КВАЛИФИКАЦИЯ
ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ
ЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
2/23
Таблица I
Уровень III. Регулярные и целенаправленные проверки инструментов
Рекомендации для приборов для ЖХ и соответствующие допустимые пределы
Модуль прибора
Параметр для проверки
Допустимые пределы
Система подачи
растворителя
Точность скорости потока (ВЭЖХ)
± 5,0 %
Точность скорости потока (УВЭЖХ)
± 3,0 %
Прецизионность скорости потока
(ВЭЖХ и УВЭЖХ)
RSD ≤ 0,5 %
Точность градиентного состава
± 2,0 %
Пульсация градиента
≤ 0,2 %
Дозатор
Прецизионность объема (ВЭЖХ и
УВЭЖХ)
RSD ≤ 1,0 %
Перенос вещества из предыдущей
пробы
≤ 0,2 %
Автоматический
дозатор
Точность термостатирования
± 3 °C
Печь или
охладительный
прибор (колонка)
Точность термостатирования
± 2 °C
Стабильность термостатирования
≤ 1 °C
Многоволновый
детектор
Линейность
r
2
≥ 0,9990
Точность длины волны
Дрейф
± 2 нм
см. Приложение I
Флуоресцентны
й детектор
Точность длины волны (возбуждение
и излучение)
± 3 нм
Отношение сигнал/шум
≥ 400
Электрохимически
е детекторы:
- Амперо-
метрическое
определение
- Встроенное
амперометрическое
определение
- Определение по
электропровод-
ности
- Кулоно-
метрическое
определение
Дрейф (ток ячейки)
Шум
Линейность
Дрейф
Шум
Линейность
Дрейф
Шум
Приложение I
≤ 8 пА/ч
≤ 2 пА
r
2
≥ 0,9990
≤ 1250 пКл/20 мин.
Среднее(MW)
20 считываний
<160 пКл
r
2
≥ 0,9990
≤ 2 нСм
≤ 20 нСм/ч
Приложение I
3/23
Рефрактометри-
ческий детектор
Отношение сигнал/шум
≥ 10
Дрейф со временем
± 0,1 мВ/мин
Линейность
r
2
≥ 0,9950
Детектор
циркулярного
дихроизма
Линейность
Отношение сигнал/шум
r
2
≥ 0,9950
> 1,0
Дрейф со временем
≤ 0,1 мград/ч
Сравнение спектров
± 4 нм
Детектор
заряженного
аэрозоля
Шум нулевой линии
Самый большой случайный пик
Дрейф нулевой линии
Сходимость
Отношение сигнал/шум
Калибровка сигнала
≤ 0,04 пА
≤ 0,2 пА
≤ 0,04 пА/мин
RSD ≤ 10 %
≥ 10
r
2
≥ 0,9990
Испарительный
детектор
светорассеяния
Шум
Дрейф нулевой линии
Сходимость
≤ 2 мВ
≤ 2,0 мВ/ч.
RSD ≤ 3,0 %
4/23
ТАБЛИЦА II
Уровень IV. Проверка приборов в процессе использования
Рекомендации для приборов для ЖХ и соответствующие допустимые пределы
Допустимые пределы
В соответствии с Евр.Фарм., или с
досье держателя регистрационного
удостоверения, или с прошедшим
валидацию собственным методом.
RSD ≤ 1,5 %
(исследуемый или стандартный раствор
вводят минимум 5 раз)
(если нет других указаний в описании
проверки пригодности системы для
выбранного метода, например, особых
требований в статье 2.2.46 Евр.Фарм.,
монографиях Евр.Фарм. или досье
держателя регистрационного
удостоверения)
RSD ≤ 5,0 %
(минимум 3 раза вводится
разбавленный раствор или стандартный
раствор, используемый для
количественной оценки)
(если нет других указаний в описании
проверки пригодности системы для
выбранного метода, например, особых
требований в статье 2.2.46 Евр.Фарм.,
монографиях Евр.Фарм. или досье
держателя регистрационного
удостоверения)
RSD ≤ 2,0%
(исследуемый или стандартный раствор
вводят минимум 5 раз)
≤ 0,2 % (количественное определение)
Ниже порога игнорирования
(родственные примеси)
5/23
В соответствии со статьей 2.2.46
Евр.Фарм.(если нет других указаний в
монографиях Евр.Фарм. или досье
держателя регистрационного
удостоверения)
6/23
ПРИЛОЖЕНИЕ I
Уровень III. Регулярные и целенаправленные проверки инструментов
В данном приложении приводятся практические примеры методик с допустимыми
пределами для ряда параметров, которые предназначены для проведения квалификации III
уровня различных модулей прибора для ВЭЖХ/УВЭЖХ.
В случае если для испытания одного параметра описано более одного метода, возможно
использование метода 1, или метода 2, или метода 3.
При описании колонки в ходе процедуры квалификации возможно использование
специальной колонки.
СИСТЕМА ПОДАЧИ РАСТВОРИТЕЛЯ
Для регулярных и целенаправленных проверок системы подачи растворителя для ВЭЖХ
предлагаются следующие испытания: проверка скорости потока и проверка работы в
градиентном режиме.
ТОЧНОСТЬ И ПРЕЦИЗИОННОСТЬ СКОРОСТИ ПОТОКА
Метод 1
Материалы:
Мерный стакан (вместимостью 5-10 мл) или сосуд для взвешивания;
Откалиброванный термометр;
Откалиброванный хронометр;
Откалиброванные аналитические весы.
Условия:
Подвижная фаза: дегазированная вода для хроматографии R;
Капилляр, например, 2 000 x 0,12 мм с обратным давлением;
Скорость потока:
система для ВЭЖХ: 0,5 мл/мин и 5,0 мл/мин или максимальная используемая
скорость потока,
система для УВЭЖХ: 0,2 мл/мин и 2,0 мл/мин или максимальная используемая
скорость потока.
Если установлены системы смешивания под высоким давлением, то данное испытание
надо проводить для каждого канала растворителя.
Методика:
Устанавливают подходящую скорость потока (испытывают, по меньшей мере, одну
скорость потока, самую низкую рабочую) и пускают воду для наполнения мерного
стакана или сосуда для взвешивания, предварительно взвешенного (пустым). По
истечении установленного времени (например, 5,0 мин.) снова взвешивают контейнер,
содержащий воду. Измеряют температуру использованной воды. Повторяют процедуру
минимум трижды. Рассчитывают объем воды, поступившей в мерный стакан, и скорость
потока:
V= m / ƍ
7/23
m…… масса воды, поступившей за измеренный промежуток времени (г)
ƍ……. плотность воды при фактической температуре на столе (г/мл)
V……. поступивший объем (мл)
f = V / t
f.................измеренная скорость потока (мл/мин);
t.................время, прошедшее до наполнения до отметки (мин);
V ...............поступивший объем (мл).
D = 100 *
f - F
F
D ...............отклонение (%),
F ...............номинальная скорость потока (мл/мин),
f.................измеренная скорость потока (мл/мин).
Метод 2
Для определения скорости потока используют откалиброванный расходомер.
Пределы:
Точность: ВЭЖХ: D ≤ 5,0 %,
УВЭЖХ: D ≤ 3,0 %;
Прецизионность (ВЭЖХ и УВЭЖХ): Относительное стандартное отклонение должно
быть ≤ 0,5 %
Метод 3
Материалы:
Используют откалиброванную мерную посуду, например, колбу вместимость 5,0 или 10,0
мл класса А;
Откалиброванный хронометр.
Условия:
Подвижная фаза: дегазированная вода для хроматографии R;
Капилляр, например, 2 000 x 0,12 мм с обратным давлением;
Скорость потока:
система для ВЭЖХ: 0,5 мл/мин и 5,0 мл/мин или максимальная используемая
скорость потока,
система для УВЭЖХ: 0,2 мл/мин и 2,0 мл/мин или максимальная используемая
скорость потока.
Если установлены системы смешивания под высоким давлением, то данное испытание
надо проводить для каждого канала растворителя.
Методика:
Устанавливают подходящую скорость потока и измеряют время, требуемое для
заполнения мерной колбы до отметки. Время записывают.

f
V * 60
t
f...............измеренная скорость потока (мл/мин)
8/23
t............... время, прошедшее до наполнения до отметки (с)
V...............объем мерной колбы (мл)

D100*
f F
F
D...............отклонение (%)
F............... номинальная скорость потока (мл/мин)
f............... измеренная скорость потока (мл/мин).
ТОЧНОСТЬ И ПУЛЬСАЦИЯ ГРАДИЕНТНОГО СОСТАВА
Условия:
Капилляр, например, 2 000 x 0,12 мм с обратным давлением;
Детектирование: 265 нм;
Подвижная фаза А: вода для хроматографии R;
Подвижная фаза B: вода для хроматографии R, содержащая 0,5 % ацетона;
Скорость потока: 1,0 мл/мин.
Методика:
Испытание проводят следующим образом, используя градиентную программу в
зависимости от количества каналов растворителя и конфигурации системы:
A-B;
A-B и A-C;
A-C, A-B и B-D.
Таблица III – Пример для конфигурации системы A-B:
Время (мин)
% подвижной фазы А
(вода)
% подвижной фазы B (смесь
воды с ацетоном)
0,0
100
0
0,1
90
10
10
90
10
10,1
50
50
20
50
50
20,1
10
90
30
10
90
30,1
0
100
40
0
100
40,1
100
0
Испытание начинают с прокачивания воды в течение, по меньшей мере, 10 минут для
приведения системы в равновесие.
Значение в 0 % в начале испытания — это нулевая линия. Измерение на всех этапах
проводят в начале горизонтальной части линии либо с помощью программного
обеспечения (в виде единиц поглощения), либо вручную на бумажной копии с
использованием линейки. Высоту линии для 100% водно-ацетоновой смеси используют в
качестве значения H в следующих расчетах:
 
%H............ расчетный состав,
9/23
h ................ высота измеренной линии,
H ............... высота линии 100% водно-ацетоновой смеси (подвижная фаза В).
d = %H - G
d ................ отклонение,
G ............... номинальный градиентный состав (% смеси водно-ацетонового раствора =
подвижная фаза В).
Пределы:
Точность: ± 2,0 %.
Пульсация градиентного состава — это процент шума 50% линии из градиентной
программы.
 

%R ............ пульсация;
h
50
............. высота 50% линии;
N ............... высота шума, т.е. разница между минимумом и максимумом 50 % линии,
измеренная в течение 1 минуты в линейной области.
Пределы: ≤ 0,2 %.
ДОЗАТОР
В качестве регулярных и целенаправленных испытаний ЖХ-дозатора предлагаются
проверки на прецизионность объема и перенос вещества из предыдущей пробы.
ПРЕЦИЗИОННОСТЬ ОБЪЕМА И ПЕРЕНОС ВЕЩЕСТВА ИЗ ПРЕДЫДУЩЕЙ
ПРОБЫ
Метод 1
Растворы:
Растворитель А: вода для хроматографии R : метанол R, (40 : 60 по объему);
Стандартный раствор (a): растворяют 15,0 мг метил- и 15,0 мг пропилпарабена в
растворителе A и доводят до 100,0 мл при помощи того же растворителя;
Стандартный раствор (b): доводят 1,0 мл стандартного раствора (a) до 10,0 мл
растворителя А.
Условия:
Колонка: Lichrospher 100 RP8, 5 мкм, 125 x 4 мм, без предколонки или эквивалентная;
Подвижная фаза: вода для хроматографии R : метанол R (40 : 60 по объему);
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Детектирование: 254 нм;
Объем вводимой пробы:
Для ВЭЖХ (с кюветой с коротким путем, например, 5 или 10 мм): 20 мкл
Для УВЭЖХ (с кюветой с коротким путем, например, 5 или 10 мм): 10 мкл
Для ВЭЖХ/СВЭЖХ (с кюветой с длинным путем, например, 60 или 85 мм): 2 мкл.
10/23
Методика:
Схема введения:
-
1 раз — растворитель A (введение холостого раствора 1),
-
6 раз — стандартный раствор (b),
-
1 раз — стандартный раствор (a),
-
1 раз — растворитель A (введение холостого раствора 2),
-
1 раз — стандартный раствор (b).
Пределы:
Сходимость площадей пиков: относительное стандартное отклонение площадей пиков
метилпарабена и пропилпарабена на хроматограммах шести последовательных введений
стандартного раствора (b) должно составлять ≤ 1,0 %.
Перенос вещества из предыдущей пробы: процентная доля площади пика,
соответствующего пропилпарабену при введении холостого раствора 2, не превышает 2 %
от площади пика для пика пропилпарабена на хроматограмме, полученной со
стандартным раствором (b), который ввели после введения холостого раствора 2, что
соответствует 0,2 %.
Метод 2
Растворы:
Стандартный раствор (a): 0,5 мг кофеина в 1 мл воды для хроматографии R,
Стандартный раствор (b): 50,0 мкг кофеина в 1 мл воды для хроматографии R.
Условия:
Колонка: RP-18 (30–150 x 2,1–4,6 мм; 5 мкм);
Подвижная фаза: вода для хроматографии R : ацетонитрил R (85 : 15 по объему);
Температурный режим: 40 °C;
Скорость потока: 1,0 мл/мин (скорость потока может быть снижена в зависимости от
диаметра колонки);
Детектирование: 273 нм;
Объем вводимой пробы:
Для ВЭЖХ (с кюветой с коротким путем, например, 5 или 10 мм): 20 мкл
Для УВЭЖХ (с кюветой с коротким путем, например, 5 или 10 мм): 10 мкл
Для ВЭЖХ/СВЭЖХ (с кюветой с длинным путем, например, 60 или 85 мм): 2 мкл.
Методика:
Схема введения:
-
1 раз — подвижная фаза (введение холостого раствора 1),
-
6 раз — Стандартный раствор (b),
-
1 раз — Стандартный раствор (a),
-
1 раз — подвижная фаза (введение холостого раствора 2),
-
1 раз — Стандартный раствор (b).
Пределы:
Прецизионность объема: относительное стандартное отклонение площадей пиков кофеина
на хроматограммах шести последовательных введений стандартного раствора (b) должно
составлять ≤ 1,0 %.
Перенос вещества из предыдущей пробы: процентная доля площади пика,
соответствующего кофеину на хроматограмме, полученной при введении холостого
раствора 2, не превышает 2 % от площади пика для пика кофеина на хроматограмме,
11/23
полученной для стандартного раствора (b), который ввели после введения холостого
раствора 2, что соответствует 0,2 %.
АВТОМАТИЧЕСКИЙ ДОЗАТОР
В рамках регулярных и целенаправленных проверок автодозатора ВЭЖХ можно
проверять термостатическую точность.
ТЕРМОСТАТИЧЕСКАЯ ТОЧНОСТЬ
Материалы:
Откалиброванный (электронный) термометр с подходящим датчиком.
Методика:
Выбирают температуру в рамках диапазона рабочих или требуемых температур
оборудования (т. е. может проверяться самая низкая, например, + 5 ºC, или обычно
используемая температура). Ждут, пока система не придет в равновесие.
С помощью откалиброванного термометра измеряют фактическую температуру в
автодозаторе и сравнивают ее с выбранной температурой. В качестве альтернативной
процедуры наполняют пробирку водой, ждут, пока система придет в равновесие, и
измеряют температуру этой воды подходящим датчиком. По возможности повторяют
измерение в нескольких точках автодозатора (картирование) согласно инструкциям
производителя.
Пределы:
Фактическая температура не должна отличаться от выбранной больше, чем на ± 3 °С.
ТЕРМОСТАТ ИЛИ ОХЛАДИТЕЛЬНЫЙ ПРИБОР
В данном примере регулярных и целенаправленных проверок термостата/ охладительного
прибора для ЖХ измеряют такие параметры как точность и стабильность
термостатирования.
ТОЧНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ ТЕРМОСТАТИРОВАНИЯ
Материалы:
Откалиброванный термометр.
Методика:
1) Температуру термостата колонки устанавливают на уровне 40 °С, ждут
приблизительно 30 минут, пока система не придет в равновесие, помещают
откалиброванный термометр внутрь термостата и 6 раз считывают температуру с
интервалом в 4 минуты.
2) В соответствующих случаях повторяют эту процедуру, настроив термостат /
охладительный прибор на другие рабочие температуры на основании рабочего
диапазона температур оборудования.
Точность рассчитывают как среднее 6 показаний температуры.
Пределы: ± 2 °C.
Стабильность проверяют, следуя такой же процедуре, как описана для точности.
12/23
Стабильность вычисляют для каждой температуры как разницу между самым высоким и
самым низким из шести полученных значений.
Пределы: ≤ 1 °C.
МНОГОВОЛНОВЫЙ ДЕТЕКТОР
В рамках регулярного и целенаправленного тестирования УФ-/видимого и ДМД-
детекторов проводят тестирование линейности, точности длины волны и дрейфа.
ЛИНЕЙНОСТЬ
Растворы:
Стд. 1: 0,5 мкг кофеина/мл,
Стд. 2: 1,0 мкг кофеина/мл,
Стд. 3: 5,0 мкг кофеина/мл,
Стд. 4: 25,0 мкг кофеина/мл,
Стд. 5: 50,0 мкг кофеина/мл,
Стд. 6: вода для хроматографии R (холостой раствор).
Например, готовят исходный раствор (стд. 0): взвешивают около 10,0 мг кофеина и
добавляют воду для хроматографии R, пока объем не составит 20,0 мл (растворяют с
помощью обработки ультразвуком или смешивают). Доводят раствор, следуя, например,
такой схеме:
Стд. 5: доводят 10,0 мл исходного раствора до 100,0 мл,
Стд. 4: доводят 5,0 мл исходного раствора до 100,0 мл,
Стд. 3: доводят 1,0 мл основного раствора до 100,0 мл,
Стд. 2: доводят 10,0 мл стд. 3 до 50,0 мл,
Стд. 1: доводят 10,0 мл стд. 3 до 100,0 мл.
Для растворения используют воду для хроматографии R.
Условия:
Колонка: подходящая колонка или капилляр (например, RP 18);
Подвижная фаза: ацетонитрил R : вода для хроматографии R (15 : 85 по объему);
Температурный режим термостата: 40 °C;
Скорость потока:
ВЭЖХ 1,0 мл/мин,
УВЭЖХ 0,5 мл/мин (или скорость потока, подходящая для этого на основании
спецификаций/эксплуатации прибора);
Детектирование: 273 нм;
Объем вводимой пробы:
Для ВЭЖХ (с кюветой с коротким путем, например, 5 или 10 мм): 20 мкл
Для УВЭЖХ (с кюветой с коротким путем, например, 5 или 10 мм): 10 мкл
Для ВЭЖХ/СВЭЖХ (с кюветой с длинным путем, например, 60 или 85 мм): 2 мкл
(или объем, подходящий для этого на основании спецификаций/эксплуатации
прибора).
Методика:
Схема введения:
2 раза — холостой раствор,
13/23
1 раз — стд. 1,
1 раз — стд. 2,
1 раз — стд. 3,
1 раз — стд. 4,
1 раз — стд. 5.
Пределы: r
2
≥ 0,9990.
Замечание: поскольку в данном испытании вводят разные исследуемые растворы, оно
также позволяет проверить правильность расположения пробирок в автоматическом
дозаторе.
ТОЧНОСТЬ ДЛИНЫ ВОЛНЫ
Если имеются встроенные процедуры для определения и корректировки точности длины
волны, то следуют инструкциям, изложенным в руководстве по использованию прибора
или предоставленным производителем.
Для прочих случаев используют приводимую ниже процедуру.
Растворы:
Кофеин стд. 5, из испытания на линейность.
Условия:
Используют условия работы, описываемые в разделе «Линейность», за исключением
условий детектирования.
Методика:
Вводят раствор кофеина и записывают спектр, сканируя область от 190 до 290 нм (по
возможности, с шагом приращения 1 нм).
Максимумы на 205 нм и 273 нм, минимум на 245 нм.
Пределы: ± 2 нм.
ДРЕЙФ
Обычно подтверждение дрейфа осуществляют с помощью встроенных методик
испытания. Следуют указаниям производителя/в инструкции прибора.
Пределы: в соответствии с указаниями производителя.
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ДЕТЕКТОР
Для регулярной и целенаправленной проверки работы флуоресцентного детектора для ЖХ
предлагаются три параметра:
ТОЧНОСТЬ ДЛИНЫ ВОЛНЫ (ВОЗБУЖДЕНИЕ)
Метод:
Ополаскивают и наполняют измерительную ячейку деионизированной водой.
Корректируют длину волны возбуждения до 350 нм и длину волны излучения до 397 нм.
Измеряют спектр излучения.
14/23
Пределы максимума возбуждения: 350 ± 3 нм.
ТОЧНОСТЬ ДЛИНЫ ВОЛНЫ (ИЗЛУЧЕНИЕ)
Метод:
Ополаскивают и наполняют измерительную ячейку деионизированной водой.
Корректируют длину волны возбуждения до 350 нм и длину волны излучения до 397 нм.
Измеряют спектр излучения.
Пределы максимума излучения: 397 ± 3 нм.
ОТНОШЕНИЕ СИГНАЛ/ШУМ
Метод:
Ополаскивают и наполняют измерительную ячейку деионизированной водой.
Задают длину волны возбуждения на 350 нм, а длину волны излучения на 397 нм.
Сигнал записывают в течение, в общей сложности, 23 минут. В 20 мин. 30 с. меняют
длину волны излучения на 450 нм.
Сигнал пика измеряют на длине волны максимального излучения рамановской полосы
спектра (т.е. 397 нм для возбуждения на 350 нм). Шум измеряют в области (450 нм), где
рамановский сигнал отсутствует.
Отношение сигнал/шум рассчитывают путем деления высоты рамановской полосы
спектра на шум.
Пределы: Отношение сигнал/шум: ≥ 400
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ДЕТЕКТОР
Различные производители предлагают электрохимические детекторы нескольких типов на
основании метода определения: амперометрии, кулонометрии или электропроводности.
Амперометрический детектор
ДРЕЙФ И ШУМ СИГНАЛА
Условия:
Потенциал проверочной ячейки: 800 мВ,
Фильтр времени нарастания сигнала: 0,1 с,
Диапазон: 0,1 нА,
Температура: 30 °C.
Методика:
Дрейф: измеряют силу тока и вычитают 2,67 нА (теоретическое значение).
Шум: измеряют шум в течение 5 минут.
Пределы:
Дрейф (ток ячейки): ≤ 8 пА/ч,
Шум сигнала: ≤ 2 пА или 20 мВ.
Встроенный амперометрический детектор
ДРЕЙФ И ШУМ СИГНАЛА
15/23
Шум сигнала: считывают сигнал каждую минуту.
Условия:
Давление: ≥ 1 000 psi;
Скорость потока: 1 мл/мин;
Капилляр для создания обратного давления: 150 см х 0,13 мм, ПЭЭК;
Колонка: CarboPac PA1 Guard;
Элюент: 50 мМ NaOH, отфильтрованного через нейлоновый фильтр с порами размером
0,2 мкм, дегазированного;
Настройки детектора: Форма волны «Аминокислоты» (pH, Ag, AgCl для сравнения);
Длительность/время анализа: 20 мин.
Пределы:
Дрейф: ≤ 1250 пКл/20 мин,
Шум сигнала: среднее (MW)
20 считываний
< 160 пКл.
ЛИНЕЙНОСТЬ
Растворы:
1, 2, 4, 8 и 10 мкМ треонина в воде для хроматографии R.
Условия:
Давление: ≥ 1 500 psi;
Скорость потока: 0,25 мл/мин;
Капилляр для создания обратного давления: 150 см х 0,13 мм, ПЭЭК;
Колонка: CarboPac PA1 Guard 2 мм;
Элюент: 50 мМ NaOH, отфильтрованного через нейлоновый фильтр с порами размером
0,2 мкм, дегазированного;
Настройки детектора: Форма волны «Аминокислоты» (pH, Ag, AgCl для сравнения);
Длительность/время анализа: 3 мин.
Объем вводимой пробы: 25 мкл
Пределы:
r² ≥ 0,999.
Детектор электропроводности
ШУМ И ДРЕЙФ
Очищенную воду пропускают через ячейку детектора со скоростью 1,0 мл/мин. Измеряют
шум нулевой линии в течение надлежащего периода.
Пределы:
Шум: ≤ 2 нСм
Дрейф: ≤ 20 нСм/ч
ЛИНЕЙНОСТЬ
Растворы:
5, 10, 25, 50 и 100 ppm нитрата в воде для хроматографии R.
Условия:
16/23
Колонка: петля обратного давления
Элюент: деионизированная вода
Скорость потока: 1,0 мл/мин
Пределы:
r² ≥ 0,999.
Кулонометрический детектор
Следуют указаниям производителя.
РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИЙ ДЕТЕКТОР
В рамках регулярной и целенаправленной проверки рефрактометрического детектора
предлагается проверка таких параметров, как отношение сигнал/шум, дрейф со временем
и линейность.
ОТНОШЕНИЕ СИГНАЛ/ШУМ
Метод 1
Растворы:
Раствор D-фруктозы с концентрацией 4,0 мг/мл (например, разводят 200,0 мг фруктозы в
20 мл воды для хроматографии R, прибавляют 25,0 ацетонитрила R и доводят до отметки
50,0 мл водой для хроматографии R).
Условия:
Колонка: Spherisorb NH
2
(250 x 4,6 мм, 5 мкм) или эквивалентная.
Температурный режим термостата: 38 °C,
Температура ячейки: 35 °С,
Скорость потока: 1,0 мл/мин,
Объем вводимой пробы: 20 мкл,
Подвижная фаза: 0,253 г натрия дигидрофосфата R в 220 мл воды для хроматографии R +
780 мл ацетонитрила R.
Методика:
После достижения равновесия трижды вводят холостой раствор подвижной фазы в
течение времени анализа, когда система стабильна. Измеряют шум нулевой линии в
течение надлежащего периода.
Значение шума нулевой линии приемлемо, если среднее значение высоты в трех
параллельных опытах < 1 000 мкВ.
Для расчета отношения сигнал/шум трижды вводят раствор фруктозы с концентрацией
0,4 мг/мл и рассчитывают среднее трех параллельных измерений.
Пределы: отношение сигнал/шум ≥ 10.
Метод 2
Растворы:
-
Стандартный раствор: 0,1 мг сахарозы на 1 мл воды для хроматографии R;
-
вода для хроматографии R (холостой раствор).
17/23
Условия:
Колонка: Atlantis dC18, 150 x 4,6 мм, 5 мкм (или эквивалентная);
Подвижная фаза: вода для хроматографии R;
Температурный режим термостата: 40 °C;
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Объем вводимой пробы: 10 мкл.
Методика:
После достижения равновесия трижды вводят холостой раствор подвижной фазы в
течение времени анализа, когда система стабильна. Измеряют шум нулевой линии в
течение надлежащего периода.
Для расчета отношения сигнал/шум трижды вводят стандартный раствор и рассчитывают
среднее двух параллельных измерений.
Пределы: отношение сигнал/шум ≥ 10.
ДРЕЙФ СО ВРЕМЕНЕМ
Методика:
Рассчитывают угол наклона амплитуды случайных вариаций сигнала детектора в
установленном диапазоне в течение заданного периода (например, 60 мин.).
Пределы: ± 0,1 мВ/мин.
Также пределы можно выразить в виде ∆ индекса рефракции/мин или в виде % от полного
масштаба выбранного диапазона, следуя спецификациям/методам производителя.
ЛИНЕЙНОСТЬ
Метод 1
Растворы:
Соответствующим образом разводят исходный раствор D-фруктозы с концентрацией
4,0 мг/мл, чтобы получить по меньшей мере 5 разведенных растворов, концентрация
которых варьирует от 0,4 до 2,0 мг/мл, например:
Стд 1: 2,0 мг D-фруктозы/мл
Стд 2: 1,6 мг D-фруктозы/мл
Стд 3: 1,2 мг D-фруктозы/мл
Стд 4: 0,8 мг D-фруктозы/мл
Стд 5: 0,4 мг D-фруктозы/мл
Для разведения используют воду для хроматографии R.
Условия:
Используют те же условия, что описаны для проверки отношения сигнал/шум.
Методика:
После достижения равновесия единожды вводят каждый из разведенных и холостой
растворы, начиная с наиболее разведенного. Интегрируют пики, соответствующие D-
фруктозе, и вычисляют линейность ответа с помощью модели линейной регрессии.
18/23
Пределы: r
2
≥ 0,9950.
Метод 2
Растворы:
Соответствующим образом разводят исходный раствор сахарозы для получения, к
примеру:
Стд. 1: 50,0 мг сахарозы/мл,
Стд. 2: 20,0 мг сахарозы/мл,
Стд. 3: 10,0 мг сахарозы/мл,
Стд. 4: 5,0 мг сахарозы/мл,
Стд. 5: 1,0 мг сахарозы/мл.
Для растворения используют воду для хроматографии R.
Условия:
Используют те же условия, что описаны в методе 2 для проверки отношения сигнал/шум.
Методика:
Следуют указаниям, приводимым в методике для метода 1. Интегрируют пик,
соответствующий сахарозе, и рассчитывают линейность ответа с помощью модели
линейной регрессии.
Пределы: r
2
≥ 0,9950.
ДЕТЕКТОР КРУГОВОГО ДИХРОИЗМА
В рамках регулярных и целенаправленных проверок ЖХ-детектора кругового дихроизма
предлагаются следующие испытания.
ЛИНЕЙНОСТЬ И ОТНОШЕНИЕ СИГНАЛ/ШУМ
Растворы:
Стандартный раствор (a): растворяют 25,0 мг D (-) пантолактона в 50,0 мл воды;
Стандартный раствор (b): доводят 2,0 мл стандартного раствора (a) до 10,0 мл;
Стандартный раствор (c): доводят 4,0 мл стандартного раствора (a) до 10,0 мл;
Стандартный раствор (d): доводят 6,0 мл стандартного раствора (a) до 10,0 мл;
Стандартный раствор (e): доводят 8,0 мл стандартного раствора (a) до 10,0 мл;
Стандартный раствор (f)): доводят 0,5 мл стандартного раствора (b) до 25,0 мл.
Для разведения используют воду для хроматографии R.
Условия:
Колонка: C18 (150 x 4,0 мм, 5мкм);
Подвижная фаза: ацетонитрил R : вода для хроматографии R (10 : 90 по объему);
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Детектирование: 225 нм;
Объем вводимой пробы: 20 мкл.
Методика:
Проверяют линейность КД- и УФ-сигнала стандартного раствора D(-) пантолактона (a),
(b), (c), (d), (e).
19/23
Измеряют шум КД сигнала стандартного раствора (f) в промежутке 0–10 мин.
рассчитывают абсолютную концентрацию (мкг) в ячейке,
рассчитывают отношение сигнал-шум (С/Ш) для 0,01 мкг в ячейке,
рассчитывают чувствительность с использованием расчетного С/Ш и указанного
С/Ш = 2 (0,01 х 2/ С/Ш
расчетный
).
Пределы:
Линейность: линейность калибровочной линии, полученной с использованием
стандартного раствора (a), (b), (c), (d), (e), должна соответствовать r
2
≥ 0,9950.
С/Ш: > 1,0.
ДРЕЙФ СО ВРЕМЕНЕМ
Условия:
Колонка: C18 (150 x 4,0 мм, 5 мкм);
Подвижная фаза: ацетонитрил R : вода для хроматографии R (10 : 90 по объему);
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Детектирование: 290 нм;
Объем вводимой пробы: 20 мкл.
Методика:
Вводят воду и через 5 минут останавливают поток. Измеряют КД-сигнал в течение 1 часа.
С помощью стрелки измеряют дрейф нулевой линии между 5-й и 65-й минутой.
Пределы:
≤ 0,1 мград/час.
СРАВНЕНИЕ СПЕКТРОВ
Растворы:
Стандартный раствор (а): растворяют 5,0 мг дексаметазона в 10,0 мл подвижной фазы.
Условия:
Колонка: C18 (150 x 4,0 мм, 5 мкм);
Подвижная фаза: ацетонитрил R : вода для хроматографии R (40 : 60 по объему);
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Детектирование: 230 нм;
Объем вводимой пробы: 20 мкл.
Методика:
Сравнивают максимумы/минимумы, полученные при установке детектора (см. таблицу).
макс КД
мин КД
макс УФ
222 нм
224 нм
236 нм
230 нм
252 нм
284 нм
Пределы:
Максимумы и минимумы не должны отличаться более чем на ± 4 нм.
ДЕТЕКТОР ЗАРЯЖЕННОГО АЭРОЗОЛЯ
В рамках регулярных и целенаправленных проверок детектора заряженного аэрозоля в
сочетании с прибором для ЖХ предлагаются следующие испытания.
20/23
ШУМ, САМЫЕ БОЛЬШИЕ СЛУЧАЙНЫЕ ПИКИ И ДРЕЙФ НУЛЕВОЙ ЛИНИИ
Условия:
Колонка: подходящая колонка или капилляр (например, RP 18);
Подвижная фаза: метанол R1 : вода для хроматографии R (20 : 80 по объему);
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Температура небулайзера: 25 °C;
Давление газа: 35 psi.
Методика:
Регистрируют нулевую линию в течение времени анализа, составляющего 30 минут.
Измеряют размах шума, наблюдаемый в промежутке, равном 5 минутам, который взят из
области хроматограммы, где нет случайных пиков, и из области хроматограммы,
соответствующей последним 15 минутам. Определяют дрейф нулевой линии,
наблюдаемый в последние 15 минут хроматограммы.
Пределы:
Шум нулевой линии: ≤ 0,04 пА (или 0,4 мВ);
Самый большой случайный пик: ≤ 0,2 пА (или 2 мВ);
Дрейф нулевой линии: ≤ 0,04 пА/мин (или 0,4 мВ/мин).
СХОДИМОСТЬ И СООТНОШЕНИЕ СИГНАЛ/ШУМ
Раствор:
25,0 мкг кофеина в 1,0 мл воды для хроматографии R.
Условия:
Колонка: Подходящая колонка или капилляр (например, RP 18);
Подвижная фаза: метанол R1 : вода для хроматографии R (20 : 80 по объему);
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Объем вводимой пробы: 10 мкл;
Температура небулайзера: 25 °C;
Давление газа: 35 psi.
Методика:
6 раз вводят раствор с концентрацией 25,0 мкг кофеина в 1 мл воды.
Пределы:
Сходимость площадей пиков: относительное стандартное отклонение площадей пиков
кофеина на хроматограммах, полученных со стандартным раствором, должно быть ≤ 10%.
Сигнал/шум ≥ 10.
КАЛИБРОВКА СИГНАЛА
Растворы:
Стд. 1: 25 мг/мл кофеина
Стд. 2: 125 мг/мл кофеина
Стд. 3: 250 мг/мл кофеина
Стд. 4: 500 мг/мл кофеина
Стд. 5: вода для хроматографии R.
21/23
Для разведения используют воду для хроматографии R.
Условия:
Используют те же условия, что описаны в разделе «Сходимость» и при проверке
отношения сигнал/шум.
Методика:
Схема введения:
1 раз — холостой раствор,
1 раз — стд. 1,
1 раз — стд. 2,
1 раз — стд. 3,
1 раз — стд. 4,
1 раз — холостой раствор.
Пределы: r
2
≥ 0,9990 (квадратическая регрессия).
ИСПАРИТЕЛЬНЫЙ ДЕТЕКТОР СВЕТОРАССЕЯНИЯ
В рамках регулярных и целенаправленных проверок испарительного детектора
светорассеяния предлагаются следующие испытания.
ШУМ И ДРЕЙФ НУЛЕВОЙ ЛИНИИ
Условия:
Шум или дрейф нулевой линии зависят от характеристик прибора, стабильности работы
электроники, энергии источника света и чувствительности трубки фотоумножителя
(усиления и используемого фильтра).
См. методику производителя в качестве справочного материала для этих параметров.
Пределы:
Средний шум по методу ASTM: ≤ 2 мВ,
Дрейф нулевой линии: ≤ 2,0 мВ/ч.
СХОДИМОСТЬ
Раствор:
250,0 мг/мл раствора кофеина в воде для хроматографии R.
Условия:
Входной капилляр: петля трубки, внеш. диам. 1/16”, внутр. диам. 0,005” x 200 см (для
обратного давления);
Подвижная фаза: вода для хроматографии R;
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Объем вводимой пробы: 20 мкл;
Температура дрейфовой трубки: 40 °C;
Давление газа: 3,5 бар (50 psi).
Методика:
6 раз вводят раствор кофеина с концентрацией 250,0 мкг/мл.
Пределы:
Сходимость площадей пиков: относительное стандартное отклонение площадей пиков
кофеина на хроматограммах, полученных с раствором кофеина, должно быть ≤ 3,0%.