Доклинические и клинические исследования препаратов для переноса генов

ДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ

Содержание:

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Перенос генов

Научный прогресс за последние десять лет позволил разработать инновационные методы для переноса генетического материала в соматические клетки. В настоящем Примечании к руководству перенос генов подразумевает целенаправленное введение генетического материала в соматические клетки в терапевтических, профилактических или диагностических целях.

1.2 Препараты для переноса генов

Препараты для переноса генов используются для лечения или профилактики заболеваний у людей или вводятся людям с целью постановки диагноза или же восстановления, коррекции или модификации физиологических функций.

В настоящее время для переноса генов используются два основных типа векторов:

i) бактериальная плазмидная ДНК

ii) вирус

Оба этих вектора создают при помощи генетической инженерии, как правило, с целью экспрессии определенного белка. Плазмидная ДНК может вводиться либо в простом солевом растворе (который называют «оголенная» ДНК) или будучи связанной с носителем или адъювантом. Вирусные векторы, как правило, не обладают способностью к репликации, хотя способные к репликации векторы также используются.

Использование подобных векторов in vivo позволяет добиться генетической модификации соматических клеток.

Соматически клетки также могут быть модифицированы ex-vivo (например, аллогенные или аутологичные соматические клетки) или in vitro (например, клетки, способные образовывать банки клеток) перед тем, как их вводят человеку.

Другие области лабораторных исследований включают использование других типов векторов, например, бактерий, и других подходов, нацеленных на модификацию или ингибирование функционирования эндогенного гена или генетических элементов в клетках млекопитающих.

В данном контексте препараты для переноса генов представляют собой широкий спектр лекарственных средств биологического происхождения, указанных в Таблице 1.

ТАБЛИЦА 1

1.3 Сфера действия

Препараты для переноса генов регулируются Частью А Постановления Совета Европейской Комиссии ЕС 2309/93 и должны регистрироваться посредством Централизованной процедуры¹. Целью данного Примечания к руководству является предоставление рекомендаций, касающихся исследований качества, доклинических и клинических исследований препаратов для переноса генов, и оказание содействия при получении данных, которые необходимы для включения в заявку на получение регистрационного удостоверения внутри Европейского Сообщества.

В данном Примечании рассматривается:

Действие данного документа не распространяется на химически синтезированные олигонуклеотиды, например антисмысловые олигонуклеотиды или химерные РНК/ДНК, для которых контроль качества во время производства будет другим. Однако принципы, изложенные в настоящем документе, могут рассматриваться, при необходимости, при исследовании и разработке подобных препаратов.

Как и в случае с любой другой новой технологией, к контролю данных препаратов применяется гибкий подход, поэтому рекомендации могут меняться в зависимости от опыта производства и использования препарата, а также с учетом новых разработок. Хотя изложенные ниже рекомендации должны рассматриваться как общеприменимые, отдельные препараты могут вызывать специфические опасения, связанные с контролем качества и безопасности, например, такие как ДНК-вакцины, предназначенные для профилактического применения у большого числа здоровых людей. Производство и контроль каждого препарата будут рассматриваться в индивидуальном порядке и с учетом его специфических особенностей, отражающих предполагаемого клиническое применение препарата.

Первичные ксеногенные клетки, полученные от животных-доноров, не должны использоваться, пока не будет получено больше данных о безопасности данного подхода. Отдельное руководство, посвященное этому вопросу, будет издано СРМР в будущем.

Говоря о препаратах для переноса генов, важно отметить, что некоторые доклинические и клинические вопросы потребуют четкого понимания характеристик продукта для того, чтобы разработать подходящие тесты для доклинических и клинических исследований, касающиеся токсикологии и фармакологии препарата. Поэтому неизбежны частичные совпадения некоторых разделов (например, качества и доклинических исследований) данного Примечания к руководству. В разделах могут встречаться повторения, но они необходимы для того, чтобы убедиться, что в разделы о качестве (Часть II), доклинических (Часть III) и клинических исследованиях (Часть IV) включены правильные данные, поэтому в этих трех разделах заявки должны присутствовать перекрестные ссылки.

Данное Примечание к руководству должно учитываться совместно с соответствующим европейским законодательством и другими руководящими документами, утвержденными СРМР, включая технические руководства Международной Конференции по гармонизации (ICH). При работе с клетками, генетически модифицированными ex vivo, данное Примечание к руководству должно рассматриваться совместно с руководством СРМР по терапии соматическими клетками.

Поскольку препараты для переноса генов содержат генетические и другие материалы биологического происхождения, многие вопросы качества, относящиеся к рекомбинантным ДНК (рДНК) и другим препаратам, произведенным при помощи современных биотехнологических методов, будут также относиться к производству препаратов для переноса генов. Следует также учитывать требования к учреждениям, в которых производятся биопрепараты, например, Директиву 91/356/ЕЕС по надлежащей производственной практике (GMP).

Заявители также должны учитывать последствия для окружающей среды, связанные с использованием препаратов для переноса генов. Следует принимать во внимание Директиву Совета 90/220/ЕЕС или её последующие переиздания и Директиву Совета 90/219/ЕЕС (с изменениями, внесенными Директивой Совета 98/81/ЕС), касающиеся, соответственно, преднамеренного выброса и ограниченного использования генетически модифицированных (микро-) организмов, а также другие европейские руководства, посвященные оценке риска для окружающей среды, связанного с лекарственными средствами для применения у человека, содержащими генетически модифицированные организмы или состоящие из них (раздел 4).

2. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ

2.1 Генетическая разработка

Дизайн препарата для переноса генов является неотъемлемой частью научного замысла, лежащего в основе разработки препарата лекарственного средства для переноса генов. Необходимо предоставить информацию о стабильности векторной системы и системы доставки. А также данные о контроле и стабильности экспрессии гена. Поэтому должен быть задокументирован и описан каждый элемент экспрессирующей конструкции (включая релевантные области стыка). Сюда должна быть включена информация об их происхождении, подлинности и изоляции, а также нуклеотидных последовательностях и функциях, включая регуляционную способность и кодирующую емкость. Последовательность должна быть идентифицирована и верифицирована при помощи подходящего метода. Включение в экспрессирующую конструкцию любой целенаправленной модификации (модификаций), например, сайт-специфических мутаций, делеций, реаранжировок любого компонента в сравнении с их природными аналогами также должно быть описано. Должно быть представлено обоснование научного замысла с точки зрения функций различных элементов и их включения в экспрессирующую конструкцию. Для экспрессирующих конструкций, содержащих транскрипционные элементы для контроля экспрессии трансгена, например во временном или тканеспецифичном отношении, следует предоставить краткие доказательства, подтверждающие подобную специфичность с позиций характеризации препарата и его контроля. Должны быть даны перекрестные ссылки на подробные отчеты, входящие в соответствующие части клинического и доклинического досье.

Маркеры отбора, например гены устойчивости к антибиотикам, используемые во время скрининга и разработки и остающиеся в готовом препарате, должны быть тщательно изучены на предмет потенциального негативного влияния на стандартные виды терапии, применяющиеся при лечении определенных человеческих заболеваний. Следует избегать их применения, где это возможно. Следовательно, основная конструкция, которая может использоваться для объединения нескольких экспрессионных кассет, должна постоянно пересматриваться, чтобы отражать современный научный взгляд на приемлемость определенного маркерного гена.

Необходимо предоставить информацию о том, каким образом экспрессирующая конструкция включена в вектор. Следует описать последовательности, которые необходимы для того, чтобы конструкция могла реплицироваться в прокариотических или эукариотических клетках. Клетки, используемые при амплификации генетического материала, должны быть подробно охарактеризованы; сюда следует включить описание истории клеточной линии, ее подлинности и характеристик, а также потенциальных вирусных контаминантов. Особое внимание следует уделить возможности перекрестной контаминации с другими клетками или вирусами.

Степень соответствия системы репликации должна быть верифицирована, чтобы обеспечить целостность и гомогенность амплифицированных нуклеиновых кислот. Следует получить доказательства того, что была создана правильная нуклеотидная последовательность, которая поддерживалась во время этапов амплификации, предшествующих переносу, и что терапевтический ген не претерпевает модификаций после переноса. Например, ген с ошибками в последовательности оснований может стать причиной аномального белка, который может иметь нежелательную биологическую и/или иммунологическую активность. Процедуры переноса предназначены для введения копий определенного генетического материала в большое число клеток-мишеней. Поэтому очень важно с максимальной тщательностью очистить и охарактеризовывать генетический материал перед использованием. В этом контексте полезным может быть рассмотрение научных принципов, изложенных в документе ICH Q5B - Примечание к руководству по качеству биотехнологических препаратов: анализ экспрессирующей конструкции в клеточных линиях, используемых для производства белковых препаратов на основе р-ДНК.

Для вирусных векторов должна быть предоставлена полная документация о происхождении, истории и биологических характеристиках первичного вируса. Следует предоставить полное описание и характеризацию части (частей) вирусного генома, в который вставляется экспрессирующая конструкция, модификаций любой другой части вирусного генома и любых других последовательностей нуклеиновых кислот (например, промоторов), которые включаются в рекомбинантный вирусный геном. Необходимо создать и охарактеризовать плазмиду, вирусный вектор и/или банки клеток , которые должны проходить периодический контроль качества. Любой компонент вектора помимо нуклеиновых кислот, который был добавлен или модифицирован с целью переноса генов, должен быть тщательно описан, включая происхождение, подлинность, физико-химические и функциональные свойства и предполагаемую функцию в готовом продукте.

2.2 Производство

При производстве препаратов для переноса генов должны использоваться посевные материалы или банки клеток, хорошо охарактеризованные в отношении подлинности, микробиологической чистоты и вирусологического контроля. Качество всех реактивов, используемых в производстве, должно тщательно контролироваться и документироваться, включая соответствие всем необходимым регуляторным рекомендациям Европейской Комиссии (например, Руководствам СРМР) или монографиям Европейской Фармакопеи. Все сырье, используемое при производстве и очистке, должно быть описано, в том числе контроль качества. См. документ СРМР «Примечание к руководству о риске передачи агентов, вызывающих губчатую энцефалопатию, посредством лекарственных средств» и общую монографию Европейской Фармакопеи на ТГЭ «Препараты, связанные с риском передачи агентов, вызывающих губчатую энцефалопатию животных».

Нежелательно использовать в производстве агенты, способные вызывать чувствительность у отдельных пациентов, например, бета-лактамные антибиотики или любые токсичные реактивы, например, этидия бромид. Внутрипроизводственный контроль играет важную роль в качестве основы, на которой может строиться комплексная характеризация готового препарата – подход, доказавший свою эффективность при контроле качества бактериальных и вирусных вакцин, произведенных при помощи традиционных методов, а также при контроле качества препаратов на основе р-ДНК.

Для того чтобы составить представление о процессе производства, в дополнение к детальному описанию необходимо предоставить технологическую схему, описывающую критические этапы процесса и контроля качества. Кроме того, контроль качества и критические этапы обработки должны быть полностью описаны и валидированы.

В некоторых случаях конструкции нуклеиновых кислот могут быть связаны с поликатионами, белками (например, трансферрином) или полимерами (например, полилизином) или присоединены к носителям (например, липосомам или пептидам) с целью повышения специфичности или эффективности переноса генетического материала (Таблица 1). Подобные компоненты готового препарата могут производиться отдельно, а затем восстанавливаться непосредственно перед применением. В любом случае в дополнение к полному описанию происхождения и процесса производства, должны быть тщательно охарактеризованы все компоненты готового препарата для переноса гена, которые также должны проходить контроль качества и контроль выпуска партий (см. раздел 3.2).

В случае с вирусными векторами конструирование оригинального вирусного вектора должно осуществляться в квалифицированной пакующей клеточной линии в тщательно контролируемых условиях с целью предотвращения контаминации занесенными агентами. Поэтому необходимо предоставить подробное описание устройства пакующей клеточной линии, в том числе природы и, по возможности, места расположения хелперной вирусной нуклеиновой кислоты и кодируемых ею белков/функций. Должно быть представлено описание происхождения, подлинности и биологических характеристик клеточной линии, а также информация о наличии или отсутствии эндогенных вирусных частиц и последовательностей. Должны быть созданы и тщательно охарактеризованы главный и рабочий банки клеток, в отношении которых должен проводиться регулярный контроль качества. Важно предоставить доказательства отсутствия контаминации занесенными агентами (см. также раздел 3.3).

Нежелательная вариабельность культуры во время производства может вызвать изменения, приводящие к модификации препарата, сокращению объема выпуска препарата или количественному или качественному изменению присутствующих примесей. Обязательно проведение процедур, обеспечивающих постоянство условий производства и характеристик готового препарата.

Увеличение масштаба культивирования и/или процесса очистки имеет место по мере расширения лабораторной разработки до уровня полномасштабного коммерческого производства. Это может иметь последствия для качества препарата, в том числе может оказать влияние на биохимические и биологические свойства и, как следствие, на контрольное тестирование. Надлежащие исследования сопоставимости помогают продемонстрировать, что данные свойства не подвергаются значительным изменениям в результате увеличения масштаба производства. Критерии, используемые для установления сопоставимости препаратов для переноса генов после внесения изменений в производственный процесс, должны быть тщательно обоснованы.

Полученному препарату следует дать четкое определение. Каждое контрольное испытание должно быть полностью описано и валидировано. Должно быть предоставлено доходчивое определение «серии» или «партии» конечного, прошедшего обработку препарата. Должно быть предоставлено полное описание и характеристики всех материалов, используемых в производстве, или же они должны иметь фармацевтическое качество. Следует определить и обосновать допустимые пределы чистоты, постоянства характеристик и объема выпуска препарата (см. разделы 2.4 и 2.5).

Вирусный вектор. Для производства вирусного вектора должна использоваться система вирусного посевного материала и/или система банков клеток. Данные системы/банки должны быть подробно описаны, в том числе меры контроля, используемые на каждом этапе. Необходимо принять меры предосторожности, чтобы предотвратить инфицирование пакующей клеточной линии дикими вирусами, которые могут привести к образованию способных к репликации рекомбинантных вирусов.

Системы на основе клеток. Генетически модифицированные соматические клетки могут сами по себе являться препаратами для переноса генов, при этом необходимый ген помещается в, например, фибробласты, миобласты, эпителиальные клетки или другие типы клеток и экспрессируется в них (см. раздел 3). Затем происходит их размножение in vitro до получения количества, достаточного для введения одному или нескольким пациентам, страдающим от одного и того же заболевания. Возможно также выращивание генетически модифицированных клеток в коллагеновых решетках или других подходящих матрицах или их инкапсулирование с целью получения «неоорганов», секретирующих определенный терапевтический белок. Необходимо предоставить полный комплект документов о происхождении, истории соматических клеток, в том числе их гистосовместимости и иммунологического фенотипа. Должна быть продемонстрирована гомогенность и генетическая стабильность клеток. Любые наблюдаемые изменения морфологии генетически модифицированных соматических клеток, их функций и поведения, например характеристик миграции, по сравнению с оригинальными немодифицированными клетками, должны быть отражены во всех трех частях заявки, подаваемой в регуляторный орган. Должны быть созданы и тщательно охарактеризованы главный и рабочий банки клеток, в отношении которых должен проводиться регулярный контроль качества. Важно предоставить доказательства отсутствия контаминации занесенными агентами, в том числе дикими вирусами. Должно быть задокументировано качество всех компонентов, используемых при производстве. Любое инкапсулирующее устройство, используемое для защиты вводимых клеток от иммунной системы реципиента, должно рассматриваться в качестве компонента готового препарата. Поэтому оно должно быть охарактеризовано, должно проходить контроль качества и контроль выпуска партий.

2.3 Очистка

Состав примесей в готовом препарате зависит от природы препарата и выбора производственного процесса. Следует использовать приемлемый процесс очистки и предоставить доказательства того, что он позволяет удалять производственные примеси в необходимом объеме. Все процессы производства, использующие клеточные культуры, должны быть валидированы на предмет отсутствия чужеродных вирусов.

Риск контаминации готового препарата чужеродными вирусами следует минимизировать посредством тщательного тестирования банка клеток, промежуточных и конечных продуктов на наличие занесенных вирусов. Кроме того, следует выбирать только то сырье биологического происхождения, которое прошло основательное тестирование и было произведено при помощи процесса, валидированного на предмет удаления занесенных и эндогенных вирусов.

2.4 Характеризация препарата

Должна проводиться тщательная характеризация конечного, прошедшего обработку препарата или, при необходимости, готового препарата и его отдельных компонентов. Их стабильность должна подтверждаться подходящим набором молекулярных и биологических методов. Следует включать в программу исследования тесты, подтверждающие, например, что комплексная нуклеиновая кислота имеет необходимые биохимические и биологические характеристики, которые нужны для ее предполагаемого применения. Источником ценной информации могут служить иммунологические и иммунохимические испытания. В случае с вирусными векторами необходимо включить тесты, демонстрирующие целостность и гомогенность рекомбинантного вирусного генома.

Должна быть подтверждена чистота конечного, прошедшего обработку препарата и обоснован уровень (уровни) допустимых примесей. К ним относятся, например, нуклеиновых кислоты, полученные из бактерий, используемых для производства плазмидной ДНК, чужеродные нуклеиновые кислоты в препаратах на основе векторов или другие примеси. Должны быть утверждены критерии приемлемости или критерии браковки серии препарата. Обоснование данных критериев должно основываться на доклинических данных о безопасности или клинических данных. В случае с неспособными к репликации вирусными векторами важно предпринять все необходимые меры/шаги, чтобы минимизировать возможность их контаминации способными к репликации вирусами в процессе производства. Необходимы тесты, демонстрирующие, что количество способных к репликации вирусов меньше допустимого уровня. В случае со способными к репликации аденовирусами следует проводить испытания на животных и/или человеке, доказывающие, что установленный предел их содержания является безопасным.

2.5 Контроль постоянства характеристик и производственный контроль серий готового препарата

2.5.1 Постоянство

Минимум три последовательные серии нерасфасованного продукта должны быть охарактеризованы с максимальной тщательностью для подтверждения постоянства характеристик, касающихся подлинности, чистоты, активности и безопасности. После этого допускается использование сокращенного набора испытаний. Данные испытания должны включать молекулярные, биологические и/или иммунологические методы для характеризации и количественного анализа препарата, а также методы обнаружения и идентификации примесей. Любые различия между сериями должны быть документально зафиксированы и расследованы.

2.5.2 Производственный контроль серий

Должна быть предоставлена таблица спецификаций (включающая параметры, методы и спецификации или критерии приемлемости). Анализ серий препарата необходим для установления постоянства характеристик, касающихся подлинности, чистоты и активности. Следует различать аналитические испытания, проводимые в ходе разработки препарата с целью его полной характеризации, и испытания, проводимые регулярно для каждой серии (очищенного) нерасфасованного продукта. Выбор испытаний для периодического контроля серий должен быть обоснован заявителем с учетом результатов испытаний по характеризации препарата.

Подлинность. Для подтверждения подлинности каждой серии препарата должен использоваться набор испытаний, предназначенных для характеризации очищенного продукта. Применяемые методы должны включать испытания для определения генетического состава и физико-химических и иммунологических характеристик, а также испытания для определения ожидаемой биологической активности.

Чистота. Степень желаемой и достижимой чистоты будет зависеть от нескольких факторов, среди которых природа и предполагаемое применение препарата, метод его производства и очистки, а также степень постоянства производственного процесса. Следует определять чистоту каждой серии, и она должна соответствовать установленным требованиям. Следует применять тесты, определяющие уровень контаминантов клеточного происхождения, например возникших из пакующей клеточной линии, а также материалов, которые могли быть добавлены во время производственного процесса. Должна быть установлена подходящая верхняя граница для каждого определяемого контаминанта.

Испытания на определение активности. Для оценки активности векторов используются, при необходимости, биологические анализы, которые позволяют оценить эффективность переноса и уровень и стабильность экспрессии генетического материала, или его эффекты. Для калибровки анализов следует утвердить и использовать референтную серию вектора с установленной активностью.

Эффективность переноса векторами генетического материала к клеткам-мишеням/тестируемым клеткам и информация о достигаемом в результате уровне экспрессии гена может служить основой для оценки их активности. Если испытания проводятся in vitro, популяции клеток-мишеней должны быть тщательно охарактеризованы. Должна контролироваться вариабельность биологической системы в целом, особенно если клетки-мишени могли быть получены из разных источников/доноров и если предусмотрена длительная экспрессия или манифестация трансфицированного генетического материала.

При необходимости и в случае с векторами, предназначенными для прямого применения in vivo, должны рассматриваться испытания биологической активности на животных тканях, поддерживаемых ex vivo, или на самих животных. Для этой цели могут подходить трансгенные животные или животные, которым были трансплантированы человеческие ткани или органы, например подходящая ксенотрансплантатная модель.

По возможности, следует утверждать подходящие способы выражения активности векторов и регистрировать результаты в стандартных единицах измерения. Следует определять удельную биологическую активность.

Испытания на безопасность. Для препаратов, содержащих неспособные к репликации вирусы, обязательным является проведение испытания на определение способных к репликации вирусов в супернатанте клеток и в вирусных пеллетах на определенных этапах производства. Испытания должны проводиться для каждого производственного цикла и серии препарата. Если в качестве вектора используются неспособные к репликации аденовирусы, должны быть установлены жесткие верхние границы для способных к репликации аденовирусов (RCA), связанных с процессом производства. Характеризация RCA должна быть хорошо выполнена, а производственный процесс должен быть стабильным и хорошо контролируемым. Кроме того, следует продемонстрировать в исследованиях на животных и/или человеке, что уровни RCA являются безопасными. Если в качестве векторов используются ретровирусы, при обнаружении способных к репликации ретровирусов вся серия должна быть забракована (см. раздел 3.3).

Необходимо определить инфекционность/ соотношение частиц (particle ratio) вирусных векторов и установить нижний предел, чтобы контролировать потенциальную токсичность, вызванную вирусными белками и активностью препарата.

Качество конечного продукта, предназначенного для введения, должно контролироваться согласно соответствующим спецификациям для готового препарата, учитывая изложенные выше принципы. Должна быть подробно изучена стабильность готового препарата во время его использования и хранения, в том числе его сочетаемость с любыми растворителями, используемые для его восстановления.

3. ЧАСТНЫЕ ВОПРОСЫ, КАСАЮЩИЕСЯ ОТДЕЛЬНЫХ СТРАТЕГИЙ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ

3.1 Препараты плазмидной ДНК (например, ДНК-вакцины)

В данном случае препарат для переноса генов состоит из бактериальной плазмидной ДНК, в которую была помещена экспрессионная конструкция.

Если готовый препарат для переноса генов состоит из более чем одной плазмиды, представленная ниже информация должна предоставляться для каждого отдельного компонента, за исключением тех случаев, когда имеется научное обоснование, подтверждающее, что соединение следует характеризовать как единое целое.

Необходимо предоставить подробное описание разработки плазмидной ДНК. Сюда относится информация о гене, кодирующем белок, устройстве плазмиды в целом и источнике и истории бактериальной клетки-хозяина.

Следует подробно описать происхождение интересующего гена, в частности особенности микроорганизма или клетки, из которых был получен ген, происхождение источника, его вид, история пассирования, подтип и стратегия изоляции, которая была использована. В некоторых случаях встраиваемый ген может иметь небольшие участки, происходящие от нескольких генов, присутствующих в исходном организме, или иметь измененную нуклеотидную последовательность для оптимизации использования кодона или содержать абсолютно новые кодирующие последовательности. В любом случае, следует предоставить научное обоснование для использования гена (генов) и описать последовательность дикого гена и биологические свойства кодируемого белка в его естественном состоянии, например функцию или антигенность.

Должны быть описаны этапы конструирования всей плазмиды, в том числе источник используемой плазмиды (плазмид) и субклоны, образованные во время процедуры клонирования. Необходимо четко обозначить функциональные компоненты, такие как регуляторные последовательности (источник репликации, вирусные/эукариотические промотеры, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, терминирующие кодоны) и маркеры отбора и предоставить информацию о происхождении и функции данных элементов. Следует обосновать использование всех специфических элементов или участков ДНК. Особое внимание необходимо уделить природе маркера отбора. Следует избегать использования некоторых маркеров отбора, таких как устойчивость к антибиотикам, которые могут отрицательно сказаться на других видах клинической терапии, применяемых у целевой популяции.

Необходимы данные о последовательностях для всей плазмиды (как правило, их получают для плазмиды главного банка клеток), должна быть предоставлена информативная рестрикционная карта плазмиды. Следует изучить альтернативные непредусмотренные рамки считывания. Кроме того, проверка гомологии последовательностей плазмиды в международной базе данных может дать полезную информацию о последовательностях с непреднамеренной биологической значимостью. Рассмотрение потенциала хромосомной интеграции (с учетом способа и метода введения) должно быть представлено в экспертных отчетах, содержащихся в частях заявки, посвященных качеству, доклинике и клинике. При этом необходимо принимать во внимание значение любых последовательностей, гомологичных геному человека.

Должно быть предоставлено обоснование выбора бактериальной клетки-хозяина, используемой для производства плазмиды, а также описание ее источника, фенотипа и генотипа. Необходимо продемонстрировать, что клетка-хозяин является гомогенной и не контаминирована занесенными агентами.

Необходимо подтвердить идентичность плазмидной ДНК после трансфекции в бактериальную клетку, используемую в производстве, а также фенотип трансфицированной клетки. Чтобы гарантировать, что сохраняется правильная последовательность плазмиды, содержащей встроенный ген, понадобятся данные о стабильности плазмиды внутри бактериальной клетки в процессе ферментации. Экспрессия любых прокариотических генов, например маркеров отбора, в эукариотической клеточной линии должна быть изучена и обоснована с учетом клинического использования препарата.

Банки клеток. Производство плазмидной ДНК должно основываться на правильно образованной системе главного банка клеток (МСВ) и рабочего банка клеток (WCB). Должны быть описаны процедуры клонирования и культивирования, используемые для создания МСВ. Во время создания как МСВ, так и WСВ следует предпринимать меры для предотвращения контаминации другими клеточными линиями. Для всех банков клеток следует подробно описывать источник, форму, хранение, использование и предполагаемый срок службы при ожидаемой интенсивности использования. Необходимо тщательно охарактеризовать МСВ и описать специфические фенотипические свойства, формирующие основу для идентификации. Последовательность всей плазмиды должна быть утверждена на этапе МСВ. WCB должны быть тщательно охарактеризованы и должны отвечать установленным критериям приемлемости. Должна быть определена жизнеспособность системы хозяин-вектор в МСВ и WСВ во время хранения и использования. Следует продемонстрировать, что в МСВ и WСВ отсутствуют чужеродные микробные агенты.

Производство. Необходимо подробно описать процедуры и материалы, используемые при ферментации. Следует предоставить данные о постоянстве условий ферментации, роста культуры и сбора плазмиды. Необходимо определить меры внутрипроизводственного контроля и критерии отбраковки во время ферментации.

Должен быть определен максимальный уровень роста клеток, допускаемый во время производства, который должен основываться на информации о стабильности системы клетки хозяина/плазмиды при уровне ферментации ниже и выше того, который используется в производстве. В конце ферментации необходимо изучить характеристики бактериальной клетки/плазмиды, в том числе число копий плазмиды, степень удержания плазмиды в бактериальной клетке, анализ фрагментов рестрикции и урожай как клеток, так и плазмид.

Критерии для отбраковки партий урожая должны устанавливаться таким образом, чтобы урожай, природа и качество продукта оставались неизменными в отношении установленных параметров.

Очистка. Методы, используемые для очистки плазмидной ДНК, и их внутрипроизводственный контроль, в том числе предельные значения спецификаций, должны быть подробно описаны, обоснованы и валидированы. Должна быть тщательно изучена способность процесса очистки удалять нежелательные нуклеиновые кислоты (РНК хозяина, хромосомную ДНК, линейные или денатурированные плазмиды), белки клетки хозяина, углеводы, эндотоксины или другие примеси, появившиеся в результате процесса производства или очистки (включая компоненты культуральной среды), а также следует тщательно изучить воспроизводимость процесса. Для того чтобы продемонстрировать эффективность очистки на каждом отдельном этапе и эффективность процесса в целом, могут понадобиться данные валидационных исследований процедур очистки с использованием концентраций контаминантов, превышающих концентрации, ожидаемые при обычном процессе производства. Должен быть установлен коэффициент сокращения подобных контаминантов для каждого этапа очистки и в целом для всего процесса. Особое внимание следует уделять устранению эндотоксина.

Характеризация нерасфасованной очищенной плазмиды. Необходимо установить подлинность, чистоту, активность и стабильность нерасфасованной очищенной плазмиды. Вначале должна быть проведена подробная характеризация, как минимум, для одной производственной серии. Затем для проведения периодического контроля серий допускается использование не всех, а только ряда тестов, используемых для характеризации.

Подлинность. Первоначальная характеризация должна включать разнообразные химические, физические и биологические методы. На данном этапе следует, как минимум, один раз полностью определить последовательность плазмиды (или плазмид, если готовый продукт содержит более одной четко выраженной структуры) а также изучить потенциал гетерогенности последовательности. Должна быть оценена молекулярная форма плазмиды, т.е. соотношение сверхспиралей и т.п. в очищенном нерасфасованном продукте, и должны быть определены все молекулярные формы. Следует изучать любые модификации ДНК, которые могли иметь место в процессе ее производства, например, специфическое бактериальное метилирование, которое может повлиять на экспрессию кодируемого антигена в клетках млекопитающих.

Чистота. Необходимо определить контаминирующие материалы и установить пределы их содержания. К подобным материалам относятся неправильные формы плазмидной ДНК, контаминанты, связанные с клеткой хозяина, такие как белок клетки хозяина, хромосомные ДНК, РНК и эндтоксин. Следует провести надлежащие испытания, подтверждающие, что материалы, используемые в производстве и очистке, были по большей части удалены и не превышают допустимого уровня.

Необходимо обосновать степень контаминации, допустимой для каждого контаминанта, и установить критерии для отбраковки производственной серии.

Следует также установить спецификации для допустимого содержания молекулярных форм плазмиды, влияющих на эффективность.

Активность. Дизайн исследования активности должен учитывать природу заболевания, предполагаемое использование плазмиды, экспрессируемый белок и желаемую биологическую или иммунную реакцию. Скорее всего, понадобится исследование in vivo, хотя возможно обосновать и валидировать подходящий количественный анализ in vitro. Вне зависимости от выбора исследования, должен быть утвержден внутренний стандартный образец препарата из числа подробно охарактеризованной серии плазмиды, желательно прошедшей клиническую оценку.

Стабильность. Должна быть определена стабильность конечного состава, и эти данные должны использоваться для установления максимального срока хранения при подходящих условиях хранения. Для этого необходимо провести исследования стабильности в реальном времени, а ускоренные испытания стабильности при повышенных температурах могут дать дополнительную информацию, подтверждающую данные о стабильности препарата.

Постоянство. Как минимум, три последовательных серии нерасфасованной очищенной плазмиды должны пройти максимально тщательную характеризацию с целью установления постоянства ее характеристик. Сюда могут, при необходимости, быть включены испытания для конечного плазмидного препарата. Данные, полученные в подобных исследованиях, должны служить основой для утверждения спецификаций для нерасфасованной очищенной или конечной плазмидной ДНК.

3.2 Невирусные векторы для доставки трансгенов (например, липосомы, опосредованные рецептором лиганды)

Невирусная доставка экспрессионной конструкции задействует фармацевтический состав конструкции посредством использования физико-химических или коллоидных свойств, например размера и поверхностного заряда устройства доставки, для сайт-специфичной или направленной доставки конструкции. Основополагающие принципы доставки конструкции, в целом, не сильно отличаются от принципов, применимых к традиционным биопрепаратам. Было экспериментально доказано, что некоторые стратегии повышают специфичность или эффективность переноса генетического материала за счет формирования комплекса с катионными липосомами, с белками (например, трансферрином) или с полимерами (например, полилизином или дендримерами).

Характеризация комплекса и его составляющих при помощи надлежащих физико-химических и биологических методов имеет фундаментальную значимость для понимания того, как эти свойства могут влиять на эффективность трансфекции и биораспределения комплекса (см. также раздел об оценке доклинической безопасности 5.2.1). Следует описать научный замысел, лежащий в основе комплекса, в том числе его физико-химические свойства, которые обеспечивают стабильность препарата при заданных условиях или в определенном биологическом окружении, например в заданном липидном составе, который делает комплекс стабильным, или же в определенных пределах рН или в соответствующей биологической матрице.

Для систем доставки, использующих катионные липиды, липосомы или катионные полимеры, должно быть предоставлено подробное описание характеристик поверхности, в том числе поверхностного заряда. Необходимо установить качество компонентов, используемых при формировании комплекса (в отношении их чистоты). Следует рассмотреть взаимодействие между составом доставки (vehicle) и отрицательно заряженной ДНК. Состав среды, используемой для доставки конструкции, должен подкрепляться экспериментальными данными, касающимися, например, эффективности трансфекции и биораспределения конструкции in vivo. Поскольку эффективность трансфекции и биораспределение in vivo могут зависеть от размера частиц, необходимо охарактеризовать средний размер частиц и распределение частиц по размерам – при помощи подходящего метода (см. раздел о доклинических исследованиях 5.2.2). Необходимо изучить стабильность частиц. Кроме того, следует изучить и оценить влияние рН и используемых буферных реактивов на стабильность комплекса и его поверхностные свойства. Следует рассмотреть потенциальные продукты деградации состава доставки, которые могут появиться в результате окисления или деполимеризации. Эти данные должны лежать в основе стратегии разработки состава и предлагаемых условий хранения.

Конструкции доставки гена, опосредуемые лигандом, как правило, состоят из связывающегося с рецептором лиганда (например поли- L-лизина или пептида), конъюгированного с ДНК-связывающим доменом. Таким образом, генные конструкции могут доставляться в клетки, экспрессирующие соответствующий рецептор. Необходимо предоставить научное обоснование для предлагаемой стратегии доставки конструкции при помощи конъюгирования. Направленность/избирательность и специфичность состава доставки должны подкрепляться экспериментальными данными (см. раздел о доклинических исследованиях 5.2.2). Эти данные должны служить основой для дизайна и разработки подходящих методов контроля. Синтез и химическая характеризация лиганда должны быть подробно задокументированы. Побочные продукты, возникающие в процессе синтеза и производства лигандов и комплекса, должны изучаться с точки зрения их воздействия на безопасность и эффективность комплекса при его введении пациентам.

Для препаратов, использующих устройства для доставки конструкции, требуется изучение операционных параметров, а также их калибровка и валидация с учетом предполагаемого клинического применения.

3.3. Вирусные векторы

Необходимо предоставить полную документацию об источнике, истории и биологических характеристиках исходного вируса (например, жизненном цикле). А также полное описание и характеризацию части (частей) вирусного генома, в которую встраивается или с которой соединяется экспрессионная конструкция, модификации оставшихся вирусных последовательностей и любых других последовательностей (например, промотеров), которые будут включены в рекомбинантный вирусный геном. Следует предоставить научное обоснование выбора вирусного вектора с учетом предполагаемых клинических показаний, в которое необходимо включить: i) тропизм к ткани, ii) эффективность трансдукции в популяции клетки-мишени или в определенном типе клеток, например, если клетки являются реплицирующимися или терминально дифференцированными или же клетки экспрессируют необходимый вирусный рецептор для интернализации, iii) наличие и поддержание вирусной последовательности (последовательностей), важной для антивирусной химиотерапии дикого вируса (см. раздел о доклинических исследованиях 5.2.3), iv) тканевую специфичность репликации.

Необходимо создать и тщательно охарактеризовать главный и рабочий вирусные инокуляты и хранить их при надлежащих стандартизированных условиях. Условия хранения должны постоянно контролироваться.

В большинстве случаев вирусные векторы для переноса генов являются неспособными к репликации. Неспособные к репликации вирусы размножают в пакующих клеточных линиях, генетически модифицированных с целью экспрессии вирусных белков, необходимых для производства и упаковки вирусных геномов, содержащих экспрессионную конструкцию. В этой связи, основной проблемой безопасности, связанной с использованием неспособных к репликации вирусных векторов, является повторное приобретение ими способности к репликации за счет рекомбинации или комплементации контаминирующими последовательностями вирусной нуклеиновой кислоты. Необходимо подробно задокументировать стратегию, используемую для лишения вирусного вектора способности к репликации. В случае с ретровирусными векторами минимизация рекомбинации достигается при помощи экспрессии генов, кодирующих вирусные структурные и ферментные белки из независимых конструкций, которые были помещены в разные хромосомные сайты интеграции пакующей клеточной линии. Поэтому чтобы минимизировать рекомбинацию, следует принимать меры, помогающие избежать контаминации в процессе производства и конструирования вектора. Необходимо оценить вероятность рекомбинации эндогенных ретровирусных последовательностей, которые могут присутствовать в клеточном субстрате, используемом для упаковки. Следует внедрить соответствующие меры контроля, позволяющие определить подобную возможность.

Препараты или промежуточные продукты (при необходимости), а также пакующие клеточные линии должны проверяться на наличие способных к репликации вирусов (RCV). Необходимо подробно описать устройство пакующей клеточной линии, включая природу и, по возможности, местонахождение последовательностей хелперной вирусной нуклеиновой кислоты и кодируемых ими белков/функций. Должны быть описаны происхождение, подлинность и биологические характеристики пакующей клеточной линии, а также представлена информация о наличии или отсутствии эндогенных вирусных частиц и последовательностей. Должны быть созданы и охарактеризованы главный и рабочий банки клеток, которые должны проходить регулярный контроль качества. Отсутствие контаминации занесенными агентами является необходимым условием обеспечения микробиологической безопасности препарата.

Кроме того, должна учитываться возможность возникновения рекомбинации in vivo, если последовательности нуклеиновых кислот в векторе демонстрируют гомологию с любой известной ретровирусной последовательностью (последовательностями), присутствующей в клеточном геноме. Необходимо согласовать удаление вирусных последовательностей, связанных с патогенезом. Данная основная информация, представленная в виде краткого обзора, может оказаться полезной при разработке необходимых доклинических токсикологических испытаний.

Способные к репликации вирусы могут также использоваться как векторы для переноса генов. Если используется вектор RCV, следует предоставить подробное обоснование конструкции и ее отдельных генетических элементов с учетом ее безопасного применения по предлагаемым клиническим показаниям. Необходимо учитывать следующие факторы при рассмотрении возможности использования RCV для переноса генов:

Вопросы безопасности, которые необходимо рассматривать при использовании ретровирусных векторов, включают активацию клеточных онкогенов или инактивацию генов-супрессоров опухолевого роста в связи с интеграцией провирусной ДНК (proviral integration). Вероятность возникновения подобной ситуации повышается при наличии способных к репликации ретровирусов (RCR). Чтобы минимизировать риск возникновения RCR, должны использоваться пакующие клеточные линии с минимальным риском рекомбинации, в которых структурные или функциональные гены экспрессируются независимо друг от друга из различных конструкций. Данная стратегия призвана уменьшить число случаев рекомбинации, приводящих к формированию RCR. В любом случае, должно быть представлено подробное обоснование разработки препарата, в том числе минимизация формирования RCR (см. также выше).

Для обнаружения RCR необходимо тестировать супернатант клеточной культуры после получения вектора посредством пассажа (пассажей) в клеточных линиях, пермиссивных к RCR. Затем проводится подходящий анализ, позволяющий определить и подсчитать RCR. Необходимо валидировать используемый анализ и указать его чувствительность. Для каждого анализа должен существовать подходящий способ контроля, позволяющий стандартизовать данный анализ. Следует рассмотреть возможность использования в качестве контрольного теста надлежащим образом валидированный анализ, основанный на технологии амплификации нуклеиновых кислот.

При разработке препаратов, использующих другие вирусные векторы, необходимо учитывать следующее: i) патогенность исходного вируса и компонентов вектора для человека и других видов, ii) минимизацию несущественных вспомогательных вирусных компонентов или конструирование вирусных упаковывающих белков, позволяющих лишить вирусный вектор способности к репликации и iii) конструирование вирусного вектора с максимально низкой гомологией по отношению к любым человеческим вирусам или эндогенным вирусам (например, эндогенным ретровирусам) и, таким образом, снижение риска формирования нового инфекционного агента. Подобно стратегии, утвержденной в отношении анализа для обнаружения RCR, следует тестировать наличие RCV в подходящей клеточной линии, пермиссивной к амплификации RCV. Присутствие RCV может быть обнаружено при помощи соответствующей детекторной клеточной линии. Может использоваться и альтернативный метод, при условии, что предлагаемая система была полностью валидирована в процессе разработки препарата.

Реципиенты препарата для вирусного переноса генов также должны проходить надлежащим образом спланированное наблюдение, для того чтобы оценить безопасность использования вирусных векторов у этих пациентов. Данные реципиенты должны контролироваться как при помощи серологических тестов, так и при помощи надлежащим образом валидированных испытаний на основе амплификации нуклеиновых кислот (см. раздел 6).

3.4 Препараты на основе клеток

В данном документе рассматриваются клетки, способные образовывать банки клеток. В качестве препарата для переноса генов могут использоваться аллогенные или ксеногенные клетки в виде суспензии или инкапсулированные или присоединенные к матрице. Следует учитывать основные принципы руководств, посвященных контролю клеточной терапии или клеточных субстратов.

3.4.1 Источник клеток

Ex vivo трансдукция генов клеток, полученных от того же человека (аутологичных) или от гистосовместимого человека (аллогенных), должна рассматриваться как особый случай. Генетическая модификация может достигаться при использовании того же вида препаратов для переноса генов (плазмид, вирусных или невирусных векторов), который используется при in vivo процедуре переноса генов. В данных случаях, чтобы минимизировать нежелательную трансформацию, конечную клеточную популяцию часто ограничивают клиническими дозами. Необходим надлежащий контроль за процессом манипулирования клеток. Если генетически модифицированные ex vivo клетки используются непатентованным образом, т.е. как часть медицинской процедуры, следует соблюдать принципы, изложенные в данном Примечании к руководству и в документе СРМР «Руководство по лекарственным средствам для терапии соматическими клетками».

Аллогенные клетки. В отношении доноров клеток применяются те же самые критерии отбора, что и в отношении доноров крови и органов, согласно рекомендациям соответствующих руководств. К данным критериям относятся: i) проверка на основные вирусные и бактериальные патогенные факторы (например, ВИЧ, вирус гепатита В, вирус гепатита С, цитомегаловирус, микобактерии), ii) типирование антигенов группы крови - главных и/или минорных (при необходимости) и антигенов гистосовместимости. Должны быть утверждены надлежащие ретроспективные исследования и, при необходимости, карантинные системы. См. следующие документы: Руководство СРМР по лекарственным средствам, полученным из плазмы (СРМР/BWP/1999); Пригодность доноров крови и плазмы и проверка донорской крови в Европейском сообществе – рекомендации Совета Европейского Союза 98/463/ЕС.

Скрининг и типирование, например, по лейкоцитарным антигенам гистосовместимости (HLA), должны проводиться при использовании валидированных современных методов, обладающих максимально высокой чувствительностью и специфичностью. Процедуры и стандарты, используемые для этих целей, должны быть подробно описаны и обоснованы. Люди с ксенотрансплантатами должны быть исключены из числа возможных доноров с целью предотвращения горизонтальной передачи зоонозов. Исключаются доноры, чья проверка подтвердила наличие любого из основных патогенных факторов; подобные доноры могут использоваться только в очень редких случаях, например при сложностях в достижении гистосовместимости или для лечения опасных для жизни заболеваний. Кроме того, при необходимости следует проводить специфический скрининг или типирование на определенные антигены, связанные с заболеваниями (например, опухолевые специфические антигены). Следует внимательно относиться к объединению в один пул клеток, полученных от разных доноров. Особое внимание следует уделять потенциальным нежелательным взаимодействиям между этими клетками в результате несовместимости доноров, поскольку это может повлиять на качество клеточной популяции.

Критерии приемлемости/неприемлемости доноров должны быть подробно описаны и обоснованы. Следует указать взаимосвязь между числом доноров и одной серией препарата на основе аллогенных клеток.

Ксеногенные клетки. Поскольку использование первичных ксеногенных клеток сопряжено с большим риском, их не следует использовать до тех пор, пока не будет достигнуто международное соглашение по ксенотрансплантации, не будет утверждена эффективная международная система надзора и не будет выпущено специальное международное руководство. Ксеногенные клетки могут использоваться в качестве препаратов для переноса генов только в том случае, если они были получены из тщательно охарактеризованных и правильно полученных клеточных линий, и при условии соблюдения требований всех специальных руководств, касающихся клинического применения ксеногенных клеток. Кроме того, следует проводить надлежащую оценку соотношения риска и пользы, чтобы обосновать использование ксеногенной клеточной линии для переноса генов. При проведении подобной оценки следует уделять внимание потенциальному риску горизонтальной передачи населению известных или до настоящего времени неизвестных инфекционных агентов. Помимо этого, следует создать систему банков клеток. Их контроль должен проводиться при использовании валидированных современных методов, обладающих максимально высокой чувствительностью и специфичностью. Клеточная линия, из которой образуется главный банк клеток, должна быть проверена на наличие животных вирусов, например эндогенных ретровирусов или других занесенных агентов, таких как бактерии, грибки и микоплазма (см. также Руководство по качеству биотехнологических препаратов: получение и характеризация клеточных субстратов, используемых для производства биотехнологических/биологических препаратов, СРМР/ICH/294/95).

3.4.2 Биологическая характеризация клеточной популяции

Должны быть описаны методы изоляции/отбора клеток. Подлинность ткани, из которой получены клетки, должна подтверждаться соответствующими гистологическими и/или фенотипическими анализами. Если клетки содержатся in vitro в виде клеточных линий, следует подробно описать виды, от которых они были получены.

Необходимо подробно описать подлинность, гомогенность/чистоту, специфическую активность и стабильность клеток, полученных для переноса генов, в том числе их биохимические, морфологические, иммунологические и физиологические характеристики. Эти клетки также следует проверять на присутствие занесенных, а также эндогенных вирусов, чтобы предотвратить возможность использования зараженных клеток в производстве. Следует описать и обосновать критерии приемлемости/отбраковки клеточных препаратов, применяемые на различных этапах.

Для ксеногенных клеток, при необходимости, следует разработать и валидировать чувствительный и специфичный метод, позволяющий дифференцировать ксеногенные клетки и клетки реципиента.

Необходимо определить серию клеток и ее размер.

3.4.3 Манипуляции с клетками in vitro

Манипуляции с клетками проводятся при помощи описанных ранее видов стратегий для переноса генов. Необходимо создать, охарактеризовать необходимые векторы, провести контроль их качества и контроль при выпуске серий: качество, имеющее отношение к безопасности трансдуцированных клеток, должно быть изучено в соответствии с изложенными ниже рекомендациями.

На всех этапах манипуляций in vitro обработка клеток должна осуществляться в тщательно контролируемых условиях, чтобы предотвратить микробную контаминацию. Следует предпринимать меры для предотвращения перекрестной контаминации с другими клеточными линиями или образцами. Ни одна другая клеточная линия не должна проходить обработку в то же самое время в том же самом лабораторном помещении или теми же самыми сотрудниками лаборатории, если на то нет отдельного обоснования. На отдельных этапах процесса должно осуществляться специфическое валидированное дифференциальное тестирование подлинности. Результаты этого тестирования должны быть представлены в регистрационном досье.

Весь процесс манипуляций с клетками должен быть валидирован, чтобы обеспечить удаление занесенных агентов (вирусов, бактерий, грибков, микоплазмы) ниже предела их обнаружения.

Все используемые для производства реактивы и материалы животного происхождения должны отвечать современным регуляторным требованиям, чтобы минимизировать риск трансмиссивных губчатых энцефалопатий. Следует описать источник, происхождение и средства контроля качества используемых реактивов (особенно вирусов, бактерий, эндотоксинов). При наличии возможности, следует рассматривать альтернативы сыворотке животного или человеческого происхождения.

Во время производства на всех ключевых этапах следует принимать необходимые меры внутрипроизводственного контроля, чтобы контролировать клеточные препараты. Сюда относится контроль подлинности, жизнеспособности, чистоты, биоактивности, стерильности, отсутствия микоплазмы и вирусов и средства контроля, связанные с вектором для переноса генов (например, RCV, остаточный вектор или нуклеиновые кислоты, процентное содержание трансфектированных клеток и т.д.). Для этих параметров должны быть установлены и обоснованы спецификации и допустимые пределы.

3.4.4 Банки клеток

Как для аллогенных, так и для ксеногенных клеток необходимо создать систему банков клеток, состоящую из главного банка клеток (МСВ), рабочего банка клеток (WCB) и банка клеток для расширенного производства (ЕРСВ) или клеток в конце их возрастного предела in vitro. Максимальный срок культивирования клеток должен быть четко установлен с учетом данных, полученных благодаря ЕРСВ.

Как для ксеногенных, так и для аллогенных клеток следует полностью охарактеризовать МСВ и ЕРСВ в отношении подлинности, жизнеспособности, гомогенности, плотности клеток, чистоты, стерильности, функциональной активности, фенотипа, отсутствия микоплазмы и занесенных или эндогенных вирусов. Для клеток, которые были трансфицированы генетическим материалом, при необходимости, следует предоставить характеризацию целостности гена, его экспрессии и стабильности, а также характеризацию остаточного вектора или нуклеиновых кислот и RCV. (см. также Руководство по качеству биотехнологических препаратов: получение и характеризация клеточных субстратов, используемых для производства биотехнологических/биологических препаратов, СРМР/ICH/294/95).

3.4.5 Пролиферативный потенциал

Клетки можно подвергать воздействию факторов роста или цитокинов, чтобы вызвать дифференцировку и/или размножение клеток. Расширенная популяция клеток должна проверяться на наличие необходимого фенотипа. В критерии контроля необходимо включить рассмотрение непредвиденной трансформации.

Для любого клеточного препарата для переноса генов, чья способность к пролиферации in vivo не является необходимым условием эффективности, должна утверждаться стратегия остановки роста клеток посредством надлежащим образом валидированной обработки, например облучения. Следует предоставить доказательства того, что клетки лишены пролиферативного потенциала, и следует измерять, контролировать и обосновывать любую остаточную пролиферативную способность.

Если способность к пролиферации клеток in vivo является необходимым условием клинической эффективности препарата, необходимо предоставить доказательство того, что клетки способны заново размножаться или пролиферировать после их хранения. Это должно быть подтверждено при помощи надлежащим образом валидированного метода.

3.4.6 Продолжительность жизни и стабильность культуры

Необходимо продемонстрировать, что условия культивирования и манипуляции обеспечивают развитие и/или поддержание необходимого фенотипа в течение периода времени, сопоставимого с периодом функционирования генетически модифицированных клеток in vivo. Следует продемонстрировать, что фенотипические и генотипические характеристики, а также жизнеспособность клеточной популяции стабильно поддерживаются в течение всего процесса, например, начиная от МСВ и заканчивая WCB и ЕРСВ. Максимальное время культивирования должно быть указано и обосновано.

3.4.7 Вопросы качества генетически модифицированных клеток

После генетической модификации и необходимых процедур обработки должна быть выполнена биологическая и генетическая характеризация конечного клеточного препарата. Для характеризации получившихся в результате клеток используются следующие показатели контроля: подлинность, жизнеспособность, плотность, гомогенность (процентное содержание субпопуляций, процентное содержание трансдуцированных клеток), чистота (присутствие остаточных реактивов, связанных с процессом, например факторов роста или моноклональных антител), биологическая активность, стерильность. Для клеток, трансфицированных необходимым геном (генами), необходимо, по возможности, определять при помощи подходящего метода: экспрессию (конститутивную или регулируемую), число копий и подлинность препарата, а также функциональную активность и статус интеграции вектора. При необходимости следует контролировать присутствие RCV, остаточных векторов или плазмидных нуклеиновых кислот и соответствующих полимеров. Должно выполняться испытание на активность для определения биологической активности, в том числе новоприобретенной биологической функции, появившейся в результате трансдукции. Эта биологическая активность должна поддерживаться в период хранения.

4. ВОПРОСЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО)

В дополнение к вопросам, связанным с безопасностью, качеством и эффективностью, лекарственные средства, содержащие генетически модифицированные организмы (ГМО) или состоящие из них, могут ставить вопросы, связанные с биологической безопасностью, касающиеся, в основном, внутренних характеристик безопасности и безопасного обращения с живыми организмами (в отношении окружающей среды и широких слоев населения).

В контексте директив 90/219/ЕЕС (в последней редакции) и 90/220/ЕЕС (в последней редакции) ГМО означает организм или микроорганизм, чей генетический материал был подвергнут изменениям, которые не могут возникнуть в естественных условиях в результате спаривания и/или естественной рекомбинации [статья 2 Директив 90/219/ЕЕС (в последней редакции) и 90/220/ЕЕС]. Данное определение распространяется на микроорганизмы, включающие вирусы, вироиды, культуры клеток, в том числе животного происхождения, но не распространяется на оголенную рекомбинантную ДНК и оголенные рекомбинантные плазмиды.

В 1992 г. группа компетентных органов, отвечающих за выполнение Директив 90/219/ЕЕС и 90/220/ЕЕС, предложила следующий подход:

В соответствии с постановлением Совета Европейской Комиссии 2309/93, для лекарственного средства, содержащего генетически модифицированные организмы (в значении, употребляемом в Статье 2(1) и (2) Директивы Совета 90/220/ЕЕС²) или состоящего из них, необходимо проведение специальной оценки риска для окружающей среды (подобной той, которая описывается в Директиве 90/220/ЕЕС или любых дополнениях к ней) с целью предоставления заявки на получение регистрационного удостоверения и оценки риска для окружающей среды, связанного с лекарственными средствами для применения у человека, содержащими ГМО или состоящими из них. Необходимо получить письменное согласие или согласия компетентных органов на преднамеренный выброс в окружающую среду. Таким образом, при составлении заключения по заявкам на получение регистрационного удостоверения для подобных лекарственных средств СРМР должен удостовериться, что были предприняты все необходимые меры, чтобы избежать нежелательного воздействия на здоровье человека и окружающую среду, которое может быть вызвано преднамеренным выбросом, связанном с выпуском на рынок генетически модифицированных организмов.

В отношении процедуры нераспространения (в значении, употребляемом в Директиве Совета 90/219/ЕЕС) следует учитывать требования «Руководства по оценке риска, изложенной в приложении III» Директивы Совета 98/81/ЕС.

5. ДОКЛИНИЧЕСКАЯ (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ/ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ) ОЦЕНКА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ

5.1 Общие вопросы

Данная глава посвящена доклиническим исследованиям, подкрепляющим клинические исследования и заявки на получение регистрационного удостоверения для препаратов для переноса генов, описанных в Разделе 1.2.

Как уже говорилось в разделе 1.3, некоторые вопросы безопасности требует ясного понимания характеристик продукта для того, чтобы разработать доклинические испытания, необходимые для оценки специфических аспектов, касающихся токсикологии и фармакологии препарата. Поэтому неизбежными являются частичные совпадения разделов, посвященных качеству и доклиническим исследованиям, по причине того, что данная информация важна с разных точек зрения для характеризации и контроля препарата для переноса генов, а также для дизайна подходящих доклинических испытаний и их оценки. Таким образом, внутри разделов возможны повторы, но они необходимы для того, чтобы убедиться, что в разделы о качестве (Часть II) и о доклинических исследованиях (Часть III) включены правильные данные, поскольку между этими двумя разделами заявки должны быть перекрестные ссылки.

Как на этапе клинических исследований, так и во время составления заявки, природа и масштаб фармакологических/токсикологических испытаний будут зависеть от природы препарата для переноса генов, его клинического применения (например, терапевтические препараты для переноса генов, такие как катионные липиды, содержащие ген CFTR (прим. трансмембранный регулятор муковисцидоза) для лечения кистозно-фиброзной дегенерации поджелудочной железы, или профилактические препараты для переноса генов, такие как ДНК-вакцина против гепатита В), популяций, которые будут получать лечение (например, дети, женщины репродуктивного возраста) и предполагаемой длительности лечения. Очевидно, что оценка соотношения риска и пользы для препарата для переноса генов, например профилактической ДНК вакцины для применения у детей, сильно отличается от аналогичной оценки, проводимой для препарата, предназначенного для лечения популяций, страдающих от серьезных заболеваний, для которых не существует альтернативных методов лечения; для рассмотрения специфических вопросов безопасности (например, потенциала хромосомной интеграции) в каждом отдельном случае понадобится надлежащий объем подтверждающих данных.

Поскольку препараты для переноса генов содержат нуклеиновые кислоты и другие биологические материалы, для них актуальны многие аспекты, вопросы и принципы безопасности, относящиеся к препаратам на основе рекомбинантной ДНК и другим биологическим препаратам, производимым при помощи современных биотехнологических методов. Поэтому следует учитывать требования соответствующих руководств (например, Руководства по доклинической оценке безопасности фармацевтических препаратов, произведенных при помощи биотехнологий (СРМР/ICH/302/95)).

Препарат должен быть достаточно хорошо охарактеризован, чтобы можно было с уверенностью утверждать, что доклинические исследования проводились с материалом, репрезентативным по отношению к тому, который будет вводиться людям во время клинических исследований. Следует учитывать значение модификаций производственного процесса и исследуемого материала, имевших место в ходе программы разработки, для экстраполяции результатов испытаний, проводимых на животных, на человека (см. «Руководство по доклинической оценке безопасности фармацевтических препаратов, произведенных при помощи биотехнологий», содержащее более подробную информацию по данному вопросу). Модификации генетической последовательности, которые приводят к изменениям в генном продукте, использование альтернативных последовательностей промоторов/энхансеров или другие изменения препарата могут требовать проведения дополнительной доклинической оценки безопасности. Следует предоставить научное обоснование используемого подхода.

Что касается других биотехнологических препаратов, оценка безопасности с использованием доклинических животных моделей, должна рассматривать два вопроса: 1) выбор животных видов и физиологического состояния/стадии заболевания; и 2) способ доставки, в том числе дозу, способ введения и схему лечения (частота и продолжительность). По возможности, должны использоваться подходящие животные виды и модели, т.е. виды/модели, чья биологическая реакция на систему доставки и экспрессируемый генный продукт должна соответствовать реакции человека.

5.2 Частные вопросы

5.2.1 Непреднамеренные и непредвиденные последствия переноса генов

Непреднамеренные и непредвиденные последствия переноса генов включают инсерционный мутагенез, индуцированные изменения клеток и мобилизацию векторной ДНК, которые также упоминались при рассмотрении вопросов качества препаратов для переноса генов.

Следует изучить потенциал интеграции нового гена в геном хозяина и рассмотреть оба случая: когда интеграция является преднамеренной и заложена в методе экспрессии, например, если используются ретровирусные векторы, и когда интеграция не является преднамеренной, например, если используются аденовирусные векторы, оголенные или комплексные нуклеиновые кислоты. В случае с некоторыми препаратами для переноса генов, в отношении которых накоплен большой (клинический и доклинический) опыт использования конкретного вектора доставки при определенном способе введения, допускается использование информации из литературных источников вместо проведения дополнительных экспериментальных работ. Выбранный подход должен быть обоснован.

Теоретические риски, связанные с потенциалом интеграции вектора в геном человека или образованием непредвиденных кодирующих последовательностей, должны быть проанализированы путем сравнения последовательностей вектора с имеющейся информацией о последовательности генома человека. Не совсем понятно, в какой мере последовательность вектора, гомологичная с последовательностью человека, может повышать вероятность интеграции. В зависимости от потенциала интеграции ДНК в геном хозяина и предполагаемого клинического применения, может понадобиться изучение потенциала опухолеобразования или нарушения нормальной экспрессии гена.

Необходимо оценить сайт, распределение и масштаб экспрессии гена, переносимого вектором (как желаемой, так и нежелательной). Подходящими методами анализа являются анализ на основе технологии амплификации нуклеиновых кислот (NAT), например NAT in situ или NAT с обратной транскриптазой (чтобы определить, экспрессируется ли или транскрибируется ли ген), иммунологические анализы и другие подходящие методы обнаружения экспрессии генного продукта. Если препарат для переноса генов присутствует и экспрессируется в неподходящих тканях, следует изучить длительность экспрессии и персистенцию гена. Необходимо изучить возможность распределения в зародышевые клетки, а также возможность интеграции и/или экспрессирования в этих клетках или предоставить обоснование для непроведения подобных исследований, например если клинические показания и/или популяция пациентов указывают на то, что подобные исследования неоправданны.

Нежелательные последствия могут быть связаны с экспрессией гена в неподходящих сайтах и/или в неподходящих количествах, например экспрессией рецепторов/ионных каналов в сайтах, в которых они при нормальных условиях не экспрессируются, сверхэкспрессией фермента или очень длительной экспрессией фактора роста или рецепторов фактора роста, или же индукцией, экспрессией или репрессией других генов.

5.2.2 Оголенная или комплексная (complexed) нуклеиновая кислота (невирусные векторы)

Необходимо разъяснить дизайн всей конструкции ДНК, в том числе экспрессирующей конструкции, включая выбор промоторных последовательностей, других транскрипционных элементов и любых последовательностей, которые могут упростить гомологическую рекомбинацию. Если в процессе производства добавляются другие генные конструкты, такие как гены устойчивости к антибиотикам, следует рассмотреть возможность экспрессии последовательностей таких генов в клетках млекопитающих или других микроорганизмах, которые являются потенциально патогенными, а также возможные клинические последствия подобной экспрессии.

Безопасность материала, используемого для образования комплекса с нуклеиновой кислотой, как правило, исследуется при оценке готового препарата, за исключением тех случаев, когда имеют место определенные опасения насчет безопасности, связанные с комплексообразующим материалом, которые требует его изучения вне комбинации с нуклеиновой кислотой. Дизайн исследований токсичности должен учитывать предлагаемый способ введения, дозу и режим дозирования, которые будут использоваться в клинических исследованиях. Следует провести тщательную оценку безопасности материала, воздействию которого подвергаются пациенты. Например, если нуклеиновые кислоты должны образовывать комплекс с липосомами и вводиться ингаляционным путем при помощи небулайзера, необходимо рассмотреть следующие вопросы: липосома, являющаяся частью комплекса, может отличаться от липосомы, не входящей в комплекс; в исследованиях токсичности следует изучить комплекс липосома-ДНК, предлагаемый для клинического использования; следует изучить стабильность комплекса липосом и ДНК после проведения ингаляции, и в исследованиях токсичности, возможно, придется использовать тот же самый метод доставки, т.е. похожий небулайзер.

Некоторые комплексообразующие материалы могут использоваться, чтобы направить ДНК в необходимый сайт экспрессии за счет тропизма комплексообразующего материала к рецептору сайта-мишени (например, комплекс лиганд-полилизин-ДНК или фузогенный белок (белок слияния)). Исследования in vitro могут дать первичную информацию о данном аспекте, но также потребуются испытания in vivo на подходящих животных моделях.

5.2.3 Вирусные векторы

Для производства терапевтических или профилактических препаратов для переноса генов также могут использоваться вирусные векторы. В этом случае необходимо предоставить достаточный объем данных об оценке доклинической безопасности, чтобы определить соотношение риска и пользы препарата. Следует также обосновать использование способных или неспособных к репликации вирусных векторов (см. раздел 3.3).

Принципы, лежащие в основе дизайна вирусных векторов, должны учитывать следующее: желаемый механизм действия и экспрессию трансгена в ткани; место локализации трансгена в векторе; присутствие и/или сохранение последовательностей гена, важных для антивирусной химиотерапии дикого вируса; генетические изменения, обеспечивающие необходимый уровень способности или неспособности к репликации; риск экспрессии трансгена способным к репликации вирусом вследствие рекомбинации или реактивации; генетические изменения, ослабляющие патогенные свойства.

Следует изучить вероятность контаминации патогенными вирусными последовательностями или способными к репликации вирусами или вероятность их образования – данный вопрос более подробно рассматривается в разделе, посвященном качеству.

Количество частиц вирусного вектора на одну дозу и количество введений, которое нужно для достижения необходимой экспрессии гена, а также безопасность подобных введений при переносе генов in vivo должны рассматриваться в контексте потенциальных иммунологических/цитотоксических проблем, связанных с высокой вирусной нагрузкой. Сюда должна входить оценка воспалительных и иммунологических реакций и их долгосрочных последствий.

Для вирусных векторов или экспрессирующих конструкций, отбираемых на основе их тропизма к органу/ткани, необходимо предоставить доказательства выборочной экспрессии генного продукта в необходимом сайте.

Животные модели, отбираемые для оценки безопасности препарата для переноса генов, должны, по возможности, быть чувствительны к инфекции и патологическим последствиям инфекции, вызванной диким вирусом, связанным с вектором. Необходимо предоставить обоснование выбора определенной животной модели. Вопросы безопасности, специфичные для определенных вирусных векторов, должны изучаться в подходящих и пермиссивных животных моделях. Например, использование векторов на основе вирусов простого герпеса потребует изучения нейровирулентности и потенциала латентности/реактивации. Эти аспекты будут иметь огромное значение, если препарат для переноса генов будет вводиться в нервную систему.

5.2.4 Генетически модифицированные соматические клетки

Все описанные ниже исследования должны выполняться с максимально охарактеризованными трансдуцированными клетками при использовании валидированных современных чувствительных и специфических методов и должны подробно документироваться в регистрационном досье. Если готовый препарат на основе клеток имеет в своем составе материал, усиливающий рост, или имплантируемое или инкапсулирующее устройство, необходимо проводить исследования с готовой формой клеточного препарата для переноса генов. В некоторых случаях необходимо проводить отдельные исследования. Должна быть изучена способность вспомогательного/инкапсулирующего материала изолировать/связывать клетки. Эти исследования должны также рассматривать устойчивость данных вспомогательных/инкапсулирующих материалов к внешним факторам и их тканесовместимость (см. раздел 5.2.4).

Должны проводиться исследования in vitro и/или in vivo для оценки любого возможного воздействия на морфологию, функцию клеток и их поведение, например пролиферацию, иммортализацию или индукцию злокачественной трансформации фенотипа, например, у безтимусных мышей.

Повторно вводимые клетки не должны содержать внеклеточный продукт переноса генов/нуклеиновую кислоту, которые могут распределиться и привести к воздействию нуклеиновой кислоты на удаленные ткани/органы. Следует изучить высвобождение вектора переноса in vivo и его потенциал встраиваться-реплицироваться-взаимодействовать с другими вирусами и/или диссеминировать в гонады или другие ткани.

Использование аллогенных или ксеногенных клеток может привести к нежелательной иммунной реакции на вводимые клетки; ценную информацию о токсикологических последствиях подобной иммунной реакции помогают получить испытания in vivo на животных. Испытания in vivo на животных также позволяют определить, отличаются ли трансдуцированные ex vivo клетки свои поведением in vivo от нетрансдуцированных клеток. Трансдукция может привести к изменению распределения, направленной миграции, локализации, а также к деструкции модифицированных клеток in vivo. Может понадобиться изучение персистенции трансдуцированных клеток и экспрессируемого ими генного продукта при помощи ПЦР и иммуногистохимических методов. Иммуногистохимическое окрашивание участков ткани-мишени позволяет продемонстрировать, что экспрессия генного продукта имеет место в подходящих клеточных популяциях и не связана с патологическими изменениями органа, в котором происходит экспрессия.

Кроме того, необходимо рассмотреть следующие вопросы:

Индуцированные клеточные изменения. После переноса вектора могут иметь место непреднамеренные или неожиданные изменения, нехарактерные для немодифицированной клеточной популяции. Исследования in vitro и/или, при необходимости, in vivo должны использоваться для оценки любого возможного воздействия на морфологию, функцию клеток и их поведение, например пролиферацию, иммортализацию или индукцию фенотипической трансформации. Кроме того, следует исследовать вероятность реактивации латентных вирусов (таких как опоясывающий герпес, вирус Эпштейна-Барра и цитомегаловирус), которая может привести к образованию инфекционного вируса. Необходимо продемонстрировать, что трансдуцированные клетки не провоцируют никакой нежелательной иммунной реакции, если только это не является преднамеренным результатом модификации (например, трансдукция антигенов для повышения иммуногенности опухолевых клеток).

Поведение и активность трансдуцированных клеток in vivo. Введение аллогенных или ксеногенных клеток может привести к нежелательной иммунной реакции организма. Испытания in vivo на животных помогают получить информацию о токсикологических последствиях и методах предотвращения/ослабления подобной реакции. Испытания in vivo на животных также позволяют определить, отличаются ли трансдуцированные ex vivo клетки свои поведением in vivo от нетрансдуцированных клеток. Подходящие испытания помогают определить, приводит ли трансдукция к изменению распределения, направленной миграции и локализации модифицированных клеток in vivo.

Также необходимо определить, как долго трансдуцированные клетки персистируют и остаются активными in vivo; следует провести исследования, подтверждающие надлежащую экспрессию, персистенцию, локализацию и активность необходимого генного продукта (продуктов), и показать, что они не приводят к патологическим изменениям в сайтах, в которых происходит экспрессия.

Высвобождение вектора переноса in vivo. Вероятность того, что трансдуцированные клетки высвобождают вектор или плазмиду при переносе in vivo, должна быть тщательно изучена (вне зависимости от того, происходит это преднамеренно или нет). В том числе следует изучить потенциал взаимодействия вектора с другими инфекционными агентами или лекарственными средствами для лечения заболевания. Объем данных исследований будет зависеть от используемого вектора или плазмиды, их способности к репликации и их статуса интеграции в клетки. Следует изучить диссеминацию векторов в различные ткани и органы, в особенности гонады, а также в окружающую среду. Необходимо определить подлинность, инфекционность, персистенцию и активность диссеминированного агента.

5.3 Потенциальная эффективность

Исследования in vitro и in vivo, использующие подходящие модели и релевантные животные виды, должны демонстрировать, что ген экспрессируется в подходящем сайте, в подходящих клетках, на подходящем уровне (имеется в виду объем и длительность экспрессии) и обладает функциональной активностью. Например, если ген кодирует рецептор, необходимо предоставить доказательства того, что экспрессируемый рецептор надлежащим образом сочетается с механизмами клеточной сигнализации. Важно разработать подходящие методы для мониторинга наличия необходимой экспрессии. Гены-репортеры могут быть полезными для оценки доставки трансгена в клетки-мишени и его последующей экспрессии. Стратегии достижения определенного тропизма к ткани/направления препарата для переноса генов к желаемому сайту-мишени должны изучаться на подходящих моделях животных.

В клетках-мишенях могут присутствовать антагонистичные механизмы, мешающие экспрессии встраиваемого гена. Необходимо описать любые стратегии, используемые для преодоления подобных антагонистичных механизмов, а также принципы использования соответствующих промоторных последовательностей и дополнительных элементов для регуляции транскрипции.

В случае с ДНК-вакцинами следует изучать вызываемую ими иммунную реакцию, в том числе клеточный и гуморальный ответ и их протективную эффективность (см. также документ СРМР «Руководство по доклиническим фармакологическим и токсикологическим испытаниям вакцин, СРМР/465/95).

Животные виды, обычно используемые в традиционных испытаниях токсичности (например, крысы и собаки), могут быть не применимы в качестве релевантной животной модели для получения необходимой фармакологической реакции на некоторые препараты для переноса генов. Поэтому целесообразным может быть включение ряда параметров безопасности в испытания однократной или многократных доз на животных для изучения потенциальной эффективности препаратов (т.е. включение тех параметров, которые обычно контролируются в доклинических исследования токсичности – например, масса тела, клиническая патология, гематология, офтальмоскопия, ЭКГ/кровяное давление, аутопсия и гистопатология).

5.4 Фармакологическая/токсикологическая оценка препаратов для переноса генов

5.4.1 Общие вопросы

Исследования токсикологии на животных могут быть источником информации о возможности возникновения нежелательных или неожиданных эффектов, однако исследования должны разрабатывать отдельно для каждого конкретного случая. По возможности должны использоваться релевантные виды животных, т.е. те, чья биологическая реакция на экспрессируемый генный продукт должна быть сопоставима с реакцией в человеческом организме. В некоторых случаях, в особенности при использовании способного к репликации вируса, целесообразным бывает выбирать для оценки безопасности препарата для переноса генов такие животные модели, которые обладают чувствительностью к инфекции и, по возможности, к похожим патологическим последствиям инфекции, вызванным диким вирусом, связанным с вектором. Релевантными животными моделями могут служить трансгенные животные модели или животные с иммунодефицитом, которым была трансплантирована человеческая ткань. Выбор дозы, длительности и частоты дозирования должен основываться на предполагаемом клиническом режиме дозирования и уровнях и длительности экспрессии гена в экспериментальной животной модели и в человеческом организме. Следует учесть возможность использования групп с промежуточным умерщвлением, если важным является контроль морфологических изменений во время максимальной воспалительной реакции (например, вызванной аденовирусным вектором) или во время максимальной экспрессии гена. Дизайн исследований токсичности должен быть обоснован.

Использование одного релевантного животного вида может быть достаточным для исследований однократной и повторных доз, если специфические вопросы безопасности не требуют использования второго животного вида. Выбранный подход должен быть научно обоснован. Как предлагается в разделе 5.3, мониторинг конечных точек безопасности во время исследований, оценивающих потенциальную эффективность, может дать дополнительную важную информацию, и в некоторых случаях может даже дать всю необходимую информацию, особенно если используются специальные устройства доставки препарата, например, внутрикоронарные устройства доставки.

5.4.2 Исследования токсичности однократной дозы

Исследование токсичности однократной дозы, включающее несколько конечных точек фармакологической безопасности (например, сердечно-сосудистые/респираторные, см. 5.4.7) может быть более подходящим, нежели отдельные исследования токсичности однократной дозы и фармакологической безопасности. Подобные конечные точки безопасности могут также быть включены в исследования по оценке потенциальной эффективности. Помимо использования клинического способа введения, в исследовании токсичности однократной дозы необходимо использование схемы лечения, приводящей к максимальному системному воздействию препарата. Подобное исследование может не понадобиться, если обоснованные данные показывают отсутствие проникновения препарата в системный кровоток и его местное удержание.

5.4.2 Исследования токсичности повторных доз

Многие потенциальные токсические эффекты препаратов для переноса генов описывались ранее в данном Руководстве и должны учитываться при разработке испытаний токсичности повторных доз.

Исследования токсичности повторных доз необходимы, если планируется многократное введение доз субъектам клинических исследований. Путь, способ, частота и длительность введения препарата в исследованиях на животных должны, по возможности, совпадать с клиническим режимом дозирования. Если период лечения пациентов является длительным, исследования токсичности, как правило, должны проводиться на протяжении 6 месяцев. Длительность исследования восстановительной фазы должна основываться на персистенции препарата для переноса генов и экспрессии генного продукта.

В этих же исследованиях могут изучаться релевантные фармакокинетические параметры/параметры распределения в ткани, позволяющие установить корреляцию между результатами исследований и присутствием векторного материала, введенной нуклеиновой кислоты и/или экспрессированного генного продукта.

Выбор доз и режима дозирования должен осуществляться таким образом, чтобы можно было определить безопасную начальную дозу и схемы увеличения дозы для первичных клинических исследований и получить информацию о параметрах, которые требуют клинического мониторинга, и о механизме любых токсических явлений, наблюдаемых в клинических исследованиях.

5.4.4 Иммуногенность и иммунотоксичность

Для ДНК-вакцин иммуногенный ответ на экспрессирующую конструкцию является желаемой реакцией, и должен быть надлежащим образом изучен.

Для остальных препаратов для переноса генов должен изучаться потенциал стимулирования клеточно-опосредованного или гуморального иммунитета к нуклеиновой кислоте, полученному из вектора материалу (например, вирусному белку), экспрессируемому белку или трансплантированным генетически модифицированным клеткам. Генерация иммунологического ответа на вектор или конструкцию, в целом может снизить их эффективность и приводить к изменению токсикологических последствий. Мониторинг иммуногенности во время исследований токсичности поможет интерпретировать результаты исследований токсичности. В определенных случаях индукция аутоиммунитета или дополнительных иммунных ответов может иметь побочные токсические эффекты.

Носители аденовируса могут выступать в качестве адъювантов при генерации иммунных ответов на экспрессируемый генный продукт. Если этот продукт является чужеродным гомологом собственного белка, аутоиммунный ответ может возникнуть на гомологичный собственный белок хозяина (нарушение толерантности). Если возникает подобное опасение, это вопрос должен быть исследован.

Могут возникать неожиданные или нежелательные последствия длительной экспрессии чужеродного антигена. Данные вопросы безопасности должны рассматриваться в подходящих исследованиях на животных. Они могут включать потенциальный аутоиммунитет, вызванный сверхстимуляцией иммунитета, приводящей к перекрестной реактивности. Кроме того, может измениться экспрессия поверхностных антигенов на клетках, экспрессирующих перенесенный генный конструкт, что также может иметь последствия для аутоиммунного потенциала. Если экспрессируемый генный продукт имеет иммуномодулирующее действие, последствия этого действия должны быть изучены.

5.4.5 Репродуктивная способность и токсическое влияние на внутриутробное развитие

Важный вопрос для рассмотрения – это возможность распределения и локализации препарата для переноса генов в гонады и зародышевые линии. Подтвердить отсутствие альтераций зародышевых линий можно при помощи изучения наличия и персистенции сигнала NAT на вектор и/или экспрессируемый генный продукт в гонадах как мужчин, так и женщин. Необходимо изучить сигнал NAT и/или сигнал NAT с обратной транксриптазой (RT-NAT) в гонадной ткани. Положительные результаты, свидетельствующие о наличии и/или персистенции сигналов, требуют проведения дополнительных исследований для исключения присутствия препарата для переноса генов в зародышевых линиях и его интеграции в геном зародышевых линий. Может проводиться исследование спермы и яйцеклетки при помощи технологий NAT. Подобные исследования необходимо проводить до начала любых испытаний препарата на людях. Однако изучение воздействия на фертильность и репродуктивную функцию может понадобиться до подачи заявки на регистрацию, если не имеется достаточных оснований для непроведения подобных испытаний. Необходимо тщательно разработать дизайн исследований, изучающих специфические вопросы безопасности, связанные с определенным препаратом для переноса генов, и учитывать предполагаемое клиническое применение и клиническую популяцию. Специфические вопросы безопасности могут быть связаны, например, с комплексообразующим материалом, используемым в невирусных векторах, функциональной активностью экспрессируемого геном продукта или патогенностью способного к репликации вирусного вектора. Рекомендации, касающиеся надлежащей контрацептивной защиты, должны учитывать персистенцию генного препарата в гонадах. Также, в зависимости от предполагаемого клинического применения и клинической популяции, могут понадобиться исследования эмбриофетотоксичности и перинатальной токсичности, если препараты для переноса генов будут назначаться женщинам, имеющим репродуктивный потенциал. Подобные исследования на животных могут не понадобиться в ранних, тщательно контролируемых клинических исследованиях в клинических популяциях с серьезными, опасными для жизни заболеваниями, при условии, что предпринимаются все меры предосторожности для минимизации рисков, согласно требованиям Руководства по доклинической оценке безопасности для проведения клинических исследований на людях для фармацевтических препаратов (СРМР/ICH/286/95).

Вопросы, связанные с потенциальным токсическим действием препаратов для переноса генов на репродуктивную функцию, являются очень сложными, поэтому руководство в данной области может быть изменено по мере накопления бóльшего опыта в данной сфере.

5.4.6 Исследования генотоксичности/канцерогенности

Стандартный набор традиционных исследований генотоксичности и канцерогенности, как правило, не подходит для препаратов для переноса генов. Однако исследования генотоксичности могут понадобиться для изучения вопросов, связанных со специфической примесью или компонентом системы доставки, например комплексообразующим материалом.

Более важным вопросом, связанным с препаратами для переноса генов, является потенциал инсерционного мутагенеза, который уже упоминался в разделе 5.2.1. Если вводимая нуклеиновая кислота обнаруживается (при помощи методов NAT) и экспрессируется (RT-NAT) в тканях/органах, не являющихся предусмотренными сайтами действия препарата, и данная экспрессия персистирует, важно использовать метод, позволяющий определить, имеет ли место интеграция подобной нуклеиновой кислоты в геномную ДНК. Необходимо, по возможности, описать принцип любого используемого анализа интеграции и обосновать пределы чувствительности в отношении частоты спонтанной мутации. В дополнение к изучению потенциала интеграции нуклеиновой кислоты в геном клетки хозяина, информация о потенциале инсерционного мутагенеза может быть также получена из исследований in vitro, в которых используются различные клеточные линии для изучения изменений клеточной морфологии, функций и поведения. Цитогенетический анализ костного мозга и/или клеток периферической крови, являющийся частью исследований токсичности/распределения, может также дать полезную информацию, если в этих тканях обнаруживаются персистирующие сигналы NAT/RT-NAT. Поскольку изучение генотоксичности неразрывно связано с изучением фармакокинетики, данный раздел должен рассматриваться с учетом требований раздела 5.4.8.

Может также понадобиться изучение туморогенного потенциала экспрессируемого геном продукта, например, слишком продолжительной экспрессии фактора роста или рецепторов фактора роста или иммуномоделирующего агента.

5.4.7 Вторичная фармакодинамика

Исследования вторичной фармакодинамики могут потребоваться, если в другие фармакологические/токсикологические исследования не включены подходящие фармакологические конечные точки.

5.4.8 Фармакокинетика

Набор испытаний для изучения абсорбции/распределения/метаболизма и выведения традиционных лекарственных средств может не подходить для препаратов для переноса генов. Более важные конечные точки, которые требуют изучения, описаны в разделе 5.2.1, и бывает целесообразным включать подобные конечные точки в исследования токсичности.

Необходимо изучить распределение, воздействие, клиренс и транскрипцию вводимой нуклеиновой кислоты. Исследования биораспределения должны, в первую очередь, использовать анализы NAT для изучения распределения в ткани и персистенции генного препарата. Если введенная нуклеиновая кислота обнаруживается при помощи NAT в нежелательных тканях/органах, может оказаться полезным определение мРНК генного продукта при помощи RT-NAT, а также длительности и уровня экспрессии генного продукта при помощи иммунологических анализов RT-NAT и/или анализов, используемых для обнаружения функционального белка. Кроме того, иногда необходимо определить, встраивается ли нуклеиновая кислота в геном клетки хозяина. Проведение подобного исследования представляется особенно важным, если нуклеиновая кислота была обнаружена в гонадах. Следует предоставить детальную информацию об используемых методах, в том числе об используемом отрицательном/положительном контроле и о чувствительности методик. Вместо того чтобы указывать границы цикла NAT или предел детектирования (например, 1 копия на определенное число клеток или на микрограмм геномной ДНК), заявителям рекомендуется обосновать анализы, используемые в исследованиях биораспределения, и установить пределы чувствительности на основе надлежащим образом валидированных процедур. Развитие методов NAT in situ может позволить локализовать векторную ДНК/трансген внутри клеток/тканей.

Фармакокинетическое поведение экспрессируемого геном продукта должно также изучаться в отношении длительности и сайта экспрессии и/или высвобождения.

Может также понадобиться изучение распределения и клиренса материала, используемого для доставки нуклеиновой кислоты, например, комплексообразующего материала, состоящего из катионных липидов.

5.4.9 Местное раздражающее действие

Для некоторых видов может потребоваться изучение местного раздражающего действия. Однако если предлагаемый клинический состав и способ введения были исследованы в других испытаниях на животных, нет необходимости проводить отдельные исследования местного раздражающего действия.

6. ОЦЕНКА КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ

6.1 Общие вопросы

Необходимо выполнять требования Руководства по Надлежащей клинической практике ICH E6. В данном разделе содержатся специфические требования к клиническим исследованиям препаратов для переноса генов. Заявители также должны учитывать существующие руководства по клиническим исследованиям, утвержденные СРМР и ICH, биостатистические методы, используемые при проведении клинических исследований, и рекомендации, касающиеся отдельных терапевтических областей.

На этапе клинических исследований характер и масштаб изучения эффективности и безопасности зависят от:

Следует учитывать, что в большинстве случае отсутствует подходящая животная модель для определения начальной дозы. Для разработки хорошо продуманной программы клинических исследований необходимо глубокое понимание характеристик и механизмов действия. Например, в случае с вирусными векторами необходимо рассматривать патологические последствия введения подобных векторов пациенту (на основе имеющейся информации о первичном штамме) и тропизм к ткани.

Планирование клинических исследований должно, по возможности, основываться на результатах, полученных в доклинических фармакологических и токсикологических исследованиях, и должно обосновываться заявителем. Планирование включает способы введения, выбор доз и режимов дозирования, а также мониторинг пациентов в отношении потенциальных побочных явлений, связанных с использованием определенных методов переноса генов.

Что касается клинической безопасности используемого вектора, следует учитывать доклинические исследования и опубликованные данные клинических и доклинических исследований похожих векторов, используемых для переноса различных терапевтических генов или генов-маркеров посредством сходного режима дозирования и способа (способов) введения. Эта информация может оказаться полезной при планировании мониторинга пациентов во время клинических исследований. Подобная оценка должна также включать другие компоненты, например, медицинские устройства, которые могут играть ключевую роль в доставке препарата для переноса генов, в том числе генетически модифицированные клетки, поскольку они могут оказать влияние на итоговую оценку клинической безопасности и эффективности.

Комбинация, появившаяся в результате сочетания определенного вектора для переноса генов и необходимого гена (генов), подлежит рассмотрению в индивидуальном порядке.

6.2 Фармакологические исследования у человека

Главной целью фармакологического исследования у человека должно быть:

При том что биораспределение вектора в организме пациентов является желательным, данные о распределении вектора в органах/тканях пациентов могут быть ограниченными. Ограничения для проведения подобных исследований могут быть связаны с группой исследуемых пациентов, способом введения, самим препаратом и показанием к применению. Поэтому необходимость проведения подобных исследований и их масштаб должны рассматриваться отдельно для каждого препарата.

Как правило, в первоначальных исследованиях выполняется однократное введение исследуемого препарата. Затем проводятся исследования, в которых применяются многократные введения, регулируемые соответствующими фармакодинамическими реакциями. Всегда, когда это возможно, начальная фаза клинических исследований должна проводиться в целевых популяциях пациентов при использовании предлагаемого способа введения. Достаточное число субъектов исследования должно изучаться для каждого уровня дозы.

6.3. Исследования эффективности

Данные исследования обычно проводятся после того, как будет накоплено достаточно информации в исследованиях на людях о следующих параметрах препарата для переноса генов:

Оптимальные дозы и режимы дозирования должны определяться на основе первоначальной оценки безопасности и доказательств наличия и экспрессии терапевтического гена in vivo. Необходимо разработать количественный анализ активности, отражающий биоактивность in vivo.

В целом, при необходимости, должна проводиться рандомизация субъектов исследований. При оценке эффективности должны использоваться надлежащим образом обоснованные клинические или суррогатные клинические конечные точки. Компаратор, используемый в исследованиях, должен быть обоснован с учетом клинических методов, обычно используемых для лечения исследуемого клинического состояния. Однако для редких состояний с хорошо известным клиническим исходом допускается проведение исследований без компаратора. Использование плацебо в конкретном клиническом исследовании должно быть обосновано с этических и клинических позиций.

6.4. Безопасность

В зависимости от вида препарата для переноса генов, используемого в клиническом исследовании, во время клинических исследований должны изучаться любые общие и специфичные для препарата побочные явления, предсказуемые с учетом любой релевантной информации, полученной из доклинических исследований или литературных источников (см. также раздел 5 о доклинических исследованиях). Данные, полученные в доклинических исследованиях, могут оказаться полезными при утверждении профиля клинической безопасности исследуемого препарата и при определении масштаба и длительности клинического мониторинга пациентов после введения препарата. Важно учитывать как краткосрочные, так и долгосрочные побочные явления, которые могут быть связаны с введением препарата для переноса генов.

В то время как некоторые эффекты можно легко идентифицировать при первом введении препарата в организм человека, часто бывает сложно определить полный профиль безопасности, и для этого может потребоваться длительное последующее наблюдение за субъектами исследования. Поэтому необходимо учитывать следующие аспекты, представленные ниже в общих чертах:

а) Мониторинг вирусной безопасности (см. раздел 2.5.2 и 3.3):

b) Функциональные клеточные изменения, возникшие в результате непреднамеренной (эктопической) трансфекции, и их патофизиологические последствия.

c) Последующее наблюдение за клиническим эффектом (эффектами), связанным с продолжительной экспрессией чужеродного белка, в динамике (см. раздел 5.4.4).

d) Мониторинг иммунной системы с целью определения потенциала стимулирования клеточно-опосредованного или гуморального иммунитета и минимизации иммунологических реакций и связанных с ними побочных эффектов, вызванных и направленных на:

Любой иммунологический ответ, возникающий на вектор или конструкцию, может, с большой долей вероятности, отрицательно сказываться на эффективности процедуры переноса гена и/или приводить к нежелательным последствиям для клинической безопасности. Проведение доклинических иммунотоксикологических исследований может помочь интерпретировать определенные данные клинических исследований (раздел 4.4.4). В некоторых случаях иммунная реакция может, напротив, быть благоприятной для определенного клинического показания; поэтому следует объяснить научный замысел и оценить нежелательные последствия.

e) Следует основательно изучить потенциал интеграции генома (вне зависимости от того, является ли она желательной или нет) и ее клинические последствия, такие как инсерционный мутагенез. Однако надо признать, что ее нелегко обнаружить в клинических исследованиях. При наличии обоснования и соответствующей возможности следует рассмотреть специфическое долгосрочное последующее наблюдение за реципиентами.

f) Следует предусмотреть защиту медицинских работников от случайного воздействия препарата для переноса гена, например, во время введения и удаления препарата для переноса гена из организма реципиента (реципиентов). Необходимы исследования, помогающие определить длительность и масштаб мониторинга, а также последующего наблюдения с учетом рекомендаций Директив о нераспространении и преднамеренном выбросе (см. раздел 4).

6.5 Мониторинг пациентов

С учетом вышеизложенного, следует рассмотреть следующие аспекты:

Объем данных и длительность мониторинга должны быть обоснованы заявителем. В данной ситуации руководство ICH E1 может не учитываться.

7. СПИСОК АББРЕВИАТУР

CFTR – трансмембранный регулятор муковисцидоза

CMV – цитомегаловирус

EPCB – банк клеток для расширенного производства

ГМО – генетически модифицированные организмы

GMP – Надлежащая производственная практика

HBV – вирус гепатита В

HCV – вирус гепатита С

HIV – вирус иммунодефицита человека

HLA – лейкоцитарный антиген гистосовместимости

МСВ – главный банк клеток

NAT – технология амплификации нуклеиновых кислот

PCR – полимеразная цепная реакция

RCA – способный к репликации аденовирус

RCR – способный к репликации ретровирус

RCV – способный к репликации вирус

RT-NAT – технология амплификации нуклеиновых кислот с обратной транксриптазой

TSE – трансмиссивная губчатая энцефалопатия

WCB – рабочий банк клеток

8. ГЛОССАРИЙ

Критерии приемлемости:

Числовые предельные уровни, диапазоны или другие подходящие меры определения приемлемости результатов аналитических процедур, которым должна отвечать лекарственная субстанция или лекарственное средство или материалы на различных этапах их производства.

Клетки, способные образовывать банки клеток:

В контексте настоящего Руководства – клетки после экспансии in vitro, сохраняемые при помощи криоконсервации и хранящиеся в таких условиях, при которых их биологические характеристики не претерпевают значительных изменений. Подобные клетки должны быть подробно охарактеризованы, должны пройти контроль качества и помещены на хранение для последующего извлечения и манипулирования с целью введения пациентам.

Биологическая активность:

Специфическая способность препарата вызывать определенный биологический эффект. Количественной мерой биологической активности является потенция (potency).

Контаминанты:

Любые непреднамеренно вводимые материалы (например, химические, биохимические или микробные частицы), которые не должны входить в процесс производства лекарственной субстанции или лекарственного средства.

Продукты деградации:

Варианты, появляющиеся в результате изменений целевого препарата, вызванные временем и/или действием, например, света, температуры, рН, воды, или реакцией со вспомогательным веществом и/или первичным упаковочным материалом/контейнером. Подобные изменения могут появляться в результате производства и/или хранения, например, дезамидирования, окисления, агрегации, протеолиза. Продукты деградации могут быть либо родственными соединениями либо родственными примесями.

Целевой препарат:

Препарат для переноса гена включает вирусный вектор, плазмиду, клетки, экспрессирующую конструкцию, а также инкапсулирующее устройство, как показано в таблице 1.

Подразумевается, что любой компонент или материал, используемый для переноса гена, является важным для достижения желаемой биологической функции препарата для переноса генов.

Экспрессирующая конструкция (кассета):

Экспрессирующая конструкция препарата для переноса генов, это та его часть, которая переносит ген (гены) или последовательность (последовательности) нуклеиновой кислоты, предназначенные для получения желаемого клинического эффекта, а также необходимые регуляторные последовательности для их экспрессии.

Примесь:

Примеси могут быть связаны либо с процессом либо с продуктом.

Они могут быть вариантами целевого препарата (например, способный к репликации вирус, нетрансдуцированные клетки), не обладающими свойствами целевого препарата в отношении активности, эффективности и безопасности.

Производственные примеси связаны с процессом производства. Они могут возникать из клеточных субстратов (например, белки клетки хозяина, ДНК клетки хозяина), клеточной культуры (например, индукторы, антибиотики или компоненты среды) или последующей переработки (например, производственные реактивы или выщелачиваемые в колонке вещества).

Плазмида:

Двухспиральные кольцевые молекулы ДНК, способные реплицироваться параллельно хромосомной ДНК.

Активность (потенция):

Мера измерения биологической активности при помощи подходящего количественного биологического анализа (также называемого биоанализом или анализом активности), основанного на свойстве препарата, которое связано с релевантными биологическими характеристиками.

Спецификация:

Спецификация представляет собой список тестов, ссылок на аналитические процедуры и подходящих критериев приемлемости в виде числовых предельных значений, диапазонов или других критериев для указанных тестов. Спецификация устанавливает набор критериев, которым должна отвечать лекарственная субстанция, лекарственное средство или материалы на различных стадиях производства, чтобы быть признанными приемлемыми для предусмотренного применения. «Соответствие спецификации» означает, что лекарственная субстанция и лекарственное средство будут отвечать критериям приемлемости, если их протестировать согласно списку аналитических процедур. Спецификации являются важнейшими стандартами качества, которые предлагаются и обосновываются производителем и утверждаются регуляторными органами в качестве условий одобрения препаратов.

Вектор:

Средство передачи; например ДНК вектор представляет собой самореплицирующуюся молекулу ДНК, которая передает генетическую информацию от одной клетки или организма к другой. Плазмиды (и некоторые вирусы) используются в качестве «векторов» для ДНК при бактериальном клонировании. (OECD – прим. Организация экономического развития и сотрудничества).

Информационное письмо Комиссии (С98/С 229/03) о процедурах получения регистрационного удостоверения Европейского Сообщества для лекарственных средств OJ 22 июля 1998 г.

Директива Совета 90/220/ЕЕС подлежит пересмотру.