Валидация альтернативных микробиологических методов

ВАЛИДАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

ВВЕДЕНИЕ

В настоящей главе представлено руководство по выбору, оценке и использованию микробиологических методов в качестве альтернативы официальным фармакопейным методам. Для надлежащего применения альтернативных методов необходимо рассмотреть ряд важных вопросов до того, как выбирать аналитическую технологию и проводить ее квалификацию по отношению к определенному лекарственному средству. Эти вопросы включают, помимо прочего, определение подходящего альтернативной методологии, разработку инструкций для пользователей по выбору оборудования, демонстрацию применимости метода в качестве замены стандартного фармакопейного метода и квалификацию метода в лаборатории.

В данной главе рассматриваются:

— Квалификация оборудования

— Валидация альтернативных технологий

— Пригодность метода

— Допустимые методики

— Эквивалентность функциональности

— Эквивалентность результатов

— Эквивалентность заключений

Перечень используемых в данной главе специальных терминов с определениями приведен в конце текста.

Микробиологические методы, описываемые в фармакопее, за исключением идентификации микроорганизмов и методов типирования штаммов (описываемых в главе «Описание микробиологических свойств, идентификация микроорганизмов и типирование штаммов 1113), делятся на две большие категории:

Существуют очевидные аналитические факторы, которые необходимо учитывать при выполнении микробиологических методов анализа и при сравнении предлагаемого альтернативного метода с существующим фармакопейным методом. При проведении качественного анализа («подтверждения отсутствия») важно помнить, что в микробиологии получение отрицательного результата («микроорганизмы не обнаружены») не означает полного отсутствия клеток в лекарственном средстве, описанном в фармакопее. Результат, свидетельствующий об «отсутствии роста», полученный при использовании фармакопейного метода, следует трактовать как «не было обнаружено роста микроорганизмов в испытуемом образце лекарственного средства, представленного в фармакопее, при определенных условиях проведения испытания».

Фактические пределы обнаружения, свойственные фармакопейным микробиологическим методам, никогда не описывались в числовом выражении, и не секрет, что на обнаружение микроорганизмов могут повлиять многие переменные факторы. К ним относятся выбор питательной среды, условия инкубирования, потребности микроорганизмов в питательных веществах (если такие имеются), физическое состояние микроорганизмов и характеристики испытуемого лекарственного средства, описанного в фармакопее. Исследования по обнаружению микроорганизмов в питьевой и природной воде показали, что при помощи традиционных чашечных методов подсчета, которые дают оценку количества клеток в колониеобразующих единицах (КОЕ), можно выделить 0,1%–1% от фактического количества микробных клеток, присутствующих в образце (1), в отличие от альтернативных методов, которые используют проточную цитометрию и поэтому дают другой сигнал (оценку содержания клеток). Присутствие большего количества клеток, обнаруживаемое при помощи альтернативного метода, который использует другой сигнал (не КОЕ), не коррелирует с бóльшим риском для пользователей или большей вероятностью присутствия патогенных микроорганизмов, при условии наличия надлежащей документации по безопасности. Однако эти результаты показывают, что в некоторых типах образцов среднее содержание клеток, рассчитанное при помощи фармакопейного метода анализа, основанного на анализе роста микроорганизмов, может существенно отличаться от среднего значения, полученного при помощи альтернативного микробиологического метода, опирающегося на другой сигнал (не КОЕ). Также необходимо учитывать, что в аналитической микробиологии понятие ложноположительных или ложноотрицательных результатов неоднозначно как с научной, так и с понятийной точек зрения. Например, было бы неправильно считать при сравнении стандартного фармакопейного метода и предлагаемого альтернативного метода, что отрицательный результат, полученный стандартным методом, означает, что положительный результат, полученный альтернативным методом, является ложноположительным. Традиционный метод, основанный на оценке роста микроорганизмов, может хорошо выделять некоторые виды микроорганизмов и не обладать способностью выделять другие, что считается его нормальной характеристикой. И хотя альтернативный метод и традиционный метод не обязательно должны давать совпадающие результаты, важно помнить, что предлагаемый альтернативный метод должен позволять микробиологу делать в равной степени обоснованные заключения о качестве лекарственных средств.

Чрезвычайно важно, чтобы при использовании данной главы пользователи принимали во внимание, что микробиология – это логарифмическая наука. Хотя мы можем различить 100 и 1000 КОЕ (разница в 1 log10), бывает невозможно различить значения с меньшей разницей (менее 0,3–0,5 log10). Вариабельность, свойственная этим методам, гораздо выше вариабельности методов, используемых в аналитической химии. И эту свойственную им аналитическую вариабельность необходимо обязательно учитывать при выборе, разработке и валидации альтернативных методов. Ожидание, что степень соответствия альтернативных микробиологических методов традиционным методам, основанным на оценке роста микроорганизмов, будет выше, чем это технически возможно, может усложнить внедрение новых аналитических технологий вне зависимости от свойственного им специфического принципа анализа.

В микробиологии невозможно достичь уровня описания свойств (степени вариабельности метода), который возможен в химических методах анализа (например, высокоэффективной жидкостной хроматографии, прецизионность которой соответствует относительному стандартному отклонению в 1 %-2 %). Разумно было бы предположить, что обычный уровень прецизионности в микробиологических анализах варьируется в пределах RSD от 15 % до 35 %, хотя, несомненно, возможны результаты за пределами данного диапазона. Также выделение микроорганизмов может осложняться из-за огромного количества и разнообразия потенциальных микроорганизмов и вариабельности уровней метаболической активности в природе. Появление альтернативных микробиологических методов, которые в некоторых случаях позволяют обнаруживать большее количество клеток, чем традиционные фармакопейные методы, не следует расценивать как появление новых рисков для пациентов, которые прежде не принимались во внимание.

Взгляд Фармакопеи США (USP) на использование альтернативных методов или методик

Фармакопея США (USP) давно предусмотрела механизмы использования альтернативных методов испытания или методик для анализа лекарственных средств, представленных в фармакопее. В главе USP «Общие замечания и требования» указано, что «альтернативные методы и/или методики могут использоваться, если они имеют преимущество в отношении точности, чувствительности, прецизионности, селективности или дают возможности автоматизации метода или сокращения объема компьютерных данных или в некоторых других особых случаях». Данное заявление дает пользователю значительную свободу в принятии решения об использовании альтернативной методики для регулярного выпуска продукции, при условии, что выбор, квалификация и внедрение метода осуществляются с учетом всех необходимых научных и технических аспектов. Если лекарственное средство широко применяется и зарекомендовало себя как безопасное при использовании текущих методов контроля выпуска или производства, внедрение альтернативного метода, который можно легко соотнести с существующим методом, должно быть простым и ясным.

Арбитражные методы и методики USP 

Все методы и методики, описанные в общих главах USP на микробиологические испытания с номерами до 〈1000〉, предназначены для использования в качестве арбитражных испытаний для любого лекарственного средства, легально реализуемого на территории США. Это означает, что в случае любого разногласия решающим считается лишь тот результат, который был получен при помощи метода или методики, опубликованных в USP. Таким образом, альтернативные методы или методики, выполняемые и квалифицируемые пользователем, не смогут служить юридически правомочной заменой официального метода USP, который будет считаться арбитражным испытанием в случае возникновения разногласий.

Общие вопросы, касающиеся методов контроля качества при выпуске лекарственного средства

Несмотря на то, что методы и методики, описанные в общих главах USP, выступают в качестве официальных арбитражных методов, иногда необходима модификация, чтобы они могли оптимально использоваться в качестве испытаний по контролю качества определенных лекарственных средств, представленных в фармакопее. Согласно общепринятым нормам, официальные методы USP необходимо оценить на пригодность для использования применительно к определенным лекарственным средствам, и подобная оценка должна проводиться на основе знаний пользователя о конкретном лекарственном средстве. Процедуры, необходимые для демонстрации пригодности метода (верификация; испытание на мешающие факторы), указаны в соответствующих главах фармакопеи, посвященных испытаниям. Например, некоторые лекарственные средства, представленные в фармакопее, могут иметь противомикробные свойства, способные (если их не модифицировать или не устранить) отрицательно повлиять на пригодность определенного фармакопейного метода или методики. Если эти методы или методики включены в документацию, предоставляемую в регуляторные органы, и лекарственное средство получает регистрационное удостоверение, они будут использоваться в качестве испытаний при выпуске продукции и испытаний для определения срока годности.

Гармонизированные главы

Некоторые микробиологические методы или методики USP содержат комментарий о том, что они были гармонизированы с соответствующими методами или методиками Европейской (Ph.Eur.) и Японской фармакопей (JP). Тексты фармакопейных глав, содержащих подобный комментарий, считаются взаимозаменяемыми с текстами Ph.Eur. и JP (подробная информация представлена в главе «Гармонизация фармакопей» 〈1196〉). Если фармакопейный метод или методика выполняются на основе гармонизированного текста, представленного в USP, Ph.Eur. или JP, то данные тексты считаются юридически равноценными. Однако использование альтернативного метода в качестве испытания контроля качества, заменяющего метод, описанный в USP, не означает, что данный метод или процедура будут считаться взаимозаменяемыми с точки зрения всех задействованных юрисдикций, если только они не соответствуют критериям, предъявляемым к альтернативным методам другими фармакопеями.

Предоставление данных об альтернативных методах или процедурах в USP

В главе USP «Общие замечания и требования» указано, что данные об альтернативных методах следует предоставлять в USP для проведения оценки, если организация хочет, чтобы альтернативный метод был рассмотрен на предмет включения в фармакопею. Данная возможность совершенствования микробиологических испытаний часто упускается из виду пользователями USP. Предоставление данных об альтернативных методах или методиках позволяет USP рассмотреть любой подобный метод в качестве дополнения или замены существующего стандартного метода или методики. Предоставляемая информация об альтернативном методе должна включать полное описание аналитических характеристик и данные об оборудовании, а также подробные аналитические данные, полученные в соответствующих квалификационных испытаниях.

Метод или методика могут рассматриваться в качестве дополнительного арбитражного метода или его замены, только если они не запатентованы и не используют реактивы или оборудование, поставляемые из единственного источника. Также любой предлагаемый в качестве замены или дополнения метод должен иметь широкое применение, подходить для регулярного использования и быть совместимым с широким набором соответствующих лекарственных средств, представленных в фармакопее.

Другие главы USP, имеющие отношение к использованию альтернативных микробиологических методов

Несколько глав USP содержат полезную информацию, касающуюся использования альтернативных методов и методик. В главе 〈1225〉 «Валидация фармакопейных методик» содержится подробная информация о предоставлении данных об аналитических методах в фармакопею, а также общее руководство по валидации и оценке характеристик аналитической эффективности. Полезная информация о валидации методов, используемых для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов в лекарственных средствах, описанных в фармакопее (нейтрализации противомикробных свойств лекарственных средств), представлена в главе 〈1227〉 «Валидация выделения микроорганизмов из лекарственных средств». Информация о квалификации методов идентификации микроорганизмов содержится в главе 〈1113〉. Информация о квалификации аналитического оборудования содержится в главе 〈1058〉 «Квалификация аналитического оборудования».   

Несмотря на то, что в главе 〈1034〉 «Анализ биологических методов» речь идет, в первую очередь, об определении активности лекарственного средства при помощи биологических методов анализа, в ней также рассматриваются базовые принципы, касающиеся дисперсии, погрешности и биометрии, и она может быть полезной при разработке и валидации альтернативных микробиологических методов и методик.

Дополнительная информация и нормы, касающиеся использования альтернативных методов

Правила современной надлежащей производственной практики Управления США по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами (FDA), изложенные в части 211.194 Раздела 21 Свода нормативных актов федеральных органов исполнительной власти США, описывают требования к методам испытаний, используемым для оценки соответствия лекарственного средства, представленного в фармакопее, утвержденным спецификациям. В данных правилах указано, что методы испытаний должны обеспечивать достаточную точность и надежность результатов. В этом же подразделе правил также признается юридически обязательный статус стандартов USP и Национального формуляра (NF) и объясняется, что валидация методов или процедур, отличающихся от стандартных фармакопейных методов, входит в обязанности пользователя.

При разработке и валидации альтернативных методов или методик можно также учитывать рекомендации документа «Валидация аналитических процедур: текст и методология» (Q2(R1)) Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации фармацевтических препаратов для применения у человека (ICH). В данном документе ICH содержится информация, которая может оказаться полезной при предоставлении данных об аналитических методиках в рамках заявок на регистрацию лекарственных средств, подаваемых в США, а также в Японии и Европе.

ПОЛЬЗОВАТЕЛЬСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

Перед тем как выбирать подходящую технологию и оборудование, которые отвечают актуальным требованиям анализа, необходимо определить точные технические требования к альтернативному микробиологическому методу. Поэтому организациям, которые хотят разработать и валидировать потенциальный альтернативный метод, рекомендуется составить спецификацию пользовательских требований (СПТ). Этот документ должен включать все ключевые функции технологии, принципиальные требования к пользовательскому интерфейсу, необходимые помещения, требования к окружающей среде, эксплуатационные требования и все другие важные характеристики альтернативного метода, имеющие отношение к его предполагаемому использованию. Эти требования будут зависеть от конкретной компании или организации, а также от предполагаемого использования альтернативного метода, и поэтому они должны составляться пользователем.

При составлении СПТ необходимо принимать во внимание три отдельных компонента валидации альтернативного микробиологического метода:

Компоненты качества данных

В главе с общей информацией 〈1058〉 описываются четыре различных компонента качества данных. Самым важным из них является квалификация оборудования; т.е. подтверждение того, что оборудование работает правильно. Следующий по значимости компонент – это валидация метода: подтверждение того, что технология работает согласно ожиданиям. Например, это может быть демонстрация того, что альтернативный микробиологический метод пригоден для выполнения испытания, как минимум, в той же мере, что и традиционный чашечный метод или выделение микроорганизмов из питательного бульона. Следующий по значимости компонент – включение в испытание надлежащего контроля для демонстрации постоянства пригодности тест-системы. Последний компонент качества данных – это использование образцов контроля качества – практика, не слишком часто применяемая в микробиологии, потому что аналитики стараются не допускать присутствия живых культур в помещениях, в которых проводят испытания образцов. Вышеперечисленные компоненты качества данных являются важным аспектом валидации альтернативных микробиологических испытаний, поскольку они помогают разработать СПТ.

Классические микробиологические методы

КОЕ используется уже на протяжении 125 лет и продолжает указываться в качестве единицы измерения количества микроорганизмов во всех действующих монографиях USP. Однако важно помнить, что КОЕ всегда являлась оценкой числа микроорганизмов, присутствующих в образцах, а не их точным подсчетом. Концептуализация КОЕ в качестве сигнала требует глубокого понимания процесса культивирования бактерий, дрожжей или плесневых грибов на твердой питательной среде, а также знания всех условий, необходимых для получения одной колонии.

Чашечный метод подсчета микроорганизмов дает оценку числа микроорганизмов, присутствующих в образце, на основе определения роста дискретных, поддающихся счету колоний в отдельной чашке; поэтому чашечный метод не является в строгом понимании методом подсчета количества клеток. Хотя теоретически возможно, чтобы одна жизнеспособная клетка выступала в качестве источника колониеобразующей единицы, в реальности маловероятно, чтобы одна единственная клетка привела к росту колонии в чашке. «Жизнеспособность клетки» определяется как способность клетки размножаться простым делением и приводить к образованию колонии. Для того чтобы из жизнеспособных клеток могла вырасти колония, необходима определенная питательная среда, особые условия инкубации и время. Однако в природе отдельные клетки встречаются редко, поэтому колония, вырастающая на твердой среде, как правило, происходит из скопления клеток, цепочки клеток или массы клеток, собранных вместе. Поэтому сигнал, основанный на КОЕ, имеет тенденцию занижать фактическое количество клеток, присутствующих в образце. Степень занижения результата будет варьироваться в зависимости от природы микроорганизма и способа подготовки образца.

Сигнал, основанный на КОЕ, также очень сильно зависит от условий окружающей среды, в которых происходит выделение микроорганизмов, и которые оказывают влияние на способность микроорганизмов к выживанию. Необходимо отметить, что все микроорганизмы, находящиеся за пределами своей оптимальной экологической ниши, в той или иной мере подвергаются стрессовому воздействию. Кроме того, вне лабораторной среды микроорганизмы редко находятся в экспоненциальной фазе роста, наиболее оптимальной для их переноса на микробиологическую среду в целях их выделения и роста. В прямом смысле слова, большинство микроорганизмов, присутствующих в лекарственных средствах, описанных в фармакопее, испытывают значительное стрессовое воздействие в сухой, лишенной питательных элементов среде, при повышенной температуре, высоких значениях ионной силы, крайних показателях рН или в присутствии противомикробных веществ, поэтому их выделение бывает сложно или даже невозможно осуществить. Очевидно, данные стрессовые факторы играют определенную роль в искажении результатов чашечного метода, о которых говорилось выше. Если условия роста микроорганизмов, особенности питательной среды или инкубации недостаточны для выделения и роста колоний, сигнал может показывать 0 КОЕ или отсутствие роста, даже если в образце присутствуют жизнеспособные клетки. Данные стрессовые факторы могут не иметь значения для альтернативных методов, не основанных на определении роста микроорганизмов и способных регистрировать сигналы клеток, не растущих на среде. Точность результатов также может быть скомпрометирована, если микроорганизмы присутствуют в больших скоплениях, которые характерны для органических веществ, и разбиваются на меньшие единицы в процессе подготовки. В данном случае, в зависимости от обработки образцов или обращения с ними, скопление может включать одну или несколько колоний. Более того, число КОЕ в чашке должно находиться в пределах, допускающих проведение подсчета, например, 25-250 для бактерий, чтобы можно было провести достаточно достоверный подсчет.

Таким образом, методы, основанные на определении роста микроорганизмов, отражают логарифмические зависимости, и сигнал, указывающий на количественное содержание (КОЕ), является в большей степени оценкой, а не точным определением количества клеток. Понимание преимуществ и недостатков использования КОЕ в качестве сигнала, является ключевым аспектом валидации альтернативного метода, в котором используется альтернативный сигнал. Поэтому КОЕ не может считаться единственной единицей микробиологического количественного определения.

Сигналы, используемые в альтернативных микробиологических методах

Современные микробиологические методы или микробиологические методы экспресс-анализа, как правило, используют при оценке или определении числа микроорганизмов другие сигналы (не КОЕ). Эти сигналы часто обрабатываются при помощи инструментов, а не визуально. Проводятся масштабные исследования по изучению возможностей различных методов в области микробиологического анализа лекарственных средств, описываемых в фармакопее, и в большинстве случаев будущий пользователь знаком с характеристиками метода и регистрируемым им сигналами до того, как выбирает этот метод в качестве альтернативного. Принципы, которыми следует руководствоваться при выборе метода, представлены в разделе «Валидация альтернативных технологий» и в рецензируемых научных источниках.

Большинство микробиологических методов экспресс-анализа являются, в известной мере, методами прямого подсчета количества клеток. Поэтому они могут дать более точную оценку содержания клеток в определенном образце, чем метод, основанный на определении КОЕ, в зависимости от способа использования метода и вида испытуемого лекарственного средства, описанного в фармакопее.

Некоторые альтернативные или экспресс-методы обнаруживают клетки и оценивают их количество на основе определения их метаболической активности с регистрацией сигнала, поддающегося измерению приборами. Примерами такого рода сигналов могут служить: количество аденозинтрифосфата (АТФ) (биолюминисценция), лазерно-индуцированная флуоресценция, ферментная активность и физико-химические изменения состава питательного бульона или свободного пространства над бульоном.

Альтернативные методы могут также основываться на прижизненном окрашивании, при котором клетки окрашиваются или имеют собственную аутофлюоресценцию (за счет компонентов клетки), и затем напрямую подсчитываются при помощи микроскопа или измерительного прибора. Чтобы повысить вероятность подсчета только живых клеток, могут использоваться несколько красителей, которые могут: 1) повышать чувствительность, зависящую от функции клеточной мембраны, 2) усиливать взаимодействие с нуклеиновыми кислотами или 3) улучшать обнаружение метаболической активности.

Существуют также методы на основе использования нуклеиновых кислот, а также целый ряд физико-химических методов анализа, которые используются в фармацевтической, биофармацевтической, клинической и пищевой микробиологии. В данных методах нуклеотидная последовательность может служить мишенью, может амплифицироваться, обнаруживаться или подсчитываться, что важно для понимания типа сигнала, который регистрируются в аналитическом методе. Кроме того, необходимо понимать физиологическое свойство микроорганизма, которое вызывает сигнал, позволяющий подсчитать количество клеток.

ПОКАЗАТЕЛИ ЭФФЕКТИВНОСТИ

Альтернативные методы подсчета клеток могут давать более высокие или низкие значения содержания клеток, чем значения, полученные при помощи традиционных фармакопейных методов, при выполнении количественного анализа лекарственных средств, описанных в фармакопее. Однако вне зависимости от того, будут ли эти значения выше или ниже, как правило, можно обнаружить отрицательные тенденции при их сравнении с результатами, полученными при помощи фармакопейного метода.

Получение результатов подсчета клеток, отличающихся от результатов в КОЕ, не должно вызывать беспокойства, если различные методы и различные регистрируемые ими сигналы, характеризующие присутствие клеток, эквивалентны или не менее эффективны чем арбитражные методы в отношении оценки микробиологической безопасности образца. Более высокое содержание клеток не следует считать показателем более высокого риска с учетом вариабельности стандартных методов, основывающихся на определении роста микроорганизмов, и физической и химической природы испытуемых лекарственных средств, описываемых в фармакопее. Особенно это касается подсчета микроорганизмов в образцах лекарственных средств, имеющих длительную историю безопасного и эффективного применения. В подобных случаях обнаружение в образце большего количества клеток, чем ранее, не означает, что его качество ухудшилось.

В случае с качественными методами (т.е. указывающими на присутствие или отсутствие микроорганизмов) сравнение ложноотрицательных и ложноположительных результатов, полученных в контролируемых исследованиях с использованием фармакопейного и альтернативного микробиологического методов, может служить мерой установления эквивалентности. Существуют коммерческие технические дополнения к методам, основанным на определении роста микроорганизмов, которые позволяют быстрее подсчитывать колонии на твердых средах и могут использоваться после значительного меньшего периода инкубации, чем требуется для подсчета микроорганизмов невооруженным глазом. Для использования этих методов все равно необходимо выращивать микроорганизмы на средах или в средах. Поэтому многие из этих методов в строгом понимании не отличаются от существующих фармакопейных методов, но являются просто техническими усовершенствованиями, позволяющими более быстро обнаруживать колонии. При применении этих усовершенствованных методов для определения роста колоний верификация необходима только для способности метода к обнаружению микроорганизмов.

ОБЪЕМ ВЫБОРКИ

Для любого альтернативного микробиологического метода испытаний (в рамках его функционального назначения) может использоваться любой объем выборки и количество испытаний, достаточные для принятия равноценного (или более обоснованного) заключения о микробиологической чистоте образца, в сравнении с заключением, основанным на результатах, полученных при использовании референтного метода. Для многих, если не для большинства, альтернативных методов проще бывает использовать инструкции по отбору проб, описанные в официальном фармакопейном методе. При использовании подхода к отбору проб, установленного официальным фармакопейным методом, нет необходимости обосновывать объем выборки.

Статистика и альтернативные методы

Попытки использования статистики для сравнения результатов, выраженных в КОЕ, с сигналами, регистрируемыми в биохимических, физиологических или генетических методах анализа, имеют ограниченную ценность. С учетом различий между этими группами методов от них нельзя ждать сигналов, которые можно было бы сравнить статистически с точки зрения средних значений и вариабельности. Таким образом, количественные значения, выраженные в КОЕ, получаемые при использовании референтных методов, как правило, не могут использоваться в качестве критериев приемлемости при анализе образцов с помощью предлагаемых альтернативных методов. Это входит в задачи пользователя – предложить и обосновать значения, при необходимости, со ссылкой на научные литературные источники, которые подходили бы для выбранного и валидированного метода. Для этого не обязательно нужно использовать существующие стандарты, выраженные в КОЕ.

КВАЛИФИКАЦИЯ ОБОРУДОВАНИЯ

Квалификация оборудования должна, хотя бы в общих чертах, следовать рекомендациям, изложенным в главе 〈1058〉. Квалификация оборудования, играющего основную роль в выполнении альтернативного микробиологического метода испытания, включает четыре отдельных этапа:

ВАЛИДАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Спецификация пользовательских требований

При подготовке документа СПТ следует использовать рекомендации всех заинтересованных сторон, имеющих отношение к применению микробиологического метода испытаний. Заинтересованные стороны могут включать специалистов в области микробиологии, качества, регуляторных вопросов, вопросов эксплуатации и др. Время, потраченное на этот этап, следует считать вкладом в достижение четкого понимания нужд компании до того, как оборудование будет куплено, и использовать это понимание при квалификации оборудования. Данный документ должен включать, как минимум, следующее:

См. главу 〈1058〉, в которой представлена информация о квалификации аналитического оборудования. Принципы, изложенные в главе 〈1058〉, как правило, применимы к квалификации оборудования, используемого для проведения альтернативных микробиологических анализов. Пользователю, возможно, придется адаптировать некоторые рекомендации, представленные в главе 〈1058〉, к спецификациям на квалификацию определенного оборудования.  

Критерии валидации

В таблице 1 представлены параметры валидации, как правило, рекомендуемые для количественных и качественных микробиологических испытаний. Примерами качественных испытаний могут служить испытание на стерильность и проверка отсутствия определенных микроорганизмов. Примером количественного испытания может служить определение числа микроорганизмов. Необходимо отметить, что качественные испытания являются бинарными, и поэтому, как правило, для них не нужно устанавливать эквивалентность единиц измерения, только эквивалентность результатов.

Таблица 1. Параметры валидации, определяемые типом микробиологического испытания

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Определение: Специфичность альтернативного качественного микробиологического метода представляет собой возможность обнаружить ряд специально вносимых в образец микроорганизмов, которые являются специфичными для используемой технологии. «Ряд микроорганизмов» можно определить как ограниченное количество микроорганизмов, представляющих риск для пациента или лекарственного средства, микроорганизмы, обнаруживаемые в случае нарушения производственных условий и производственного брака, микроорганизмы, которые подходят для измерения эффективности альтернативного метода, и микроорганизмы, репрезентативные по своим морфологическим и физиологическим свойствам в отношении метода и лекарственного средства.

Подтверждение: Специфичность демонстрируется посредством сравнения результатов выделения набора микроорганизмов, специально вносимых в образцы, при помощи фармакопейного и альтернативного методов. Количество микроорганизмов, вносимых в образцы, превышает предел обнаружения или количественного определения, но при этом позволяет измерить эффективность методов.

Методы на основе определения роста микроорганизмов — помещают небольшое количество (около 100 КОЕ) каждого микроорганизма на панель и выполняют анализ при помощи как фармакопейного, так и альтернативного метода, чтобы продемонстрировать выделение микроорганизмов.

Методы, не основанные на определении роста микроорганизмов — применяют подходящие отрицательные и положительные контроли, чтобы продемонстрировать, что посторонние вещества, которые могут присутствовать в системе (например, внеклеточная АТФ, ДНК или ингибирующие и стимулирующие сигнал вещества) не мешают определению установленного набора микроорганизмов.

При использовании методов на основе роста микроорганизма необходимо выделить и идентифицировать все внесенные в образец микроорганизмы. При использовании методов, не основанных на росте микроорганизмов, микроорганизмы выделяют и идентифицируют при наличии возможности.

ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ

Определение: Предел обнаружения (LOD) альтернативного микробиологического метода – это наименьшее количество микроорганизмов, которое может быть обнаружено, но не обязательно количественно измерено, в установленном объеме образца при заданных экспериментальных условиях. Данное испытание проводится с использованием контрольных штаммов микроорганизмов, указанных в монографиях «Тестирование антимикробной эффективности» 51, «Испытание на микробиологическую чистоту нестерильных лекарственных средств: определение количества микроорганизмов» 61, «Испытание на микробиологическую чистоту нестерильных лекарственных средств: испытания на отдельные виды микроорганизмов» 62, «Испытание на микоплазмы» 63 и «Испытание на стерильность», и подходящих для альтернативного метода.

Подтверждение

Метод 1

— Статистика: используют критерий хи-квадрат или другой приемлемый подход, чтобы продемонстрировать эквивалентность выделения внесенных микроорганизмов.

— Возможно также использовать метод 2.

Метод 2 (метод наиболее вероятного количества)

РОБАСТНОСТЬ

Определение: способность метода не реагировать на воздействие небольших преднамеренных изменений в параметрах метода, например, объема реактива, времени инкубации или температуры окружающей среды, что указывает на его надежность во время обычного использования. Измерение робастности не заключается в сравнении альтернативного и традиционного методов, а скорее является необходимым компонентом валидации альтернативного метода, нацеленным на ознакомление пользователя с рабочими параметрами метода. Допускается использование данных, предоставленных разработчиком метода.

УСТОЙЧИВОСТЬ

Определение: степень прецизионности результатов испытаний, полученных при анализе одних и тех же образцов при различных нормальных условиях проведения испытаний, например, при выполнении испытания разными аналитиками (например, тремя), с использованием разного оборудования и партий реактивов (способ демонстрации устойчивости может основываться на рекомендациях поставщика оборудования или материалов или может полностью основываться на данных, предоставленных разработчиком метода).

Определения других параметров валидации представлены в глоссарии.

ПРИГОДНОСТЬ МЕТОДА

Для каждого нового лекарственного средства, которое будет тестироваться с использованием валидированного альтернативного микробиологического метода, проводят испытание на пригодность согласно инструкциям, представленным в главах об общих методах испытаний (см. 〈51〉, 〈61〉, 〈62〉, 〈63〉, и 〈71〉), используя указанное количество и объем образцов, а также способ подготовки образцов, подходящий для исследуемого лекарственного средства, и требуемую чувствительность метода для того, чтобы подтвердить, что факторы, связанные с лекарственным средством, не искажают сигнал, регистрируемый методом.

Пригодность метода можно продемонстрировать с использованием трех независимых испытаний. Для количественных методов необходимо проверять только такие параметры валидации, как точность и прецизионность. Для количественных методов достаточным является проверка выделения вносимых в образцы микроорганизмов, выполняемая согласно указаниям в главах 〈62〉, 〈71〉 и 〈1227〉.

Если на примере одного лекарственного средства было продемонстрировано, что альтернативный метод эквивалентен фармакопейному методу, то необязательно повторять проверку параметров эквивалентности для каждого нового лекарственного средства; достаточно будет проверить пригодность метода. Например, при использовании испытания на основе нуклеиновых кислот для каждого нового лекарственного средства необходимо продемонстрировать, что остаточные вещества не влияют на концентрацию, экстракцию, очистку и выделение нуклеиновой кислоты-мишени или амплификацию рибосомной рибонуклеиновой кислоты-мишени (рРНК) при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение ее нуклеотидной последовательности при помощи химического зонда.

ЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ

Целью всех микробиологических испытаний является получение данных для принятия обоснованных заключений о микробиологической чистоте лекарственного средства, сырья, компонента лекарственного средства или этапа обработки. В связи с этим, предполагаемым назначением микробиологических испытаний может являться либо оценка присутствия/отсутствия микроорганизмов (как в испытании стерильности), либо оценка количества присутствующих микроорганизмов. Технологические средства, которые используются в микробиологических методах для оценки микробиологической чистоты и которые позволяют сделать вывод о качестве лекарственного средства, могут отличаться от технологий, основанных на определении роста микроорганизмов, которые используются в арбитражных методах. При проведении микробиологической оценки качества с использованием альтернативных микробиологических методов единицами измерения (сигналами) являются, как правило, не КОЕ, а другие подходы к оценке содержания клеток. Поэтому валидация альтернативных микробиологических методов должна включать два компонента: 1) демонстрацию эквивалентности и 2) квалификацию аналитической методики и оборудования.

Демонстрация эквивалентности

В главе «Общие замечания и требования» указано, что альтернативные методы могут использоваться, если они имеют преимущества в отношении точности, чувствительности, прецизионности, селективности или дают возможности автоматизации метода или сокращения объема компьютерных данных. Далее в главе говорится, что альтернативные методы могут использоваться и в некоторых других особых случаях. Подобные методы должны валидироваться согласно инструкциям в главе 〈1225〉 и должны демонстрировать эквивалентные или более надежные результаты для каждого из показателей качества в сравнении с арбитражными методами. При сравнении двух методик анализа для демонстрации эквивалентности или большей эффективности альтернативного метода, собирают статистические данные, подтверждающие его эквивалентность или, говоря языком статистики, не меньшую эффективность. Например, в случае с определением числа микроорганизмов эквивалентность можно продемонстрировать, если отсутствует статистически значимое различие между двумя средними значениями, полученными при подсчете микроорганизмов с использованием фармакопейного и альтернативного методов. Однако такое сравнение невозможно, если в этих двух методах регистрируются разные сигналы. Примером подобной ситуации может служить определение числа микроорганизмов при помощи витального окрашивания микробных клеток или измерения геномного материала вместо измерения КОЕ.

В отраслевом руководстве FDA «Валидация аналитических методик и процедур: документация по химическим свойствам, процессу производства и контролю» также указано, что валидированные альтернативные аналитические методики могут фигурировать в заявке, только если было продемонстрировано, что их эффективность эквивалентна или выше эффективности аналитической методики, одобренной регуляторным органом. Также, в разделе 2.7 документа ICH «Методики испытаний и критерии приемлемости для новых фармацевтических субстанций и новых лекарственных препаратов: химические субстанции» (Q6A) говорится, что альтернативными методиками являются те методики, которые могут использоваться для измерения определенного свойства при условии, что контроль качества фармацевтической субстанции или лекарственного препарата осуществляется на том же или на более высоком уровне, что и при использовании официального метода. Однако существуют и другие варианты демонстрации эквивалентности, которые описаны ниже в разделе «Подтверждение эквивалентности».  

Подтверждение эквивалентности

Для демонстрации эквивалентности предлагаемого альтернативного аналитического метода могут использоваться четыре модели: 1) допустимые методики (т.е. соответствие минимальным требованиям к эффективности или критериям приемлемости без необходимости демонстрации эквивалентности по отношению к фармакопейному методу); 2) эквивалентность функциональности в сравнении с фармакопейным методом; 3) эквивалентность результатов в сравнении с фармакопейным методом; и 4) эквивалентность заключений в сравнении с фармакопейным методом (1). Сравнение этих четырех способов демонстрации эквивалентности представлено в таблице 2. Наличие нескольких способов демонстрации эквивалентности отражает разнообразие технологий и применений альтернативных методик и может рассматриваться как смена парадигмы в демонстрации эквивалентности.

Таблица 2. Матрица выбора эквивалентности

ВАРИАНТ 1: ДОПУСТИМЫЕ МЕТОДИКИ

Данный случай не является в полной мере подтверждением эквивалентности на основе прямого сравнения предлагаемого альтернативного метода с официальным фармакопейным методом. Для этой модели может использоваться стандартный образец с известными свойствами, например, стандартный инокулят, содержащий специфический микроорганизм, определенное количество высокоочищенного бактериального генома, уровень АТФ или другой подходящий сигнал. В некоторых случаях необходимо, чтобы альтернативный метод измерял сигнал в присутствии испытуемого образца, и применялись критерии валидации, соответствующие возможностям технологии, согласно данным научных источников.

ВАРИАНТ 2: ЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОСТИ

Эквивалентность функциональности подразумевает демонстрацию эквивалентных или более надежных результатов с точки зрения критериев валидации – таких как точность, прецизионность, специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, робастность и устойчивость, - которые могут быть актуальны для предполагаемого использования альтернативного качественного или количественного метода. Альтернативный метод может не соответствовать некоторым из перечисленных критериев валидации, в отличие от официального фармакопейного метода, и, тем не менее, будет считаться допустимым благодаря своим преимуществам. Например, в случае если альтернативный метод имеет какие-либо из преимуществ, перечисленных в главе «Общие замечания и требования» (методы «могут использоваться, если они имеют преимущества в отношении точности, чувствительности, прецизионности, селективности или дают возможность автоматизации метода или сокращения объема компьютерных данных»). Другие особые случаи могут включать сокращения срока получения результата или сокращение расходов на проведение испытания. Если предлагаемый альтернативный метод подходит для оценки качества испытуемого образца, он может считаться допустимым, даже если он отличается от официального метода по одному или более параметрам валидации. Окончательные критерии квалификации должны отражать критерии, которые, по мнению микробиологов, являются обязательными для достижения эквивалентной функциональности.

ВАРИАНТ 3: ЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эквивалентность результатов подразумевает, что альтернативный и фармакопейный методы дают эквивалентные численные результаты. Этот подход отличается от оценки параметров валидации, проводимой при подтверждении эквивалентности функциональности. Поскольку в микробиологии невозможно провести разные испытания для одного и того же образца, как правило, при сравнении двух методов устанавливается допустимый интервал, и альтернативный метод определяется как дающий более точные результаты или не менее точные результаты в числовом выражении. Отчеты об использовании альтернативных методов, не основанных на определении роста микроорганизмов, показывают, что они могут давать гораздо более высокие значения содержания клеток, чем методы основанные на определении роста микроорганизмов, результаты которых выражаются в КОЕ. В данном случае аналитики могут использовать градуировочный график, чтобы показать корреляцию между двумя методами в диапазоне спецификации на лекарственное средство.

ВАРИАНТ 4: ЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ ЗАКЛЮЧЕНИЙ

Эквивалентность заключений схожа с эквивалентностью результатов, но только в этом случае получают не численный результат, а заключение о прохождении/непрохождении испытания. При данном подходе частота получения положительных и отрицательных результатов не должна отличаться от аналогичных показателей фармакопейного метода. Это требование к «не меньшей эффективности» основывается на длительной истории использования арбитражного фармакопейного метода для проведения испытаний качества и испытаний при выпуске лекарственных средств. Для квалификации метода можно рассмотреть возможность проведения лабораторных испытаний с намеренным добавлением в образец малых количеств микроорганизмов. В приведенных ниже разделах предлагаются подходы к демонстрации эквивалентности или преимуществ альтернативных методик в сравнении с фармакопейными. Пользователи могут применять другие подходящие методы для демонстрации эквивалентности при наличии соответствующего научного обоснования.

Демонстрация эквивалентности для альтернативных качественных микробиологических методик анализа

Результаты, полученные при использовании методик, описанных в главах 〈62〉, 〈63〉 и 〈71〉, помогают определить присутствие или отсутствие микроорганизмов в испытуемом образце. Эти испытания позволяют сделать заключение о качестве (т.е. проходит ли лекарственное средство испытание или нет). Такой вид данных относится к категории эквивалентности заключений, описанной в статье «Стимулы» (2). Подход 1 (см. ниже) основывается на демонстрации эквивалентности заключений. Подход 2 (см. ниже) является альтернативным и преобразует качественные результаты в количественные при помощи метода наиболее вероятного количества (MPN). В обоих подходах используется гипотеза не меньшей эффективности (3).

Чтобы продемонстрировать приемлемость альтернативной методики в сравнении с утвержденной микробиологической методикой лаборатория должна показать, что новая методика обладает такой же или более высокой эффективностью в сравнении с утвержденной методикой в отношении способности обнаруживать присутствие микроорганизмов. В целом, рекомендованным подходом к сравнению альтернативной методики с фармакопейной является использование испытания не меньшей эффективности (одностороннего сравнения, как в исследованиях не меньшей эффективности, проводимых в клинических исследованиях новых лекарственных средств) (4), а не двустороннего исследования эквивалентности (как при установлении биоэквивалентности (5)). Подход, основанный на демонстрации не меньшей эффективности, является приемлемым по двум причинам. Во-первых, с точки зрения пациента лучше использовать альтернативную методику, которая потенциально является более чувствительной, чем арбитражный метод. При двустороннем подходе, напротив, более точные результаты обнаружения микроорганизмов считаются недопустимыми. Важно отметить, что те, кто будет использовать альтернативный метод, должны будут оценить риск, связанный с изменением процедуры, поскольку использование более чувствительной методики может привести к появлению большего числа положительных результатов. Во-вторых, у альтернативной методики могут быть преимущества (основное из которых – сокращение времени получения результатов), которые делают ее более предпочтительной, чем фармакопейный метод, даже если она не обладает такой же чувствительностью, при условии, что она все же позволяет сделать не менее обоснованное заключение о качестве лекарственного средства, чем фармакопейный метод.

ПОДХОД 1: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ, СВИДЕТЕЛЬСТВУЮЩИХ О ПРИСУТСТВИИ/ОТСУТСТВИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Гипотеза не меньшей эффективности для данного подхода заключается в том, что процент образцов, в которых регистрируется сигнал при использовании новой методики (PN), должен быть не более чем на определенное значение (Δ > 0) меньше процента образцов, в которых регистрируется сигнал при использовании утвержденной фармакопейной методики (PC) (6):

Result = PN−PC≥−Δ

Δ – это предел не меньшей эффективности. Если лаборатории не нужны более строгие значения предела, используют Δ = 0,20 в экспериментах, описанных ниже. Рассчитывают односторонний доверительный интервал с уровнем доверия 90 % для PN−PC (7). Не меньшая эффективность подтверждается, если нижняя граница доверительного интервала выше −0,20. Если по результатам эксперимента подтверждается гипотеза не меньшей эффективности, то с вероятностью 95 % можно утверждать, что PN≥PC− 0,20 при исследуемом уровне бионагрузки.

Данный анализ должен проводиться с использованием типов микроорганизмов, которые лаборатория считает репрезентативными в отношении наиболее часто встречающихся микроорганизмов. Выбор может осуществляться на основе данных главы 〈71〉, или могут быть выбраны подходящие микроорганизмы, используемые при проверке пригодности методики испытаний, микроорганизмы, выделенные при проведении испытаний лекарственного средства, и/или микроорганизмы, репрезентативные в отношении тех, которые могут представлять риск для пациентов при определенном пути введения.  

Лаборатория должна проанализировать, можно ли продемонстрировать, что альтернативная методика является не менее эффективной, чем микробиологическая методика в отношении чувствительности, за счет определения процента образцов, показывающих положительный результат выделения и роста микроорганизмов. Для каждого из микроорганизмов, используемых в качественном испытании, проводят три анализа. В первом анализе используют образцы, которые после серийного разведения имеют значения на уровне или около 100, т.е. 1 КОЕ, в которых маловероятно определение роста микроорганизмов (и, соответственно, не будет регистрироваться сигнал при использовании методики, основанной на определении роста микроорганизмов), чтобы охарактеризовать чувствительность новой методики на данном уровне. Во втором анализе используются образцы со значениями на уровне или около 102 (100–200 КОЕ), в которых при помощи микробиологической методики можно определить рост микроорганизмов на достаточно высоком уровне около 75 % или выше, чтобы определить приемлемость новой методики. В третьем анализе проводится сравнение двух методик на уровне бионагрузки, при котором в около 50 %- 75 % образцов вероятен рост колоний (часто при серийном разведении до примерно 101 (10–50 КОЕ)), чтобы проверить гипотезу не меньшей эффективности, описанную выше. При анализе не меньшей эффективности качественных микробиологических испытаний должны использоваться, минимум, 75 образцов для каждой из методик. Использование 75 образцов обеспечивает приблизительно 80 % мощность исследования. Если лаборатория решит, что с учетом требований анализа к определенному лекарственному средству необходима более высокая статистическая мощность, повышение количества испытуемых образцов до 100 позволит повысить статистическую мощность до примерно 90 %. Данные процедуры подходят для проверки не меньшей эффективности, если методики обладают одинаковой чувствительностью при Δ = 0,20. Если лаборатория считает, что их новая методика менее чувствительна, чем фармакопейная, для обеспечения описанных выше уровней мощности необходимо будет использовать большее количество образцов.

Независимые выборки: Предположим, что NA образцов были исследованы при помощи предлагаемой альтернативной методики анализа, из которых XA образцов дали положительные результаты; и NC образцов (не тех же самых, которые исследовались при помощи новой методики) были исследованы при помощи фармакопейной методики, и из них XC образцов дали положительные результаты. Выполняют расчеты по формулам:

где  R – соотношение дисперсий, по которым устанавливают мощность.

Заключение о не меньшей эффективности делается, если Z > zα, где zα – верхняя процентная точка стандартного нормального распределения для уровня значимости α.

Парные выборки: Предположим, что N образцов были исследованы при помощи обеих методик - предлагаемой альтернативной и фармакопейной. Результаты могут быть представлены в таблице «два на два» (см. таблицу 3).

Таблица 3. Результаты для парной выборки

Проводят вычисления по следующим формулам:

Заключение о не меньшей эффективности делается, если Z > zα, где zα – верхняя процентная точка стандартного нормального распределения для уровня значимости α.

ПОДХОД 2: СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ MPN

Для фармакопейной арбитражной методики и альтернативной методики проводят сравнительное исследование наиболее вероятного числа микроорганизмов (MPN) с использованием стандартных процедур MPN для каждого из N числа образцов. Лучше всего использовать одни и те же образцы для обеих методик, но это не является обязательным требованием.

Для подхода 2 гипотеза не меньшей эффективности выглядит следующим образом:

µA−µC≥ log(R) or antilog(µA−µC) ≥R

где µA и µC – средние значения в логарифмической шкале для альтернативной и фармакопейной методик, соответственно.

Независимые выборки: Определяют MPN для NA образцов при помощи альтернативной методики, преобразуют все значения в логарифмические и определяют среднее значение выборки для логарифмических значений (xA) и дисперсию выборки для логарифмических значений (S2A). Точно так же определяют xC и S2C на основе логарифмических значений, полученных для NC образцов, исследуемых с использованием фармакопейной методики. Выполняют следующие расчеты:

где tα, df – верхняя процентная точка t-распределения при уровне значимости α с числом степеней свободы df и:

При использовании программного обеспечения, которое допускает только целые значения степеней свободы (например, Excel), используют линейную интерполяцию для получения t-значения. Не меньшая эффективность подтверждается, если antilog(Llow) ≥R.

Парные выборки: Определяют MPN для N образцов при помощи альтернативной методики и для тех же самых N образцов при помощи фармакопейной методики, преобразуют все полученные значения (2N) в логарифмические и определяют среднее значение выборки (x) и дисперсию выборки (S2) для разниц логарифмических значений, полученных с использованием альтернативной методики, и логарифмических значений, полученных с использованием фармакопейной методики. Проводят следующие расчеты:

Llow = x−tα,N−1S/√N

где tα,N−1 – верхняя процентная точка t-распределения при уровне значимости α с числом степеней свободы N− 1. Не меньшая эффективность подтверждается, если antilog(Llow) ≥R.

Демонстрация эквивалентности для альтернативных количественных микробиологических методик анализа

Отличительной чертой некоторых альтернативных количественных методик является значительное отличие регистрируемого ими сигнала от КОЕ, используемых в фармакопейной микробиологической методике, что не позволяет продемонстрировать их эквивалентность в общепринятом смысле, поскольку численные результаты будут различаться по значениям и по используемым единицам измерения. Поэтому в данной главе предлагаются два критерия для проверки приемлемости альтернативных количественных методик:

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Готовят, минимум, шесть образцов для, минимум, двух уровней бионагрузки, близких к пределам требований спецификации, актуальным для лаборатории. Исследует образцы при помощи альтернативной методики. (Примечание: должны соблюдаться условия повторяемости; см. главу 〈1225〉). На каждом уровне определяют дисперсию выборки (S2) для логарифмических значений (log10), полученных для образцов. Выполняют следующие расчеты:

Где n  количество образцов (n≥ 6) и χ2.05,N−1  нижнее 5 % значение распределения хи-квадрат с числом степеней свободы n−1. Прецизионность считается приемлемой, если *UL ≤σ, где σ максимальный геометрический коэффициент вариации для заранее установленного приемлемого процента повторяемости (%GCV). (Для небольших значений %GCV будет приблизительно равняться %RSD).

Чем больше используется образцов (n), тем больше вероятность (которая в статистике называется «мощность»), что методика, для которой была установлена приемлемая прецизионность, будет давать удовлетворительные результаты и, таким образом, будет считаться допустимой. Лаборатория должна опираться на полученные ранее данные и опыт, чтобы определить, какое количество образцов (n) необходимо им для проверки прецизионности.

Пример: для данных, полученных при использовании альтернативной методики и приведенных в таблице 4, выполняют следующие расчеты:

n = 10

S2 = 0.000241, и

= 3.325113, следовательно

UL = 6.06%

Таким образом, данная альтернативная методика имеет приемлемую прецизионность повторяемости, поскольку предварительно заданный критерий успешной работы σ составлял, как минимум, 6,06%.

КОРРЕЛЯЦИЯ (ЛИНЕЙНОСТЬ)

Готовят, минимум, два образца для каждого из четырех различных уровней бионагрузки, охватывающих диапазон от уровня, близкого к пределу квалификации (LOQ), до уровня, который на один логарифм выше предела спецификации, установленного в стандартном фармакопейном методе, с которым сравнивается предлагаемый альтернативный метод. Определяют активность всех образцов при помощи как альтернативного, так и фармакопейного метода. Строят график и устанавливают корреляцию между логарифмическими значениями, полученными при использовании альтернативного метода (y), и логарифмическими значениями, полученными при использовании фармакопейного метода (x). Данная корреляция считается приемлемой при минимальном значении 0,95 (или R2 равном, минимум, 0,9025).

Хотя обычно наблюдается линейная зависимость между двумя наборами результатов, допустимой считается и нелинейная зависимость. В последнем случае используют корреляцию Спирмена (непараметрический метод) вместо корреляции Пирсона.

Таблица 4

На рисунке 1 показан график данных после их преобразования в логарифмы по основанию 10. Поскольку R2 не отвечает установленному требованию, корреляция результатов двух методик считается недостаточной.  

Рисунок 1.

Предлагаемые альтернативные методики, подходящие для получения заключений о микробиологической чистоте образца (как на рис. 1), могут недостаточно хорошо коррелировать с фармакопейной методикой и поэтому не отвечать описанному выше критерию корреляции. В этом случае допускается использовать модель эквивалентности заключений, описанную ранее для качественных испытаний. Во время разработки методики лаборатория должна установить спецификацию для альтернативной методики по соответствию спецификации фармакопейной методики в отношении требуемого уровня микробиологической чистоты. Например, если требуемый уровень микробиологической чистоты составляет не более 102 КОЕ, которому соответствует максимальное приемлемое содержание 200 КОЕ, установленное фармакопейной методикой, то лаборатории необходимо установить критерий приемлемости для предлагаемой альтернативной методики, которая будет соответствовать данному значению с точки зрения принятия заключения о микробиологической чистоте лекарственного средства. Затем для подтверждения приемлемости выбранного критерия проводится валидационное исследование в соответствии с инструкциями, описанными выше для качественных испытаний.

ГЛОССАРИЙ

Точность (Accuracy): близость результатов испытаний, полученных при использовании альтернативного метода, значениям, полученным при помощи традиционного метода, которую демонстрируют в аналитической области испытания.

Альтернативный микробиологический метод (Alternative microbiological method): современный микробиологический метод или микробиологический метод экспресс-анализа (MMM или RMM), который отличается от традиционного метода, основанного на определении роста микроорганизмов, такого как чашечный метод или выделение микроорганизмов из питательного бульона. Альтернативные или экспресс-методы могут использовать различные технологии, оборудование и программное обеспечение для проведения анализа и интерпретации данных и могут давать количественные (подсчет) или качественные (определение) результаты микробиологического анализа.

Колониеобразующая единица, КОЕ (Colony-forming unit, cfu): оценка количества микроорганизмов, полученная при помощи традиционных чашечных методов. Результаты подсчета зависят от способности микроорганизмов, содержащихся в образце, к росту в микробиологической питательной среде при определенных условиях инкубации. Поскольку нельзя точно определить, возникла ли колония из одной или даже тысячи клеток, результаты приводятся в КОЕ/мл (для жидких форм) или КОЕ/г (для твердых форм), а не в количестве клеток на миллилитр или на грамм.

Традиционный микробиологический метод (Conventional microbiological method): классический или традиционный метод анализа, основанный на определении роста микроорганизмов, например, подсчет колоний в чашке с агаровой средой или определение колоний в жидком бульоне после инкубации в течение определенного периода времени при определенной температуре. Эти методы указываются в главах 〈51〉, 〈61〉, 〈62〉, 〈63〉 и 〈71〉.

Эквивалентность (Equivalence): совпадение результатов, получаемых при использовании двух разных методик анализа, в достаточной степени для использования данных методик по предполагаемому назначению. Для демонстрации эквивалентности необходимо заранее установить целевую степень совпадения результатов, получаемых при использовании двух разных методик.

Ложноотрицательный (False negative): результат испытания, который неправильно квалифицируется как отрицательный (например, результат, свидетельствующий об отсутствии жизнеспособных микроорганизмов в образце, в то время как они присутствуют). Ошибка типа II, также известная как ошибка второго рода, имеет место, когда нулевая гипотеза является ложной, но по ошибке ее не опровергают. Это неспособность определить то, что на самом деле существует, другими словами, невосприятие сигнала (также «пропуск события»). Ошибку типа II можно сравнить с так называемым ложноотрицательным результатом (и расценивать как «невосприятие сигнала») в испытании, в котором проверяется определенное состояние и дается заключение о его наличии или отсутствии («да или нет»). Вероятность ошибки типа II обозначается греческой буквой β и соотносится с мощностью испытания (которая равняется 1 −β).

Ложноположительный (False positive): результат испытания, который неправильно квалифицируется как положительный (например, результат, свидетельствующий о наличии жизнеспособных микроорганизмов в образце, в то время как они отсутствуют). В теории статистической проверки гипотез понятие статистической ошибки является очень важным. Бывают ошибки типа I и типа II. Ошибка типа I, также известная как ошибка первого рода, имеет место, когда нулевая гипотеза (H0) является верной, но по ошибке ее опровергают. Это утверждение о том, что что-то существует, в то время как на самом деле оно отсутствует (т.е. «ложная тревога»). Ошибку типа I можно сравнить с так называемым ложноположительным результатом (свидетельствующим о наличии определенного состояния при его отсутствии) в испытании, в котором проверяется определенное состояние. Вероятность ошибки типа I называется «размером» испытания и обозначается греческой буквой α. Она обычно эквивалентна уровню значимости испытания. В случае с простой нулевой гипотезой α – это вероятность возникновения ошибки I типа.

Независимые выборки (Independent samples): образцы, отобранные из одной или из разных популяций, которые не оказывают влияния друг на друга. Другими словами, образцы не коррелируют друг с другом.

Предел обнаружения (Limit of detection, LOD):  наименьшее количество микроорганизмов, которое может быть обнаружено, но не обязательно количественно измерено, в установленном объеме образца при заданных экспериментальных условиях.

Предел количественного определения (Limit of quantification, LOQ): наименьшее количество микроорганизмов, которое может быть с приемлемой степенью точности и прецизионности подсчитано в испытуемом образце при заданных экспериментальных условиях.

Линейность (Linearity): способность давать результаты, которые пропорциональны концентрации микроорганизмов в образце в пределах конкретного диапазона.

Пригодность метода (Method suitability): демонстрация того, что факторы, связанные с лекарственным средством, не усиливают и не ослабляют сигнал, регистрируемый методом.

Не меньшая эффективность (Non-inferiority): демонстрация того, что альтернативный метод не хуже фармакопейного более чем на небольшое заранее установленное значение. Это значение известно как предел не меньшей эффективности или δ. Не меньшая эффективность отличается от эквивалентности тем, что в исследовании эквивалентности желательно получить заключение, что два микробиологических метода не отличаются друг от друга в недопустимой степени. В исследовании не меньшей эффективности необходимо продемонстрировать, что новый продукт не хуже старого в недопустимой степени.

Парные выборки (Paired samples): выборка из соответствующих пар одинаковых образцов.

Аналитическая (динамическая) область (Range-Dynamic or Operational): интервал между верхними и нижними концентрациями микроорганизмов, который был установлен с определенной точностью, прецизионностью и линейностью.

Прецизионность повторяемости (Repeatability precision): степень соответствия между отдельными результатами испытания при повторном применении методики к множеству образцов из одной и той же суспензии микроорганизмов и использовании различных суспензий для диапазона испытания. Также известна как «повторяемость».

Робастность (Robustness): способность метода не реагировать на воздействие небольших преднамеренных изменений в параметрах метода, например, объема реактива, времени инкубации или температуры окружающей среды, что указывает на его надежность во время обычного использования.

Устойчивость (Ruggedness):. Промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность, связанная с изменением условий проведения испытания. Промежуточная прецизионность определяется любыми изменениями, которые могут иметь место в конкретной лаборатории и которые могут повлиять на результаты анализа (например, разные дни выполнения испытания, разные аналитики, выполняющие испытание, разное оборудование, на котором выполняется испытание).

Специфичность (Specificity): способность метода к обнаружению ряда микроорганизмов, которая подтверждает, что метод подходит для применения по назначению. Эти микроорганизмы могут включать ограниченное количество микроорганизмов, представляющих риск для пациента или лекарственного средства, микроорганизмы, обнаруживаемые в случае нарушения производственных условий и производственного брака, микроорганизмы, которые подходят для определения эффективности альтернативного метода, и микроорганизмы, указанные в соответствующих монографиях, касающихся метода испытания или лекарственного средства.

Обязанности пользователя (User Responsibility): обязанности, касающиеся квалификации монтажа, функционирования и эксплуатации, могут выполняться совместно производителем оборудования и пользователем, применяющим альтернативный микробиологический метод. Валидация метода может проводиться производителем оборудования при наличии соответствующего обоснования. Проверка пригодности метода для каждого отдельного лекарственного средства является исключительно обязанностью пользователя.

Валидация (Validation): создание документально оформленной доказательной базы, которая подтверждает, что рабочие характеристики методики и лежащего в ее основе метода отвечают требованиям к их предполагаемому применению, вследствие чего методика подходит для целей применения. Формальная валидация проводится «перспективно» согласно письменному плану, который включает подтверждаемые критерии приемлемости для валидации метода.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ