перед тем, как использовать их для создания главных и рабочих банков клеток и

производства биологических препаратов. Особое внимание следует уделить тем вирусам,

которые могут быть занесены материалами, полученными от крупного рогатого скота, и

которые могут быть зоонозными или канцерогенными (например, вирусная диарея

крупного рогатого скота (BVDV), полиомавирус КРС, цирковирусы КРС, вирус

бешенства, аденовирусные инфекции КРС, парвовирусная инфекция КРС (BPV),

респираторно-синцитиальный вирус КРС (BRSV), вирус инфекционного ринотрахеита

КРС (IBR), вирус парагриппа типа 3 КРС (BPIV3), реовирус 3 типа (REO3), вирус долины

Кэш (Cache Valley virus), вирус блютанга (BTV) и вирус эпизоотической-геморрагической

болезни). Также следует обдумать план направленных на снижение риска действий, таких

как инактивация с помощью высокой температуры или иррадиации, чтобы гарантировать

снижение активности занесенных агентов, не поддающихся обнаружению при

изготовлении и контроле качества сыворотки, до уровня, который признан приемлемым

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией. Если в

ходе изготовления сыворотки применяется иррадиация или другие методы инактивации

(например, стерилизация с помощью высокой температуры), испытания на занесенные

агенты следует проводить до инактивации, чтобы увеличить шансы обнаружить

контаминанты. Если в результате какого-либо из испытаний обнаружены признаки

присутствия вирусов, такая сыворотка пригодна к использованию, только если вирус

удалось идентифицировать, а в ходе валидационного исследования доказано, что он

присутствует в таком количестве, которое можно эффективно инактивировать. Если в

ходе какого-либо из испытаний сыворотки, которая не подлежит процедуре инактивации

или удаления вирусов, обнаружены признаки вирусной контаминации, то такая сыворотка

в большинстве случаев считается непригодной. Если производитель решает использовать

не прошедшую инактивацию сыворотку, следует провести тщательные анализы на

занесенные агенты, используя существующие передовые технологии. Если какие-либо

агенты найдены, то производитель обязан доказать, что банки клеток, созданные данным

способом, не заражены найденным(и) вирусом(ами).

Если применяется иррадиация, важно удостовериться, что воспроизводимая доза излучения

используется для всех серий препарата и составляющих их частей. Доза иррадиации должна быть

достаточно низкой, чтобы реактивы сохранили свои биологические свойства, но достаточно

высокой, чтобы сократить риск, связанный с вирусами. Из этого следует, что такая доза иррадиации

не обязательно приводит к стерилизации.

Если до создания банка клеток производитель использовал для изготовления

субстрата клеток животных или пассирования сыворотку, то следует проверить этот банк

(главный или рабочий) и/или клетки на пригодном для производства или более позднем

пассаже на занесенные агенты, характерные для тех видов животных (например, крупного

рогатого скота), сыворотка которых использовалась в создании клеточного субстрата и

истории пассирования. Если сыворотка не будет использоваться на последующих этапах

производства, то данное испытание не понадобится повторять, так как банк клеток уже

проверен и сочтен не содержащим занесенных агентов крупного рогатого скота (или

любого вида, сыворотка которого использовалась).

Методы, которые используются в исследованиях на вирусы крупного рогатого

скота, должны быть одобрены национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией. Подробное описание методов дается в Приложении 1. В

качестве метода первоначального отбора используются пробы инфекционности. При

таком отборе среди прочих обнаруживаются вирусная диарея КРС, реовирус 3 типа, вирус

долины Кэш, вирус блютанга и вирус эпизоотической-геморрагической болезни. Однако

следует заметить, что обычно такие методы, как описанная здесь проба инфекционности,

с трудом выявляют некоторые вирусы (например, полиомавирусы КРС), которые часто

могут контаминировать сыворотку. Может понадобиться рассмотреть дополнительные

методы, такие как технология амплификации нуклеиновых кислот (NAT), хотя

присутствие последовательностей генома вирусов не обязательно указывает на наличие

вируса. В таких случаях бывает необходимо рассмотреть возможность разработки

специфичной пробы инфекционности для обнаружения определенного вируса (например,

полиомавируса КРС).

Вторая особенность отбора сыворотки заключается в том, что объем пробы для

испытания значительно меньше, чем размер серии, которую получают путем объединения

сыворотки, полученной от многих животных (разница составляет порядка 1000:1).

Поэтому возбудители вирусных инфекций могут не попасть в пробу сыворотки при

тестировании, и следует рассмотреть возможность непосредственной проверки банка

клеток на вирусы крупного рогатого скота. В дополнение к обычной процедуре скрининга

такая проверка может включать, например, амплификацию нуклеиновых кислот для

обнаружения вирусов крупного рогатого скота, которые могут контаминировать

клеточный субстрат, но подвергнуться абортивной и/или трансформирующей инфекции.

В этом отношении особый интерес вызывают полиомавирусы, герпесвирусы,

цирковирусы, аннеловирусы и аденовирусы.

Обычная процедура скрининга для обнаружения вирусных инфекций в сыворотке

или клеточных субстратах предполагает использование по крайней мере одной

индикаторной линии клеток, пригодной для репликации вируса, вызывающего диарею

крупного рогатого скота, например, линии клеток носовых раковин (turbinate cells) КРС.

Следует также использовать вторую клеточную линию, например, линию Vero, для

расширения возможностей обнаружения контаминации. Перед тем как начать скрининг,

может понадобиться проверить сыворотку на наличие антител, особенно к вирусной

диарее КРС, которые могут маскировать вирусную инфекцию.

Индикаторные клетки обычно культивируют в присутствии испытуемой сыворотки

в течение 21-28 дней, при пересеивании клеток по мере необходимости. В течение этого

периода клетки регулярно проверяют на предмет цитопатического эффекта, который

указывает на присутствие вируса. В конце периода наблюдения, который должен длиться

не менее 7 дней с момента последнего пересева культуры, проводят анализ с

применением окрашивания для обнаружения цитопатического эффекта, который мог быть

незамечен во время наблюдения за живыми клетками. Дополнительные анализы в конечной

точке должны включать тесты на гемадсорбцию и гемагглютинацию при температуре 4 °C

и более высокой, например, 20–25 °C, а также иммунофлуоресцентные анализы (IFA) на

специфические вирусы. Для каждого из испытаний следует применять должные меры

контроля, например, инфицирование вирусом парагриппа типа 3 крупного рогатого скота

определяется по гемадсорбции. Иммунофлуоресцентные анализы особенно актуальны для

обнаружения вирусной диареи КРС, так как в сыворотке может присутствовать

нецитопатический вирус диареи. Конечные точки иммунофлуоресцентного анализа также

используются для обнаружения других вирусов, которые могут быть определены на основе

географических данных, например, аденовирусов, парвовирусной инфекции КРС, вируса

блютанга, респираторно-синцитиального вируса КРС, реовируса 3 типа и таких

маловероятных, но серьезных контаминантов, как вирус бешенства.

Если используется сыворотка, полученная от другого вида животных (т.е., не

крупного рогатого скота), следует проконсультироваться с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией насчет методов тестирования,

соответствующих этому виду.

A.3.3 Трипсин и другое получаемое от свиней сырье, используемое для

подготовки культур клеток

Трипсин, используемый для культивирования клеток, следует тестировать на

поддающиеся культивации бактерии, грибки, микоплазмы и возбудители вирусных

инфекций, включая парвовирусы крупного рогатого скота или свиней, если это

необходимо. Методы такого тестирования должны быть одобрены национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

В некоторых странах для инактивации потенциальных вирусных контаминантов применяется

иррадиация. Если используется иррадиация, важно удостовериться, что для всех серий и

составляющих их частей применяется воспроизводимая доза излучения. Доза иррадиации должна

быть достаточно низкой, чтобы реактивы сохранили свои биологические свойства, но достаточно

высокой, чтобы сократить риск, который несут вирусы. Поэтому иррадиация в такой дозе не может

считаться процессом стерилизации.

За качество трипсина, как и за качество сыворотки, отвечает производитель

биологических препаратов (см. раздел A.4.2). Для применения доступен рекомбинантный

трипсин, и следует рассмотреть возможность его использования. Однако не следует

полагать, что рекомбинантный трипсин не несет риска контаминации. Он должен

оцениваться с использованием тех же критериев, что и любой другой реактив

биологического происхождения (см. раздел A.4.1).

Как и серии сыворотки, которые получают не от одного животного, серии трипсина

готовят из поджелудочных желез большого количества животных. Большинство серий

свиного трипсина содержат генетические последовательности парвовируса свиней 1 типа

и цирковирусов свиней, поэтому следует обращаться с ними определенным образом,

одобренным национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией, чтобы инактивировать любой вирус, который может в них содержаться.

Хотя принято считать, что эти вирусы относительно устойчивы к инактивации 58. Если

используется трипсин, полученный от другого животного вида, следует

проконсультироваться с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией насчет соответствующих этим видам методов тестирования.

Обычная процедура скрининга для обнаружения характерных для свиней

возбудителей вирусных инфекций в трипсине или клеточном субстрате предполагает

использование по крайней мере одной индикаторной клеточной линии, которая пригодна

для репликации вирусов свиней, например, линии клеток семенников свиньи или клеток

Vero. Обычно индикаторные культуры клеток выращиваются в течение 14 дней с

высеванием на свежие исследуемые клетки еще на 14 дней. На протяжении всего периода

культивирования в дополнение к периодическим проверкам на цитопатический эффект и

общим методам обнаружения вирусов в конечной точке, таким как тесты на

гемадсорбцию и/или гемагглютинацию, могут понадобиться более специфичные методы,

такие как иммунофлуоресцентный анализ или ПЦР.

Если производитель использовал трипсин до создания банков клеток при

получении субстрата клеток животных или при пассировании, то банк клеток (главный

или рабочий) следует тестировать на парвовирус свиней или соответствующие занесенные

агенты, характерные для тех видов, трипсин которых использовался. Если трипсин не

используется на последующих этапах производства, то данное тестирование не

понадобится повторять на этих этапах, так как банк клеток уже проверен и сочтен не

содержащим парвовируса свиней (или соответствующих агентов). Следует рассмотреть

необходимость скрининга на другие агенты, например, цирковирусы свиней, для которого

можно использовать молекулярные методы, такие как ПЦР.

Тестирование клеток, которые подвергаются воздействию трипсина или другого

полученного от свиней материала, может повлечь тестирование на большее количество

агентов, чем парвовирус и цирковирусы свиней. Например, могут понадобиться анализы

на аденовирус свиней, трансмиссивный вирусный гастроэнтерит, вирус свиного

гемагглютинирующего энцефалита, вирусную диарею крупного рогатого скота,

реовирусы, вирус бешенства, свиной анелловирус (anellovirus), свиной хоковирус

(hokovirus), свиной бокавирус, свиной вирус гепатита Е, вирус репродуктивного и

респираторного синдрома свиней, вирус энцефаломиокардита и, возможно, другие

вирусы. Особое внимание следует уделить тем вирусам, которые могут быть занесены

материалом, полученным от свиней, и быть зоонозными или онкогенными. Следует

проводить дополнительные испытания на стерильность и отсутствие бактерий и грибков и

на микоплазмы, в зависимости от типа полученного от свиней материала. По этому

поводу следует проконсультироваться с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией.

A.3.4 Получаемые из других источников добавки для среды и универсальные

реактивы, используемые для подготовки культур клеток

Качество добавок к среде, полученных от других видов животных, следует

контролировать с точки зрения занесенных агентов. Следует принимать во внимание,

вступали ли добавки к среде, полученные с помощью рекомбинантных технологий, в

процессе производства в контакт с сырьем животного происхождения. И если такой

контакт имел место, то добавки следует оценить с точки зрения возможности попадания

занесенных агентов в производство банков клеток и биологических препаратов. В ходе

тестирования на занесенные агенты должны оцениваться вирусы, характерные для тех

видов животных, от которых были получены добавки. По этому поводу следует

проконсультироваться с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией.

Как правило, не рекомендуется получать добавки для среды из материалов

человеческого происхождения. В частности, не следует использовать сыворотку человека.

Однако при особых обстоятельствах и с согласия национального регуляторного

органа/национальной контрольной лаборатории может быть допустимо использование

полученных от человека добавок. Если на какой-либо стадии изготовления препарата

используется альбумин человеческой сыворотки, следует проконсультироваться с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией

относительно требований к альбумину, так как они могут отличаться в разных странах.

Альбумин человеческой сыворотки должен, как минимум, соответствовать

пересмотренным Требованиям к биологическим субстанциям №27 59, а также

Руководству по оценке инфекционности трансмиссивной губчатой энцефалопатии в

тканях 57.

Для приобретения доступен рекомбинантный альбумин человека, следует

рассмотреть возможность его использования. Однако не следует полагать, что он не несет

риска контаминирования. Он должен оцениваться с использованием тех же критериев, что

и любой другой реактив биологического происхождения (см. раздел A.3.1).

Как и для других реактивов для культивирования клеток, для добавок к среде

важно обеспечить отслеживаемость, оценить и снизить микробиологический риск, как

описано в разделе A.3.1.

Доступны различные реактивы биологического происхождения для

культивирования клеток. Эти реактивы получены из неживотных источников,

включающих ряд водных организмов, растений и морских водорослей. При этом

конкретная угроза, которую они представляют, может быть неопределенной и не

изученной. Микробиологические риски могут значительно отличаться от тех, которые

связаны с реактивами животного происхождения (см. разделы A.3.1–A.3.3). Также могут

возникнуть и другие проблемы, например, связанные с иммуногенными, митогенными и

аллергическими свойствами реактивов и их компонентов. Полученное из растений сырье

может, например, нести повышенную опасность контаминирования микоплазмами и

микобактериями.

A.4 Аттестация банков клеток производителем

Крайне важно, чтобы производитель предоставлял информацию о клеточном

субстрате, с четким указанием источника или происхождения культуры и описанием

создания, определения характеристик и тестирования предназначенных для производства

банков клеток (главного и рабочего). Должны быть представлены все данные,

необходимые для доказательства того, что этот клеточный субстрат и созданные банки

клеток пригодны для производства биологических препаратов.

A.4.1 Данные о клеточной линии

Каждая новая клеточная линия должна сопровождаться данными, объем которых

будет расти по мере того, как клеточная линия создается и развивается в

производственных целях. Этот пакет данных нужен для подтверждения того, что клетки

пригодны к использованию. Он должен содержать информацию о происхождении клеток

(информация о доноре и любые относящиеся к делу данные об этичном получении

донорских материалов), выделении клеточной линии, истории культивирования, условиях

культивирования (включая используемые реактивы), оценке безопасности на раннем этапе

производства, создании банка клеток и установлении его характеристик, а также

испытаниях для проверки безопасности. Эта информация должна быть предоставлена

национальному регуляторному органу/национальной контрольной лаборатории для

одобрения клеток, используемых в производстве.

A.4.2 Аттестация первичных культур клеток производителем

Следует обеспечить возможность полностью проследить историю культивирования

первичных клеток, включая информацию о животных, от которых были получены клетки,

условиях их содержания, ветеринарном осмотре, вакцинациях (если проводились),

процедурах введения анестезии и сбора клеток, реактивах, процедурах подготовки

первичных культур и сопутствующих условиях окружающей среды. Следует проводить

всестороннее тестирование и документировать этот процесс.

Важно описывать каждую серию или партию клеток, используемых в каждом

отдельном процессе производства. В рамках производства серия или партия – это

культура первичных клеток одного или нескольких животных, которая получена в ходе

общепринятых процедур забора ткани, ее разделения на отдельные части и обработки,

ведущих к созданию фракции клеток одной культуры. Партии можно готовить разными

способами сбора и объединения клеток, но все процедуры их обработки должны быть

воспроизводимыми. Особенно важно тщательно следить за признаками негативных

изменений в культуре клеток и контаминации микроорганизмами. До того как культуры

будут объединены в пул, следует проверить клетки на пригодность к использованию в

производстве. Должны быть установлены критерии пригодности, включающие

проведение анализов на микробиологическую контаминацию и общее состояние клеток

(например, определение морфологии, количества, жизнеспособности). Если не удастся

обнаружить и удалить атипичные (т.е., возможно зараженные вирусом) или серьезно

контаминированные клетки, это подвергнет риску весь ход производства и может

негативно сказаться на качестве готового препарата. Не следует использовать образцы с

недопустимо большим содержанием мертвых или атипичных клеток, а испытания на

присутствие микроорганизмов следует, в идеальных условиях, проводить и заканчивать

до того, как клетки начнут использоваться в производстве.

Подготовка партий клеток для производства должна подробно отражаться в

документации, чтобы можно было полностью отследить их путь от животного(ых)-

донора(ов) до производства. Согласно требованиям Надлежащей производственной

практики, любое объединение клеток, как и любое отклонение от стандартных

операционных процедур, следует четко фиксировать в документации. Также следует

записывать любые наблюдаемые различия между сериями, даже если они не обязательно

могли бы привести к отказу от использования этих серий. Такая информация может

оказаться ценной для текущей оптимизации и улучшения процесса производства.

A.4.3 Аттестация линий диплоидных клеток, непрерывных клеточных линий

и линий стволовых клеток производителем

Должны быть доступны указанные в разделе A.4.1 данные обо всех клеточных

линиях, используемых в производстве биопрепаратов. В них следует указать

первоначальный уровень удвоения популяции посевного фонда клеток (или номер

пассажа, если уровень удвоения популяции неизвестен). Для линий клеток человека

следует, если возможно, оценивать анамнез донора, от которого ведет начало клеточная

линия, чтобы лучше определить потенциальные риски и то, насколько эта линия подходит

для использования.

Среди важных характеристик линий стволовых клеток можно назвать

морфологические признаки. Для сравнения должны быть доступны репрезентативные

изображения и иммунофенотипические профили недифференцированных и

дифференцированных клеток.

A.5 Криосохранение и создание банков клеток

A.5.1 Криосохранение

При создании банков успешное сохранение клеток при сверхнизких температурах

имеет критическое значение для получения качественных культур (т.е. с высокой

жизнеспособностью и необходимыми свойствами). Особые сложности связаны с

необходимостью готовить большие запасы пробирок с замороженными клетками для

банков клеток, поэтому следует принять на вооружение ряд ключевых принципов:

■ Следует применять метод, соответствующий текущей передовой практике

сохранения клеточных культур (см., например, 60).

■ Следует определить профиль охлаждения замораживаемых клеток и

использовать такой же профиль для каждого отдельного процесса криосохранения

(т.е. стандартная операционная процедура должна включать документацию

профиля охлаждения в протоколе изготовления серии).

■ Каждый процесс сохранения должен быть запротоколирован.

■ Общие правила предполагают использование только тех культур,

большинство из клеток которых находится в экспоненциальной фазе роста. Клетки

в таких культурах также проявляют тенденцию к низкому ядерно-

цитоплазматическому отношению (по объему) и должны быть более пригодны для

успешного криосохранения. Неразумно использовать клетки, которые находятся

преимущественно в лаг-фазе роста почти сразу после пассирования, или в

стационарной фазе, когда культура уже достигла максимально возможной

плотности клеток.

■ При создании каждого банка следует использовать клетки, объединенные

из одной разросшейся культуры (т.е., не из ряда культур, созданных в разное время

после высевания или на разных уровнях удвоения популяции), и перемешивать их

перед аликвотированием, чтобы обеспечить гомогенность.

■ Количество клеток в пробирке должно позволять при восстановлении

получить репрезентативную культуру (например, 5–10х10

в 1 мл аликвоты).

■ При создании новых банков клеток не следует обрабатывать

предназначенные для этого культуры антибактериальными препаратами, за

исключением случаев, когда это может быть оправдано для культур на раннем

уровне удвоения популяции, которые могут содержать контаминанты, попавшие

при заборе тканей или с рекомбинантными клетками, требующими подбора

антибиотиков, и когда это необходимо для сохранения генетической стабильности

линии рекомбинантных клеток. Если антибактериальный препарат все же

применяется, то это должен быть не пенициллин и не другой бета-лактамный

антибиотик.

■ Когда фонд клеток уже заморожен, следует восстановить один из

образцов, чтобы подтвердить, что он сохраняет жизнеспособность, а результаты

этого действия следует запротоколировать. Также важно установить степень

гомогенности содержимого банка. Чтобы убедиться в перспективности

производства с использованием этого банка клеток, следует продемонстрировать

восстановление достаточного числа (например, 1% или рекомендованного

национальным регуляторным органом процента) пробирок, представляющих

начало, середину и конец процесса криосохранения. И наконец, когда пробирки,

содержимое которых предназначено для использования в производстве,

размораживаются и показывают получение целевого продукта на должном уровне,

демонстрируется стабильность (см. раздел B.3) и целостность содержимого

криосохраненных пробирок (см. также раздел B.7).

■ Следует проверять и содержать в исправности сосуды для хранения

банков клеток при сверхнизкой температуре, чтобы обеспечить высокую

стабильность условий хранения для банков клеток. Осуществление доступа к таким

клеткам может вызывать периодическое изменение температуры, которое в худшем

случае может привести к потере клетками жизнеспособности. Будет

предусмотрительно создать программу тестирования стабильности,

предполагающую периодическое восстановление клеток, в которой частота

восстановления клеток соотносится с риском циклических перепадов температуры.

Новые разработки в области удаленного мониторинга отдельных пробирок в

будущем могут сделать тестирование стабильности ненужным.

A.5.2 Создание банков клеток

При использовании в производстве биологического препарата линий диплоидных

или стволовых клеток или непрерывных клеточных линий следует применять систему

банков клеток. Одобрение и регистрация банков клеток национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией должны быть частью процесса

одобрения препарата. Источник клеток, используемых для создания банков клеток и

производства клеток – это очень важный фактор в разработке и получении биопрепарата.

Желательно получать клетки из источников с документированной историей, которые

можно отследить до донора клеток, с которых начиналась линия.

После того как был получен образец начального посевного фонда клеток, следует

создать предварительную заготовку для главного банка клеток всего из нескольких

пробирок. Одна или более пробирок из заготовки для главного банка используется для

создания главного банка. Рабочий банк клеток получают из одного или нескольких

контейнеров главного банка путем увеличения количества клеток. Рабочий банк клеток

должен быть аттестован для получения культур клеток, пригодных для использования в

производстве биологического препарата.

Если в процессе производства используются клетки первичных культур на ранних

уровнях удвоения популяции, условия создания банков клеток рассматриваются для

каждого отдельного случая. У такого подхода есть серьезные преимущества: он дает

значительную гибкость в определении графика производственного процесса, позволяет

завершить контроль качества и тестирование безопасности до использования клеток, и

сокращает совокупное количество испытаний, необходимых в процессе производства.

Характеристики банков клеток следует определять, как указано в части B

настоящих рекомендаций, и согласно любым другим правилам, действующим на текущий

момент, и тем, что еще будут опубликованы ВОЗ. Тестирование банка клеток,

предназначенного для замены главного банка (и полученного из той же самой

клонированной клетки или из существующего главного или рабочего банка клеток), не

отличается от тестирования первоначального главного банка клеток, кроме как в

надлежащим образом обоснованных исключительных случаях. Меры по обнаружению

контаминации вирусами и другими бактериальными агентами представляют собой

ключевой элемент определения характеристик клеточных банков.

После процедуры криосохранения, проведенной в соответствии с аттестованными

методами (см. раздел A.5.1), как главный, так и рабочий банк клеток следует хранить в

замороженном виде при определенных условиях, например, в паровой или жидкой фазе

жидкого азота. Место хранения, идентификационные характеристики и инвентарный

номер отдельных криопробирок или ампул с клетками следует тщательно

документировать. Рекомендуется хранить части главного и рабочего банка клеток по

крайней мере в двух далеко расположенных друг от друга местах производственного

объекта и/или в географически разных местах, чтобы обеспечить возможность

непрерывного производства препаратов в случае катастрофы на одном из

производственных объектов. Когда криосохраненные клетки перевозятся на отдаленную

площадку, важно использовать для транспортировки подходящие контейнеры и

контролировать перевозку с помощью датчиков для обнаружения колебаний температуры.

Со всеми контейнерами следует обращаться одинаково. После того как их вынимают из

хранилища, их обычно туда уже не возвращают. На производственной площадке, где

хранится вторая часть банка, должны действовать стандарты контроля качества,

эквивалентные стандартам, используемым на первой площадке.

A.5.3 Стандартные банки клеток ВОЗ

Принцип создания стандартных банков клеток под эгидой ВОЗ предлагает

возможное решение проблем, которые могут возникнуть в будущем при разработке

вакцин и биотерапевтических препаратов в развивающихся регионах. Однако ВОЗ не

утверждает, что клетки из стандартного банка, поставляемые производителям, следует

использовать в качестве главного банка клеток. Назначение стандартных банков клеток

ВОЗ в том, чтобы предоставить производителям должным образом охарактеризованный

клеточный материал для посева и создания главного банка. От таких главных банков

клеток ожидается, что они будут соответствовать требованиям данного документа и будут

полностью охарактеризованы.

Стандартные банки клеток ВОЗ дают следующие ключевые преимущества для

разработки вакцин по всему миру:

■ происхождение клеток, выделение клеточной линии и источник

материалов, используемых в подготовке посевного фонда клеток, можно отследить;

■ стандартные банки ВОЗ открыты для тщательного изучения учеными со

всего мира, совместных технических исследований свойств клеток и проверок на

наличие занесенных агентов;

■ результаты определения характеристик банков клеток реферируются

экспертами в этой области и публикуются;

■ испытания оцениваются экспертами ВОЗ, которые готовят

соответствующее заключение и признают их пригодность для использования в

процессе производства вакцин;

■ поставка клеток не ограничивается никакими правами на

интеллектуальную собственность по отношению к готовому препарату;

■ единый источник клеток с растущей и постоянно пополняемой базой

последних научных и технических данных о тестировании безопасности и истории

безопасного использования клеток служит дополнительной гарантией безопасности

для производителей, регуляторных органов и представителей правительственных

структур.

На протяжении последних двадцати лет линия клеток Vero является самой широко

используемой в производстве вирусных вакцин непрерывной клеточной линией.

Стандартный банк клеток Vero 10-87 ВОЗ был создан в 1987 г. и подвергался широкому

ряду испытаний для установления его пригодности для производства вакцин. Этот

стандартный банк ВОЗ представляет собой уникальный ресурс для разработки

биологических препаратов в будущем, когда понадобится клеточный субстрат с историей

безопасного и надежного применения. Недавно был проведен исчерпывающий обзор

исследований по описанию свойств посевного фонда клеток Vero 10-87 ВОЗ, подробный

отчет о работе представлен на сайте ВОЗ (http://www.who.int/biologicals/).

Согласно заключениям экспертизы, проведенной в 2002 г., стандартный банк

клеток Vero 10-87 ВОЗ сочтен непригодным для непосредственного использования в

качестве материала главного банка клеток. Тем не менее, стандартный банк клеток Vero

10-87 ВОЗ сочтен пригодным для использования в качестве посевного фонда клеток для

создания главного банка клеток, и его статус изменен с «банк клеток Vero 10-87 ВОЗ» на

«стандартный банк клеток Vero 10-87 ВОЗ».

Стандартный банк клеток Vero 10-87 ВОЗ хранится в Европейской коллекции

культур клеток животных (www.hpacultures.org.uk) в Великобритании и Американской

коллекции типовых культур (ATCC, www.atcc.org) в США. Эти доступные для общего

пользования коллекции культур распространяют ампулы среди многочисленных

производителей и других пользователей по договоренности с ВОЗ. Стандартный банк

клеток Vero 10-87 ВОЗ является собственностью ВОЗ и не несет никаких ограничений

касательно прав на интеллектуальную собственность. Образцы из стандартного банка

клеток Vero 10-87 ВОЗ можно получить бесплатно по запросу в ВОЗ. Однако в силу того,

что количество оставшихся пробирок ограничено, распространение возможно только для

целей производства вакцин и других биологических препаратов. На данный момент

рассматривается возможность замены стандартного банка клеток Vero 10-87 ВОЗ.

ВОЗ также осуществляет надзор за созданием посевного фонда клеток MRC-5 для

производства вакцин. Стандартный банк линии MRC-5 ВОЗ был создан в 2007 г. из-за

проблем со стабильностью оригинальных пробирок с клетками MRC-5, которые были

помещены в банк в 1966 г. Новый стандартный банк клеток был подготовлен в

аттестованном чистом помещении и подвергся специализированным испытаниям

контроля качества под общим руководством Экспертного комитета ВОЗ по биологической

стандартизации.

Часть B. Рекомендации по исследованию свойств банков

субстратов клеток животных

B.1 Общие положения

С момента подготовки отчета Исследовательской группой в 1986 г. научно-

технический прогресс привел к расширению диапазона типов клеток животных,

используемых для производства биологических препаратов. В некоторых случаях

использование таких новых типов клеток позволяет получать большее количество

препарата при более низких издержках, а в других случаях только с их помощью может

быть произведен рентабельный препарат. Получили одобрение многие изготовленные из

различных типов непрерывных клеточных линий препараты; некоторые примеры таких

препаратов приведены в Таблице A3.1.

Таблица A3.1

Примеры зарегистрированных биологических препаратов, полученных из

непрерывных клеточных линий

Класс препарата

Препарат (заболевание)

Клеточная линия

Терапевтическое

средство

Фактор VIII (гемофилия)

Клетки яичников

китайского хомячка

(CHO)

Фактор VIIa (гемофилия)

Клетки почки

новорожденного

сирийского хомячка

(ВНК-21)

Моноклональные антитела

(различные заболевания)

Клетки яичников

китайского хомячка и

мышиной миеломы (NS0

и SP2/0)

Профилактическое

средство

Вакцина от полиовируса

Vero

Вакцина от ротавируса

Vero

Вакцина от бешенства

Vero

Вакцина от японского

энцефалита

Vero

Вакцина от папилломавируса

человека

Sf-9

Вакцина от гриппа

Клетки Мадин-Дарби

почек собак (MDCK)

Значительно большее количество препаратов находится сейчас на стадии

разработки. Для некоторых препаратов используются высокотуморогенные клетки

(например, клеточная линия HeLa и некоторые банки клеток MDCK), а для некоторых

применяются клетки, полученные из таких источников, которые ранее не использовались

в производстве, например, клетки насекомых. Примеры таких препаратов перечислены в

Таблице A3.2.

Таблица A3.2

Примеры получаемых из непрерывных клеточных линий биологических препаратов

на стадии разработки

Класс препарата

Препарат (заболевание)

Клеточная линия

Терапевтическое средство

Более чем для половины препаратов на стадии разработки в

качестве клеточного субстрата используются клетки

яичников китайского хомячка или мышиной миеломы 61.

Моноклональные антитела, как правило, производятся из

клеток CHO, SP2/0, PER.C6 и NS0 (62).

Профилактическое средство

Вакцина от ВИЧ

CHO, Vero, PER.C6,

293ORF6, HER96, HeLa

Вакцина от простого герпеса

2 типа

CHO

Вакцины от гриппа

sf9, Vero, PER.C6

Вакцина от бешенства

Непрерывные клеточные линии могут отличаться от первичных культур клеток или

линий диплоидных клеток по биохимическим, биологическим и генетическим

характеристикам и могут представлять риск для пациентов, которые будут получать

биопрепараты, полученные с использованием этих клеточных линий. В частности,

непрерывные клеточные линии могут экспрессировать трансформирующие белки и

содержать потенциально онкогенную ДНК и гены вирусов. В некоторых случаях

непрерывные клеточные линии могут вызывать возникновение опухолей при инокуляции

животным. Раньше считалось, что туморогенные клетки по своей природе более опасны,

чем нетуморогенные (например, первичные культуры клеток и линии диплоидных

клеток). И когда использовались туморогенные клетки (например, клетки CHO для

изготовления рекомбинантных белков), требовался более высокий уровень чистоты, и

особый упор делался на сокращение количества ДНК. Если сократить количество ДНК

ниже определяемого уровня было невозможно, особые усилия прикладывались к

уменьшению ее размера или к инактивации рекомбинантных ДНК и РНК другими

способами (например, инактивация вакцины от бешенства бета-пропиолактоном).

Производители, рассматривающие возможность использования в производстве

непрерывных клеточных линий, должны быть в курсе необходимости разработки, оценки

и валидации эффективных методов очистки, которые являются существенным элементом

программы разработки любого препарата. Однако могут быть одобрены и подвергшиеся

минимальной степени очистки препараты, такие как определенные вирусные вакцины

(например, от полиомиелита), если они производятся на основе таких непрерывных

линий, как линия Vero и сопровождаются комплектом подтверждающих безопасность

данных. Такие данные должны включать подробную характеристику главного или

рабочего банков клеток и самого продукта.

Поскольку испытания на туморогенность – часть определения характеристик

непрерывных клеточных линий, они представляют собой только одно из испытаний,

результаты которых следует принимать во внимание при оценке безопасности

биологического препарата, произведенного в данном клеточном субстрате. Например,

если какая-либо непрерывная клеточная линия имеет положительный результат в

испытании на туморогенность, и если ее планируется использовать для производства

живой вирусной вакцины, национальный регуляторный орган/национальная контрольная

лаборатория может потребовать провести оценку онкогенного потенциала клеток, чтобы

охарактеризовать их ДНК и обнаружить онкогенные вирусы, которые могут в них

присутствовать. Такие исследования следует согласовать с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией.

Следует предоставить свидетельства, демонстрирующие, в пределах

диагностических возможностей анализа, что любая непрерывная линия клеток животных,

которую предлагается использовать в качестве субстрата для производства

биологического препарата, не содержит (легко) культивируемых бактерий, микоплазм,

грибков и вирусов-возбудителей инфекции, и в том числе потенциально онкогенных

веществ. Особое внимание следует уделять вирусам, которые обычно заражают те виды

животных, клетки которых используются для создания клеточной линии, а также

реактивам биологического происхождения, предназначенным для работы с культурами

клеток. Предпочтительно, чтобы посевной фонд клеток не содержал микробных агентов.

Однако определенные непрерывные клеточные линии могут экспрессировать эндогенные

ретровирусы. Испытания, способные обнаружить такие агенты, следует проводить на

клетках, выращенных при таких же условиях культивирования, какие будут

использоваться в процессе производства, и следует провести количественное определение

уровня содержания вирусных частиц. Следует наглядно показать, что вирусные

контаминанты в главном и рабочем банках клеток инактивированы и/или удалены в

результате используемой процедуры очистки. Валидация процедуры очистки считается

очень важной.

Определение характеристик любой линии диплоидных клеток, линии стволовых

клеток или непрерывной клеточной линии, предназначенной для использования в

производстве, должно включать следующее:

■ историю клеточной линии (т.е. ее происхождение) и детальное описание

производства банков клеток, включая указание используемых во время

культивирования методов и реактивов, уровня удвоения популяции, условий

хранения, жизнеспособности после размораживания и характеристик роста;

■ результаты испытаний на возбудители инфекционных заболеваний;

■ описание отличительных свойств клеток, таких как биохимическая,

иммунологическая, генетическая или цитогенетическая структура, которые

позволяют отличить их от линий других клеток;

■ результаты испытаний на туморогенность, включая данные из научной

литературы.

Дополнительное внимание следует уделять препаратам, полученным из клеток,

которые содержат известные генетические последовательности вирусов (например, клетки

Намальва, HeLa, 293 и PER.C6).

Рекомендации, которые даются далее, задуманы как руководство для

национальных регуляторных органов, национальных контрольных лабораторий и

производителей по минимальному комплекту данных о клеточном субстрате, который

должен быть доступен при рассмотрении нового подаваемого на регистрацию

биологического препарата. Объем данных, которые могут понадобиться на различных

стадиях клинической разработки препарата, следует оговаривать и согласовывать с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией на

каждом этапе программы.

B.2 Подлинность

Следует подтвердить подлинность банка клеток методом идентификации,

одобренным национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией. При наличии такой возможности, для проверки подлинности следует

использовать методы, специфичные для конкретной клеточной линии, чтобы подтвердить

отсутствие переключения или кроссконтаминации культур, которые могли возникнуть в

ходе создания банка клеток и производства. Ряд повсеместно используемых методов

идентификации сравниваются в таблице A3.3. В случае работы с клетками человека,

генетические тесты, такие как профилирование ДНК (например, анализ коротких

тандемных повторов и множественных однонуклеотидных полиморфизмов), позволяют

создать профиль, характерный по крайней мере для того человека, от которого были

получены клетки. Еще один тест, который может проводиться для клеток человека, это

HLA-типирование. Среди других анализов, которые могут быть проведены, но, как

правило, дают менее точные результаты, можно перечислить изоферментный анализ и

кариологию, которые могут быть особенно удобны, когда есть характерные маркерные

хромосомы. Если есть более специфические генетические маркеры, следует принять эти

методы на вооружение. Малая часть клеточных линий, прежде всего трансформированные

клетки, могут показывать измененный профиль идентичности. Это наблюдается в ходе

изоферментного анализа, когда отдельная клеточная линия в редких случаях может

демонстрировать профиль, неизменно отличающийся от ожидаемого для того вида, от

которого она происходит; это также общая проблема действия генетической

нестабильности на методики молекулярной идентификации. При применении

стандартных методик такое случается редко, но подобное может произойти при

применении новых способов проведения испытаний. Возможные последствия любых

неожиданных результатов следует обсудить с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Идентификация клеточных линий для

препаратов на основе рекомбинантных белков должна включать, помимо прочих, тесты на

целостность вектора, число копий экспрессирующей плазмиды, вставки, делеции,

количество сайтов интеграции, процент клеток-хозяев, сохранивших систему экспрессии,

подтверждение кодирующих белок последовательностей, и уровня производства белка.

Таблица A3.3

Определение идентификационных характеристик линий клеток млекопитающих

Технология

Преимущества

Недостатки

Кариология (особенно

удобна для линий

диплоидных и стволовых

клеток)

Дает возможность

визуализировать и

проанализировать геном

хромосомы целиком,

чтобы определить вид

животного, от которого

происходят клетки, и

может применяться для

Результаты обычно не

специфичны для

отдельного представителя

вида (т.е. они

видоспецифичны), хотя

определенные клеточные

линии могут содержать

маркерные хромосомы,

большого количества

животных видов при

использовании одной и

той же методологии.

которые легко

распознаются.

Кариология (особенно

удобна для линий

диплоидных и стволовых

клеток)

Более новые методы

подразумевают

проведение спектрального

кариотипирования с

помощью зондов,

помеченных

флуоресцентными

красителями. Зонды

окрашивают хромосомы,

придавая разные цвета

определенным участкам.

С помощью

спектрального

кариотипирования можно

обнаружить

транслокации, которые не

распознаются

традиционным

дифференциальным

окрашиванием хромосом.

Окрашивание по Гимза

требует специальных

знаний и большого труда.

Стандартный анализ 10-20

метафазных пластинок

недостаточно

чувствителен для

обнаружения

контаминирующих

клеток.

Изоферментный анализ

Позволяет в течение

нескольких часов

определить вид донора.

Анализ на 4-6 видов

активности изофермента в

большинстве случаев

позволит определить вид

донора, но не специфичен

для конкретного

представителя вида.

Профилирование ДНК с

использованием анализа

варьирующегося числа

тандемных повторов

(VNTR) или другого

метода ПЦР, такого как

ПЦР с использованием

праймеров к экзону и

прилежащему к нему

интрону (EPIC-PCR), или

анализ полиморфизма

длины рестрикционных

фрагментов (RFLP).

Анализ коротких

тандемных повторов

(STR) с помощью ПЦР

быстро проводится и

определяет

идентификационные

характеристики,

специфичные для

отдельного представителя

вида.

Доступны коммерческие

наборы для ряда

человеческих популяций.

Существует некоторая

ограниченная, но

неопределенная

перекрестная реакция

праймеров короткого

тандемного повтора

человека на клетки

приматов.

Анализ методом EPIC-

PCR быстро проводится и

определяет

идентификационные

характеристики,

специфичные для

отдельного представителя

вида. Это обеспечивает

преимущество охвата

широкого спектра

организмов и линий

клеток, отличных от

человеческих.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и каждый из рабочих банков

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.3 Стабильность

Стабильность банков клеток во время криохранения и генетическая стабильность

клеточных линий и систем экспрессии рекомбинантных генов – ключевые элементы

успешной программы по созданию банка клеток.

B.3.1 Стабильность при низкотемпературном хранении

Следует собирать данные для обоснования стабильности или пригодности

клеточного субстрата или какой-либо системы экспрессии рекомбинантных генов или

необходимого фенотипа клеток в ходе культивирования до момента производства или

после него и для подтверждения стабильности банков криосохраненных клеток во время

хранения. Стабильность банков при хранении может подтверждаться успешным

созданием рабочего банка клеток или удачным выпуском производственных партий

препарата. В периодическом тестировании на жизнеспособность нет необходимости, если

в журнале непрерывного мониторинга нет никаких отклонений от спецификаций, и

регулярные производственные циклы проходят успешно. Если банки используются реже,

чем раз в 5 лет, может быть целесообразным собирать данные для подтверждения их

соответствия для производства каждые 5 лет по графику, принимающему во внимание

условия хранения.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и рабочий банк клеток

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.3.2 Генетическая стабильность

Теоретически, генетическая нестабильность в любой форме может негативно

сказаться на качестве готового препарата, и важно знать, как изменяются клетки, и может

ли это негативно отразиться на природе или безопасности препарата. Любые способные

повлиять на качество препарата свойства клеточных линий, следует обсуждать с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией, чтобы

гарантировать, что испытания на генетическую стабильность, которые проводятся

производителем, соответствуют всем применимым требованиям. На практике испытания

будут различаться в зависимости от природы препарата. Цель их проведения состоит в

том, чтобы продемонстрировать неизменность количества и характеристик продукта,

получаемого из клеток главного или рабочего банка клеток в пределах определенного

числа пассажей, по сравнению с клетками из расширенного банка (ECB) или клетками,

получаемыми в конце производственного цикла (EOPC). Для препаратов на основе

рекомбинантных белков особое внимание следует уделять кодирующей белок

последовательности и посттрансляционным модификациям.

Следует сравнивать стабильность ДНК-экспрессирующих конструктов в

главном/рабочем банке клеток и в расширенном банке клеток или клетках, получаемых в

конце производственного цикла. Также следует определять количество копий конструкта

и, если требуется, места вставки хромосом. Последнее выполняется секвенированием

фланкирующих областей клетки, но такие методы как флуоресцентная гибридизация in

situ могут предоставить дополнительную информацию, в частности о расположении

конкатемеров генных вставок в отдельных локусах хромосом. Следует определять

последовательность конструкта внутри клеток. При традиционном секвенировании ДНК

определяется типичная последовательность нуклеотидов, а при массивном параллельном

секвенировании можно определить последовательность вставок отдельных генов или их

транскриптов.

Если белки получают из клеток, которые не были генетически модифицированы,

следует оценивать постоянство количества и характеристик белка, а также

последовательность информационной РНК (иРНК), кодирующей исследуемый белок.

Дополнительное определение характеристик биологических процессов и ответов

клеток во время культивирования (например, с помощью экспрессии универсальных или

целевых генов, определения протеомического или метаболического профиля и других

фенотипических маркеров) может оказаться полезным в дальнейшем развитии широкого

понимания клеточного субстрата.

На случай, если на каком-либо из перечисленных этапов жизнеспособность клеток

серьезно понизится, следует применять соответствующие методы, чтобы гарантировать,

что возраст клеток оценен правильно. Потери жизнеспособности отражаются в

увеличении периодов культивирования до достижения определенных уровней роста.

Также может понадобиться оценка стабильности функционирования клетки в

плане продуктивности в течение процесса производства. Другие исследования

стабильности можно провести, если используются методы размножения в биореакторе,

особенно если это предполагает продленные периоды культивирования.

Область применения

■ Банки клеток: Главный банк клеток, в котором клетки находятся на этапе,

характерном для конца производственного цикла, или расширенного банка клеток

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.4 Стерильность

(см. раздел B.11.3.1)

B.5 Жизнеспособность

Высокий уровень жизнеспособности криосохраненных клеток важен для

обеспечения эффективности и надежности производства. Уровень жизнеспособности

размороженных клеток обычно превышает 80%, хотя такой жизнеспособности не всегда

удается достичь, и она может варьироваться в зависимости от линии клеток. Адекватное

восстановление роста и допустимое качество препарата могут быть достигнуты и при

более низких уровнях жизнеспособности. В таком случае данные следует обсудить с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией. Для

измерения различных характерных признаков функционирования клетки (например,

целостности мембраны, активности обмена веществ, репликации ДНК) доступен ряд

испытаний на жизнеспособность. При определенных условиях, например, когда

предапоптозное состояние клетки исключает использование трипанового синего, анализы

жизнеспособности могут давать недостоверные результаты, и важно понимать, какую

именно информацию дает определенный анализ жизнеспособности. Таким образом, важно

оценить восстановление роста прошедших криосохранение клеток после разморозки.

Если для определенных типов культур клеток, таких как гибридомы, используется тест на

целостность мембраны, то следует изучать дополнительные клеточные маркеры, такие как

индикаторы апоптоза, чтобы избежать значительной переоценки жизнеспособности.

Следует подобрать подходящий тест на жизнеспособность для рассматриваемого

клеточного субстрата и установить среднестатистические экспериментальные значения

для культур, которые сочтены приемлемыми (см. разделы B.6 и B.7). Также может быть

необходимо подобрать альтернативные анализы жизнеспособности, которые лучше

подходят для получения данных о жизнеспособности клеток в процессе изготовления

препарата (например, уровни лактатдегидрогеназы в системах биореакторов).

Область применения

■ Банки клеток: Главный и рабочий банки клеток

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.6 Характеристики роста

Чтобы гарантировать постоянство процесса производства, при его разработке

следует получить глубокое понимание особенностей роста линии клеток, используемой в

производстве. Изменение этих особенностей может указывать на любое явление из

широкого ряда возможных причин. Соответственно, следует собрать данные о

характеристиках роста, таких как жизнеспособность, морфология, время удвоения

популяции, эффективность клонирования и/или посева. Для определенных клеточных

субстратов испытания характеристик роста могут быть необходимы в ходе проверки

гомогенности (см. раздел B.7). Эксперименты для подтверждения гомогенности и

демонстрации характеристик роста могут проводиться вместе, однако анализ результатов

следует проводить по отдельности.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и рабочий банки клеток

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.7 Гомогенность

Каждая культура клеток, полученная из контейнера рабочего банка клеток, должна

иметь такое же качество (в установленных пределах) и производить такое же количество

жизнеспособных клеток с теми же характеристиками роста, как и остальные. Чтобы

гарантировать это, необходимо восстановить содержимое части контейнеров из каждого

банка клеток и проверить его характеристики, как указано в разделе B.6. Количество

контейнеров для тестирования следует обсудить с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Это количество должно примерно

соответствовать тому, что обычно используется для установления постоянства

характеристик продукции. Следует продемонстрировать восстановление содержимого

достаточной части пробирок, представляющих начало, середину и конец процесса

аликвотирования, чтобы удостовериться в успешности процесса производства,

основанного на использовании банка клеток. И наконец, стабильность и единообразие

содержимого пробирок, прошедших криосохранение, демонстрируются, когда пробирки

размораживаются для использования в производстве и используются для получения

целевого продукта в необходимом количестве. Вместо того чтобы тестировать часть

контейнеров на разных этапах процесса создания банка, можно использовать

альтернативную стратегию обеспечения гомогенности банков, основанную на валидации

методов заполнения и заморозки пробирок. Несмотря на то, что эксперименты для оценки

характеристик роста (см. раздел B.6) и испытания на гомогенность обычно проводят

вместе, анализ и интерпретацию каждого из них следует выполнять отдельно. Также

может быть целесообразным протестировать главный банк клеток на гомогенность, чтобы

убедиться, что характеристики будущих рабочих банков клеток соответствуют первому

рабочему банку клеток.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и рабочий банки клеток

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.8 Туморогенность

B.8.1 Общие положения

В качестве альтернативы испытаниям на туморогенность in vivo было изучено

несколько систем тестирования in vitro, таких как выращивание клеток в мягком агаре 63

и органной культуре мышц 64. Однако корреляция с тестами in vivo была неполной или

альтернативные испытания были технически сложными. Таким образом, тесты in vivo

остаются стандартом для оценки туморогенности.

Хотя в требованиях ВОЗ 1 описаны допустимые подходы к испытаниям на

туморогенность, ряд важных аспектов испытаний обойден стороной. Поэтому был

разработан типовой протокол, который приложен к данному документу (см. Приложение

2). Основные пункты, вошедшие в этот типовой протокол, перечислены ниже вместе с

комментариями к каждому из них.

Следует проводить тестирование новой линии диплоидных клеток (т.е., за

исключением клеток WI-38, MRC-5 и FRhL-2) на туморогенность в рамках определения

характеристик линии клеток, но не следует требовать проведения этих испытаний на

повседневной основе.

Доступные на настоящий момент испытания на туморогенность проводят на

млекопитающих тех видов, температура тела и другие физиологические параметры

которых отличаются от аналогичных характеристик видов птиц и насекомых. Поэтому,

когда тестирование проводится для клеток птиц или насекомых, достоверность данных,

полученных в таких испытаниях, вызывает сомнения, если только туморогенная

клеточная линия исследуемого вида не используется как положительный контроль.

Национальный регуляторный орган/национальная контрольная лаборатория могут

принять результаты теста in vitro, такого как выращивание в мягком агаре, в качестве

замены теста in vivo для клеток птиц и насекомых. Однако как указывалось выше,

корреляция тестов in vitro и in vivo неполная. Это следует обсудить с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

Многие непрерывные линии клеток (например, BHK-21, CHO, HeLa)

классифицируются как туморогенные, так как обладают способностью формировать

опухоли у животных с подавленным иммунитетом, например, у грызунов. Некоторые

непрерывные линии клеток (например, линия Vero) становятся туморогенными после

большого количества удвоений популяции, однако не обладают способностью вызывать

опухоли на более ранних уровнях удвоения популяции, когда происходит производство

вакцин. Наиболее опасной чертой, относящейся к плюрипотентности линий

эмбриональных стволовых клеток, хотя они и проявляют диплоидный кариотип, является

формирование опухолей у мышей с ослабленным иммунитетом.

Проявление туморогенного фенотипа может варьироваться от одной непрерывной

линии клеток к другой, и даже между разными сублиниями одной и той же непрерывной

линии клеток. Некоторые специалисты рассматривают такой масштаб изменчивости – от

отсутствия до низкой и высокой туморогенности – как указывающий на разные степени

риска при использовании непрерывных клеточных линий в качестве субстрата для

производства биологических препаратов 10, 11.

Если уже доказана туморогенность непрерывной линии клеток (например, BHK-21,

CHO, HEK293, Cl27) или такая клеточная линия относится к туморогенному классу

(например, гибридомы, линии стволовых клеток), могут не понадобиться дополнительные

испытания клеток, используемых для производства терапевтических препаратов. Такие

линии клеток могут использоваться в качестве субстрата для производства биопрепаратов,

если национальный регуляторный орган/национальная контрольная лаборатория

определит, основываясь на данных характеризации и производства, что вопросы чистоты,

безопасности и постоянства характеристик уже рассматривались. Следует считать любую

новую линию клеток (линию диплоидных клеток, стволовых клеток или непрерывную

линию клеток) туморогенной, если данные не доказывают обратного. Если производитель

предлагает охарактеризовать линию клеток как нетуморогенную, то это должно

подкрепляться описанным далее тестированием.

Клетки из главного или рабочего банков, размноженные in vitro до

предполагаемого возраста, необходимого для производства препарата, или до более

позднего срока жизни клеток, следует испытывать на туморогенность с помощью теста,

одобренного национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией. Этот тест должен включать сравнение между линией клеток и подходящим

для положительного контроля препаратом сравнения (например, клетки HeLa) и

стандартизированную процедуру оценки результатов.

B.8.2 Типы животных, используемых в испытаниях

Для оценки туморогенного потенциала клеточных линий используется ряд

различных животных систем. В Таблице A3.4 перечислено несколько примеров таких

систем, а также преимущества и недостатки каждой из них. Поскольку для оценки

туморогенного фенотипа клеточного субстрата требуется инокуляция ксеногенных или

аллогенных клеток, следует добиться недостаточной активности цитотоксических Т-

лимфоцитов у подопытных животных, либо используя грызунов с генетически

ослабленным иммунитетом (например, голые мыши, мыши с тяжелым комбинированным

иммунодефицитом (ТКИД)), либо инактивируя функцию Т-клеток антитимоцитарным

глобулином (АТГ), антитимоцитарной сывороткой (АТС) или антилимфоцитарной

сывороткой (АЛС). Использование для оценки клеточных субстратов животных с

дополнительными нарушениями функции натуральных киллеров (NK-клеток), таких как

не страдающих ожирением мышей с диабетом и ТКИД, не страдающих ожирением

мышей с диабетом, ТКИД и полностью выключенным геном, кодирующим гамма-цепи

(NSG) и мышей с дефектом CD3e, еще не было изучено, но может дать некоторые

преимущества. В дополнение к вышеперечисленным системам в прошлом использовались

несколько других систем in vivo, таких как модель защечного мешка хомяка (HCP) и

подвергнутые воздействию АТГ низшие приматы, но сейчас они редко используются.

Таблица A3.4

Тесты in vivo для оценки онкогенного потенциала инокулированных клеток

Тест и его краткое

описание

Преимущество(а)

Недостаток(и)

Ссылки

Взрослая

бестимусная мышь

(генотип Nu/Nu):

исследуемые клетки

инокулируют

животным подкожно

или внутримышечно.

 Животные

легкодоступны

 Не требуется

подавлять иммунитет

 Частота спонтанного

опухолеобразования выше,

чем у других животных

моделей, иммунитет которых

не подавлен

 Низкая

чувствительность для оценки

метастатического

потенциала привитых клеток

65

Новорожденная

бестимусная мышь

(генотип Nu/Nu):

животным подкожно

инокулируют

исследуемые клетки.

 Не требуется

подавлять иммунитет

 Более

чувствительны, чем

взрослые особи

 Низкая

чувствительность для оценки

метастатического

потенциала привитых клеток

 Поскольку пометы

включают и гетерозиготных

мышей, нужно прививать

клетки в два раза большему

количеству особей, чтобы

удостовериться, что

достаточное количество

гомозиготных мышей попало

в выборку

 Матери поедают

новорожденных

66

Мыши с ТКИД:

животным под кожу,

в кожу или в почку

 Не требуется

подавлять иммунитет

 Возможно

 Животные очень

подвержены вирусным,

бактериальным и грибковым

66, 67

вводится капсула с

исследуемыми

клетками

повышенная

чувствительность

 Животные

легкодоступны

инфекциям

 Инфекции могут

негативно сказаться на

результатах и

воспроизводимости

исследований

 Может спонтанно

возникать Т-клеточная

лимфома

Новорожденные

крысы: иммунитет

животных

подавляется АТГ, а

затем в мышечную

ткань или под кожу

вводятся исследуемые

клетки

 Животные

легкодоступны

 Чувствительная

модель для обнаружения

метастазов

 Очень редко

опухоли формируются

спонтанно

 Стандартизированный

АТГ не доступен из-за

ограниченного масштаба

производства

 Для того чтобы найти

золотую середину между

подавлением иммунитета и

токсичностью, требуется

тщательно устанавливать

пригодность АТГ и

определять его

характеристики

65, 68

Новорожденные

хомяки или мыши:

иммунитет животных

подавляется АТС, а

затем в мышечную

ткань или под кожу

вводятся исследуемые

клетки

 Животные

легкодоступны

 Матери поедают

новорожденных

 Недоступна

стандартизированная АТС, и

сложно сбалансировать

токсичность и степень

подавления иммунитета

69

Новорожденные

хомяки или мыши:

иммунитет животных

подавляется АЛС, а

затем в мышечную

ткань или под кожу

вводятся исследуемые

клетки

 Высокая

чувствительность по

сравнению с тестом с

использованием

защечного мешка хомяка

 Животные

легкодоступны

 Матери поедают

новорожденных

 Недоступна

стандартизированная АЛС, и

сложно сбалансировать

токсичность и степень

подавления иммунитета

70

Защечный мешок

хомяка: иммунитет

животных подавляют

кортизоном, а затем

вводят исследуемые

клетки в защечный

мешок

 Животные

легкодоступны

 Чувствительность

ниже, чем у новых моделей

71

Низшие приматы:

иммунитет животных

 Животные ближе

к человеку

 Стандартизированный

АТГ не доступен

72

подавляют АТГ, а

затем вводят

исследуемые клетки в

мышцы четырех

конечностей

 Животные

труднодоступны

 Высокая цена и

ограниченная доступность не

дает использовать большое

количество животных

 Принципы защиты

прав животных запрещают

использовать низших

приматов, если те же

результаты могут быть

получены с использованием

более простых видов

животных

Несмотря на то, что перечисленные в Таблице A3.4 животные модели, уже

используются для оценки туморогенности клеток, при попытке сравнить различные

модели оценки туморогенности in vivo следует учесть несколько параметров

чувствительности исследований с использованием клеток положительного контроля.

Параметры следующие:

(I) частота образования опухолей;

(II) время до возникновения опухолей;

(III) размер опухолей;

(IV) наименьшее количество инокулированных клеток, которое вызывает

образование опухоли;

(V) развитие метастатической опухоли.

Факторы (I), (II), (III) и (V) обычно зависят от количества введенных клеток (т.е.

они дозозависимы). Также следует учитывать скорость спонтанного образования опухоли.

Хотя о сравнении двух и более анализов сообщалось в литературе 68, 73, 74, в этих

исследованиях не принимались во внимание указанные выше факторы и, кроме того,

использовались разные туморогенные линии клеток. Поэтому невозможно сделать

определенных выводов о сравнительной чувствительности различных способов оценки

онкогенности. Тем не менее, следующее представляется общепризнанным:

■ новорожденные крысы, получавшие АТС, и системы не на основе низших

приматов, получавшие АТГ, наиболее чувствительны для оценки метастатического

потенциала инокулированных клеток;

■ АТС и АТГ подавляют иммунитет лучше, чем АЛС;

■ в отличие от моделей, которые зависят от АЛС, АТС или АТГ, у голых

мышей лучше определяется уровень подавленности иммунитета. При

использовании таких мышей больше вероятность сделать правильные выводы при

сравнении данных, полученных в разных лабораториях с использованием

бестимусных мышей.

Суммарный опыт, полученный на протяжении последних 30 лет и учитывающий

все вышесказанное, приводит к заключению, что бестимусные голые мыши являются

оптимальной системой для проведения испытаний на туморогенный потенциал клеток,

которые предлагается использовать для производства биологических препаратов.

Основные преимущества систем на бестимусных голых мышах заключаются в том, что

такие системы проще утвердить и стандартизировать, и они, как правило, доступны, а

системы на новорожденных крысах более чувствительны для оценки метастатического

потенциала туморогенных клеток. В некоторых случаях может быть предпочтительно

использовать новорожденных бестимусных голых мышей, так как они более

чувствительны для обнаружения слаботуморогенных клеток, чем взрослые животные 66.

Протокол испытаний на туморогенность с использованием бестимусных голых мышей

представлен в Приложении 2. Выбранная животная система должна быть одобрена

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

B.8.3 Этап жизненного цикла клеток, подходящий для их тестирования

Исследование туморогенности должно быть частью предварительной оценки

клеточного субстрата, предназначенного для использования в производстве. Клетки

главного или рабочего банка, размножаемые in vitro до предполагаемого возраста,

необходимого для производства препарата, или в течение более длительного срока,

следует проверять на туморогенность. Проведение дополнительных удвоений популяции

(например, 3-10) гарантирует, что результаты испытаний на туморогенность могут

использоваться в оценке общей безопасности препарата, даже для ситуации наихудшего

случая. Таким образом, создается резерв безопасности.

B.8.4 Использование контрольных клеток

Испытания на туморогенность должны включать сопоставление непрерывной

линии клеток и препарата сравнения (положительного контроля), например, клеток HeLa

из надежного источника. Такой источник предпочтителен, чтобы стандартизировать

испытания в нескольких лабораториях, так чтобы накопленный со временем опыт можно

было оценить и предоставить национальным регуляторным органам/национальным

контрольным лабораториям и производителям, чтобы помочь им в интерпретации данных.

Однако и другие источники клеток для положительного контроля могут быть

приемлемыми. Цель положительного контроля – убедиться, что результаты отдельного

испытания достоверны, продемонстрировав, что животная модель обладает возможностью

развивать опухоли из инокулированных клеток (т.е., отрицательный результат вряд ли

получен из-за проблем с моделью in vivo). Если клетки положительного контроля не

вызывают развития опухолей с ожидаемой частотой, то это может указывать на проблемы

с животными (например, инфекции) или с испытательной лабораторией, которые могут

мешать развитию опухолей.

Когда клеточный субстрат адаптирован к росту в питательной среде без сыворотки,

которая может содержать факторы роста и другие компоненты, способные повлиять на

развитие и обнаружение туморогенного фенотипа, следует рассмотреть возможность

обработки клеток положительного контроля в той же самой среде. По возможности и

опытный образец, и клетки положительного контроля следует ресуспендировать в одной и

той же среде для инокуляции, такой как фосфатно-солевой буферный раствор.

При разработке протокола испытаний на туморогенность важно учитывать, что

опухоли возникают у голых мышей спонтанно, и частота образования таких опухолей

растет с возрастом мыши. Поэтому во время оценки результатов испытаний на

туморогенность следует принимать во внимание информацию из баз данных (как

опубликованные, так и неопубликованные записи/данные лаборатории, занимающейся

разведением экспериментальных животных, из которой были получены подопытные

животные) о частотности спонтанного возникновения новообразований у голых мышей.

Как правило, использовать отрицательный контроль не рекомендуется, потому что у

голых мышей достаточно редко самопроизвольно развиваются новообразования, а малые

количества животных для отрицательного контроля вряд ли позволят получить

статистически значимые данные. Если все же используются клетки отрицательного

контроля, такие как WI-38, MRC-5 или FRhl-2, следует представить подробное

обоснование их включения. Например, если для выращивания клеточного субстрата

используется бессывороточная среда, подразумевается, что факторы роста могут повлиять

на спонтанное появление опухолей, следовательно, может понадобиться суспендировать

клетки отрицательного контроля в той же среде, чтобы интерпретировать результаты

испытаний.

B.8.5 Количество подопытных животных

Для того чтобы определить, могут ли характеризуемые клетки образовывать

опухоли у животных, следует вводить их, а также, для сравнения, клетки положительного

контроля и клетки отрицательного контроля, если последние используются, отдельным

группам животных по 10 особей в каждой. В испытании с достоверным результатом

прогрессирующие опухоли должны образовываться по крайней мере у 9 из 10 животных,

которым для сравнения ввели клетки положительного контроля.

B.8.6 Количество клеток для инокуляции

Каждому животному в мышцу или под кожу 75 следует вводить минимум 10

жизнеспособных клеток. Если в конце периода наблюдения нет признаков образования

прогрессирующих узелков, линию клеток можно счесть нетуморогенной. Если же

обнаружено, что клеточная линия туморогенна, то национальный регуляторный

орган/национальная контрольная лаборатория может потребовать проведения

дополнительных исследований для определения уровня туморогенности. Это может быть

сделано с помощью исследования зависимости «доза-ответ», в ходе которого

жизнеспособные клетки вводятся в количествах 10

, 10

и 10

. Полученные данные

можно представить в виде дозы, вызывающей возникновение опухоли в 50% случаев

(TPD50 value) 76.

B.8.7 Период наблюдения

Животных следует проверять на признаки образования узелков в месте инъекции

еженедельно путем осмотра и пальпации. Минимальный срок наблюдения зависит от

выбранной системы тестирования. Если это голая мышь, то рекомендуется наблюдать за

животным в течение минимум 4 месяцев. Для получавших АТС новорожденных крыс

рекомендован более короткий период наблюдения, так как подавляющее иммунитет

действие АТС слабеет после последней инъекции сыворотки на 2 неделе.

B.8.8 Оценка места инокуляции с течением времени (рост или уменьшение

опухоли)

Если появились узелки, их измеряют в двух противоположных проекциях и

еженедельно записывают измерения, чтобы определить, растет узелок, остается таким же

или уменьшается с течением времени. Животных, у которых образовались растущие

узелки, следует умертвить до завершения исследования, если опухоли достигнут

предельного размера, установленного соответствующими регуляторными органами по

гуманному обращению с животными. Животных, узелки у которых уменьшаются, не

следует умерщвлять до конца периода наблюдения. Линии клеток, которые вызывают

образование узелков, чей размер не прогрессирует, не считаются туморогенными. Если

узелок не исчезает на протяжении периода наблюдения и сохраняет гистопатологические

характеристики опухоли, то требуется дальнейшее изучение и консультация с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

B.8.9 Окончательная оценка места инокуляции

В конце периода наблюдения всех животных, включая группу(ы) сравнения,

умерщвляют и исследуют на крупные и микроскопические свидетельства роста

инокулированных клеток в месте инъекции или других местах.

B.8.10 Обследование животных на метастазы

Животных обследуют на микроскопические свидетельства метастатических

поражений в таких местах как печень, сердце, легкие, селезенка и регионарные

лимфатические узлы.

B.8.11 Оценка метастазов (если они есть)

Любые метастатические поражения исследуются более подробно, чтобы

установить их отношение к первичной опухоли в месте инъекции. Если то, что кажется

метастатической опухолью, отличается от первичной опухоли по гистопатологическим

характеристикам, необходимо рассмотреть возможность, что эта опухоль либо развилась

самостоятельно, либо была вызвана одним или несколькими компонентами клеточного

субстрата, такими как онкогенные вирусы. Для этого могут потребоваться более

подробные исследования данной опухоли или повторные анализы на туморогенность. В

таком случае соответствующие дальнейшие исследования следует обсудить и согласовать

с национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией (см.

также раздел B.9, «Онкогенность»).

B.8.12 Интерпретация результатов

Непрерывная клеточная линия считается туморогенной, если по крайней мере у 2

животных из 10 в течение периода наблюдения разовьются опухоли в месте инокуляции.

Однако при оценке результатов следует принимать во внимание зарегистрированную

частоту возникновения спонтанных новообразований у подопытных животных. Также

гистопатология опухолей должна соответствовать инокулированным клеткам, а

генотипический маркер должен указывать, что происхождение опухоли не связано с

клетками самой голой мыши.

Если только у одного из 10 животных возникнет опухоль, целесообразно провести

дальнейшее исследование, чтобы определить, например, образовалась ли она из-за

инокулированного клеточного субстрата или из-за особенностей самого животного, и

содержит ли она последовательности ДНК какого-либо вируса или инокулированных

клеток. Следует обсудить это с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией.

Зависимость «доза-ответ» для непрерывной линии клеток можно изучить с

помощью титрации инокулята при определении характеристик непрерывной линии

клеток. Необходимость таких данных будет зависеть от многих факторов, специфичных

для конкретной непрерывной линии клеток и разрабатываемого препарата. Следует

обсудить это с национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией.

Область применения

■ Банки клеток: репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного

цикла, или расширенный банк клеток, которые получают на основе главного или первого

рабочего банка клеток

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.9 Онкогенность

B.9.1 Испытания на онкогенность

Туморогенность – это способность клеток вызывать образование опухолей после

инокуляции восприимчивым животным, а онкогенность – это свойство бесклеточного

агента вызывать перерождение клеток животного в клетки опухоли. Как таковые, опухоли

которые возникают в анализе туморогенности, содержат клетки, происходящие от

инокулированных клеток, тогда как опухоли, которые возникают в анализе на

онкогенность, происходят от клеток хозяина. Онкогенная активность клеточного

субстрата может быть вызвана либо ДНК клеток субстрата (и возможно других клеточных

компонентов) или онкогенным вирусом, присутствующим в клетках. Несмотря на то, что

может складываться впечатление, что ДНК клеток с высокой туморогенностью может

иметь бóльшую онкогенную активность, чем ДНК клеток с низкой туморогенностью или

нетуморогенных клеток, на данный момент неизвестно, есть ли связь между

туморогенностью клетки и онкогенностью ее ДНК. Тем не менее, национальный

регуляторный орган/национальная контрольная лаборатория может потребовать провести

испытания онкогенности ДНК и клеточного лизата из новой линии клеток (т.е., не CHO,

NS0, Sp2/0 и не раннего пассажа Vero, для которых уже имеется значительных опыт),

которая туморогенна в системах животных моделей (см. ниже), из-за предположения, что

вакцина, произведенная на основе такой линии клеток, представляет риск

новообразований у реципиентов вакцины.

Самые большие сложности при проведении анализа клеточной ДНК животных

связаны с размером генома млекопитающих. Поскольку гаплоидный геном

млекопитающих содержит приблизительно 3х10

пар оснований (п.о.), а размер типичного

онкогена может составлять 3–30х10

п.о., концентрация онкогена в клеточной системе

экспрессии ДНК была бы примерно в 10

–10

раз меньше, чем в плазмиде, содержащей

тот же онкоген. Как следствие, если 1 μг онкоген-экспрессирующей плазмиды вызывает

образование опухоли у экспериментальной животной модели, количество клеточной ДНК,

которая бы содержала схожее количество того же самого онкогена, составляет10

–10

μг

(т.е., 100 мг на 1 г). На сегодняшний день, три исследования показали, что от 1 до 10 μг

экспрессирующих клеточные онкогены плазмид могут быть онкогенными у мышей 34,

43, 44. Таким образом, до того как испытания онкогенной активности клеточной ДНК

станет возможно выполнять на практике, нужно еще разработать более чувствительные

анализы in vivo. Судя по недавно полученным результатам, чувствительность анализа

можно повысить на несколько порядков, если использовать определенные разновидности

мышей с ослабленным иммунитетом, которые подвержены образованию опухолей после

инокуляции онкогенов. Таким образом, можно будет оценить онкогенную активность

клеточной ДНК в будущем. Тем не менее, на настоящий момент не существует

стандартизированного испытания на онкогенность in vivo для клеточной ДНК. Несмотря

на это, пример протокола испытаний представлен в Приложении 3.

Для оценки онкогенности используется несколько систем in vitro, таких как

подсчет клеток NIH 3T3, прошедших злокачественное перерождение, с помощью одного

из видов анализа бляшкообразования с использованием флюоресцентно меченых антител

(FFA) после трансфекции онкогенной ДНК 77–79. Однако не ясно, как такие анализы

отражают онкогенную активность ДНК in vivo, поскольку они в основном обнаруживают

онкогенное действие активированных генов семейства ras, и поэтому неясно, как анализы

могут помочь в оценке риска, связанного с ДНК или клеточным лизатом из субстрата

клеток.

Благодаря накопленному опыту работы с линиями диплоидных клеток WI-38,

MRC-5 и FRhL-2, не требуется тестировать новые главные банки клеток этих линий на

онкогенность. Также тестирование может не требоваться для других линий диплоидных

клеток, в отношении которых был также накоплен существенный опыт. Следует

проконсультироваться по этому поводу с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Как утверждается в разделе B.8.1,

следует считать новую непрерывную линию клеток туморогенной, пока не будет доказано

обратное. Если производитель докажет, что новая непрерывная клеточная линия не

туморогенна, то национальный регуляторный орган/национальная контрольная

лаборатория могут не потребовать проведения испытаний ДНК и лизатов клеток на

онкогенность.

По мере целесообразности, ДНК и лизаты клеток, особенно те, которые

предназначены для производства вакцин, следует проверять на онкогенность с помощью

теста, одобренного национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией. Протокол испытаний на онкогенность представлен в Приложении 3.

Область применения

■ Банки клеток: главный банк клеток или первый рабочий банк клеток,

доведенный до репрезентативных клеток, получаемых в конце производственного цикла,

или расширенного банка клеток

■ Типы клеток: непрерывная клеточная линия, линия стволовых клеток

(рекомендуется, если в производстве вакцин используются клетки, способные вызывать

опухоли).

B.10 Цитогенетика

B.10.1 Определение характеристик

Определение характеристик хромосом и мониторинг были введены в 1960-х годах,

чтобы обеспечить безопасность и приемлемость линий диплоидных клеток человека в

качестве субстратов для производства вакцин. Линии диплоидных клеток человека

отличаются от непрерывных клеточных линий тем, что сохраняют характеристики

нормальных клеток, включая нормальный для человека диплоидный кариотип. С тех пор

было накоплено значительное количество данных, благодаря которым в настоящее время

допускается менее подробное исследование цитогенетических характеристик, поскольку

была подтверждена кариотипическая стабильность линий диплоидных клеток человека,

используемых в производстве вакцин 80. Таким образом, нет необходимости в

проведении кариологических исследований в качестве мер контроля качества для каждой

партии препарата, полученного из тщательно охарактеризованных и не

модифицированных линий диплоидных клеток человека (например, WI-38, MRC-5) и

FRhL-2.

Данные о цитогенетике могут быть полезны для определения характеристик

непрерывных клеточных линий, особенно когда идентифицирована(ы) маркерная(ые)

хромосома(ы). Такие данные могут помочь оценить генетическую стабильность линии

клеток по мере того, как она развивается от главного банка клеток к рабочему и, в итоге,

до культур клеток для производства (см. раздел B.3). Следующие рекомендации подходят

для определения характеристик банков линий диплоидных клеток и непрерывных

клеточных линий.

Повторное определение цитогенетических характеристик линий диплоидных

клеток (например, WI-38, MRC-5 и FRhL-2) потребуется, только если с того момента, как

эти данные уже были получены, клетки будут генетически модифицированы, или

значительно изменятся условия их культивирования 19–21. Однако для каждого

создаваемого рабочего банка клеток производитель должен один раз подтвердить, что

клетки, выращиваемые для использования в производстве, являются диплоидными и

имеют ожидаемый срок жизни.

Для определения основных свойств новой или ранее уже охарактеризованной

линии диплоидных клеток следует проверить образцы из главного банка клеток примерно

на четырех разных этапах, между которыми проходят равные промежутки времени, в

течение серийного культивирования in vitro от главного банка клеток до предполагаемого

для производства возраста клеток или более длительного периода времени. Интервалы

между этими испытаниями должны быть согласованы с национальным регуляторным

органом. Каждый из образцов должен состоять минимум из 100 клеток в метафазе и

должен быть исследован на точное количество хромосом, а также разрывы или другие

нарушения структуры.

Окрашивание по Гимза кариотипов дополнительных пяти клеток в метафазе из каждого из четырех

образцов может дать дополнительную полезную информацию. Минимальный допустимый уровень

разрешающей способности анализа бэндирования по Гимза для клеток человека должен составлять

400 единиц по номенклатуре ISCN 81.

Окрашенные микроскопические препараты, используемые для определения

характеристик хромосом клеток (т.е., линий диплоидных клеток и непрерывных

клеточных линий) или фотографии таковых должны находиться на постоянном хранении

как часть протокола на клеточную линию. Далее представлены рекомендации,

касающиеся линий стволовых клеток 57.

Область применения

■ Банки клеток: Главный банк клеток, расширенный банк или репрезентативные

клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия (в качестве теста на генетическую стабильность, если необходимо).

B.11 Микробные агенты

B.11.1 Общие положения

Субстраты клеток человека или животных, необходимые для многих систем

производства биологических препаратов, подвержены контаминации чужеродными,

случайными или т.н. занесенными организмами, такими как микоплазмы и вирусные

агенты, которые могут размножаться в таких субстратах. Также в клетках животных

содержатся эндогенные агенты, такие как ретровирусы, которые также могут вызывать

опасения. Испытания и на эндогенные (например, ретровирусы) и на занесенные

(например, микоплазмы) агенты описываются в следующем разделе. Как правило,

клеточные субстраты, контаминированные микробными агентами, не подходят для

производства биологических препаратов. Однако есть исключения из этого общего

правила. Например, клетки CHO и линии клеток других грызунов, экспрессирующие

частицы эндогенных ретровирусов, используются для производства рекомбинантных

белков, проходящих высокую степень очистки. Следует учитывать соотношение риска и

пользы при определении пригодности клеточного субстрата для производства

конкретного препарата. В дополнение к этому, если возможно и целесообразно, следует

вводить в производство стратегию по снижению риска, включая очистку (удаление) и

инактивацию с помощью физических, ферментных и/или химических способов. Несмотря

на то, что может быть недопустимо использовать определенный клеточный субстрат для

производства некоторых препаратов, например, живых вирусных вакцин, которые не

проходят ни серьезной очистки, ни инактивации, этот же субстрат может подходить для

производства других типов препаратов, например, подвергающихся высокой степени

очистки рекомбинантных белков или моноклональных антител, снижение риска для

которых достигается серьезной и валидированной очисткой от вирусов в процессе

производства.

Следует разработать стратегию по испытанию банков клеток на микробные агенты.

Одна из возможных стратегий заключается в тщательном тестировании на уровне

рабочего банка клеток и менее серьезном тестировании рабочего банка клеток,

полученного из главного банка клеток. Испытания для этого более ограниченного

тестирования выбирают на основании того, какие агенты теоретически могли быть

занесены в процессе получения рабочего банка клеток из главного. На этом этапе не

нужно будет повторять испытания на те агенты, которые могли присутствовать до

получения рабочего банка клеток (например, какой-либо эндогенный ретровирус или

вирус диареи КРС, попавший из сыворотки, которая использовалась для получения

посевного фонда клеток или в ходе создания линии клеток).

Однако если количество пробирок главного банка клеток ограничено, в качестве

альтернативы можно проводить более полное тестирование первого из рабочих банков

клеток, созданного из этого главного банка, и тем самым ограничить испытания главного

банка. Преимущество стратегии более тщательного тестирования первого рабочего банка

клеток состоит в том, что она дает больше возможностей для амплификации агентов,

которые могли быть занесены до и во время производства рабочих банков клеток.

Поскольку у тщательного тестирования как главного, так и рабочего банка клеток есть как

преимущества, так и недостатки, следует обдумать, какая стратегия больше подходит для

конкретного(ых) продукта(ов), который(ые) планируется производить из данного банка

клеток. Перед осуществлением выбранной стратегии следует рассмотреть возможность

консультации с национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией, чтобы определить пригодность выбранной стратегии.

Клетки, получаемые в конце производственного цикла/при создании расширенного

банка, следует охарактеризовать один раз для каждого процесса коммерческого

производства препаратов. Тестирование расширенного банка клеток нужно для еще более

полного определения характеристик главного/рабочего банка клеток, который прошел

всестороннее тестирование. Тестирование расширенного банка клеток также дает

дополнительное время/количество пассажей для амплификации малоактивных вирусных

контаминантов или реактивации вирусов, которые могли быть упущены в испытаниях

предшествующего банка.

B.11.2 Вирусы

Проявления вирусных инфекций в культурах клеток очень различаются в

зависимости от потенциального контаминанта, который может принадлежать к широкому

ряду семейств вирусов, поэтому методы их обнаружения тоже различаются. Литические

инфекции часто обнаруживаются по цитопатическому эффекту, который они оказывают.

Однако в некоторых случаях, таких как заражение нецитопатическим вирусом диареи

крупного рогатого скота, цитопатического эффекта не наблюдается. Вирусы также могут

присутствовать в клетках в скрытой (например, герпесвирусы) или эндогенной форме (в

зародышевой клетке, например, ретровирусные провирусы). Для обнаружения таких

бессимптомных инфекций (inapparent infection) могут понадобиться особые методики,

такие как молекулярные и иммунологические методы и электронная микроскопия. Для

новых клеточных субстратов может понадобиться индукция поддающейся обнаружению

инфекции с помощью помещения клеток в особые условия (например, химическая

индукция, тепловой шок), и могут оказаться полезными особые методики обнаружения

инфекции, такие как секвенирование транскриптома или ПЦР с вырожденными

праймерами.

При разработке стратегии проверки клеточных субстратов на вирусы следует

принимать во внимание, какие семейства вирусов и специфические вирусы могут

присутствовать в клеточном субстрате. Также следует учесть вид живых организмов и

источник ткани, от которых берет начало клеточный субстрат, и анамнез первоначального

донора (если субстрат выведен из клеток человека) или патогенный статус донорских

животных (если субстрат выведен из клеток животных). Также следует обдумать, какие

вирусы могли бы попасть в клеточный субстрат от донора или из сырья животного или

человеческого происхождения, используемого в создании и истории пассирования

(наследии) субстрата до и в процессе создания банка клеток или производственного цикла

(например, сыворотка, трипсин, компоненты среды человеческого или животного

происхождения, антитела, используемые для селекции, или виды животных, с помощью

которых могли размножать клеточный субстрат). А также нужно учесть возможность

внутрилабораторной контаминации, связанной с сотрудниками или другими культурами

клеток.

Следует проводить испытания, чтобы обнаружить и по возможности

идентифицировать любые эндогенные или экзогенные агенты, которые могут

присутствовать в клетках. Следует уделять внимание испытаниям на агенты, которые

вызывают у клеток определенных видов бессимптомные, и поэтому сложно

распознаваемые, инфекции (например, вирус обезьян 40 (SV40) у макак-резусов).

Первичные клетки получают непосредственно из тканей здоровых животных, но

вероятность, что они содержат занесенные агенты выше, чем у клеток из банка с

полностью определенными характеристиками. Также следует учитывать сведения о

недавних прививках, сделанных животным-источникам клеток, так как они могли

получить живую вирусную вакцину. Риск использования первичных клеток может быть

снижен тщательной проверкой на пригодность животных-источников клеток и самих

первичных клеток. По мере целесообразности, для создания первичных культур следует

использовать животных из генетически замкнутых популяций, контролируемых на

предмет отсутствия патогенов, вызывающих особое беспокойство. Такие животные

заведомо свободны от патогенной микрофлоры (СПФ). Термин «замкнутая популяция»

описывает содержание группы животных (стаи, стада или колонии) без допуска новых

особей (нового генетического материала, с которым могли бы быть привнесены,

например, новые ретровирусы в провирусном состоянии). Многие живые вирусные

вакцины обычно производятся на основе первичных клеток и проходят незначительную

очистку в ходе производства. Для производства таких вакцин, и когда это целесообразно,

настоятельно рекомендуется использовать СПФ животных. Документы о статусе

животных-источников следует предоставить национальному регуляторному

органу/национальной контрольной лаборатории. Животных не из закрытых стай, стад или

колоний следует изолировать и тщательно следить за ними в течение периода,

достаточного для проявления заболевания или инфекции (например, обезьян обычно

помещают на карантин на шесть и более недель 82). Такие животные также должны

пройти серологический скрининг на соответствующие занесенные агенты, чтобы

определить их пригодность в качестве источника для субстрата первичных клеток. То, в

каких условиях содержались животные, следует документировать. И даже при

соблюдении всех этих мер нельзя исключить вирусной контаминации для всех культур.

Например, контаминация первичных клеток почки обезьяны вирусом пенистости обезьян

или обезьяньим цитомегаловирусом – обычное явление, если не предпринимается особых

координированных действий по предотвращению такой контаминации.

При производстве первичных культур клеток можно следовать принципам и

процедурам, изложенным в части С «Рекомендаций по производству и контролю

полиомиелитной вакцины (пероральной)» 82, и в разделе A.4 «Требований к вакцинам

против кори, эпидемического паротита и краснухи и комбинированным вакцинам

(живым)» 83.

Производство вирусных вакцин, например, против оспы и бешенства, изначально

требовало использования живых животных, и широкий ряд возможных вирусных

контаминантов стал известен только по мере разработки культуральных методов.

Например, энтеровирусы человека не могли опознать до разработки культур клеток почки

обезьяны, в которых эти вирусы могут вызывать цитопатические эффекты, поскольку

болезнь, развивающаяся у человека, либо имеет слабо выраженные симптомы, либо в

некоторых случаях не проявляется. Также стало понятно, что вирусы можно обнаружить в

одних системах и нельзя обнаружить в других. Например, полиомавирус SV40 не

вызывает цитопатического эффекта в клетках почки макаки-резуса (в которых раньше

производились многие полиомиелитные вакцины), полученных от зараженных SV40

обезьян, но вызывает его в культурах клеток почки яванской макаки или африканской

зеленой мартышки. Поэтому существует подозрение, что в то время в системах

культивирования содержалось много вирусов, которые обнаруживались, только если

анализы для этого подходили. Это мнение остается актуальным и привело к разработке

различных подходов к обнаружению всех контаминантов.

Вирусы Коксэки получили свое название в честь города в штате Нью-Йорк, где они

были впервые идентифицированы после того, как обнаружили их действие на мышей.

Вирусы Коксэки типа В вызывают клинические симптомы и смерть у взрослых мышей, а

вирусы Коксэки типа А поражают только мышей-сосунков. На протяжении многих лет

анализы методом культивирования тканей были менее надежным способом обнаружения

вирусов Коксэки типа А, чем использование мышей-сосунков, и продолжающееся

использование этих животных в определении характеристик банков клеток является тому

подтверждением.

В 1940-х годах популярным субстратом для выращивания и обнаружения вирусов,

возбудителей таких болезней как грипп, корь, паротит, желтая лихорадка и вакцинальная

болезнь, были оплодотворенные куриные яйца, восприимчивые к широкому ряду вирусов.

Вирусы обезьян, такие как SV5 или такие вирусы, как Сендай, также хорошо развиваются

в яйцах. Поскольку многие из них являются парамиксовирусами и обладают

гемагглютинирующей активностью, анализы на основе яиц включают испытания на

гемагглютинацию, а также на смертность эмбрионов.

Дополнительно используется ряд клеточных культур тканей, обычно включающий

один образец человеческого происхождения, один – того же вида, к которому относится и

клетка для производства, и один – другого вида (часто обезьян). Надежда возлагается на

то, что такой набор образцов поможет обнаружить вирусы, которые невозможно

зафиксировать другими способами, хотя рационально будет предположить, что на

практике не существует такого явления, как общий для всех вирусов метод обнаружения.

Например, вирус SV40 не обязательно обнаруживается с помощью клеток от

определенных «неподходящих» пород обезьян, тогда как в клетках других видов он

обнаруживается (например, в клетках Vero). В определенных условиях, если вирус

вызывает особое беспокойство, применяются специфичные тесты. Например, вирус

герпеса типа В характерен для обезьян в отсутствие таких профилактических

мероприятий как карантин и клиническая оценка донорских животных, и это оказывает

очень серьезное влияние на инфицированных людей. Поскольку вирус герпеса типа В был

в рабочем порядке обнаружен при использовании культур первичных клеток почек

кролика, стандартные линии клеток кролика сейчас принято использовать для

обнаружения этого вируса. Другой пример – вирус Маргбург, который в 1970-х привел к

смерти нескольких человек, работавших на производственном объекте с обезьянами,

клетки которых предполагалось использовать для изготовления вакцины. Этого

инцидента можно было избежать, если бы животных достаточное время продержали на

карантине. Чтобы гарантировать отсутствие этого вируса, был введен специфичный тест

на морских свинках, который продолжают использовать уже много лет.

Ряд различных по своей природе испытаний использовался и продолжает

использоваться с целью обнаружения всевозможных опасных контаминантов, которые

могут присутствовать в культурах клеток. Некоторые из них, такие как испытание на

клетках почки кролика, имеют очень узкое применение, тогда как другие могут иметь

более общий характер. Однако в целом маловероятно, чтобы какой-нибудь один анализ

смог учесть все вирусы, будь он основан на старых подходах к вирусологии или на более

новых методиках. Поэтому перед тем, как предпринимать какие-либо действия,

обязательно следует очень тщательно оценить последствия отказа от проведения какого-

либо испытания на основании их избыточности. С другой стороны, сложно обосновать

продолжение проведения испытания, если с его помощью можно обнаружить только те

вирусы, которые обнаруживаются и другими методами с сопоставимыми

чувствительностью, легкостью выполнения и затратами. Следует учитывать оба

аргумента при разработке соответствующей стратегии тестирования конкретного банка

клеток. Также следует обдумать возможность минимального использования животных в

тестировании безопасности, но при этом следует учесть полезность и необходимость

проведения тестов (чувствительность и способность обнаруживать конкретные

занесенные агенты, которые сложно определяются другими способами), в которых

используются животные.

B.11.2.1 Испытания на животных и яйцах

Клетки главного или рабочего банка клеток не подходят для производства, если

испытания на животных или яйцах указывают на присутствие какого-либо вирусного

агента, свойственного банкам клеток.

Как правило, характеристики главных банков клеток тщательно определяются

описанными ниже методами. Характеристики рабочих банков клеток могут описываться

по сокращенной процедуре, когда это применимо. Однако, как уже обсуждалось в разделе

B.11.2, может использоваться альтернативная этому общему правилу стратегия.

Испытания можно проводить непосредственно с клетками, надосадочными жидкостями

или лизатами клеток из самого банка или после того, как in vitro проведено определенное

количество пассажей для достижения предлагаемого для производства возраста клеток

или большее количество пассажей.

В некоторых странах проводится политика сокращения использования животных в тестировании

безопасности.

B.11.2.1.1 Взрослые мыши

Изначально целью испытания на взрослых мышах было обнаружение вируса

лимфоцитарного хориоменингита (LCMV). Испытание на патогенные вирусы на взрослых

мышах предполагает инокуляцию клеток и культуральных жидкостей из главного или

рабочего банка клеток внутрь брюшины (0,5 мл). Для такого теста минимум 10

жизнеспособных клеток или эквивалентное количество клеточного лизата разделяется

поровну между по крайней мере 10 взрослыми мышами весом 15-20 г.

В некоторых странах взрослым мышам также вводят инокулят (0,03 мл) в мозг.

В некоторых странах для каждого испытания требуется по меньшей мере 20 мышей.

За животными наблюдают минимум 4 недели. Если какие-либо из животных

заболевают или имеют признаки возникновения патологии, то их обследуют для

установления причины их состояния. Для животных, которые не переживут период

наблюдения, следует провести макропатологические и гистопаталогические

исследования, чтобы определить причину смерти, и если будет обнаружена вирусная

инфекция, следует предпринять попытки идентифицировать этот вирус. Идентификация

вируса может включать культивирование и/или молекулярные методы. Более того,

каждую мышь, которая умрет за первые 24 часа проведения испытания, или будет

умерщвлена вследствие болезни, следует вскрыть и исследовать на признаки вирусной

инфекции с помощью перепрививки соответствующей ткани по крайней мере пяти

дополнительным мышам, за которыми следует наблюдать 21 день. Испытание считается

недействительным, если более 20% животных в исследуемой группе, в группе

отрицательного контроля (если она используется), или в обеих, заболеет по

неспецифическим причинам и умрет до завершения периода наблюдения.

В некоторых странах период наблюдения за взрослыми мышами составляет 21 день.

Если клеточный субстрат был получен от грызунов, то для испытания на

присутствие вируса лимфоцитарного хориоменингита по крайней мере 10

жизнеспособных клеток или эквивалентное количество клеточного лизата вводится в мозг

каждой из 10 восприимчивых взрослых мышей.

В некоторых странах после завершения периода наблюдения животных заражают живым вирусом

лимфоцитарного хориоменингита, чтобы выявить развитие иммунитета от непатогенных

контаминантов этого вируса, вызывающих бессимптомную инфекцию, которую иначе не

обнаружить.

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий, расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.2.1.2 Мыши-сосунки

Изначально целью проведения этого испытания было обнаружение вирусов

Коксэки. Испытание на патогенные вирусы на мышах-сосунках предполагает инокуляцию

в брюшину (0,1 мл) клеток и культуральных жидкостей из главного или рабочего банка

клеток. По крайней мере 10

жизнеспособных клеток или эквивалентное количество

клеточного лизата разделяются поровну между двумя пометами мышей-сосунков младше

24 часов, вместе насчитывающими по крайней мере 10 особей.

В некоторых странах мышам-сосункам также вводят инокулят (0,01 мл) в мозг.

В некоторых странах используется 20 мышей-сосунков.

За животными наблюдают минимум 4 недели. Если какие-то из животных

заболевают или имеют признаки возникновения патологии, то их обследуют для

установления причины их состояния. Для животных, которые не переживут период

наблюдения, следует провести макропатологические и гистопаталогические

исследования, чтобы определить причину смерти. Если будет обнаружена вирусная

инфекция, следует предпринять попытку идентификации, если это практически

выполнимо. Идентификация вируса может включать культивирование и/или

молекулярные методы. Более того, такое исследование вирусной инфекции должно

включать перепрививку соответствующих суспензий тканей дополнительной группе

минимум из пяти мышей-сосунков в мозг или брюшину и ежедневное наблюдение в

течение 14 дней. При работе с мышами-сосунками часто случается, что тех мышат,

которые скоро умрут, поедает мать. Это не дает определить причину смерти (когда они

съедены полностью и ничего не остается для анализа). Испытание считается

недействительным, если более 20% животных в исследуемой группе, в группе

отрицательного контроля (если она используется), или в обеих, умрет до завершения

периода наблюдения.

В некоторых странах период наблюдения за мышами-сосунками может длиться 14 дней, а затем

проводится пассаж, в том числе слепой пассаж (с помощью инокуляции в брюшину или в мозг по

крайней мере пяти дополнительным мышам) единого пула переведенных в состояние эмульсии

тканей (без кожи и жира) всех мышей, выживших в изначальном 14-дневном испытании.

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий, расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.2.1.3 Морские свинки

Изначально целью испытания на морских свинках было обнаружить вирус

лимфоцитарного хориоменингита и Mycobacterium tuberculosis. Если необходимо

обнаружить вид Mycobacterium, проводится испытание на морских свинках с помощью

инокуляции в брюшину (5 мл) клеток и культуральных жидкостей из главного или

рабочего банка клеток, в ходе которой минимум 10

жизнеспособных клеток или

эквивалентное количество клеточного лизата разделяются поровну между животными.

В некоторых странах пяти морским свинкам весом 350-450 г в мозг вводят инокулят (0,1 мл) и

наблюдают за ними в течение 42 дней, чтобы обнаружить палочку Коха и другие виды

микобактерий.

За животными наблюдают минимум 6 недель. Если какие-то из животных

заболевают или имеют признаки возникновения патологии, то их обследуют для

установления причины их состояния. Для животных, которые не переживут период

наблюдения, следует провести макропатологические и гистопаталогические

исследования, чтобы определить причину смерти, и если будет обнаружена вирусная

инфекция, следует предпринять попытку ее идентифицировать.

Идентификация вируса может включать культивирование и/или молекулярные

методы. Испытание считается недействительным, если более 20% животных в

исследуемой группе, группе отрицательного контроля (если она используется), или в

обеих, умрет до завершения периода наблюдения.

Испытание на микобактерии на морских свинках можно заменить на испытание

альтернативным методом in vitro, таким как культивирование или ускоренное

культивирование с ПЦР в конечной точке (см. также раздел B.11.3).

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий, расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия (последние три зависят от «наследия» и

текущего использования компонентов среды животного происхождения, способные

привести к контаминации видами микобактерий)

B.11.2.1.4 Кролики

Изначально целью испытания на кроликах было обнаружение вируса герпеса типа

В. Если необходимо обнаружить характерный для обезьян вирус герпеса типа В,

проводится испытание на патогенные вирусы на кроликах, которое предполагает

инокуляцию в кожу (1 мл) и под кожу (>2 мл) кролика клеток и культуральных жидкостей

из главного или рабочего банка клеток, в ходе которой минимум 10

жизнеспособных

клеток или эквивалентное количество клеточного лизата разделяются поровну между

животными.

В некоторых странах пяти кроликам весом 1,5-2,5 кг под кожу вводят инокулят объемом 2 мл или 9-

19 мл. Следует обратиться к национальному регуляторному органу/национальной контрольной

лаборатории за консультацией по допустимым методам проведения испытания.

За животными наблюдают минимум 4 недели. Если какие-то из животных

заболевают или имеют признаки возникновения патологии, то их обследуют для

установления причины их состояния. Для животных, которые не переживут период

наблюдения, следует провести макропатологические и гистопаталогические

исследования, чтобы определить причину смерти, и если будет обнаружена вирусная

инфекция, следует предпринять попытку ее идентифицировать. Идентификация вируса

может включать культивирование и/или молекулярные методы. Испытание считается

недействительным, если более 20% животных в исследуемой группе или в группе

отрицательного контроля (если она используется) умрет до завершения периода

наблюдения.

Испытание на вирус герпеса типа В на кроликах предназначено для первичных

культур клеток обезьян. Его можно заменить испытанием с использованием культуры

клеток почки кролика.

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий, расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.2.1.5 Оплодотворенные куриные яйца

В аллантоисную полость каждого из по крайней мере 10 оплодотворенных

куриных яиц и в желточный мешок каждого из еще 10 оплодотворенных куриных яиц

вводятся минимум 10

жизнеспособных клеток, размноженных in vitro до достижения

предполагаемого возраста клеток, необходимого для использования в производстве или до

более позднего этапа, или эквивалентное количество клеточного лизата с культуральными

жидкостями из главного или рабочего банка клеток птичьего происхождения. Яйца

исследуют спустя не менее 5 дней после инкубации. Аллантоисную жидкость яиц

тестируют на присутствие гемагглютининов с помощью эритроцитов морских свинок, а

также куриц (или других видов птиц). Результаты испытания считаются

недействительными, если более 20% оплодотворенных куриных яиц в исследуемой

группе, группе отрицательного контроля (если она используется), или в обеих, будут

отбракованы по неспецифическим причинам.

В некоторых странах национальный регуляторный орган/национальная контрольная лаборатория

также требует использовать в качестве дополнения к клеткам морских свинок и куриц (или других

видов птиц) эритроциты других видов, в том числе человека (с группой крови АВ0) или обезьян. Во

всех испытаниях следует фиксировать данные после инкубации в течение 30 минут при температуре

0–4 °C, а потом еще раз после дальнейшей инкубации в течение 30 минут при 20–25 °C. Для

испытаний с использованием эритроцитов обезьян следует также фиксировать данные после

конечной инкубации в течение 30 минут при 34-37 °C.

В некоторых странах инокулят вводят в полость амниона.

В некоторых странах после инкубации необходимо собирать аллантоисную жидкость или 10%

суспензию желточных мешков, объединять в пул и проводить слепой пассаж в дополнительную

партию яиц.

Для тестирования желточного мешка следует использовать яйца через 5-7 дней

после откладывания. А для тестирования аллантоисной полости следует использовать

яйца через 9–11 дней после откладывания.

Использование оплодотворенных куриных яиц на другой день после откладывания и изменение

продолжительности периодов инкубации допустимо, если определена эквивалентность или лучшая

пригодность таких измененных параметров для обнаружения в исследуемых образцах тех

занесенных агентов, которые испытание способно обнаруживать в том виде, который описан выше.

Для эмбрионов, которые не переживут период наблюдения, следует проводить

макропатологические исследования, чтобы определить причину смерти, и если будет

обнаружена вирусная инфекция, следует предпринять попытку ее идентифицировать.

Идентификация вируса может включать культивирование и/или молекулярные методы.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и рабочий банк клеток птичьего происхождения,

расширенный банк клеток или репрезентативные клетки, получаемые в конце

производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток птиц, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия (также рекомендуется для впервые

полученных клеточных субстратов)

B.11.2.1.6 Испытания на антитела

Линии клеток грызунов тестируют на видоспецифичные вирусы с помощью

испытаний на антитела на мышах, крысах и хомяках, в зависимости от конкретного

случая. Для этих линий in vivo проводятся испытания на вирус лимфоцитарного

хориоменингита, включающие анализ на нелетальные штаммы, как описано в разделе

B.11.2.1.1. Линии клеток птиц можно также тестировать с помощью испытания на

образование антител у куриц, например, чтобы обнаружить вирус анемии цыплят. Далее,

если клеточный субстрат (даже если он получен не от грызунов) подвергается

воздействию материалов, полученных от грызунов (например, отбор с помощью

моноклонального антитела), следует рассмотреть тестирование на видоспецифичные

вирусы, используя испытание на экспрессию антител 84, 85.

В некоторых странах рассматривается возможность проведения анализа ДНК вместо испытания на

антитела in vivo. В таком случае следует предоставить данные для обоснования такого подхода

национальному регуляторному органу/национальной контрольной лаборатории.

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий банк клеток или расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия (рекомендуется в первую очередь для клеток, полученных от грызунов)

B.11.2.2 Испытания на культуре клеток

С помощью испытаний на культуре клеток можно обнаружить вирусы широкого

ряда семейств. Считывание данных предполагает периодический мониторинг культур на

цитопатический эффект и испытания на гемадсорбирующие и гемагглютинирующие

вирусы, которые проводятся в конце периода культивирования. В дополнение к

нижеописанным индикаторным клеткам, может быть целесообразно размножить и другие

типы используемых индикаторных клеток (более двух или трех типов), чтобы была

возможность обнаружить вирусы, развивающиеся в различных клетках-хозяевах.

Решение, линии каких клеток использовать в качестве индикаторных, следует принимать,

основываясь на видовой принадлежности и «наследии» клеточного субстрата для

производства, принимая во внимание типы вирусов, воздействию которых клеточные

субстраты теоретически могли подвергаться, и, следовательно, наличие которых следует

проверять с помощью данного метода анализа. Субстрат не подходит для использования в

производстве, если в какой-либо из индикаторных клеточных линий будут обнаружены

признаки присутствия какого-либо вирусного агента, который мог появиться в результате

использования исследуемого клеточного субстрата.

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий банк или расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.2.2.1 Индикаторные клетки

Живые клетки или клеточный лизат, а также отработанная культуральная жидкость

(spent culture fluid) главного или рабочего банка, инокулируются на монослой культур или

культивируется с монослойными культурами нижеперечисленных типов клеток, в

зависимости от каждого конкретного случая.

Лизат клеток можно подготовить любым методом, позволяющим избежать разрушения вируса и в

то же время максимально высвобождающим вирус (например, обычно это три цикла

заморозки/разморозки, за которыми следует центрифугирование при низкой скорости). Если клетки,

лизат или отработанную культуральную жидкость предполагается хранить перед тестированием, то

следует хранить их при температуре ≤–70 °C.

Можно проводить испытание на культурах (на первичных клетках или

непрерывных культурах клеток) того же вида животных и типа ткани, что используются

для производства.

Можно использовать культуры линий диплоидных клеток человека. Изначально

целью этого испытания с первичными клетками человека было обнаружение вируса кори.

Если клеточный субстрат имеет человеческое происхождение, то в качестве второй

индикаторной линии клеток следует использовать линию клеток почек обезьян.

Первоначально этот тип клеток использовался для обнаружения вирусов, характерных для

обезьян.

В некоторых странах требуется проводить испытания и на культурах другой (третьей) линии клеток

иных видов животных.

Во многих случаях может понадобиться больше, чем две линии клеток, чтобы охватить весь ряд

потенциальных вирусных контаминантов и, как правило, если субстрат не обезьяньего

происхождения, то используется третья клеточная линия, происходящая от обезьян.

Для новых клеточных субстратов можно рассмотреть возможность использования

дополнительных клеточных линий для обнаружения вирусов, которые признаны

потенциально опасными для человека (например, для клеток насекомых; если линии

клеток, отобранные для вышеупомянутых испытаний, не являются пригодными для

развития вирусов насекомых, следует включить в испытания дополнительную

восприимчивую к вирусу линию клеток).

Образец банка клеток для тестирования разбавляется в минимальной степени.

Минимум 10

клеток или эквивалентное количество лизата клеток вместе с отработанной

культуральной жидкостью инокулируется на каждый тип индикаторных клеток.

Полученную совместную или инокулированную культуру клеток исследуют на признаки

вирусов по цитопатическому эффекту по крайней мере в течение двух недель. Если

известно, что конкретная клеточная линия способна поддерживать рост цитомегаловируса

человека или обезьян, за культурами диплоидных клеток человека наблюдают минимум 4

недели. Продленное (4 недели) культивирование клеток для обнаружения

цитомегаловируса человека или обезьян можно заменить технологией NAT для

обнаружения ДНК цитомегаловируса.

В некоторых странах для всех индикаторных культур рекомендуется пересев на свежую культуру на

дополнительный срок в 2 недели. В некоторых случаях сложно поддерживать нормальное состояние

культур клеток в течение 2 недель без субкультивирования. В таких случаях необходимо

подкармливать культуры свежей питательной средой или пересевать через 2 недели на свежие

культуры, чтобы получить возможность обнаружить вирусные агенты.

По завершении периода наблюдения образцы каждой совместной культуры или

инокулированной культуры клеток тестируются на гемадсорбирующие и/или

гемагглютинирующие вирусы, как описано в разделе B.11.2.1.5.

B.11.2.2.2 Дополнительные вопросы, касающиеся испытаний на вирусы

насекомых в культуре клеток

Многие линии клеток насекомых переносят персистирующие вирусные инфекции,

которые обычно не вызывают заметного цитопатического эффекта (например, некоторые

клоны линии клеток Hi-5 инфицированы персистирующим нодавирусом насекомых).

Однако репликацию этих вирусов может спровоцировать стресс, которому клетки

подвергаются при обработке химическими индукторами или различными приемами,

такими как культивирование при высокой/низкой температуре (выше или ниже, чем

температура, обычно используемая для производства), кратковременный тепловой шок,

вторичное инфицирование другими вирусами насекомых. Таким образом, вероятность

обнаружения таких малоактивных персистирующих инфекций можно увеличить,

подвергая клетки стрессу перед анализом.

Интактные клетки и лизаты клеток на уровне пассажа, эквивалентном или

превышающем конец производственного цикла, культивируются совместно с

индикаторными клетками минимум трех различных видов насекомых в дополнение к

индикаторным клеткам, указанным в разделе B.11.2.2.2. Линии клеток следует отбирать

по следующим критериям: одна из клеток должна быть чувствительна к арбовирусам

человека, вторая – к ряду вирусов насекомых, а третья должна быть получена от вида,

который имеет близкое отношение к тому, из которого был выделен главный банк клеток

(или используется другая клеточная линия того же вида животных). Копии культур

индикаторных клеток обычно проходят инкубацию при двух температурах, например, при

37±1 °C и более низкой, например, при 28±1 °C, наблюдаются в течение 14 дней и

исследуются на предмет возможных морфологических изменений. В конце периода

испытания культуральные жидкости тестируются на гемагглютинирующие вирусы, а

интактные клетки – на гемадсорбирующие вирусы. Клетки отвечают критериям

испытания, если не обнаружено никаких свидетельств присутствия какого-либо вирусного

агента.

Доступно несколько клеточных линий москитов, чувствительных к некоторым

характерным для человека арбовирусам, которые можно использовать в этих испытаниях.

В качестве альтернативы для этой цели можно использовать клетки BHK-21. Наиболее

восприимчивые к вирусу линии клеток насекомых, охарактеризованные на сегодняшний

день, были получены из тканей эмбриона рода Drosophila. Хотя линии клеток москитов и

дрозофил и подходят для некоторых аспектов тестирования, следует помнить, что многие

линии клеток насекомых инфицированы персистирующими вирусами насекомых, которые

обычно не вызывают явного цитопатического эффекта. Также многие клетки насекомых

могут быть инфицированы вирусами млекопитающих, такими как вирус диареи крупного

рогатого скота, известными своей способностью реплицироваться в клетках насекомых.

Важным предварительным требованием для проведения вышеописанных испытаний

является демонстрация того, что линии индикаторных клеток не содержат занесенных

агентов сами по себе. Также следует обдумать стратегии смягчения риска, как уже

обсуждалось ранее, для препаратов, проходящих высокую степень очистки, для которых

может быть достигнуто и валидировано удаление вируса.

B.11.2.3 Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия

Минимум 200 клеток из главного или рабочего банка и из расширенного банка

клеток исследуют с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на

признаки микробиологической контаминации. Для этого используются такие методы, как

негативное окрашивание и исследование тонких срезов. Эти методы рассмотрены в работе

г-жи Bierley с соавт. 86. В некоторых случаях может быть целесообразно исследовать

большее количество клеток, как рассматривается ниже для линий клеток насекомых. По

этому вопросу следует проконсультироваться с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Следует отмечать и обсуждать с этими

организациями также любые необычные или ошибочные наблюдения, которые могут

иметь микробиологическое значение.

С помощью ПЭМ можно обнаружить в клеточном субстрате частицы вирусов, в

том числе и эндогенных ретровирусов. ПЭМ недостаточно чувствительна (как правило, с

ее помощью обнаруживается сильная контаминация, но не всегда обнаруживается

незначительная), это обобщенный анализ, способный обнаружить микробные агенты

многих различных типов.

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий банк или расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.11.2.3.1 Дополнительные вопросы, связанные с ПЭМ для клеток насекомых

Описанный выше общий скрининг-тест применяется к главным и рабочим банкам,

полученным из клеток насекомых. Перед проведением ПЭМ линии клеток следует

дополнительно подвергать стрессу, как описано в разделе B.11.2.2.3. С ростом количества

исследуемых клеток может также вырасти и вероятность обнаружения каких-либо агентов

(например, эррантивирусов и гемивирусов). Температуры, в которых содержатся клетки, и

виды обработки следует согласовать с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией, также как и количество срезов клеток

для исследования.

B.11.2.4 Испытания на ретровирусы

Все клетки насекомых и позвоночных, которые были проанализированы в

настоящем документе, содержат генетически заложенные эндогенные ретровирусные

последовательности, встроенные в ДНК-хромосомы в форме провирусов. Эти

последовательности, например, информационная РНК, могут экспрессироваться или

индуцироваться. В некоторых случаях происходит трансляция иРНК в белок вируса, и

продуцируются вирусные частицы (вирионы). Во многих случаях вирионы этих вирусов

(например, птичьего эндогенного ретровируса EAV (эндогенный ретровирус птиц), гамма-

ретровируса линии клеток яичника китайского хомячка 87) неспособны к репликации,

тогда как в других случаях ретровирусы (например, ксенотропный вирус мышиной

лейкемии (x-MuLV)) могут инфицировать клетки других видов, в том числе клетки

человека.

Следует также рассмотреть вероятность заражения банков клеток ретровирусами

негенетического происхождения (экзогенными) либо вследствие заражения животного-

донора, либо вследствие контаминации в лаборатории.

Следует отметить, что заражение ретровирусами не обязательно проявляется в виде

цитопатического эффекта. Поэтому для обнаружения их присутствия могут понадобиться

скрининг-анализы, такие как анализ на усиленную препаратом активность обратной

транскриптазы (PERT) или ПЭМ.

Клетки главного или рабочего банка клеток не подходят для производства, если

испытания на вызывающие инфекционные заболевания ретровирусы, при необходимости

проведения таких испытаний, указывают на присутствие каких-либо связанных с

субстратом вирусных агентов, удаление которых в ходе производства не может быть

наглядно продемонстрировано. Как правило, для надлежащего удаления вирусов 14

требуется валидация последних этапов процесса производства препаратов (например,

моноклональных антител), которые изготавливают в клеточных субстратах,

продуцирующих частицы ретровирусов (например, клетки CHO) или вызывающие

инфекционные заболевания эндогенные ретровирусы (например, клетки NS0, Sp2/0).

Приемлемую степень очистки от вирусов следует согласовать с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

Фибробласты куриного зародыша (CEF) содержат дефектные ретровирусные

элементы, которые часто продуцируют дефектные частицы, проявляющие активность

обратной транскриптазы. По поводу этой особенности фибробластов куриного зародыша

было проведено множество исследований и консультаций с ВОЗ, так как эти клетки

используются для производства живых вирусных вакцин. При условии предоставления

доказательств того, что группа доноров не заражена вызывающими инфекционные

заболевания ретровирусами, и что нет признаков заражения ими культур клеток, культуры

могут считаться приемлемыми в отношении ретровирусов.

Линии клеток грызунов экспрессируют эндогенные ретровирусы, поэтому для

определения, опасны ли производимые ими эндогенные вирусные частицы, следует

проводить испытания на инфекционность.

Такие линии клеток как CHO, BHK-21, NS0 и Sp2/0 часто используются в качестве

субстратов для производства лекарственных препаратов, и пока не сообщалось о

проблемах с безопасностью, связанных с контаминацией препаратов вирусами. Эти линии

клеток можно классифицировать как «подробно охарактеризованные», потому что

характерные для них эндогенные частицы ретровирусов тщательно изучены. Более того,

подсчитывается общее количество ретровирус-подобных частиц в собранных клетках

(ПЭМ или количественная ПЦР) для репрезентативного количества серий, и очистка от

ретровирусов подтверждается значимыми коэффициентами безопасности. В таком случае

испытания на инфекционные ретровирусы можно сократить (например, проверить одну

партию, затем прекратить тестирование, но повторить его, когда в процесс

культивирования клеток будут внесены значительные изменения, например, изменения

масштабов производства). Спонсорам рекомендуется консультироваться с национальным

регуляторным органом.

Область применения

Главные банки клеток и клетки, размноженные in vitro до достижения возраста,

используемого при производстве, или более зрелого возраста. В качестве альтернативы,

это испытание можно проводить на рабочих банках клеток.

■ Банки клеток: Главный или рабочий банк и расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия

B.11.2.4.1 Анализ на усиленную препаратом активность обратной

транскриптазы

Тестовые образцы главных и рабочих банков клеток, размноженные in vitro до

достижения возраста, используемого при производстве, или более зрелого возраста,

исследуют на присутствие ретровирусов.

Супернатанты культуры тестируются с помощью высокочувствительного анализа

на обратную транскриптазу на основе количественной ПЦР или анализа на усиленную

препаратом активность обратной транскриптазы 88–91.

Активность обратной транскриптазы не специфична по отношению к ретровирусам

и может вызываться не только ими, но и, например, ретровирус-подобными элементами,

которые не кодируют полноценный или инфекционный геном 92–96, или клеточные

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы 97, 98. Сообщалось о попытках сократить усиленную

препаратом активность обратной транскриптазы, ассоциируемую с клеточными ДНК-

зависимыми ДНК-полимеразами 98–100, но никакая обработка не может исключить

такую активность полностью. Поэтому результаты высокочувствительных анализов на

усиленную препаратом активность обратной транскриптазы необходимо

интерпретировать с осторожностью. Поскольку действие обратной транскриптазы может

ассоциироваться с присутствием дефектных ретровирус-подобных частиц, и другие

полимеразы могут приводить к проявлению активности обратной транскриптазы,

положительный результат анализа на обратную транскриптазу не является решающим

доказательством присутствия инфекционного ретровируса. При получении

положительного результата могут потребоваться дальнейшие исследования, например,

анализ на инфекционность (см. раздел B.11.2.4.4). Также в этом исследовании полезным

может быть проведение традиционного анализа на обратную транскриптазу для того,

чтобы определить, зависит ли ее активность от присутствия ионов Mg2+ или Mn2+. Такое

тестирование следует предварительно согласовать с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией.

Известно, что фибробласты куриного зародыша и другие клетки птичьего

происхождения экспрессируют элементы ретровирусов. Целесообразность проведения

данного испытания следует обсудить с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Например, может быть

целесообразным направить стратегии тестирования на обнаружение инфекционных

ретровирусов птиц, таких как вирусы лейкоза и вирус ретикулоэндотелиоза, а также на

серологический скрининг групп доноров, от которых получают фибробласты куриного

зародыша. Также известно, что в составе клеток насекомых есть элементы ретровирусов,

которые обнаруживаются с помощью анализа на усиленную препаратом активность

обратной транскриптазы, поэтому они также могут дать положительный результат в этом

анализе.

B.11.2.4.2 ПЦР или другие испытания in vitro, специфичные в отношении

ретровирусов

Если анализ на усиленную препаратом активность обратной транскриптазы дает

неоднозначные результаты, или нет возможности провести такой анализ, допускается

проводить скрининг клеточного субстрата на видоспецифичные ретровирусы с помощью

молекулярных методов анализа, таких как ПЦР, иммунофлуоресцентный анализ,

иммуносорбентный ферментный анализ (ELISA), или других специфичных в отношении

вируса методов. Молекулярные методы анализа, такие как ПЦР, могут также

использоваться для определения количества ретровирус-подобных частиц в урожаях

клеток, используемых для производства, при условии, что такой метод прошел

соответствующую валидацию. Рекомендуется проконсультироваться с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией относительно

допустимости такого подхода.

B.11.2.4.3 Испытание на инфекционность ретровирусов

Если в исследуемом образце обнаружена активность обратной транскриптазы,

могут понадобиться анализы на инфекционность, чтобы оценить возможность связи этой

активности с репликацией вируса.

Поскольку клетки грызунов, как правило, экспрессируют эндогенные ретровирусы,

для таких вирусов следует оценить инфекционность, а также круг хозяев in vitro. Тестовые

образцы главного или рабочего банка клеток, размноженные in vitro до достижения

возраста, используемого при производстве, или более зрелого возраста, следует изучить

на присутствие ретровирусов с помощью анализов на инфекционность. Клетки, которые

будут для этого использоваться, должны быть способны поддерживать репликацию

широкого ряда вирусов. Могут понадобиться клетки различной видовой принадлежности

и разных типов. Стратегию тестирования следует согласовать с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

Часто можно повысить чувствительность анализов с помощью предварительной

инокуляции исследуемого материала на культуры клеток, которые могут поддерживать

рост ретровирусов, чтобы амплифицировать какой-либо ретровирусный контаминант,

который может присутствовать в незначительной концентрации. Для не имеющих

отношения к мышам ретровирусов следует отбирать линии клеток соответственно их

способности обеспечить рост широкого ряда ретровирусов, включая вирусы

человекообразных и низших приматов 101, 102.

Для мышиных ретровирусов важно оценить, высвобождают ли клетки

инфекционные ретровирусы, и если да, то определить круг хозяев этих вирусов.

Проведение анализов на мышиные ретровирусы может представлять сложность, следует

проконсультироваться с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией для получения рекомендаций. Линии клеток мышей и других

грызунов (CHO, NS0, Sp2/0) или гибридные клеточные линии следует считать, по

определению, способными производить инфекционные ретровирусы или

неинфекционные ретровирус-подобные частицы. В таком случае, следует количественно

определять степень очистки от этих ретровирусов в ходе процесса производства (с

помощью удаления и/или инактивации). Уровень чистоты, достигаемый в процессе

производства, должен соответствовать требованиям национального регуляторного

органа/национальной контрольной лаборатории.

Любое тестирование, проводимое по инициативе производителя, следует

согласовать с национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией.

B.11.2.5 Испытания на конкретные вирусы, которые сложно поддаются

определению с помощью испытаний, описанных в разделах B.11.2.1–B.11.2.4 и

соответствующих подразделах

Некоторые вирусы, такие как вирусы гепатита В или С или папилломавирусы

человека сложно обнаружить с помощью любого из вышеописанных методов, поскольку

эти вирусы сложно выращивать в культуре клеток, или их круг хозяев ограничивается

человеком. Некоторые вирусы животных (например, полиомавирус крупного рогатого

скота и цирковирусы свиней) сложно обнаружить с помощью стандартных испытаний,

которые были описаны ранее. В таких условиях могут понадобиться анализы,

специфичные в отношении таких вирусов. В то время как общие анализы широкой

направленности предпочтительны для обнаружения неизвестных контаминантов,

присутствие некоторых вирусов может быть установлено только с помощью специфичных

анализов, таких как молекулярные технологии (например, технология амплификации

нуклеиновых кислот). Также могут использоваться технологии, основанные на

обнаружении антител, такие как иммунофлуоресцентный анализ.

Обычно если доказано, что главный, рабочий или расширенный банк клеток не

заражены определенными вирусами, и их невозможно занести в ходе культивирования,

может не понадобиться тестирование клеток на более поздних этапах (например, на

уровне производства).

Скрининг линий клеток человека на специфические вирусы, которые являются

высококонтагиозными и могут вызывать скрытые или хронические инфекции, и которые

сложно или невозможно обнаружить с помощью технологий, описанных в разделах

B.11.2.1– B.11.2.4 и соответствующих подразделах, следует проводить с помощью

соответствующих технологий in vitro. При выборе вирусов, на которые должен быть

направлен скрининг, следует, если есть такая возможность, принимать во внимание

источник тканей и анамнез донора, от которого была получена клеточная линия.

Если источник клеток или анамнез донора (при наличии такой информации) будут

указывать на присутствие специфических вирусов, может быть целесообразно провести

испытания, специфичные в отношении герпесвирусов, ретровирусов, папиломавирусов,

вирусов гепатита, полиомавирусов человека или сложно поддающихся культивированию

аденовирусов человека.

Следует обдумать возможность скрининга линий клеток насекомых на конкретные

вирусы, которые, по имеющимся данным, способны контаминировать клеточные линии

(например, нодавирусы) или персистировать в линиях клеток насекомых и вызывать

инфекции у людей.

Область применения

Следует получить консультацию национального регуляторного

органа/национальной контрольной лаборатории относительно специфических патогенов

или определенных вирусов для включения в стратегию тестирования, так как набор

анализов подбирается для каждого конкретного случая в зависимости от видовой

принадлежности и источника клеток и анамнеза донора, если подобная информация

доступна.

■ Банки клеток: Главный, рабочий или расширенный банк клеток или

репрезентативные клетки, получаемые в конце производственного цикла

■ Типы клеток: культура первичных клеток (если необходимо), линия диплоидных

клеток, линия стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.2.5.1 Методы, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот

Испытания на специфические вирусы обычно проводят с использованием методов

амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты. ПЦР можно проводить

непосредственно с извлеченной из клеток ДНК, или же с лизатами клеток/надосадочными

жидкостями, амплифицируя ДНК, или с РНК, которую с помощью обратной

транскрипции превращают в ДНК и затем амплифицируют (ПЦР с обратной

транскрипцией). Так можно обнаружить как ДНК-содержащие, так и РНК-содержащие

вирусы, а также ДНК ретровирусов в провирусном состоянии. Праймеры для ПЦР могут

быть направлены против вариабельных областей нуклеиновых кислот, чтобы обеспечить

обнаружение специфического вируса или штамма, или против консервативных областей

вирусных последовательностей, общих для нескольких штаммов или семейства вирусов,

чтобы повысить вероятность обнаружения нескольких связанных между собой вирусов.

Стандартный анализ с помощью ПЦР может быть дополнен анализами на основе методов

гибридизации, чтобы увеличить универсальность, чувствительность и специфичность

испытания. Например, использование зондов в различных участках ампликона может

оказаться полезным для определения, к какому штамму или семейству относится вирус.

Тем не менее, методы ПЦР-анализов ограничены тем, что не все представители

отдельного семейства вирусов могут сохранить гены неизменными в достаточной для

обнаружения мере, даже если для ПЦР будут выбраны консервативные участки ДНК.

На данный момент идет разработка новых чувствительных молекулярных методов

с широкими возможностями обнаружения. Такие методы еще не вошли в повседневное

использование, но по мере того, как они станут широкодоступными и пройдут валидацию,

они начнут играть все более важную роль в оценке клеточных субстратов. При расчете

применимости таких методов следует принимать во внимание их чувствительность, а

также то, насколько широкий круг вирусов можно обнаружить с их помощью. Одним из

преимуществ таких новых методов является их потенциал для обнаружения новых

вирусов. Современные подходы предполагают или упростить ПЦР для целых семейств

вирусов, или использовать методы случайного примирования, которые не зависят от

известной последовательности оснований. В анализе полученных ампликонов

применяются секвенирование, анализ вступающих в гибридизацию олигонуклеотидов и

масс-спектрометрию 103–105. Новое поколение методов массового параллельного

секвенирования (МПС) может быть особенно полезным. Эти методы можно применять

для обнаружения вирионов после обработки нуклеазы для удаления клеточной ДНК и

неинкапсидированных геномов. В таком режиме МПС используется для обнаружения

новых вирусов в сыворотке и других тканях и выявления контаминации человеческих

вакцин цирковирусом свиней 103, 106–110. МПС также можно применять для скрининга

клеточных субстратов на латентные и литические вирусы с помощью секвенирования

транскриптомов. В таком режиме генерируются огромные массивы данных, и требуются

робастные методы биоинформатики, чтобы обнаружить вирусные последовательности с

помощью позитивного отбора на основе баз данных о вирусах, либо с помощью

негативного отбора для исключения последовательностей генома клетки 103, 110, 111.

Необходимо учитывать и исключать ложные признаки обнаружения вирусов,

возникающие в результате распознавания трансфектированных последовательностей

клетки, присутствующих в некоторых геномах вируса, или из-за того, что вирусные гены,

такие как вирокины, имеют близкую гомологию с генами клетки 103, 105, 111.

Возможно, что в будущем регуляторные органы будут ожидать или требовать

применения методов этого типа. На настоящий момент данные методы еще не прошли

оценку чувствительности и специфичности и должны рассматриваться как хороший

инструмент для исследований, с помощью которого можно выявить вопросы для

дальнейшего исследования более традиционными методами.

B.11.3 Бактерии, грибы, молликуты и микобактерии

Наиболее распространенные контаминанты при культивировании клеток не

являются вирусами. Они могут с легкостью попасть в культуру из окружающей среды и

материалов, могут быть занесены персоналом, и т.д. Попав в культуру, такие организмы

быстро размножаются и могут быть патогенными для человека. При оценке риска

производитель должен иметь в виду, что стандартные фармакопейные тесты на

«стерильность» разработаны, чтобы давать представление об эффективности

асептической обработки для предотвращения общей контаминации бактериями или

грибами, но неспособны исключить все возможные заражения. Производителю следует

проконсультироваться с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией о любых конкретных материалах или условиях, которые могут

нести повышенный риск контаминации определенными типами микроорганизмов со

сложными питательными потребностями.

Следует определять характеристики исходных материалов биологического

происхождения, таких как клеточные субстраты, чтобы гарантировать отсутствие

занесенных инфекционных агентов, таких как бактерии, грибы, поддающиеся и не

поддающиеся культивированию микоплазмы, спироплазмы (в случае использования

клеток насекомых или клеток, которые подвергаются воздействию материалов,

полученных из растений) и микобактерии. Для того чтобы признать субстанцию

«свободной» от таких контаминантов, следует доказать с помощью анализов с заранее

определенным уровнем чувствительности, что определенное количество субстанции не

содержит поддающихся обнаружению контаминантов. Тестирование следует проводить в

асептических условиях соответствующего чистого производственного помещения, чтобы

избежать ложноположительных результатов. Тестирование должно сопровождаться

планом, позволяющим повторить его в случае получения ложноположительного

результата, и предварительным квалификационным отбором используемых в тестах

реактивов.

Испытания на микобактерии могут проводиться в ходе определения характеристик

банка клеток, если клетки восприимчивы к заражению Mycobacterium tuberculosis или

другими видами микобактерий. Такое тестирование следует также проводить для культур

первичных клеток. Для обнаружения микобактерий может понадобиться лизировать

клетки-хозяев, потому что некоторые штаммы могут находиться преимущественно внутри

клеток.

Для обнаружения микоплазм или спироплазм могут потребоваться другие условия

роста, чем те, которые используются в методах анализа клеток млекопитающих, несмотря

на то, что по крайней мере один род, спироплазму, можно культивировать при 30 °C.

Следует установить положительные контроли для этих испытаний (особенно на

спироплазму). Сообщалось, что спироплазмы являются инфекционными агентами для

некоторых видов насекомых, а также сообщалось, что линии клеток насекомых вызывают

патогенные эффекты у млекопитающих.

B.11.3.1 Стерильность в отношении бактерий и грибов

Испытания проводятся согласно указаниям части А раздела 5.2 «Требований к

биологическим субстанциям» №6 112, с помощью одобренного национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией метода. Дополнительная

информация содержится в национальных фармакопеях и документах Международной

конференции по гармонизации 10, 113–115. Тестирование главного и рабочего банка

клеток проводится с использованием 10 мл надосадочной жидкости из культур клеток для

каждой среды. Также испытание проводится, по крайней мере, на 1% содержимого

заполненных контейнеров (т.е., пробирок для криосохранения), минимальное число

контейнеров – 2. Для надосадочной жидкости рекомендуется использовать метод

мембранной фильтрации. Для тестирования пробирок из банка клеток может

понадобиться использовать метод прямого посева. Следует исключить бактериостаз и

фунгистаз.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и каждый из рабочих банков клеток

■ Типы клеток: культуры первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.3.2 Молликуты

Молликуты отличаются от других микроорганизмов отсутствием клеточной

стенки. К ним относятся микоплазмы, ахолеплазмы, спироплазмы и другие роды

прокариотических организмов. Молликуты паразитируют на различных видах животных

и растений, на поверхности или внутри клеток хозяина. Также молликуты часто

контаминируют культуры клеток. Помимо того, что они потенциально патогенны,

микоплазмы конкурируют с клетками хозяина за питательные вещества, вызывают

хромосомные отклонения, препятствуют нормальному метаболизму и ингибируют

слияние клеток хозяина. Несмотря на то, что не было сообщений о случаях заражения

человека видом M. pneumoniae вследствие воздействия культур клеток или полученных из

клеток препаратов, этот вид микроорганизмов остается патогенным для человека. В

любом случае, чтобы счесть банки клеток пригодными для производства биологических

препаратов следует продемонстрировать отсутствие этих контаминантов.

B.11.3.2.1 Микоплазмы и ахолеплазмы

Испытания на микоплазмы проводятся согласно указаниям части А раздела 5.2 и

5.3 «Требований к биологическим субстанциям» №6 116, или с помощью метода,

одобренного национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией. Следует использовать для тестирования и культуральный метод, и метод

индикаторной клеточной культуры. Использование только технологии NAT в комбинации

с культуральным методом или с подходящим методом обнаружения ДНК может после

соответствующей валидации и обсуждения с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией применяться в качестве альтернативы

одному или обоим другим методам. В таком случае следует провести исследование

сопоставимости методов. Оно должно включать сравнение пределов чувствительности,

соответствующих альтернативному и официальному методу. Также следует уделить

внимание специфичности (панель обнаруженных микоплазм, возможные

ложноположительные результаты из-за перекрестной реакции на другие бактерии). Более

подробная информация приводится в главе 2.6.7 Европейской Фармакопеи 117. Для

испытаний используется по одному или более контейнеров из главного и каждого из

рабочих банков клеток.

Область применения

■ Банки клеток: Главный и каждый из рабочих банков клеток

■ Типы клеток: культуры первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.3.2.2 Спироплазма и другие роды прокариотических организмов

Другие молликуты, такие как спироплазма, могут попасть в клеточные субстраты с

контаминированным сырьем (пептонами) или занесены в связи с природой и

восприимчивостью клеток (например, клеток насекомых). В соответствии с процессом

производства банков клеток, если клетки подвергаются воздействию сырья на этапе

создания главного банка или ранее, можно тестировать на занесенные агенты только этот

главный банк клеток. Если возможен контакт с источником заражения на более позднем

этапе, может понадобиться также тестирование рабочего банка клеток.

Для обнаружения таких молликутов может потребоваться адаптация условий

культивирования (среды и/или температуры), в зависимости от того, какой штамм нужно

обнаружить. Чтобы гарантировать возможность обнаружения широкого ряда молликутов,

полезно использовать технологию NAT после соответствующей валидации с подходящим

модельным организмом (например, Spiroplasma citri или другим штаммом,

соответствующим источнику клеток).

Область применения

■ Банки клеток: Главный, рабочий банк клеток (рекомендовано для клеток

насекомых)

■ Типы клеток: линия диплоидных клеток, линия стволовых клеток, непрерывная

клеточная линия (рекомендовано для субстратов клеток насекомых, а также когда сырье

растительного происхождения используется в подготовке банка клеток или в процессе

производства)

B.11.3.3 Микобактерии

Для микобактерий испытания проводятся, как описано ниже, или с помощью

метода, утвержденного национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией.

В трёх параллельных опытах высевают 0,2 мл образца на две подходящих твердых

среды (например, среда Левенштейна–Йенсена и среда Миддлбрука 7H10). В трёх

параллельных опытах инокулируют на подходящую жидкую среду 0,5 мл образца и

инкубируют при 37 °C в течение 56 дней.

В некоторых странах инкубационный период составляет 42 дня.

Одновременно с испытаниями исследуемого образца следует проводить

аналогичные испытания с использованием положительного контроля, чтобы

продемонстрировать, что испытание позволяет обнаруживать рост небольшого количества

микобактерий. Кроме того, следует установить продуктивность среды в присутствии

препарата, который нужно исследовать, с помощью инокуляции точно измеренного

количества соответствующего штамма какого-либо вида Mycobacterium, например,

бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ). Если по завершении инкубационного периода не

отмечается роста микобактерий ни в одной из исследуемых сред, а опыты с

положительным контролем и инокуляцией точно измеренных образцов демонстрируют

соответствующий рост, то препарат считается прошедшим испытание.

В качестве альтернативы такому культуральному методу может использоваться

технология NAT, если продемонстрировано, что этот анализ сопоставим с

фармакопейным культуральным методом. Следует провести надлежащее исследование

сопоставимости, включающее сравнение пределов чувствительности, характерных для

альтернативного и культурального методов. Также следует учесть специфичность (панель

обнаруженных микобактерий, возможные ложноположительные результаты из-за

перекрестной реакции на другие бактерии). Можно также использовать метод in vivo,

описанный для испытания на морских свинках (см. раздел B.11.2.1.3).

Область применения

■ Банки клеток: Главный или рабочий банк клеток

■ Типы клеток: культура первичных клеток, линия диплоидных клеток, линия

стволовых клеток, непрерывная клеточная линия

B.11.4 Трансмиссивные губчатые энцефалопатии

Трансмиссивные губчатые энцефалопатии – это группа медленно развивающихся

смертельных неврологических заболеваний, поражающих мозг животных и человека.

Сегодня принято считать, что их вызывают неконвенциональные инфекционные агенты,

известные как ТГЭ-ассоциированные прионы (PrP

tse

), которые представляют собой

нормальный прионный белок хозяина (PrP) с аномальной структурой. ТГЭ включают

губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, скрепи овец, болезнь Крейтцфельда-

Якоба, включая ее вариантную форму (vCJD), синдром Герстманна-Штреусслера-

Шейнкера (GSS) и фатальную семейную бессонницу (FFI) у человека, хронический

вастинг-синдром лосей и оленей (CWD) и трансмиссивную энцефалопатию норок 118,

119. Нормальный белок PrP (PrPc) может экспрессироваться на поверхностях клетки, но

in vivo пептидные цепи могут свернуться неправильно, и белок примет вызывающую

заболевание аномальную форму PrP

tse

, которая может катализировать превращение

нормального белка PrPc в белок с аномальной структурой. По сравнению с PrPc, прион

PrP

tse

относительно устойчив к воздействию протеолитических ферментов, таких как

протеиназа К.

Губчатую энцефалопатию КРС впервые описали в Великобритании в 1984 году, а

пик заболеваемости пришелся на 1992-1993 годы. Животные в других странах тоже

пострадали. На текущий момент количество обнаруживаемых за год новых заражений

низкое 120. Однако губчатая энцефалопатия КРС продолжает вызывать беспокойство,

так как все еще встречается, хотя и редко, и имеет долгосрочные последствия из-за

длительного инкубационного периода заболевания, прогнозируемого периода службы

банков клеток и сложности процессов, с помощью которых они создаются.

Губчатая энцефалопатия КРС передается людям в виде вариантной формы болезни

Крейтцфельда-Якоба. Около 200 человек были заражены либо при прямом контакте с

инфицированным губчатой энцефалопатией КРС сырьем, либо при контакте с вторичным

переносчиком –эритроцитами, не обедненными лейкоцитами. Классическая болезнь

Крейтцфельда-Якоба также переносится в ходе медицинских процедур, включающих

введение трупного препарата гормона роста 121, трансплантацию роговицы и

использование твёрдой мозговой оболочки, и этими же путями может происходить

заражение вариантной формой болезни. Также вариантная форма переносится

препаратами на основе крови человека. Несмотря на то, что нет свидетельств переноса

вариантной формы болезни Крейтцфельда-Якоба препаратами на основе плазмы крови, в

сфере здравоохранения были введены меры предосторожности для сокращения

возможного риска передачи вариантной формы болезни этим путем в будущем 122.

Получаемые от крупного рогатого скота белковые продукты, включая сыворотку крови,

часто используются для выращивания клеток в культуре и производства биологических

препаратов, в том числе вакцин и рекомбинантных препаратов. Поэтому важно

гарантировать, что любой полученный от жвачных животных материал, используемый в

биофармацевтическом производстве, не заражен агентами, вызывающими ТГЭ. Более

того, поскольку существует возможный, но не поддающийся количественному

определению риск контаминации клеток агентами, вызывающими ТГЭ, важно исключить

использование потенциально зараженных материалов, полученных от жвачных животных,

с самого начала разработки какой-либо клеточной линии. Если «наследие» линии клеток

невозможно отследить полностью, следует предпринять оценку риска, чтобы на ее

основании принять решение о соответствии линии клеток предполагаемому

предназначению. На текущий момент не существует практически применяемого

валидированного анализа, который можно использовать для тестирования биологических

препаратов или клеточных линий на возбудители ТГЭ, кроме заражения восприимчивых к

инфекции видов животных, осуществление которого представляют большую сложность

из-за долгого инкубационного периода заболевания. Сейчас изучаются более удобные для

проведения тесты, такие как циклическая амплификация неправильно

свернутого белка (PMCA), которая аналогична ПЦР для нуклеиновых кислот, и

количественные анализы экранирования эпитопа 123, но их эффективность для

обнаружения возбудителей губчатой энцефалопатии КРС в биологических препаратах или

линиях клеток пока не определена. Таким образом, стратегии по минимизации риска до

настоящего момента основывались на отборе исходных материалов из стран, в которых

очень низок риск инфекции, и на замене материалов животного происхождения на

неживотные материалы.

B.11.4.1 Категории инфекционности тканей

ВОЗ и другие научные организации, такие как Европейское агентство по

лекарственным средствам, подразделяют ткани жвачных животных на три категории

(категория A – высокая инфекционность; категория B – низкая инфекционность;

категория C – не поддающаяся обнаружению инфекционность) 57, 124. К категории A

относят головной мозг, а к категории C – такие ткани, как семенники и желчь. Анализы с

более высокой чувствительностью показали инфекционность таких тканей, как мышцы,

которые ранее считали свободными от инфекционных агентов. Это подразумевает, что в

то время как определенные ткани имеют высокую инфекционность, многие другие ткани

могут иметь настолько низкий уровень инфекционности, что его сложно обнаружить 57,

124–126.

B.11.4.2 Меры контроля, выбор источников и отслеживаемость

Если доступны эффективные альтернативы материалам, получаемым от жвачных

животных, их следует использовать в культивировании клеток и процедурах

производства. В качестве примера можно привести следующие варианты: не содержащая

материалов животного происхождения среда для культивирования клеток, полисорбат и

стеарат магния растительного происхождения, рекомбинантный инсулин, синтетические

аминокислоты, и ферменты бактериального происхождения, например, сычужный

фермент (используется для производства лактозы). Следует отметить, что

рекомбинантные материалы сами по себе могут подвергаться воздействию животных

материалов, поэтому следует принять к сведению эту возможность при выборе

рекомбинантных материалов в качестве альтернативы. Однако не всегда возможно

использовать компоненты, которые не содержат материалов животного происхождения, и

сырье, полученное не от жвачных животных. Например, фетальная бычья сыворотка

может быть необходима для разработки клеточных линий или для ферментации. В таком

случае сырье следует получать из стран, отнесенных Всемирной организацией

здравоохранения животных (OIE) к категории стран с незначительным риском губчатой

энцефалопатии КРС (географический риск 1 уровня или GBR I), согласно классификации

Европейского агентства по безопасности пищевых продуктов. Сырье категории С можно

получать из стран, которым был присвоен статус страны с контролируемым риском, при

условии, что есть гарантии отсутствия перекрестной контаминации с материалами

категорий А или В в ходе отбора и обработки этого сырья (с разъяснением, что хотя

уровень их инфекционности не поддается обнаружению, они все равно могут быть

инфекционными). Производителям следует вести записи, чтобы готовый продукт из

каждой серии можно было отследить до источника любого использованного в

производстве ингредиента, полученного от жвачных животных, с которым может быть

занесен возбудитель губчатой энцефалопатии КРС, а каждый полученный от жвачных

животных ингредиент прослеживался до готового препарата. Это относится и к

ингредиентам, используемым для разработки и создания главного и рабочего банка

клеток. А также должна быть возможность в максимальной степени отследить историю

препарата до получения самой клеточной линии. Отслеживаемость в обоих направлениях

важна для соответствующих регуляторных действий, если в ходе нового научного

исследования будет обнаружен риск заражения губчатой энцефалопатией КРС, или если

выяснится, что использование препаратов вызывает развитие вариантной болезни

Крейтцфельда-Якоба. Ни при каких обстоятельствах нельзя использовать в производстве

биологических препаратов материалы категорий А и В, полученные от жвачных

животных из энзоотичных по губчатой энцефалопатии КРС стран. Поскольку новые

случаи развития губчатой энцефалопатии КРС продолжают возникать, несмотря на

запреты на использование в кормах отходов скотобоен, поскольку подходящих анализов

на возбудители инфекционной губчатой энцефалопатии в сырье еще не существует, и

поскольку научные разработки указывают на присутствие патологических прионов в

материалах категории С, наилучшим подходом к обеспечению безопасности в отношении

возбудителей этой болезни является отказ от использования белков животного

происхождения. Следующим по эффективности подходом является получение сырья из

стран, которые классифицированы как не подверженные губчатой энцефалопатии КРС, но

при этом необходимо учитывать, что в будущем и там могут быть зафиксированы случаи

развития этого заболевания.

B.11.4.3 Испытания

На настоящий момент не существует анализов, подходящих для обнаружения

возбудителей инфекционной губчатой энцефалопатии в сырье, полученном от

человека/жвачных животных, похожих на серологические анализы или ПЦР для

скрининга на возбудители вирусных инфекций. Разрабатываются новые тесты для

скрининга на присутствие возбудителей ТГЭ в крови (такие как циклическая

амплификация неправильно свернутого белка, количественный анализ экранирования

эпитопа и другие). Возможно, после того как эти испытания пройдут валидацию, они

станут пригодными для скрининга сырья и банков клеток.

Около 15% случаев возникновения трансмиссивных губчатых энцефалопатий у

людей ассоциируется с наследственной мутацией гена PrP. Эти наследственные, но

заразные формы трансмиссивных губчатых энцефалопатий ассоциируются примерно с 30

известными патогенными мутациями или вставками и делециями в октапептидных

повторах белка PrP [127]. Следует секвенировать ген PrP в новых субстратах клеток

человека, чтобы исключить наличие таких генетических изменений.

B.12 Краткое описание испытаний для оценки и определения

характеристик субстратов клеток животных

В данном разделе представлен обзор испытаний, которые рекомендованы для

оценки и определения характеристик субстратов клеток животных, которые предлагается

использовать для производства биологических препаратов. Не все испытания подходят

для всех субстратов, но следует рассмотреть возможность проведения каждого из них и

определить, подходит ли отдельное испытания для конкретного субстрата в контексте его

использования для производства определенного препарата. В дополнение следует дать

обоснование тому, в какой(ие) момент(ы) проводить какое-либо испытание. В целом

стратегия тестирования должна обеспечивать гарантии, что в процессе производства риск

сокращается до разумного для продукта и его назначения предела. Стратегию

тестирования следует также согласовать с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией.

B.12.1 Посевной фонд клеток

Посевной фонд клеток обычно получают из определенного источника клеток или

тканей с учетом его возможной полезности для разработки биологического препарата. В

некоторых случаях от посевного фонда могут ожидать, что он послужит субстратом для

производства нескольких продуктов. Стандартные банки клеток (см. также раздел A.5.3)

можно считать посевными фондами клеток. Количество клеток посевного фонда обычно

ограничено, поэтому проведение большое количество испытаний не представляется

возможным. По этой причине некоторое количество клеток посевного фонда используется

для создания запаса клеток в количестве, которое достаточно для более тщательного

тестирования, и которое может служить долгосрочным источником клеток для

производства. Этот вторичный источник клеток обычно называют главным банком

клеток. Однако клетки посевного фонда также могут использоваться для производства

дополнительного материала на ранних пассажах, который можно использовать для

создания банка (заготовки для главного банка клеток) и производства главных банков

клеток, характеристики которых будут затем определяться, как описано в данном

документе.

Посевные фонды клеток можно тестировать в любое время до момента создания

главного банка клеток. Обычно такое тестирование ограничивается получением

информации, которая имеет особую важность для принятия решения об использовании

материала для создания главного банка клеток. Обычно оно включает изучение

жизнеспособности, структуры, идентичности (например, кариотипа, изоферментов) и

стерильности (например, в отношении бактерий, грибов и микоплазм) посевного фонда

клеток. Эти данные очень важны в качестве справочной информации, но они не могут

заменить полного определения характеристик главного банка клеток.

B.12.2 Главный и рабочий банк клеток

Как правило, главный банк клеток разрабатывается для производства достаточного

количества клеток, чтобы заполнить достаточное количество пробирок для производства

большого количества рабочих банков клеток на протяжении продолжительного периода

времени (обычно, годы). Главные банки клеток обычно содержат минимум 200 пробирок,

а часто 1000 и больше. В рабочем банке клеток также должно быть достаточное

количество пробирок, чтобы предоставить материал для определения характеристик

линии клеток.

Некоторые испытания рабочего банка проводятся на клетках, восстановленных

непосредственно из самого банка, а другие – на клетках, которые доводят до пассажа, на

котором они должны использоваться в производстве, или более позднего пассажа. Также

некоторые анализы могут подходить для использования в рамках

внутрипроизводственного контроля. В таком случае их следует определять и описывать в

рекомендациях к специфическим препаратам.

Список литературы:

1. Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of

biologicals. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Forty-seventh report.

Geneva, World Health Organization, 1998 (WHO Technical Report Series, No. 878), Annex 1.

2. Hilleman MR. Cells, vaccines, and the pursuit of precedent. National Cancer Institute

Monograph, 1968, 29:463–470.

3. Hayflick L, Plotkin S, Stevenson R. History of the acceptance of human diploid cell

strains as substrates for human virus vaccine production. Developments in Biological

Standardization, 1987, 68:9–17.

4. Requirements for poliomyelitis vaccine (inactivated). In: Requirements for biological

substances: 1. general requirements for manufacturing establishments and control laboratories;

2. Requirements for poliomyelitis vaccine (inactivated). Report of a Study Group. Geneva, World

Health Organization, 1959 (WHO Technical Report Series, No. 178).

5. Requirements for poliomyelitis vaccine (inactivated). In: Requirements for biological

substances. Report of a WHO Expert Group. Geneva, World Health Organization, 1966 (WHO

Technical Report Series, No. 323).

6. Hayflick L. History of the development of human diploid cell strains. In: Proceedings

of the Symposium on the Characterization and Uses of Human Diploid Cell Strains, Opatija,

1963, Yugoslavia. Ljubljana, Casopisno podjetje, 1963:37–54.

7. Hayflick L. A brief history of cell substrates used for the preparation of human

biologicals. Developmental Biology, 2001, 106:5–23.

8. Suggested methods for the management and testing of diploid cell culture used for

virus vaccine production. In: Proceedings of the Symposium on Human Diploid Cells, Zagreb,

1970 Yugoslavia. Zagreb, Izdavacki zavod Jugoslavenske akademije, 1970:213–216.

9. Requirements for poliomyelitis vaccine (oral). (requirements for biological substances,

No. 7). In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-fourth report.

Geneva, World Health Organization, 1972 (WHO Technical Report Series, No. 486), Annex 1.

10. Derivation and characterization of cell substrates used for production of

biotechnological/biological products. Geneva, International Conference on Harmonisation, 1997

(http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5D/Step4/

Q5D_Guideline.pdf, accessed 18 June 2011).

11. Guidance for industry. Characterization and qualification of cell substrates and other

biological starting materials used in the production of viral vaccines for the prevention of

infectious diseases. Rockville, MD, United States Food and Drug Administration, 2010

(http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInfor

mation/Guidances/Vaccines/UCM202439.pdf, accessed 18 June 2011).

12. Acceptability of cell substrates for production of biologicals. Report of a WHO Study

Group on Biologicals. Geneva, World Health Organization, 1987 (WHO Technical Report

Series, No. 747).

13. Requirements for continuous cell lines used for biologicals production. In: WHO

Expert Committee on Biological Standardization. Thirty-sixth report. Geneva, World Health

Organization, 1987 (WHO Technical Report Series, No. 745), Annex 3.

14. Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or

animal origin. Geneva, International Conference on Harmonisation, 1999

(http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5A_R1/Ste

p4/Q5A_R1__Guideline.pdf, accessed 18 June 2011).

15. Analysis of the expression construct in cells used for production of r-DNA derived

protein products. Geneva, International Conference on Harmonisation, 1995

(http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5B/Step4/Q

5B_Guideline.pdf, accessed 18 June 2011).

16. Requirements for diphtheria, tetanus, pertussis and combined vaccines (revised 1989).

In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fortieth report. Geneva, World

Health Organization, 1990 (WHO Technical Report Series, No. 800), Annex 2.

17. Schaeffer WI. Terminology associated with cell, tissue, and organ culture, molecular

biology, and molecular genetics. Tissue Culture Association Terminology Committee. In Vitro

Cellular and Developmental Biology, 1990, 26:97–101.

18. Hendriksen CFM, ed. Laboratory animals in vaccine production and control:

replacement, reduction and refinement. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, 1988.

19. Jacobs JP. Updated results on the karyology of the WI-38, MRC-5 and MRC-9 cell

strains. Developments in Biological Standardization, 1976, 37:155–156.

20. Jacobs JP et al. Guidelines for the acceptability, management and testing of serially

propagated human diploid cells for the production of live virus vaccines for use in man. Journal

of Biological Standardization, 1981, 9:331–342.

21. Petricciani JC et al. Karyology standards for rhesus diploid cell line DBS-FRhL-2.

Journal of Biological Standardization, 1976, 4:43–49.

22. Schollmayer E et al. High resolution analysis and differential condensation in RBA-

banded human chromosomes. Human Genetics, 1981, 59:187–193.

23. Rønne M. Chromosome preparation and high resolution banding techniques: a

review. Journal of Dairy Science, 1989, 72:1363–1377.

24. Healy LE, Ludwig TE, Choo A. International banking: checks, deposits, and

withdrawals. Cell Stem Cell, 2008, 2(4):305–306.

25. Laflamme MA et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in

pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology, 2007,

25(9):1015–1024.

26. Fleckenstein B, Daniel MD, Hunt RD. Tumour inductions with DNA of oncogenic

primate herpesviruses. Nature, 1978, 274:57–59.

27. Petricciani JC, Regan PJ. Risk of neoplastic transformation from cellular DNA:

calculations using the oncogene model. Developments in Biological Standardization, 1986,

68:43–49.

28. Temin HM. Overview of biological effects of addition of DNA molecules to cells.

Journal of Medical Virology, 1990, 31:13–17.

29. Wierenga DE, Cogan J, Petriccaini JC. Administration of tumour cell chromatin to

immunosuppressed and non-immunosuppressed primates. Biologicals, 1995, 23:221–224.

30. Petricciani JC, Horaud FN. DNA, dragons, and sanity. Biologicals, 1995, 23:233–

238.

31. Nichols WW et al. Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Annals

of the New York Academy of Sciences, 1995, 772:30–38.

32. Kurth R. Risk potential of the chromosomal insertion of foreign DNA. Annals of the

New York Academy of Sciences, 1995, 772:140–150.

33. Coffin JM. Molecular mechanisms of nucleic acid integration. Journal of Medical

Virology, 1990, 31:43–49.

34. Sheng L et al. Oncogenicity of DNA in vivo: tumour induction with expression

plasmids for activated H-ras and c-myc. Biologicals, 2008, 36:184–197.

35. Garnick RL. Experience with viral contamination in cell culture. Developments in

Biological Standardization, 1996, 88:49–56.

36. Burstyn DG. Contamination of the CHO cells by orbiviruses. Developments in

Biological Standardization, 1996, 88:199–203.

37. Rabenau H et al. Contamination of genetically engineered Chinese hamster ovary

cells. Biologicals, 1993, 21(3):207–214.

38. Sheng-Fowler L, Lewis AM Jr, Peden K. Quantitative determination of the infectivity

of the proviral DNA of a retrovirus in vitro. Evaluation of methods for DNA inactivation.

Biologicals, 2009, 37:259–269.

39. Lewis AM Jr., Krause P, Peden K. A defined-risks approach to the regulatory

assessment of the use of tumourigenic cells as substrates for viral vaccine manufacture.

Developmental Biology, 2001, 106:513–535.

40. Krause PR, Lewis AM Jr. Safety of viral DNA in biological products. Biologicals,

1998, 26:317–320.

41. Sheng-Fowler L, Lewis AM Jr., Peden K. Issues associated with residual cell-

substrate DNA in viral vaccines. Biologicals, 2009, 37:190–195.

42. Ledwith BJ et al. Plasmid DNA vaccines: investigation of integration into host

cellular DNA following intramuscular injection in mice. Intervirology, 2000, 43:258–272.

43. Sheng-Fowler L et al. Tumors induced in mice by direct inoculation of plasmid DNA

expressing both activated H-ras and c-myc. International Journal of Biological Sciences, 2010,

6:151–162.

44. Burns PA et al. Transformation of mouse skin endothelial cells in vivo by direct

application of plasmid DNA encoding the human T24 H-ras oncogene. Oncogene, 1991,

6:1973–1978.

45. Meng F et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumour suppressor

gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology, 2007, 133:647–658.

46. Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by

microRNA-10b in breast cancer. Nature, 2007, 449:682–688.

47. He L et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature, 2005,

435:828–833.

48. Hayashita Y et al. A polycistronic microRNA cluster, miR-17-92, is over expressed in

human lung cancers and enhances cell proliferation. Cancer Research, 2005, 65:9628–9632.

49. Israel MA et al. Biological activity of polyoma viral DNA in mice and hamsters.

Journal of Virology, 1979, 29:990–996.

50. Peden K et al. Biological activity of residual cell-substrate DNA. Developmental

Biology (Basel), 2006, 123:45–53.

51. Perrin P, Morgeaux S. Inactivation of DNA by beta-propiolactone. Biologicals, 1995,

23:207–211.

52. Lebron JA et al. Adaptation of the WHO guideline for residual DNA in parenteral

vaccines produced on continuous cell lines to a limit for oral vaccines. Developmental Biology

(Basel), 2006, 123:35–44.

53. Oh YK et al. Nasal absorption and biodistribution of plasmid DNA: an alternative

route of DNA vaccine delivery. Vaccine, 2001, 19:4519–4525.

54. Coecke S et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the Second

ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. Alternatives to Laboratory Animals/ATLA,

2005, 33:1–27.

55. Consensus guidance for banking and supply of human embryonic stem cell lines for

research purposes. Stem Cell Reviews and Reports, 2009, 5:301–314.

56. Stacey GN. Risk assessment of cell culture processes. In: Stacey GN, Davis JM, eds.

Medicines from animal cell culture. Chichester, J Wiley & Sons, 2007:567–587.

57. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform

encephalopathies. Geneva, World Health Organization, 2006

(http://www.who.int/bloodproducts/tse/WHO%20TSE%20Guidelines%20FINAL-

22%20JuneupdatedNL.pdf, accessed 18 June 2011).

58. Plavsic ZM, Bolin S. Resistance of porcine circovirus to gamma irradiation.

BioPharm International, 2001, 14:32–36.

59. Requirements for the collection, processing and quality control of blood, blood

components and plasma derivatives. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization.

Forty-third report. Geneva, World Health Organization, 1994 (WHO Technical Report Series,

No. 840), Annex 2.

60. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines.

Nature Protocols, 2008, 3(12):1981–1989.

61. Chu L, Robinson DK. Industrial choices for protein production by large-scale cell

culture. Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12:180–187.

62. Ho Y, Varley J, Mantalaris A. Development and analysis of a mathematical model for

antibodyproducing GS-NSO cells under normal and hyperosmotic culture conditions.

Biotechnology Progress, 2006, 22:1560–1569.

63. McPherson I, Montagnier I. Agar suspension culture for the selective assay of cells

transformed by polyoma virus. Virology, 1964, 23:291–294.

64. Petricciani JC, Levenbook I, Locke R. Human muscle: a model for the study of

human neoplasia. Investigational New Drugs, 1983, 1:297–302.

65. Giovanella BC et al. Development of invasive tumours in nude mice after injection of

cultured human melanoma cell. Journal of the National Cancer Institute, 1972, 48:1531–1534.

66. Manohar M et al. Assessing the tumorigenic phenotype of VERO cells in adult and

newborn nude mice. Biologicals, 2008, 36:65–72.

67. Hentze H et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of

essential parameters for future safety studies. Stem Cell Research, 2009, 2:198–210.

68. van Steenis G, van Wezel AL. Use of ATG-treated newborn rat for in vivo

tumorigenicity testing of cell substrates. Developments in Biological Standardization, 1982,

50:37–46.

69. Noguchi PD, Johnson JB, Petricciani JC. Comparison of the nude mouse and

immunosuppressed newborn hamsters as a quantitative tumorigenicity test for human cell lines.

Pathology, 1979, 7:302–304.

70. Wallace R, Vasington PJ, Petricciani JC. Heterotransplantation of cultured cell lines

in newborn hamsters treated with antilymphocyte serum. Nature, 1971, 230:454–455.

71. Foley GE et al. Assessment of potential malignancy of cultured cells: further

observations on the differentiation of “normal” and “neoplastic” cells maintained in vitro by

heterotransplantation in Syrian hamsters. National Cancer Institute Monograph, 1962, 7:173–

204.

72. Petricciani JC, Martin DP. Use of nonhuman primates for assaying tumorigenicity of

viral-vaccine cell substrates. Transplantation Proceedings, 1974, 6:189–192.

73. Furesz J et al. Tumorigenicity testing of various cell substrates for production of

biologicals. Developments in Biological Standardization, 1989, 70:233–243.

74. Levenbook I et al. Tumorigenicity testing of primate cell lines in nude mice, muscle

organ culture and for colony formation in soft agarose. Journal of Biological Standardization,

1985, 13:135–141.

75. Levenbook I, Smith PL, Petricciani JC. A comparison of three routes of inoculation

for testing tumorigenicity of cell lines in nude mice. Journal of Biological Standardization,

1981, 9:75–80.

76. Lewis AM Jr et al. Evaluating virus-transformed cell tumorigenicity. Journal of

Virological Methods, 1999, 79:41–50.

77. Pulciani S et al. Transforming genes in human tumours. Journal of Cellular

Biochemistry, 1982, 20:51–61.

78. Murray MJ et al. Three different human tumour cell lines contain different

oncogenes. Cell, 1981, 25:355–361.

79. Shih C et al. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into

mouse fibroblasts. Nature, 1981, 290:261–264.

80. Wood DJ, Minor PD. Meeting report. Use of human diploid cells in vaccine

production. Biologicals, 1990, 18:143–146.

81. Shaffer LG, Tommerup N, eds. An international system for human cytogenetic

nomenclature. Basel, Karger, 2005.

82. Recommendations for the production and control of poliomyelitis vaccine (oral). In:

WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fiftieth report. Geneva, World Health

Organization, 2002 (WHO Technical Report Series, No. 904), Annex 1.

83. Requirements for measles, mumps and rubella vaccines and combined vaccine (live)

(requirements for Biological Substances No. 47). In: WHO Expert Committee on Biological

Standardization. Fortyfourth report. Geneva, World Health Organization, 1994 (WHO Technical

Report Series, No. 848), Note.

84. Nicklas W, Kraft V, Meyer B. Contamination of transplantable tumours, cell lines,

and monoclonal antibodies with rodent viruses. Laboratory Animal Science, 1993, 43(4):296–

300.

85. Collins MJ, Parker JC. Murine virus contaminants of leukemia viruses and

transplantable tumours. Journal of the National Cancer Institute, 1972, 49(4):1139–1143.

86. Bierley ST et al. A comparison of methods for the estimation of retroviral burden.

Developments in Biological Standardization, 1996, 88:163–165.

87. Goff SP. Retroviridae: the retroviruses and their replication. In: Knipe DM et al., eds.

Fields virology, 5th ed. Baltimore, MD, Lippincott, Williams & Wilkins, 2007:199–2069.

88. Arnold BA, Hepler RW, Keller PM. One-step fluorescent probe product-enhanced

reverse transcriptase assay. Biotechniques, 1998, 25:98–106.

89. Maudru T, Peden KW. Adaptation of the fluorogenic 5'-nuclease chemistry to a PCR-

based reverse transcriptase assay. Biotechniques, 1998, 25:972–975.

90. Lovatt A et al. High throughput detection of retrovirus-associated reverse

transcriptase using an improved fluorescent product enhanced reverse transcriptase assay and its

comparison to conventional detection methods. Journal of Virological Methods, 1999, 82:185–

200.

91. Sears JF, Khan AS. Single-tube fluorescent product-enhanced reverse transcriptase

assay with Ampliwax (STF-PERT) for retrovirus quantitation. Journal of Virological Methods,

2003, 108:139–142.

92. Pyra H, Böni J, Schüpbach J. Ultrasensitive retrovirus detection by a reverse

transcriptase assay based on product enhancement. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 1994, 91:1544–1548.

93. Böni J, Pyra H, Schüpbach J. Sensitive detection and quantification of particle-

associated reverse transcriptase in plasma of HIV-1-infected individuals by the product-

enhanced reverse transcriptase (PERT) assay. Journal of Medical Virology, 1996, 49:23–28.

94. Böni J et al. Detection of reverse transcriptase activity in live attenuated virus

vaccines. Clinical and Diagnostic Virology, 1996, 5:43–53.

95. Weissmahr RN, Schüpbach J, Böni J. Reverse transcriptase activity in chicken

embryo fibroblast culture supernatants is associated with particles containing endogenous avian

retrovirus EAV-0RNA. Journal of Virology, 1997, 71:3005–3012.

96. Khan AS et al. The reverse transcriptase activity in cell-free medium of chicken

embryo fibroblast cultures is not associated with a replication-competent retrovirus. Journal of

Clinical Virology, 1998, 11:7–18.

97. Maudru T, Peden K. Elimination of background signals in a modified polymerase

chain reactionbased reverse transcriptase assay. Journal of Virological Methods, 1997, 66:247–

261.

98. Lugert R et al. Specific suppression of false-positive signals in the product-enhanced

reverse transcriptase assay. Biotechniques, 1996, 20:210–217.

99. Voisset C et al. Specific detection of RT activity in culture supernatants of retrovirus-

producing cells, using synthetic DNA as competitor in polymerase enhanced reverse

transcriptase assay. Journal of Virological Methods, 2001, 94:187–193.

100. Fan XY et al. A modified single-tube one-step product-enhanced reverse

transcriptase (mSTOSPERT) assay with heparin as DNA polymerase inhibitor for specific

detection of RTase activity. Journal of Clinical Virology, 2006, 37:305–312.

101. Peebles PT. An in vitro focus-induction assay for xenotropic murine leukemia virus,

feline leukemia virus C, and the feline-primate viruses RD-114/CCC/M-7. Virology, 1975,

67:288–291.

102. Sommerfelt MA, Weiss RA. Receptor interference groups of 20 retroviruses plating

on human cells. Virology, 1990, 176:58–69.

103. Onions D, Kolman J. Massively parallel sequencing, a new method for detecting

adventitious agents. Biologicals, 2010, 38:377–380.

104. Wang D et al. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS

Biology, 2003, 1:E2.

105. Ecker DJ et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nature

Reviews, Microbiology, 2008, 6:553–558.

106. Allander T et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of

respiratory tract samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America, 2005, 102(43):12891–12896.

107. Gaynor AM et al. Identification of a novel polyomavirus from patients with acute

respiratory tract infections. PLoS Pathogens, 2007, 3(5):E64.

108. Allander T et al. A virus discovery method incorporating DNase treatment and its

application to the identification of two bovine parvovirus species. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(20):11609–11614.

109. Allander T et al. Identification of a third human polyomavirus. Journal of Virology,

2007, 81(8):4130–4136.

110. Victoria JG et al. Viral nucleic acids in live-attenuated vaccines: detection of

minority variants and an adventitious virus. Journal of Virology, 2010, 84(12):6033–6040 (Epub

7 April 2010).

111. Sampath R et al. Global surveillance of emerging influenza virus genotypes by mass

spectrometry. PLoS One, 2007, 2:e489.

112. General requirements for the sterility of biological substances (requirements for

biological substances, No. 6, revised 1973). In: WHO Expert Committee on Biological

Standardization. Twentyfifth report. Geneva, World Health Organization, 1973 (WHO Technical

Report Series, No. 530), Annex 4.

113. Sterility test. In: Code of Federal Regulations Title 21. Washington. DC, National

Archives and Records Administration, 2010, Section 610.12.

114. USP 35-NF 30, Sterility tests <71> . In: United States pharmacopeia. Rockville,

MD, US Pharmacopeial Convention, 2012:69–74.

115. Sterility. In: European pharmacopoeia, 6th ed. Strasbourg, EDQM Publications,

2007, Section 2.6.1.

116. General requirements for the sterility of biological substances (requirements for

biological substances, No. 6, revised 1973). In: WHO Expert Committee on Biological

Standardization. Fortysixth report. Geneva, World Health Organization, 1998 (WHO Technical

Report Series, No. 872), Annex 3.

117. Mycoplasmas. In: European pharmacopoeia, 6th ed. Strasbourg, EDQM

Publications, 2007, Section 2.6.7.

118. Kovacs GG, Budka H. Prion diseases: from protein to cell pathology. American

Journal of Pathology, 2008, 172:555–565.

119. Ryou C. Prions and prion diseases: fundamentals and mechanistic details. Journal of

Microbiology and Biotechnology, 2007, 17:1059–1070.

120. Number of reported cases of bovine spongiform encephalopathy (BSE) in farmed

cattle worldwide (excluding the United Kingdom). Paris, World Organisation for Animal Health

(http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/bse-specific-data/number-of-reported-cases-

worldwideexcluding-the-united-kingdom/, accessed 29 June 2011).

121. Preece M.A. Creutzfeldt-Jakob disease following treatment with human pituitary

hormones. Clinical Endocrinology, 1991, 34:527–529.

122. Millar CM et al. Risk reduction strategies for variant Creutzfeldt–Jakob disease

transmission by UK plasma products and their impact on patients with inherited bleeding

disorders. Haemophilia, 2010, 16(2):305–315.

123. Minor P, Brown P. Diagnostic tests for antemortem screening of Creutzfeldt–Jakob

disease. In: Turner ML, ed. Creutzfeldt–Jakob disease: managing the risk of transmission by

blood, plasma, and tissues. Bethesda, MD, AABB, 2006:119–148.

124. WHO tables on guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible

spongiform encephalopathies. Geneva, World Health Organization, 2010

(WHO/EMP/QSM/2010.1; http://www.who.int/bloodproducts/tablestissueinfectivity.pdf,

accessed 18 June 2011).

125. Update of the opinion on TSE infectivity distribution in ruminant tissues. Brussels,

Health and Consumer Protection Directorate-General, European Commission, 2002

(http://ec.europa.eu/food/fs/sc/ssc/out296_en.pdf, accessed 18 July 2011).

126. Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform

encephalopathy agents via human and veterinary medicinal products (EMA/410/01 rev.3).

Official Journal of the European Union, 5 March 2011, C 73/1–C 73 18

(http://www.emea.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC50

0003700.pdf, accessed 28 February 2013).

127. McKintosh E, Tabrizi SJ, Collinge J. Prion diseases. Journal of Neurovirology,

2003, 9(2):183–193.

Приложение 1

Испытания на вирусы крупного рогатого скота в сыворотке,

применяемой для производства банков клеток

Перед использованием сыворотки в главных и рабочих банках клеток ее следует

испытывать на занесенные агенты, такие как бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы.

Также следует продумать стратегии смягчения риска, такие как инактивация высокой

температурой или иррадиацией, чтобы убедиться, что те занесенные агенты, которые не

были обнаружены в процессе производства и контроля качества сыворотки, будут

инактивированы до степени, допустимой национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией. Если в производстве сыворотки

используется иррадиация или другие методы инактивации (например, стерилизация

высокой температурой), следует проводить испытания на занесенные агенты перед

инактивацией, чтобы увеличить вероятность обнаружения контаминантов. Если в ходе

какого-либо из испытаний обнаружены признаки вирусной контаминации, сыворотка

может считаться пригодной к использованию, только если вирус удалось

идентифицировать, а его содержание таково, что может быть эффективно

инактивировано, согласно полученным в ходе валидационного исследования данным.

Если есть признаки вирусной контаминации сыворотки, которую не планируется

подвергать процедуре инактивации/удаления вирусов, то такая сыворотка, как правило, не

подходит для применения. Если производитель решает все же использовать не

прошедшую инактивацию сыворотку, ему следует провести тщательное исследование

сыворотки на занесенные агенты, используя текущие передовые методы тестирования.

Если в сыворотке будут найдены какие-либо вирусы, то следует показать, что созданные

банки клеток не содержат обнаруженного(ых) вируса(ов).

Если применяется иррадиация, важно удостовериться, что для всех серий препарата и их отдельных

частей используется воспроизводимая доза излучения. Доза иррадиации должна быть достаточно

низкой, чтобы реактивы сохранили свои биологические свойства, но достаточно высокой, чтобы

сократить риск, который несут вирусы. Из этого следует, что такая доза иррадиации может не

являться стерилизующей.

Факторы, которые следует учитывать при тестировании

сыворотки

Сыворотка КРС может быть контаминирована широким рядом вирусов. Обычно

производители объединяют плазму в очень большие пулы, содержащие плазму до тысячи

животных. Поэтому многие серии сыворотки содержат поддающиеся обнаружению

последовательности вирусных геномов таких вирусов, как возбудитель вирусной диареи

КРС и полиомавирус КРС [1], при том, что заражение пула могло произойти по вине

одного животного с вирусемией.

Другие вирусы, например, вирус долины Кэш, вирус блютанга и вирус

эпизоотической-геморрагической болезни, вызывают спорадическую контаминацию и

могут ограничиваться каким-либо регионом. В некоторых случаях сообщалось только о

нескольких случаях контаминации, например, кальцивирусом 2117 [2].

Применение современных методов, таких как массивное параллельное

секвенирование, помогало обнаружить новые виды вирусов, например, парвовирусы,

некоторые из которых часто могут быть очень опасными контаминантами сыворотки [3,

4]. Значение и потенциальную патогенность этих вирусов требуется дополнительно

исследовать.

Важным фактором, который необходимо принимать во внимание при проведении

анализов, является то, что вирионы могут быть нейтрализованы антителами,

содержащимися в пуле плазмы. Рекомендуется устанавливать пределы содержания

антител, нейтрализующих возбудителей вирусной диареи КРС, так как они могут

осложнить обнаружение потенциального инфекционного вируса.

Следует знать о статистических ограничениях способности количественных

анализов обнаруживать вирусы в больших пулах сыворотки. Например, при

инфицировании биореактора вирусом долины Кэш было установлено, что в сыворотке

присутствовало менее 10 копий вируса на литр. В таком малом количестве вирус не

удалось обнаружить стандартными методами скрининга [5].

Общий скрининговый анализ на вирусы, вызывающие

инфекционные заболевания

Общий скрининговый анализ обычно предполагает культивирование

индикаторных клеток в течение 21 дня в среде, содержащей исследуемую сыворотку в

15% концентрации. Следует провести минимум два субпассажа клеток, обычно на 7 и 14

день. Для обнаружения вирусной инфекции требуется регулярно изучать исследуемые

образцы на предмет развития цитопатического эффекта, проводить тесты на

гемадсорбцию и иммунофлуоресцентные анализы (или использовать любые другие

подходящие иммунологические методы исследования) на специфические вирусы.

Иммунофлуоресцентный анализ особенно важен для обнаружения вируса диареи КРС, так

как многие изоляты не вызывают цитопатического эффекта. В завершении анализа

используется цитологическое окрашивание (например, по Гимза) для выявления вирусных

включений и других цитопатических явлений, которые не были обнаружены с помощью

визуального наблюдения за живыми клетками.

Следует подбирать такие индикаторные клетки, в которых может размножаться

большое количество вирусов КРС. Обычно используются клетки MDCK или клетки

носовых раковин КРС, и также имеет смысл включить в тестирование дополнительные

клетки, например, клетки Vero.

Этот анализ должен подходить для обнаружения следующих агентов: возбудителя

вирусной диареи КРС, вируса парагриппа типа 3 КРС, вируса папилломы КРС 1 типа

(BPV1), вируса бешенства, реовируса 3 типа, возбудителя инфекционного ринотрахеита

КРС (IBR), респираторно-синцитиального вируса КРС, вируса блютанга, аденовируса

КРС типа 5 и вируса везикулярного стоматита. Отдельные сосуды с индикаторными

клетками положительного контроля следует инфицировать каждым из

вышеперечисленных вирусов, кроме вируса бешенства. В качестве положительного

контроля для иммунофлуоресцентного анализа на вирус бешенства следует использовать

многолуночные планшеты, на которых закреплены инфицированные этим вирусом

клетки. Также следует использовать неинфицированные клетки отрицательного контроля.

Типичный анализ предполагает использование сосуда с площадью основания 75

см

, содержащего индикаторные клетки и в общей сложности ~250 мл исследуемой

сыворотки, в котором еще остается место для сыворотки для подкормки клеток после

пассирования.

Процедура

Подготовка анализа

Сначала подготавливаются сосуды с клетками негативного контроля и сосуды с

исследуемыми образцами. В сосуды с образцами инокулируют среду, в которой

поддерживается 15% содержание исследуемой сыворотки. Имитируют заражение сосудов

для отрицательного контроля сывороткой, которая заведомо не содержит поддающихся

обнаружению вирусов. На 7 день обычно требуется провести пассаж клеток.

Клетки положительного контроля получают из сосудов с клетками отрицательного

контроля на 13 или 14 день, или когда клетки достигнут ≥70% конфлюэнтности. Клетки

пересевают в колбы с площадью основания 25 см

(для проведения

иммунофлуоресцентного анализа) и шестилуночные планшеты (для проведения

испытания на гемадсорбцию и цитологического окрашивания).

На следующий день оставшиеся клетки отрицательного контроля и исследуемые

клетки пересевают в колбы с основанием 75 см

для проведения иммунофлуоресцентного

анализа и шестилуночные планшеты для испытания на гемадсорбцию и цитологического

окрашивания.

Инфицирование положительным контролем

Одновременно с последним пересевом культур исследуемого материала и клеток

отрицательного контроля, колбы с клетками носовых раковин КРС инокулируют

возбудителями вирусной диареи КРС, аденовируса КРС 5 типа, парвовируса крупного

рогатого скота, блютанга, респираторно-синцитиального вируса КРС, инфекционного

ринотрахеита КРС и парагриппа типа 3 КРС. Планшеты с клетками носовых раковин КРС

инокулируют вирусом парагриппа типа 3 КРС, положительным контролем для испытания

на гемадсорбцию, и вызывающим цитопатический эффект вирусом диареи крупного

рогатого скота, положительным контролем для цитологического окрашивания. Таким же

образом колбы с клетками Vero инокулируют реовирусом 3 типа, положительным

контролем для испытания на гемадсорбцию, а планшеты инокулируют вирусом

парагриппа типа 3 КРС, положительным контролем для испытания на гемадсорбцию и

цитологического окрашивания. Все вирусы для положительного контроля в

иммунофлуоресцентных анализах следует инокулировать в количестве 100–300 средних

инфекционных доз в тканевой культуре (TCID

Анализ

Культуры клеток отрицательного контроля и клеток исследуемого материала

тестируют на гемадсорбцию, а также закрепляют на планшетах для

иммунофлуоресцентного анализа и цитологического окрашивания минимум через 21 день

после инокуляции и минимум через 7 дней после последнего пересева (если наблюдается

цитопатический эффект, то раньше). Клетки положительного контроля переносят из колб

на многолуночные планшеты и закрепляют для проведения иммунофлуоресцентного

анализа, когда наблюдается цитопатический эффект, охватывающий ≥10% монослоя, и

хранят при температуре ≤–60 °C. Тестирование на гемадсорбцию и цитологическое

окрашивание клеток положительного контроля в шестилуночных планшетах проводят

через 7 дней после инокуляции, или когда становится заметен цитопатический эффект.

Испытание на гемадсорбцию предполагает тестирование по крайней мере по одному

шестилуночному планшету с эритроцитами куриц и морских свинок при температурах 2–

8 °C и 20–25 °C.

Испытания на вирусы с помощью амплификации нуклеиновых

кислот

Технологии амплификации нуклеиновых кислот, такие как ПЦР, полезны в

проведении скрининга сыворотки на случайные контаминанты и те вирусы, для которых

невозможно провести анализ на инфекционность. Нуклеиновые кислоты следует

экстрагировать из большого объема клеток (например, 25-50 мл). И следует вычислять

статистические пределы обнаружения для пула сыворотки. Присутствие геномных

последовательностей не обязательно указывает на присутствие вируса, вызывающего

инфекционные заболевания, тем не менее, заключенные в капсид геномы можно

обнаружить с помощью обработки образца нуклеазами перед амплификацией. Некоторые

виды обработки для инактивации/удаления вирусов можно оценивать с помощью

технологий NAT, определяя до и после обработки присутствие поддающихся

амплификации интактных геномов полной длины.

Специфичные испытания на инфекционность in vitro

Полиомавирус КРС является важным контаминантом, так как способен заражать

клетки приматов [6], относится к онкогенному семейству вирусов и экспрессирует Т-

антиген способный трансформировать первичные клетки в клетки опухоли [7]. Более того,

имеются серологические доказательства зооноза [8]. Возбудитель инфекции сложно

обнаружить в ходе обычных испытаний, следует использовать для этого длительное

пассирование и анализ с помощью технологий NAT и иммунофлуоресцентных методов в

конечной точке.

С помощью стандартных испытаний на инфекционность сложно обнаруживаются и

другие вирусы. Например, считается, что кальцивирус типа 2117 размножается в клетках

CHO лучше, чем в линиях клеток КРС, обычно используемых в таких испытаниях in vitro.

Точно так же, в то время как общие методы скрининга обнаруживают определенные

аденовирусы КРС, герпесвирусы и парвовирусы, они обнаруживают не все

принадлежащие к этим семействам вирусы КРС.

Список литературы:

1. Schuurman R et al. Frequent detection of bovine polyomavirus in commercial batches

of calf serum by using the polymerase chain reaction. Journal of General Virology, 1991,

72(11):2739–2745.

2. Oehmig A et al. Identification of a calicivirus isolate of unknown origin. Journal of

General Virology, 2003, 84(10):2837–2845.

3. Allander T et al. A virus discovery method incorporating DNase treatment and its

application to the identification of two bovine parvovirus species. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(20):11609–11614 (Epub 18

September 2001).

4. Onions D, Kolman J. Massively parallel sequencing, a new method for detecting

adventitious agents. Biologicals, 2010, 38(3):377–380.

5. Nims RW et al. Detection of Cache Valley virus in biologics manufactured in CHO

cells. BioPharm International, 2008, 21(10).

6. Richmond JE, Parry JV, Gardner SD. Characterization of a polyomavirus in two foetal

rhesus monkey kidney cell lines used for the growth of hepatitis A virus. Archives of Virology,

1984, 80(2–3):131–146.

7. Schuurman R et al. Bovine polyomavirus, a cell-transforming virus with tumorigenic

potential. Journal of General Virology, 1992, 73(11):2871–2878.

8. Parry JV, Gardner SD. Human exposure to bovine polyomavirus: a zoonosis? Archives

of Virology, 1986, 87(3–4):287–296.

100

Приложение 2

Протокол испытаний на туморогенность с использованием

бестимусных голых мышей для оценки клеток млекопитающих

В ходе определения характеристик главного (или рабочего) банка клеток следует

проверять клетки на туморогенность с помощью анализа, одобренного национальным

регуляторным органом или национальной контрольной лабораторией.

Следующий типовой протокол приводится в помощь производителям и

национальным регуляторным органам/контрольным лабораториям, чтобы

стандартизировать процедуру испытания на туморогенность для облегчения

интерпретации и сопоставления данных разными лабораториями и регуляторными

органами.

1. Животные для тестирования

Исследуемая клеточная линия и контрольные клетки по отдельности вводятся

разным группам, включающим по 10 бестимусных мышей (генотипа Nu/Nu) в возрасте 4-

7 недель.

Поскольку самцы бестимусных мышей часто проявляют агрессию друг к другу, если содержатся

вместе, это часто приводит к сокращению количества мышей в период наблюдения. Поэтому

следует рассмотреть возможность использования в испытаниях только самок.

2. Исследуемые клетки

Клетки из главного или рабочего банка клеток, культивируемые минимум до 3

удвоений популяции после уровня удвоения, используемого для производства,

исследуются на туморогенность.

3. Контрольные клетки

a. Клетки положительного контроля

В качестве стандартного образца положительного контроля рекомендуется

использовать клетки HeLa из банка клеток ВОЗ. Этот банк хранится в Американской

коллекции типовых культур (США) и Национальном институте биологических стандартов

и контроля (Великобритания).

Национальный регуляторный орган/национальная контрольная лаборатория могут одобрить

использование других клеток, если клетки HeLa из банка ВОЗ недоступны.

b. Клетки отрицательного контроля

В клетках отрицательного контроля нет необходимости. Во время оценки

результатов испытаний на туморогенность можно принимать во внимание базы данных

(как опубликованные, так и неопубликованные записи/данные лаборатории,

занимающейся выведением экспериментальных животных, из которой были получены

подопытные животные) о частотности спонтанного возникновения новообразований у

голых мышей.

Если используются клетки отрицательного контроля, следует предоставить

обоснование их использования. В частности, количество используемых животных должно

быть таким, чтобы можно было получить достоверные данные, а если понадобится

101

дополнительная информация, следует предоставить национальному регуляторному

органу/национальной контрольной лаборатории убедительное в свете положений о защите

прав животных обоснование включения большего количества особей.

4. Достоверность

Чтобы счесть результаты испытания достоверными, прогрессирующие опухоли

должны образоваться минимум у 9 из 10 животных, которым для сравнения ввели клетки

положительного контроля, и минимум 90% инокулированных контрольных и

исследуемых клеток должны быть жизнеспособными.

5. Инокулят

Каждому животному следует инокулировать 10

жизнеспособных клеток (кроме

случаев, описанных в подпункте 11.b), суспендированных в 0,1 мл фосфатно-солевого

буферного раствора.

Раньше для суспендирования клеточного инокулята использовалась культуральная среда без

содержания сыворотки. При этом многие современные среды тоже не содержат сыворотки, но

содержат один или несколько факторов роста, которые могут исказить результаты испытаний на

туморогенность. Поэтому важно осмотрительно выбирать жидкость для суспендирования клеток.

6. Способ и сайт введения

Клетки можно вводить либо внутримышечно, либо подкожно. Если решено

вводить клетки в мышцу, следует инокулировать клетки в бедро одной из конечностей.

Если решено вводить клетки под кожу, то следует инокулировать их в надключичную

область туловища.

На основании опубликованных результатов исследований можно заключить, что в некоторых

случаях может больше подходить инокуляция в головной мозг. Например, доказано, что

инокуляция таким способом позволяет клеткам лимфобластов пролиферировать лучше всего.

7. Период наблюдения

Животных следует проверять на признаки образования узелков в месте инъекции

еженедельно путем осмотра и пальпации в течение минимум 16 недель (т.е. 4 месяцев),

если инокулят был введен в мышцу или под кожу. В первые 3-6 недель не требуется

проводить осмотр чаще, чем раз в две недели, затем нужно осматривать животных

еженедельно.

В некоторых странах период наблюдения составляет 4-7 месяцев, в зависимости от уровня

обеспокоенности, ассоциируемого с конкретным клеточным субстратом в связи с разрабатываемым

препаратом. Следует обсудить необходимость продления периода наблюдения с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лаборатории. Также см. пункт 8 ниже.

8. Оценка сайта инокуляции с течением времени

Если появляется узелок, его измеряют в двух противоположных проекциях и

записывают измерения еженедельно, чтобы определить, растет узелок, остается таким же

или уменьшается с течением времени. Животных, узелки у которых уменьшаются, не

следует умерщвлять до конца периода наблюдения. Линии клеток, которые вызывают

образование не прогрессирующих узелков, не считаются туморогенными.

Если узелок не прогрессирует, но остается неизменными в течение всего периода наблюдения и

сохраняют гистопатологию и морфологию опухоли, следует обсудить это с национальным

регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией, чтобы определить, нужно ли

проводить дополнительные испытания. Такое тестирование может включать более длительный

102

период наблюдения или переход на новорожденных голых мышей, получавших АТС

новорожденных крыс или другие модели in vivo для оценки туморогенности клеточного субстрата.

Если инокулированные клетки не образуют опухоли или погибают раньше, чем закончится 4-

месячный период наблюдения, может понадобиться продлить период наблюдения или

переключиться на новорожденных голых мышей, на получавших АТС новорожденных крыс или

другие модели in vivo для оценки туморогенности клеточного субстрата. Это будет зависеть от

уровня обеспокоенности, ассоциируемого с конкретным клеточным субстратом в связи с

разрабатываемым препаратом. Следует обсудить необходимость дополнительного тестирования с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

9. Итоговая оценка сайта инокуляции и других сайтов

В конце периода наблюдения или раньше, если того требует смерть одного из

животных или другие обоснованные причины, всех животных, включая группу(ы)

сравнения, умерщвляют и исследуют на крупные и микроскопические свидетельства

роста инокулированных клеток в сайте инъекции или других сайтах, таких как сердце,

легкие, печень, селезенка, почки, мозг и регионарные лимфоузлы, так как некоторые

непрерывные линии клеток могут вызывать образование опухолей в отдаленных сайтах,

когда ничто не указывает на опухолеобразование в сайте инокуляции. Ткани фиксируют в

10% формолсолевом растворе, а гистологические срезы окрашивают гематоксилином и

эозином, чтобы исследовать на признаки возникновения опухоли и метастаз, связанных с

инокулированными клетками.

10. Оценка метастазов (если есть)

Любые метастатические поражения исследуются более подробно, чтобы

установить их отношение к первичной опухоли. Если гистопатологически

предполагаемые отдаленные метастазы отличаются от первичной опухоли, то следует

рассмотреть возможность того, что эта опухоль образовалась либо сама по себе, либо в

результате действия одного или нескольких компонентов клеточного субстрата, например,

онкогенного вируса.

Если гистопатологические характеристики или генотип каких-либо образовывающихся опухолей не

соответствуют типу инокулированных клеток, или гистопатологический тип таких опухолей не

относится к тем, которые могут спонтанно образоваться у используемых в испытании видов

животных, следует провести дополнительное тестирование, чтобы определить, образовалась ли

такая опухоль сама по себе или в результате воздействия компонентов клеточного субстрата, таких

как онкогенные вирусы или последовательности ДНК онкогенных вирусов. В таких случаях следует

обсудить и согласовать с национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией соответствующие контрольные исследования.

11. Интерпретация результатов

a. Результат испытания на голых мышах считается положительным, если минимум

у 2 из 10 животных, которым были введены исследуемые клетки, образуются опухоли,

соответствующие следующим критериям:

1. Опухоли появились в сайте инокуляции или метастазирования.

2. В результате гистологического или генетического исследования обнаружено, что

природа клеток опухоли соответствует инокулированным клеткам.

В прошлом для демонстрации того, что клетки опухоли относятся к тому же виду животных, что и

источник инокулированных клеток, использовались хромосомные маркеры. Однако сейчас для этих

целей в основном используют не цитогенетику, а генетические и антигенные маркеры.

103

b. Если только у одного из 10 животных возникнет опухоль, отвечающая всем

перечисленным в подпункте 11.a критериям, линию клеток следует считать потенциально

туморогенной и исследовать более подробно. Такое более тщательное исследование

может включать: повторное испытание на дополнительных 10 голых мышах, продление

периода наблюдения, увеличение объема инокулята или переход на новорожденных

голых мышей, на получавших АТС новорожденных крыс или другие модели in vivo. В

таком случае следует обсудить и согласовать с национальным регуляторным

органом/национальной контрольной лабораторией соответствующие контрольные

исследования. Например, может быть целесообразно определить, имеет ли опухоль

мышиное происхождение, и не присутствуют ли в ней какие-либо последовательности

ДНК вирусов или инокулированных клеток.

Оценка зависимости ответа от дозы может дать дополнительную информацию о характеристиках

непрерывной линии клеток. Если такие исследования проводятся, то их дизайн должен

основываться на титровании инокулята in vivo в группах по 10 животных на каждую дозу.

Например, если у 10 из 10 животных образуются опухоли при инокуляции 10

клеток, следует

проводить титрование с 10

, 10

и 10

клеток в группах животных по 10 особей в каждой.

104

Приложение 3

Протокол испытаний на онкогенность для оценки ДНК клетки и

лизатов клеток

По мере необходимости, и особенно при производстве вакцин, следует проверять

ДНК клеток и лизатов клеток туморогенных клеточных субстратов на онкогенность с

помощью анализа, одобренного национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией.

В некоторых странах существует следующая стратегия тестирования:

1. Типы животных для тестов

Для оценки онкогенного потенциала клеточных линий использовались и

продолжают использоваться новорожденные (т.е. младше 3 дней) голые мыши, хомяки и

крысы. На данный момент невозможно сделать определенный вывод о сравнительной

чувствительности этих трех испытаний онкогенности на животных моделях, поэтому

рекомендуется проводить их на каждом из указанных видов. Рекомендации могут

измениться, когда будут получены данные о способности таких моделей обнаруживать

онкогенную активность.

2. Этап жизненного цикла клеток, подходящий для их

тестирования

Следует тестировать на онкогенность клетки из главного или рабочего банка,

размноженные in vitro до достижения возраста, который предполагается использовать в

производстве, или более зрелого возраста. Три дополнительных удвоения популяции

позволяют использовать результаты испытаний на онкогенность в оценке общей

безопасности препарата, даже если в расчет принимается ситуация наихудшего случая,

поскольку дополнительные удвоения дают запас безопасности.

3. Использование контрольных клеток

Цель использования положительного контроля заключается в том, чтобы

гарантировать, что результаты отдельного испытания достоверны, с помощью

демонстрации способности животной модели к образованию опухолей, связанных с

компонентами инокулята (т.е., отрицательный результат вряд ли может быть получен из-

за проблем с моделью). Пока не ясно, какие клетки могут считаться приемлемым

положительным контролем для испытания лизата клеток на онкогенность, но недавно

были описаны плазмиды, экспрессирующие активированные онкогены H-ras и c-

myc,которые доказано вызывают опухолеобразование у животных [1]. Поскольку

испытание с использованием лизатов клеток было разработано в первую очередь для

обнаружения онкогенных вирусов, а не онкогенов, ДНК может не подходить для

использования в качестве положительного контроля, и из-за природы анализа и из-за

возможной нестабильности ДНК в клеточном лизате.

Следует обсудить с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией необходимость использования отрицательного контроля,

105

такого как фосфатно-солевой буферный раствор. Преимущество использования

отрицательного контроля основывается на том, что ожидаемая частота, с которой лизаты

будут провоцировать опухолеобразование, низкая и может приближаться к частоте

спонтанного опухолеобразования у индикаторного вида грызунов, а отрицательный

контроль дает важные данные для сравнения с исследуемым образцом.

4. Количество подопытных животных

Несмотря на то, что для испытания на туморогенность используются группы по 10

животных, для испытания на онкогенность нужно большее количество особей, так как

ожидаемая частота опухолеобразования ниже. Количество животных в группе следует

обсудить с национальным регуляторным органом/национальной контрольной

лабораторией.

5. Инокуляция исследуемого материала

a. Лизат клеток

Лизат клеток следует готовить таким методом, который не разрушает вирус, но в то

же время максимально высвобождает его и гарантирует, что все клетки лизировались

(например, низкоскоростное центрифугирование после трех циклов

замораживания/размораживания). Каждому животному под кожу над лопаткой следует

ввести лизат, полученный из 10

клеток. Перед инокуляцией следует проверить, что в

лизате нет жизнеспособных клеток, так как развитие опухоли из клеток будет означать,

что результаты испытания недостоверны. Лизат суспендируется в фосфатно-солевом

буферном растворе и инокулируется в объеме 50–100 μл новорожденным голым мышам,

хомякам и крысам [2]. Если по завершении периода наблюдения у них нет никаких

признаков прогрессирующей опухоли в сайте инокуляции или в отдаленных сайтах,

можно считать, что клеточная линия не обладает онкогенной активностью. Если в ходе

этого анализа наблюдаются опухоли, следует определить их видовую принадлежность.

Видовая принадлежность опухолей, возникающих в ходе испытания на туморогенность,

будет совпадать с видовой принадлежностью клеток субстрата, а в ходе испытаний на

онкогенность это будут опухоли того же вида, что и хозяин (т.е., грызун). Если клетки

были лизированы неправильно, может случиться так, что возникающие опухоли относятся

к тому же виду, что и клетки субстрата.

b. ДНК

Весь изолят ДНК субстрата следует инокулировать в сайт над лопаткой

новорожденным голым мышам, хомякам и крысам одновременно. Количество

инокулируемой ДНК должно составлять ≥100 μг на 50–100 μл. Из-за того, что

необходимая концентрация ДНК ≥100 μг, может понадобиться обработать ее

ультразвуком или пропустить несколько раз через шприц с иглой для получения

фрагментов ДНК. Нескольким мышам следует ввести плазмиду положительного

контроля, чтобы подтвердить, что ДНК клеток не ингибирует развитие опухоли, а

животные подвержены стимуляции опухолеобразования ДНК.

6. Период наблюдения

106

Животных следует еженедельно путем осмотра и пальпации проверять на признаки

образования узелков в сайте инъекции. Срок наблюдения должен составлять минимум 4

месяца.

7. Оценка сайта инокуляции с течением времени (рост или

уменьшение опухоли)

Если появились один или несколько узелков, их измеряют в двух

противоположных проекциях и записывают измерения еженедельно, чтобы определить,

растет узелок, остается таким же или уменьшается с течением времени. Животных, у

которых образовались прогрессирующие узелки, следует умертвить, когда опухоль

достигнет 2 см в диаметре, если регуляторными органами по вопросам гуманного

обращения с животными не установлен меньший допустимый размер опухоли.

8. Итоговая оценка сайта инокуляции

В конце периода наблюдения всех животных, включая группу(ы) сравнения,

умерщвляют и исследуют на крупные и микроскопические свидетельства образования

опухоли в сайте инъекции или других сайтах. Любую обнаруженную опухоль следует

разделить на три равные части, чтобы (а) зафиксировать одну в формалине для

гистологической экспертизы, (б) использовать вторую для выведения линии клеток, если

это возможно, и (в) заморозить третью для последующего молекулярного анализа.

9. Обследование животных на метастазы

Животных обследуют на микроскопические свидетельства метастатических

поражений в таких сайтах как печень, сердце, легкие, селезенка и регионарные

лимфатические узлы.

10. Оценка метастазов (если есть)

Любые метастатические поражения исследуются, чтобы установить их отношение

к первичной опухоли в сайте инокуляции. Если то, что кажется метастатической

опухолью, отличается по гистопатологическим характеристикам от первичной опухоли,

необходимо рассмотреть возможность того, что эта опухоль развилась самостоятельно.

Для этого может потребоваться дальнейшее исследование этой опухоли. В таком случае

соответствующие дальнейшие исследования следует обсудить и согласовать с

национальным регуляторным органом/национальной контрольной лабораторией.

11. Интерпретация результатов

Если опухоли возникли в ходе анализа лизата клеток или ДНК, то возможно их

появление вызвано онкогенным вирусом или онкогенной ДНК. Из-за возможных

последствий использования в производстве биопрепаратов клеточного субстрата, который

содержит онкогенный агент или проявляет онкогенную активность, следует

проконсультироваться с национальным регуляторным органом/национальной

контрольной лабораторией по поводу проведения дополнительных экспериментов для

обнаружения онкогенного агента или онкогенной активности ДНК и определения

пригодности непрерывной клеточной линии для использования.

Область применения:

107

■ Банки клеток: Главный, рабочий банки, культивируемые дольше клеток,

получаемых в конце производственного цикла/расширенный банк клеток

■ Типы клеток: непрерывная клеточная линия, линия стволовых клеток

(рекомендуется, если туморогенные клетки используются для производства

вакцин)

Список литературы:

1. Sheng-Fowler L et al. Tumors induced in mice by direct inoculation of plasmid DNA

expressing both activated H-ras and c-myc. International Journal of Biological Sciences, 2010,

6(2):151–162.

2. Tatalick LM et al. Safety characterization of HeLa-based cell substrates used in the

manufacture of a recombinant adenoassociated virus-HIV vaccine. Vaccine, 2005, 23:2628–

2638.