Эквивалентность профилей экспрессии генов под действием препаратов Глатопа и Копаксон

Подробнее
Текстовая версия:
маркерных генов с Копаксоном, Глатопой и контрольной средой. В Табл. 4 представлены кратные изменения (log2) уровней экспрессии генов для Копаксона и Глатопы по сравнению с контрольной средой для подгруппы зондов микрочипа, которые относятся к маркерным генам, изображенным на диаграмме в виде узлов. Копаксон и Глатопа продемонстрировали одинаковые по направленности кратные изменения экспрессии генов по сравнению с контрольной средой, и во время оценки серии генов различий между действиями двух препаратов обнаружены не были. В Таблице 5 приведены Р-значения и кратные изменения (log2) экспрессии генов для Глатопы и Копаксона. На фоне действия Копаксона отмечалась индукция двух важных Th2-цитокинов: IL-3 и IL-4. Схожие изменения были обнаружены и в группе Глатопы (Таблица 4 и Рис.7). Также были проведены наблюдения за несколькими основными генами иммунной системы (например, FoxP3 and GPR83), экспрессия которых, по имеющимся сведениям, в других биологических тестовых системах регулируется с помощью ГА[29, 35]; на Рис.7 представлена блочная диаграмма, на которой отображено 7 таких специфических генов (IFT3, FOXP3, GPR83, CD14, TLR2, CD9 и MMP-14). В чувствительной к ГА Th2-поляризованной Т-клеточной тестовой системе, экспрессия этих генов не изменилась (IFT3, FOXP3, GPR83, CD14 и MMP-14) или понизилась по сравнению с контрольной средой. Более важно, что во время сопоставления действия Глатопы и Копаксона, не было обнаружено статистически значимых изменений экспрессии ни одного из данных генов. Рис. 6. Диаграмма путей поляризации клеток Т-хелперов. Транскрипты, которые в данном исследовании подвергались измерениям, отображены на диаграмме в виде узлов и окрашены в соответствии с отличиями, которые они продемонстрировали во время стимуляции Копаксоном по сравнению с контрольной питательной средой для выращивания культур клеток (Р< 1е-3 [t-критерий Стьюдента]; красным обозначено повышение, зеленым – угнетение). Молекулы со значением Р > 1е-3 показаны серым. Гены относятся к ортологам генов человека. Человеческие гены HLA-DMA, HLA-DMB, и HLA-DQB1 представляют мышиные гены H2-Dma, H2-Dmb2, и H2-Ab1, соответственно. Голубыми стрелками показано направление активации основными молекулами по пути Th1- и Th2. Например, клетки АПК продуцируют IL-4, который связывается с рецептором IL-4 и активирует его, за чем следует фосфорилирование и активация фактора транскрипции STAT6. Красными и зелеными стрелками показан ожидаемый транскрипционный исход Th1 и Th2-поляризации; красные и зеленые стрелки указывают на то, что активация повлечет за собой переход к росту и угнетению, соответственно. Ожидаемые исходы транскрипции основаны на опубликованных данных по Th1/Th2-поляризации Т-клеток, а также на результатах исследований, которые проводились относительно ГА [3,4,8,10,17,29–34]. Серыми линиями отмечены члены группы. Клетки АПК, антиген-презентирующие клетки; CXCR1, рецептор хемокина 1 (фрагмент C-X-C); CXCR3, рецептор хемокина 3 (фрагмент C-X-C); CXCR5, рецептор хемокина 5 (фрагмент C-X-C); CXCL10, лиганд хемокина 10 (фрагмент C-X-C); ГА, глатирамера ацетат; HLADMA, главный комплекс гистосовместимости класса II, DM-alfa; HLADMB, главный комплекс гистосовместимости класса II; DM-beta; HLADQB1, главный комплекс гистосовместимости класса II, DQ beta 1; ICOSLG, индуцируемый Т-клеточный костимулирующий лиганд; IL-4, интерлейкин-4, MHC класса II, лейкотриен B4, Лимфотоксин-бета (надсемейство рецепторов факторов некроза опухоли, член 3); MYD, белок первичного ответа миелоидной дифференцировки; S100A10, S100 кальций-связывающий белок А10; STAT, передатчик сигнала и активатор транскрипции; TCR, T-клеточный рецептор; Th, T-хелпер. Табл. 4. Уровни генной экспрессии в Th2-поляризованных клетках, подверженных действию Копаксона и Глатопы и сравнения полученных данных только с контрольной средой. Символ Ген lоg2 кратные изменения – разница для Копаксона lоg2 кратные изменения – разница для Глатопы CCR2 Хемокина (фрагмент C-C) рецептор 2 –0.7 –0.7 CXCL10 Хемокина (фрагмент С-Х-С) лиганд 10 –0.8 –0.8 CXCR3 Хемокина (фрагмент С-Х-С) рецептор 3 –0.6 –0.6 H2-Eb2 Комплекс гистосовместимости класса II, антиген Е бета 2 –0.3 –0.3 HLADMA Главный комплекс гистосовместимости класса II, DM-альфа 0.8 0.8 HLADMB Главный комплекс гистосовместимости класса II, DM-бета 1.0 0.9 HLADQB1 Главный комплекс гистосовместимости класса II, DQ-бета 1 0.6 0.7 ICOSLG Индуцируемый Т-клеточный костимулирующий лиганд –1.9 –1.9 IL-10 Интерлейкин-10 0.7 0.8 IL-12RB1 Рецептор интерлейкина-12, бета 1 1.1 1.2 IL-13 Интерлейкин-13 4.1 4.0 IL-2RA Рецептор интерлейкина-2 альфа 0.6 0.7 IL-2RB Рецептор интерлейкина-2 1.0 1.2 бета IL-3 Интерлейкин-3 3.7 3.9 IL-4 Интерлейкин-4 2.4 2.6 IL-5 Интерлейкин-5 2.4 2.5 IL-6 Интерлейкин-6 1.1 1.3 LTB Лимфотоксин бета (надсемейство фактора некроза опухоли, член 3) –1.0 –1.1 S100A10 S100 кальций-связывающий белок А10 –1.3 –1.2 Th, T-хелпер *показатель Log2 кратного изменения среднего уровня экспрессии для указанного испытуемого материала по сравнению с контрольной средой. Обсуждение Основной целью настоящего исследования являлась оценка эквивалентности уровней генной экспрессии под действием препарата Копаксон и под действием зарегистрированного в FDA дженерика ГА Глатопы. В целях исследования использовалась воспроизводимая биологическая испытательная система, выбор которой был обоснован и осуществлялся индивидуально как подходящий для исследования механизма действия ГА при лечении пациентов с РС. С этой целью, был создан и описан банк мышиных Т-клеток, чувствительных к ГА типа Th2, повторные выборки из разных партий Глатопы и Копаксона были протестированы в соответствии с данной экспериментальной системой, в которой использовалась зарекомендовавшая себя технологическая платформа полногеномного анализа на микрочипах. Во время проверки образцов на ложноположительные результаты, которая проводилась как на уровне отдельно взятого гена, так и на уровне полного генома, для отслеживания значимых отличий использовалось обширное количество статистических (одномерных и многомерных) методов анализа. Параллельно с испытаниями Глатопы и Копаксона, для независимой проверки возможностей данной экспериментальной системы по выявлению любых потенциальных различий, проводилось испытание неэквивалентной молекулы глатирамоида (АНС). АНС является глатирамоидом и обладает таким же молекулярно-массовым распределением и аминокислотным составом, как и ГА; тем не менее, его получили с помощью технологического процесса, в связи с чем он представляет собой структурно неэквивалентное соединение. Помимо этого, учитывая, что Th2-клеточная поляризация считается одним из основных механизмов действия ГА у человека [4,8,10,17], а многие факторы (включая IL-4, IL-5, IFN-γ и IL-10), стимуляция которых наблюдалась под действием испытательной системы, также модулируются под действием ГА в организме человека [6,17], можно сделать вывод, что экспериментальная система с Th2-поляризованными Т-клетками, которая использовалась в настоящем исследовании, соотносится с механизмами, наблюдаемыми у человека при лечении рецидивирующих форм РС с помощью ГА. Ни один из зарекомендовавших себя статистических методов, которые мы использовали в ходе исследовании, не смог опровергнуть гипотезу об эквивалентности профилей экспрессии генов под действием препаратов Глатопа и Копаксон. Таблица 5. Уровни экспрессии генов в Th2-пляризованных клетках под действием Глатопы и Копаксона. Символ Ген Значение Р для Копаксона Кратные изменения (lоg2) – разница по сравнению с Копаксоном CCR2 Хемокина (фрагмент C-C) рецептор 2 0.473896 0.1 CXCL10 Хемокина (фрагмент С-Х-С) лиганд 10 0.956119 0.0 CXCR3 Хемокина (фрагмент С-Х-С) рецептор 3 0.360223 –0.1 H2-Eb2 Комплекс гистосовместимости класса II, антиген Е бета 2 0.768097 0.0 HLADMA Главный комплекс гистосовместимости класса II, DM-альфа 0.977577 0.0 HLADMB Главный комплекс гистосовместимости класса II, DM-бета 0.33147 -0.1 HLADQB1 Главный комплекс гистосовместимости класса II, DQ-бета 1 0.381386 0.1 ICOSLG Индуцируемый Т-клеточный костимулирующий лиганд 0.608632 0.0 IL-10 Интерлейкин-10 0.018739 0.1 IL-12RB1 Рецептор интерлейкина-12, бета 1 0.152837 0.1 IL-13 Интерлейкин-13 0.928521 0.0 IL-2RA Рецептор интерлейкина-2 альфа 0.057472 0.2 IL-2RB Рецептор интерлейкина-2 бета 0.168497 0.2 IL-3 Интерлейкин-3 0.025309 0.2 IL-4 Интерлейкин-4 0.002263 0.2 IL-5 Интерлейкин-5 0.292582 0.2 IL-6 Интерлейкин-6 0.067614 0.1 LTB Лимфотоксин бета (надсемейство фактора некроза опухоли, член 3) 0.380219 –0.1 S100A10 S100 кальций-связывающий белок А10 0.158363 0.1 Действие глатирамоидов на экспрессию генов при РС рассматривалось и в других исследованиях [29,35]. В ходе таких исследований, стимуляция мышиных Т-клеток производилась разными глатирамоидами, включая стандартные образцы ГА и лекарственные препараты компании TEVA Pharmaceuticals [29,35]. По результатам одного из исследований (Бакаши и соавт.[29]), была выявлена существенная разница между уровнями генной экспрессии в контрольном препарате (пустой среде) и в клетках, обработанных глатирамоидом, что соответствует результатам нашего исследования. Также, в ходе этого исследования, были обнаружены значительные отличия по уровню экспрессии 98 генов при стимуляции Т-клеток дженериками ГА, зарегистрированными не в FDA, по сравнению с Копаксоном [29]. В настоящем исследовании, существенной разницы между препаратами Копаксон и Глатопа обнаружено не было. По результатам другого исследования (Тауфик и соавт.[29,35]), под действием Копаксона и дженериков ГА (Natco), зарегистрированных не в FDA, наблюдались серьезные отличия по уровню экспрессии генов (FoxP3 и Gpr83), ассоциированные с регуляторными Т-клетками, в то время как в настоящем исследовании не было обнаружено никаких отличий по уровню экспрессии данных генов, независимо от того, какой препарат использовался во время тестирования. Учитывая, что в нашей испытательной системе использовалась популяция Th-поляризованных Т-клеток, полученных в результате многократной стимуляции ГА, единственным логичным объяснением является состав популяции, в который изначально входили Т-клетки памяти и нерегуляторные Т-клетки. Не смотря на это, отличия между результатами, полученными в ходе нашего исследования, и результатами исследования Тауфик и соавт., скорее всего, объясняются использованием разных испытательных систем. Также, исследования могли отличаться друг от друга методологически; например, тот массив данных, который анализировали в исследовании Тауфик и соавт., был получен от 18 разных серий и нуждался в серьезной корректировке, в то время, как наш массив данных был построен на результатах испытаний одной серии. На Рис. 7 представлена блочная диаграмма изменений экспрессии генов для ключевых Th2 цитокинов IL-4 и IL-3 и дополнительных генов, имеющих отношение к функции иммунных клеток. Ни для одного из рассмотренных генов не было выявлено значительной разницы по действию Глатопы и Копаксона. По сравнению с нашим исследованием, в котором клетки, полученные из лимфатических узлов мышей, выделяли спустя 11 дней после иммунизации и в дальнейшем их количество увеличивали на основе CD4+ Т-клеточной популяции, Бакши и соавт. [29] использовали клетки, полученные из селезенки мыши через 3 дня после введения разовой дозы Копаксона. Строение клеток (в основном, В- и Т-клеток) значительно отличался от строения клеток, полученных из лимфатических узлов. Помимо этого, в исследовании Бакши и соавт. не проводились циклы повторной стимуляции для отбора Копаксон-специфических Т-клеток, в то время как в нашей испытательной системе использовалось такое количество клеток, которого было достаточно для проведения 13 циклов стимуляции Копаксоном, что обеспечило достижение значительной степени обогащения чувствительной к ГА популяции Т-клеток. Таким образом, можно предположить, что в исследовании Бакши иммунный ответ на различные образцы ГА был более переменчивым. Не смотря на то, что методика профилирования генной экспрессии является полезным инструментом для исследования механизмов действия новых лекарственных средств, он может также использоваться в качестве одного из многих способов оценки эквивалентности действия дженериков. Представленное здесь исследование генной экспрессии является лишь частью более широкого спектра проведенных исследований. Эквивалентность была установлена путем определения подобия исходных материалов, контроля процессов и эквивалентности физико-химических, биологических и иммунологических свойств с помощью разнообразных методов анализа аминокислотного состава, молекулярно-массового распределения, N- и С-анализа, анализа активности, Т-клеточной биологии, В-клеточной биологии, биологии АРС и животных моделей заболевания (например, экспериментальный аутоиммунный энцефалит), но не ограничиваясь ими. В завершение, необходимо сказать, что использование метода генного профилирования в качестве элемента, входящего в комплекс аналитических инструментов, помогло продемонстрировать эквивалентность Глатопы и Копаксона. Как ожидалось, в тестовой системе Копаксон вызывал серьезные изменения генной экспрессии. Наблюдаемые изменения касались генов, связанных с механизмом действия ГА при РС. Различия по уровню экспрессии генов были зафиксированы при сопоставлении Копаксона и неэквивалентного глатирамоидного соединения. Тем не менее, между уровнями генной экспрессии Копаксона и Глатопы, существенной разницы обнаружено не было, что было продемонстрировано с помощью комплекса статистических методов.