Вакцина против желтой лихорадки (живая)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Вакцина против желтой лихорадки (живая) представляет собой лиофилизированную

суспензию, содержащую вирус штамма 17D, который был выращен с использованием куриных

эмбрионов. Вакцину восстанавливают непосредственно перед применением, как указано на

этикетке, до получения прозрачной жидкости.

ПРОИЗВОДСТВО

Производство вакцины основано на системе вирусных посевных материалов. Метод

производства должен стабильно давать вакцину против желтой лихорадки (живую) с

приемлемой иммуногенностью и безопасную для человека.

Метод производства будет считаться валидированным, если доказано, что испытуемый

препарат выдерживает испытание на аномальную токсичность для иммуносывороток и вакцин

для медицинского применения (2.6.9), измененный следующим образом для испытания на

морских свинках: каждой морской свинке вводят по 10 доз, допустимых для человеческого

организма, в два разных места инъекции и наблюдают в течение 21 дня.

Стандартный препарат. В испытании на нейротропизм в качестве стандартного

препарата используется соответствующая серия вакцины, которая, как известно, обладает

надлежащими свойствами для медицинского применения.

СУБСТРАТ ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА

Вирус для приготовления главного и рабочего посевных материалов и для всех серий

вакцин выращивается на тканях куриных эмбрионов, свободных от специфической патогенной

микрофлоры (SPF) (5.2.2).

ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ

Штамм 17D должен быть идентифицирован с помощью документов, включающих

сведения о его происхождении и последующих манипуляциях. Вирусный посевной материал

готовят в больших количествах и хранят при температуре ниже 60 °С. Главный и рабочий

посевные материалы не должны содержать белок человека или добавленную сыворотку.

Если не указано иное, готовая вакцина должна содержать вирус на уровне пассажа от 204

до 239 от исходного штамма 17D и полученного из него изолята. Количество пассажей главного

посевного материала для получения рабочего посевного материала, используемого для

производства вакцины, не должно превышать 1. Рабочий посевной материал не должен иметь

промежуточного пассажа в качестве инокулята для заражения тканей, используемых при

производстве партии вакцины, с тем чтобы готовая вакцина содержала вирус, прошедший не

более 1 пассажа от посевного материала, выдержавшего все испытания на безопасность.

Для размножения вируса может использоваться только тот вирусный посевной материал,

который соответствует следующим требованиям.

Подлинность

Главный и рабочий посевные материалы определены в качестве содержащих вирус

желтой лихорадки при нейтрализации сывороткой в культуре клеток с использованием

специфических антител.

Посторонние вещества (2.6.16)

Каждый главный посевной материал проходит следующие испытания:

 Испытание на морских свинках (как описано в главе 2.6.16 в разделе «Вирусный

посевной материал»).

 Испытание на бактериальную и грибковую стерильность (приводится в главе 2.6.16

в разделе «Вирусный посевной материал и сбор выросших в культуре клеток»).

 Испытание на присутствие микоплазм (рассматривается в главе 2.6.16 в разделе

«Вирусный посевной материал и сбор выросших в культуре клеток»).

Вирус лейкоза птиц (2.6.24)

Каждый главный посевной материал должен отвечать требованиям испытания на

обнаружение вируса лейкоза птиц.

Посторонние вещества (2.6.16)

Каждый рабочий посевной материал проходит следующие испытания:

 Испытание на взрослых мышах (только внутрибрюшинная инокуляция) (описано в

главе 2.6.16 в разделе «Вирусный посевной материал»).

 Испытание на морских свинках (описано в главе 2.6.16 в разделе «Вирусный

посевной материал»).

 Испытание на бактериальную и грибковую стерильность (приводится в главе 2.6.16

в разделе «Вирусный посевной материал и сбор выросших в культуре клеток»).

 Испытание на присутствие микоплазм (рассматривается в главе 2.6.16 в разделе

«Вирусный посевной материал и сбор выросших в культуре клеток»).

 Испытание на присутствие микобактерий (приводится в главе 2.6.16 в разделе

«Вирусный посевной материал и сбор выросших в культуре клеток»).

 Испытание клеточных культур на другие посторонние вещества (рассматривается в

главе 2.6.16 в разделе «Вирусный посевной материал и сбор выросших в культуре

клеток»).

 Испытание на выявление вируса птиц (описано в главе 2.6.16 в разделе «Вирусный

посевной материал и сбор выросших в культуре клеток»).

Вирус лейкоза птиц (2.6.24)

Каждый рабочий посевной материал должен отвечать требованиям испытания на

обнаружение вируса лейкоза птиц.

Испытания на обезьянах

Каждый главный и рабочий посевной материал должен соответствовать следующим

испытаниям на обезьянах на виремию (висцеротропизм), иммуногенность и нейротропизм.

Участвующие в испытании обезьяны рода Macaca sp. (макаки) должны быть

чувствительны к вирусу желтой лихорадки и не иметь в крови вируснейтрализующих антител к

вирусу желтой лихорадки до введения посевного вируса. Они должны быть здоровы и не

подвергаться ранее внутрицеребральной или интраспинальной инокуляции. Кроме того,

обезьяны не должны быть каким-либо другим способом инокулированы нейротропным

вирусом или антигенами, связанными с вирусом желтой лихорадки. В каждом испытании

используют не менее 10 обезьян.

Испытуемую дозу по 0.25 мл, содержащую не менее 5.000 LD

и не более 50.000 LD

(см. раздел «Количественное определение), вводят во фронтальную долю мозга каждой

обезьяне под анестезией. Обезьяны после заражения должны наблюдаться в течение 30 суток.

Виремия (висцеротропизм). Висцеротропизм определяется количеством вируса,

присутствующего в сыворотке. У каждой испытуемой обезьяны на 2-й, 4-й и 6-й дни после

инокуляции берут пробу крови и готовят сыворотку из каждого образца. Готовят разведения

сывороток 1:10, 1:100 и 1:1000, каждое разведение засевают в группу минимум по 6 сосудов для

культивирования клеток, используемых для определения концентрирования вируса. Посевной

материал выдерживает испытание, если содержание вируса в 0.03 мл сыворотки обезьяны не

менее 100 LD

и не более 500 LD

50.

Иммуногенность. Взятие крови у каждой обезьяны для приготовления сыворотки

проводится через 30 дней после введения испытуемой дозы. Посевной материал выдерживает

испытание, если минимум 90 % испытуемых обезьян окажутся невосприимчивы к вирусу, что

устанавливается путем изучения их сывороток в испытании на нейтрализацию вируса желтой

лихорадки, изложенного ниже.

Было доказано, что слабое разведение сыворотки (например, 1:10) может содержать

неспецифические ингибиторы, влияющие на испытание. Такая сыворотка должна быть

обработана для удаления ингибиторов. Смешивают разведения сывороток 1:10,1:40 и 1:160

каждой обезьяны с равным объемом вакцинного вируса 17D, позволяющие получить

оптимальное число бляшек при использовании титриметрического метода. Смеси вирус-

сыворотка инкубируют на водяной бане при температуре 37 °C в течение одного часа, затем

охлаждают ледяной водой. Прибавляют 0.2 мл каждой смеси вирус-сыворотки в каждый 4-

луночный планшет и приступают к определению концентрирования вируса. Таким же образом

инокулируют 10 планшетов с одинаковым количеством вируса, а так же равным объемом (1:10)

разведения сыворотки обезьяны, не содержащей нейтрализующих антител к вирусу желтой

лихорадки. В конце периода наблюдения сравнивают среднее количество бляшек в планшетах,

содержащих вирус и неиммунную сыворотку со средним количеством бляшек в планшетах,

содержащих вирус и разведения сыворотки каждой обезьяны. Не более 10 % испытуемых

обезьян имеют сыворотку, не способствующую сокращению бляшек на 50 % при разведении

1:10.

Нейротропизм. Нейротропизм оценивается по клиническим проявлениям энцефалита,

частоте клинического проявления заболевания и оценке гистологического поражения путем

сравнения 10 обезьян, которым ввели стандартный препарат. Посевной материал считается

неприемлемым, если проявление и продолжительность фебрильной реакции или клинических

проявлений энцефалита и обнаруженных патологий свидетельствуют об изменении свойств

вируса.

Клиническая оценка

Обезьяны исследуются ежедневно в течение 30 дней специалистами, знакомыми с

клиническими проявлениями энцефалита у приматов (при необходимости, обезьян извлекают

из клеток и исследуют на наличие признаков моторной слабости или мышечной спастичности).

Посевной материал считается неприемлемым, если у обезьян, которым он был введен, частота

ярко выраженных признаков энцефалита (паралич, неспособность стоять, летальный исход)

больше, чем у стандартной вакцины. С помощью метода классификации этим и другим

признакам энцефалита (частичный паралич, расстройство координации, заторможенность,

тремор или мышечная спастичность) присваиваются числовые значения тяжести симптомов.

Каждый день в испытании обезьяне присваивают балл согласно нижеприведенной шкале:

 Стадия 1: грубая, жесткая шерсть; отказ от еды.

 Стадия 2: высокий голос, вялость, малоподвижность.

 Стадия 3: шаткость, тремор, нескоординированность движений, слабость

конечностей.

 Стадия 4: неспособность стоять, паралич конечностей или смерть (мертвая

обезьяна ежедневно получает 4 балла со дня смерти в течение 30 дней).

Клинический показатель каждой обезьяны это среднее значение её ежедневных баллов.

Клинический показатель посевного материала это среднее значение баллов каждой обезьяны.

Посевной материал считается неприемлемым, если среднее значение клинической шкалы

тяжести заболевания для группы обезьян, им инокулированных, значительно больше (P = 0.95),

чем среднее значения для группы обезьян, которой был введен стандартный препарат. Кроме

того, при принятии решения о приемлемости посевного материала особое внимание уделяется

любому животному, демонстрирующему нехарактерные признаки заболевания.

Гистологическая оценка

Рассматриваются 5 отделов головного мозга:

 Блок I: полосатое тело на уровне зрительного перекреста (место среза).

 Блок II: таламус в области сосцевидных тел.

 Блок III: средний мозг на уровне верхнего двухолмия.

 Блок IV: варолиев мост и мозжечок на уровне верхних олив.

 Блок V: продолговатый мозг и мозжечок на уровне нижнего оливного ядра.

Шейное и поясничное утолщение спинного мозга разделяют поровну на 6 частей; из

тканевых блоков, залитых в твердый парафин, готовят срезы толщиной 15 мкм и окрашивают

галлоцианином. Каждому половинному поражению спинного мозга и структурам половинного

поражения головного мозга даются оценки в баллах, изложенные ниже. Повреждения

оцениваются следующим образом:

 1 стадия-незначительная: от 1 до 3 небольших очаговых воспалительных

инфильтратов; дегенерация или потеря нескольких нейронов.

 2 стадия-умеренная: 4 или более очаговых воспалительных инфильтратов,

дегенерация или потеря нейронов, затрагивающая не более одной трети клеток.

 3 стадия-тяжелая: умеренная фокальная или диффузная воспалительная

инфильтрация; дегенерация или потеря до двух третей нейронов.

 4 стадия-необратимая: непостоянная, но часто тяжелая воспалительная реакция;

дегенерация или потеря более 90% нейронов.

Было установлено, что инокуляция вакцины против желтой лихорадки в головной мозг

обезьяны вызывает гистологические поражения в разных анатомических структурах ЦНС с

разной частотой и степенью тяжести (I. S. Levenbook etal., журнал «Journal of Biological

Standardization», 1987,15, 305-313). На основе этих двух показателей анатомические структуры

можно разделить на целевые, резервные и дискриминирующие области. Целевыми областями

являются те, которые показывают наиболее тяжелые специфические поражения у большинства

обезьян вне зависимости от степени нейровирулентности посевного материала. Резервные

области это те, что показывают минимальные специфические поражения у меньшинства

обезьян. Дискриминирующими областями являются те области, где наблюдается значительное

увеличение частотности тяжелых специфических поражений на фоне посевного материала,

имеющего более высокую степень нейровирулентности. Целевые и дискриминирующие

области для обезьян Macaca cynomolgus и Macaca rhesus приводятся в таблице ниже.

Вид обезьяны

Дискриминирующие

области

Целевые области

Macaca cynomolgus

(яванский макак)

Бледный шар

Чёрная субстанция

Скорлупа (путамен)

Передние/срединные ядра

таламуса

Боковые ядра таламуса

Macaca rhesus

(макак-резус)

Хвостатые ядра

Чёрная субстанция

Бледный шар

Шейное утолщение

Скорлупа (путамен)

Поясничное утолщение

Передние/срединные ядра

таламуса

Боковые ядра таламуса

Шейное утолщение

Поясничное утолщение

(спинного мозга)

Показатели дискриминирующей и целевой областей используются для заключительной

оценки посевного материала. Баллы обезьяны рассчитываются по сумме баллов целевой

области каждого половинного поражения, деленные на количество исследуемых областей.

Аналогично рассчитывается отдельный балл для дискриминирующих областей.

Средний балл для группы испытуемых рассчитывается двумя способами: (1) путём

деления суммы баллов дискриминирующей области каждой обезьяны на количество обезьян

или (2) путём деления суммы баллов дискриминирующей и целевой областей каждой обезьяны

на количество обезьян. Эти 2 средних балла учитываются при принятии решения относительно

приемлемости посевного материала. Посевной материал считается неприемлемым, если любой

из средних баллов поражения значительно больше (P = 0.95), чем для стандартного препарата.

РАЗМНОЖЕНИЕ И СБОР КЛЕТОК

Вся обработка оплодотворенных яиц проводится в асептических условиях в помещении,

где никакие другие инфекционные агенты или клетки не обрабатываются в то же время.

Минимум 2 %, но не менее 20 и не более 80 яиц, сохраняются в качестве неинфицированных

яиц контрольных партий. После инокуляции и инкубации при регулируемой температуре на

исследование отбирают только живые и типовые куриные эмбрионы. Во время отбора яйца

контрольных партий обрабатывают тем же способом, что и инокулированные яйца, для

получения контрольной эмбриональной суспензии. Возраст эмбриона на момент сбора вируса

отсчитывается с первоначальной закладки яйца в инкубатор и должен составлять не более 12

дней. После гомогенизации и осветления методом центрифугирования эмбриональный экстракт

испытывают, как описано ниже, и выдерживают при температуре -70 °C или ниже до

дальнейшей обработки. Вирусные сборы, соответствующие условиям требуемых испытаний,

могут быть объединены. На любом этапе производства в вирусную суспензию не должен быть

добавлен белок человека. При добавлении стабилизаторов должно быть установлено, что они

не имеют антигенных и сенсибилизирующих свойств.

Только один сбор, соответствующий следующим требованиям, может быть использован

при производстве конечного балка вакцины.

Подлинность

Один сбор клеток определяется как содержащий вирус желтой лихорадки при

нейтрализации сывороткой в культуре клеток с использованием специфических антител.

Бактериальная и грибковая контаминация (2.6.1)

Образец сбора объемом 10 мл должен выдерживать испытание на стерильность.

Испытания на присутствие микоплазм (2.6.7)

Образец одного сбора объемом 10 мл должен выдерживать испытание на присутствие

микоплазм.

Испытание на присутствие микобактерий (2.6.2)

Образец сбора объемом 5 мл подвергают испытанию на наличие Mycobacterium spp.

методами культивирования, обладающими известной чувствительностью в отношении

определения этих организмов.

Эмбриональная суспензия партии контрольных яиц

Экстракт контрольных яиц демонстрирует отсутствие любых посторонних агентов в

описанных ниже испытаниях.

Испытание в клеточной культуре на посторонние агенты. Образец эмбриональной

суспензии контрольных яиц объемом 5 мл инокулируют в культуру клеток почки обезьяны и

человека, а так же в первичную культуру клеток фибробластов куриного эмбриона. Клетки

инкубируют при температуре 36 ± 1 °C и наблюдают в течение 14 дней. Эмбриональная

суспензия выдерживает испытание, если ни в одной из клеточных культур не обнаруживается

признаков любых посторонних агентов, не внесенных в результате случайной контаминации.

Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80 % клеточных культур остаются

жизнеспособными.

Птичьи вирусы. Используя по 0.1 мл на каждое яйцо, инокулируют эмбриональную

суспензию в группу из 10 оплодотворенных яиц SPF возрастом от 9 до 11 дней аллантоисным

путем, а другую группу, возрастом от 5 до 7 дней, - в желточный мешок. Инкубируют в течение

7 дней. Эмбриональная суспензия выдерживает испытание, если в аллантоисных жидкостях и

жидкостях желточных мешков не обнаруживаются гемагглютинирующие агенты и если ни

один из эмбрионов и хорио-аллантоисных мембран не обнаруживает макроскопической

патологии. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% привитых яиц

выживают в течение 7 дней.

Концентрирование вируса

Для расчета разведения при разработке конечного балка, каждый сбор титруют в

соответствии с разделом «Количественное определение».

КОНЕЧНЫЙ БАЛК ВАКЦИНЫ

Сборы, соответствующие условиям испытаний, объединяются и снова осветляются.

Проводится испытание на содержание белкового азота. Может быть добавлен

соответствующий стабилизатор, а объединенные сборы, при необходимости, разбавлены.

При изготовлении итоговой партии может использоваться только тот конечный балк,

который соответствует следующим требованиям.

Бактериальная и грибковая контаминация (2.6.1)

Образец объемом 10 мл должен выдерживать испытание на стерильность.

Содержание белкового азота

Максимум 0.25 мг на дозу, допустимую для человеческого организма, перед добавлением

какого-либо стабилизатора.

ИТОГОВАЯ ПАРТИЯ

Конечный балк вакцины распределяется в асептических условиях в стерильные

контейнеры с индикацией вскрытия и лиофилизируется до содержания влаги, благоприятного

для стабильности вакцины. Затем для предотвращения контаминации и попадания влаги

контейнеры закупоривают.

Только та итоговая партия, которая удовлетворяет требованиям в отношении

термостабильности и каждого приведенного ниже требования в соответствии с пунктами

«Подлинность», «Испытания» и «Количественное определение», может быть выпущена для

использования. При условии, что испытание конечного балка вакцины на содержание

овальбумина дало удовлетворительные результаты, с итоговой партией его можно не

проводить.

Термостабильность

Образцы итоговой партии лиофилизированной вакцины выдерживают в сухом состоянии

при температуре 37 °C в течение 14 дней. Определяют концентрирование вируса, как описано в

пункте «Количественное определение», одновременно для нагретой и ненагретой вакцины.

Разница между нагретой и ненагретой вакциной в концентрировании вируса не должна

превышать 1.0 log, а концентрирование вируса нагретой вакцины должно быть не менее

бляшкообразующего числа (БОЕ), равного 3.0 log LD

для дозы, допустимой для

человеческого организма.

ПОДЛИННОСТЬ

Когда вакцина, восстановленная как указано на этикетке, смешивается со

специфическими антителами вируса желтой лихорадки, происходит значительное снижение ее

способности инфицировать чувствительные культуры клеток.

ИСПЫТАНИЯ

Овальбумин

Максимум 5 мкг овальбумина на дозу, допустимую для человеческого организма,

определяемую подходящим иммунохимическим методом (2.7.1).

Содержание воды (2.5.12)

Не более 3.0 %.

Бактериальная и грибковая контаминация (2.6.1)

Восстановленная вакцина должна выдерживать испытание на стерильность.

Бактериальные эндотоксины (2.6.14)

Менее 5 МЕ на одну дозу, допустимую для человеческого организма.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Инфекционный вирус в культуре клеток титруют с использованием по меньшей мере 3

различных флаконов вакцины. Для подтверждения каждого количественного определения один

флакон соответствующего стандартного вирусного препарата титруют в трёх повторностях.

Концентрирование вируса стандартного препарата отслеживается с помощью контрольной

карты, а титр устанавливается каждой лабораторией на основе имеющихся данных. Используя

обычные статистические методы (например, 5.3) рассчитывают концентрирование вируса для

каждого флакона вакцины и для каждой повторности стандартного препарата, а так же

соответствующую совокупность концентраций. Суммарная вирусная концентрация 3-х

флаконов вакцин должна быть не меньше, чем соответствующий показатель БОЕ, равный 3.0

log LD

для допустимой для человеческого организма дозы. Связь между LD

и БОЕ

устанавливается каждой лабораторией и утверждается компетентными органами.

Количественное определение является недопустимым, если:

 Суммарный доверительный интервал (P = 0.95) концентрирования вируса

стандартного препарата для трех повторностей больше, чем ± 0.3 log БОЕ.

 Концентрирование вируса стандартного препарата отличается более чем на 0.5 log

БОЕ от установленного значения.

Количественное определение повторяют, если доверительный интервал (P = 0,95)

суммарной концентрации вируса вакцины превышает ± 0.3 log БОЕ. Данные, полученные на

основе только валидированных методов, объединяют с помощью обычных статистических

методов (например, 5.3) для расчета концентрирования вируса в образце. Доверительный

интервал (P = 0.95) суммарной концентрации вируса не должен превышать ± 0.3 log БОЕ.

Если обосновано и разрешено уполномоченным компетентным органом, могут

использоваться иные методы анализа. Это может подразумевать применение различных

критериев приемлемости и обоснованности. Однако вакцина должна соответствовать выше

описанным испытаниям.

Ниже описанный метод, или любая другая подходящая методика, может быть

использована для определения LD

(мыши).

Предлагаемый метод определения LD

(мыши)

Статистически рассчитанное количество вирусной суспензии, которое, как ожидается,

приведет к летальному исходу вследствие специфического вируса энцефалита у 50 % мышей,

высокочувствительных к штамму, в возрасте от 4 до 6 недель после внутримозговой

инокуляции.

Соответствующие серийные разведения восстановленной вакцины выполняются в

разбавителе для вируса желтой лихорадки (7.5 г/л раствора бычьего альбумина R в фосфатно-

солевом буферном растворе pH 7.4 или любом другом разбавителе, который, как было

показано, аналогичен для поддержания инфекционности вируса).

Мышам, высокочувствительным к штамму, в возрасте от 4 до 6 недель под анестезий

внутрицеребрально вводят 0.03 мл разведения вакцины. Для каждого разведения используют

группу не менее из 6 мышей. Серия разведений выбирается таким образом, чтобы охватить

диапазон смертности мышей от 0 до 100 %. Введение выполняют сразу же после разведения. За

мышами наблюдают в течение 21 дня, все случаи со смертельным исходом регистрируют.

При расчетах учитываются только выжившие и погибшие вследствие желтой лихорадки.

Мыши, парализованные на 21-й день наблюдения, считаются выжившими.

МАРКИРОВКА

В маркировке указывается:

 Штамм вируса, используемый при производстве вакцины.

 Факт производства вакцины на основе куриных эмбрионов.

 Минимальная концентрация вируса.

 Факт недопущения контакта между вакциной и дезинфицирующими средствами.