Выделение и характеристика клеточных субстратов, используемых при производстве биотехнологических/биологических препаратов

Подробнее
Текстовая версия:

Выделение и характеристика клеточных субстратов, используемых при производстве биотехнологических/биологических препаратов

Введение

Клеточные субстраты – это клетки, используемые для производства биологического препарата. Для рекомбинантных белковых продуктов клеточный субстрат представляет собой произведенные клетки, несущие ген, который кодирует терапевтический белок. Производство продуктов, полученных из клеток млекопитающих (рекомбинантные белки, моноклональные антитела (mAb), вирусные вакцины, вирусные векторы, применяемые в генной терапии, и т.д.) невозможно реализовать без использования четко определенных и надлежащим образом охарактеризованных клеточных субстратов. Такие клеточные субстраты часто называют исходным материалом; они так же представляют собой наиболее важное средство, которым биотехнологическая компания может обладать. Таким образом, разработка, отбор, производство, испытание, описание и хранение клеточных субстратов представляют собой некоторые из наиболее важных и основных предпосылок для обеспечения производства высококачественных биопрепаратов, обладающих необходимой безопасностью, чистотой и эффективностью. В руководстве ICH Q5D [1] содержатся руководящие принципы для производителей биопрепаратов в отношении требований регуляторных органов относительно выделения, получения и определения характеристик клеточного субстрата. Действие настоящего руководства распространяется на клеточные субстраты, в отношении которых создана система банков клеток1.

Целью данной главы является изучение вопросов практического применения руководства Q5D с использованием клеток яичника китайского хомячка (СНО) в качестве образца. Изложенные принципы могут быть широко применимы к другим системам клетки-хозяина млекопитающих (многоклеточным организмам), и в значительной степени простейших, используемым в производстве рекомбинантных белков. Однако следует отметить, что клеточные субстраты простейших могут иметь определенные особенности, которые не являются общими для клеток млекопитающих и, следовательно, требуют дополнительных положений, выходящих за рамки настоящей главы. Тем не менее, изложенные в данной главе принципы могут распространяться на многие типы клеток.

Источник, история и получение клеточного субстрата

Начальная часть руководства Q5D содержит указания в отношении первичной документации, в которой описывается общая информация о клеточном субстрате, используемом для производства биологического препарата, а также о каждой родительской клеточной линии, из которой клеточный субстрат был выделен. Отсутствие достаточного объема данных может в результате привести к повышенной зависимости от других методов, используемых для характеристики клеточного субстрата.

Получение клеточной линии и предварительного главного банка клеток

Создание производственной клеточной линии состоит из нескольких этапов, которые могут включать:

Клетки-хозяина и родительская клеточная линия

Получение клеточного субстрата обычно начинается с отбора нетрансфицированной клетки-хозяина, так же известной как родительская клеточная линия. В случае производственной платформы на основе СНО, клеткой-хозяина/родительской клеточной линией может являться, в частности, CHODG44, CHO DXB11, CHOK1SV, CHOS, или линия клеток, полученная от одного из них. Поскольку первоначальные клетки-хозяина могут быть генетически гибкими, воздействие определенных условий роста с последующим клонированием клеток может осуществляться на уровне клетки-хозяина, чтобы отобрать клон клеток с определенными характеристиками роста и метаболизма. В то же время рекомендуется адаптация к условиям, не содержащим компоненты животного происхождения, или к химически определяемым условиям, с использованием базовой среды предприятия. В данном контексте базовая среда определяется как состав, который может использоваться для культивирования многочисленных линий клеток/клонов клеток от начальной клональной селекции до производства лекарственного препарата без необходимости замены базовой среды (тем не менее, возможно, потребуется оптимизация системы пополнения питательной среды для разных линий клеток, экспрессирующих разные молекулы). Клетки-хозяина с требуемыми характеристиками, полученные после клонирования и адаптации к среде для культивирования клеток, собирают, испытывают и хранят для будущих нужд. Клетки-хозяина должны иметь чётко определенный источник, документально оформленную историю культивирования клеток, описанный метод, первоначально использованный для выделения клеток, а так же должна быть предоставлена информация на наличие посторонних агентов.

Клеточная инженерия и технологии экспрессии белка

Количество рекомбинантного белка, экспрессируемого клеточной культурой, зависит от интеграла по времени от плотности жизнеспособных клеток (IVCD) и удельной продуктивности клеток. С целью повышения IVCD клеточная инженерия направлена на увеличение продолжительности жизни клеточной культуры, ускорение удельной скорости роста и повышение максимальной плотности жизнеспособных клеток. Удельная продуктивность клеток может изменяться в зависимости от конструирования вектора, экспрессионной платформы и клеточной инженерии [2].

Применяются различные программы клеточной инженерии, нацеленные на разнообразные клеточные функции клеток СНО, такие как апоптоз, аутофагия, пролиферация, регуляция клеточного цикла, фолдинг белка, секреция белка, получение метаболитов и IVCD.

Удельная продуктивность клеточной культуры может быть увеличена за счет модуляции транскрипционной активности. Как правило, этого добиваются с помощью векторной инженерии, модулирующей коэкспрессию генов, точность селективного маркёра, регуляторные элементы ДНК, переносимые на вектор, и локализацию сайта интеграции в геном клетки-хозяина. Доступны различные технологии экспрессии белка, основанные на конструировании трансфекции вектора и экспрессионной кассеты, а так же на векторном интегрировании. Например:

Специфической интеграции генома трансгена способствуют инструменты редактирования генома – нуклеаза на основе белков, содержащих домен «цинковые пальцы» (ZFN), эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции (TALEN), мегануклеазы, и короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами, связанные с эндонуклеазами (CRISPRCas). Подобные инструменты дают возможность редактировать (разрезать) молекулы ДНК клетки-хозяина в определенных участках, куда может быть встроен трансген. Полученный двухцепочечный разрыв ДНК в целевом генном локусе впоследствии репарируется путём котрансфекции трансгена с гомологичным участком в сайт расщепления. Это приводит к интеграции трансгена в сайт расщепления, нацеленный на нуклеазу, посредством гомологичного соединения концов [2, 3].

В настоящее время технологии создания линии клеток основаны либо на методе амплификации в присутствии метотрексата (MTX), впервые опробованного в 1980-х годах, либо на системе регуляции глутаминсинтетазы [4, 5]. Оба подхода используют специфическое действующее вещество для ингибирования селектируемого ферментного маркёра, необходимого для клеточного метаболизма. MTX ингибирует фермент дигидрофолатредуктазу (ДГФР) в амплификационной системе MTX, а метионинсульфоксимин (MSX) ингибирует фермент глутаминсинтетазы в системе регуляции глутаминсинтетазы. Дополнением к таким парам действующее вещество/фермент являются линии клеток, дефицитные в этих ферментах. Клеточная линия СНО, дефицитная в ДГФР, была создана в 1980-х годах, а дефицитные линии в глутаминсинтетазе были разработаны лишь недавно. После трансфекции векторами, содержащими экспрессионные кассеты для генов рекомбинантного белка и селективного маркёра, клетки отбирают для стабильных трансфектантов, и амплифицируют ген с помощью селективного действующего вещества, например, MTX или MSX. При MTX амплификация гена может быть выполнена путем наращивания объёмов селективного действующего вещества. В этом случае амплификация гена относится к увеличению числу копий рекомбинантного гена, обычно связанных с применением MTX. Продуктивность клональной линии можно увеличить путем амплификации целевого гена под действием возрастающих концентраций метотрексата.

Трансфекция

В контексте создания линии клеток, трансфекция представляет собой процесс введения требуемых чужеродных генов (трансгенов) в живые клетки для получения линии клеток, способной эффективно экспрессировать нужный белок. Трансфицированный генетический материал может находиться в клетке постоянно или временно в зависимости от ряда факторов. При стабильной трансфекции вводимый ген (трансген), интегрируется в геном клетки-хозяина, что приводит к устойчивой экспрессии трансгена даже после репликация клетки-хозяина. В то же время временно трансфицированный ген не интегрирован в геном клетки-хозяина, и поэтому белок экспрессируется в течение ограниченного периода времени. Временно экспрессируемый ген может быть потерян после последующих делений клеток.

Существует несколько методов трансфекции, и все они могут быть классифицированы на биологические, химические и физические методы.

В основе биологических методов лежит использование вирусов. Как правило, используется ретровирус (вирус лейкоза мышей) для достижения устойчивой экспрессии трансгена благодаря тому факту, что ретровирусы интегрируются в геном клетки-хозяина. Другими вирусами, используемыми в биологической трансфекции (трансдукции), являются простой герпес, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус коровьей оспы и вирус Синдбис. Вирус-опосредованная трансфекция обычно высокоэффективна. Однако недостатком применения вирусов является их ограниченная ёмкость. Кроме того, вирусы могут быть цитотоксичны для клеток, а также могут нарушать нормальную физиологию клеток. Ретровирусы случайным образом интегрируются в геном хозяина и могут повредить гены-супрессоры опухоли, активировать онкогены или нарушить функции нормальных генов клетки-хозяина [6].

Химические методы трансфекции являются самыми первыми методами трансфекции, и наиболее широко используемыми в наше время в исследованиях и разработках. Обычно применяются следующие химические вещества: катионные полимеры (диэтиламиноэтилдекстран, полибрен, полиэтиленимин), фосфат кальция, катионные липиды (липофектин, липофектамин, DOTAP, DOTMA) и катионные аминокислоты. Химические методы демонстрируют относительно хорошую эффективность трансфекции, низкую цитотоксичность, отсутствие мутагенеза и не имеют ограничений по ёмкости нуклеиновой кислоты/гена [6, 7].

Физические методы трансфекции основаны на использовании определенных инструментов для доставки требуемого гена в клетку. К методам относятся электропорация, микроинъекция, доставка частиц золота (биолистика) и лазерная трансфекция. Электропорация является наиболее используемым способом в силу своей простоты, надежности и быстроты, благодаря которому за короткое время можно трансфицировать большое количество клеток после оптимизации условий трансфекции [6, 7].

На эффективность трансфекции может повлиять множество факторов. Некоторые из них специфичны для клетки-мишени, а другиедля метода. Влияющими на трансфекцию факторами, связанными с клетками, являются плотность и размер клеток, состояние репликации, количество пассажей, состояние клеток, качество среды для культивирования клеток, концентрация трансгенов. Факторы, зависящие от метода, включают качество реагентов, лабораторные условия, концентрацию, pH, напряжение, ёмкость, и т.д.

Отбор стабильных высокопродуктивных популяций клеток

После трансфекции линии клеток-хозяев экспрессирующим вектором, содержащим необходимый ген или селективный маркёр, трансфицированные клетки культивируют в селективной культуральной среде (т.е. среде, содержащей селективные агенты для обеспечения пролиферации стабильных популяций). При амплификации гена концентрации селективного действующего вещества (например, MTX) можно постепенно увеличивать для получения более продуктивных клонов клеток. Популяции анализируют с точки зрения экспрессии необходимого белка, и наиболее продуктивные из них выделяют и клонируют для индивидуальной селекции клонов клеток. В качестве стратегии резервного хранения для каждой популяции может быть создан банк клеток для исследований с целью минимизации рисков, связанных с процессом разработки.

Анализ клеток после трансфекции

После любого процесса трансфекции следует оценить эффективность трансфекции и, в случае необходимости, воздействие на клетки. Анализ эффективности трансфекции может осуществляться таким же простым методом, как и подтверждение экспрессии гена. Однако во многих случаях оценка предполагает определение общего уровня экспрессии, например, количества трансфицированных клеток в популяции, и визуальное подтверждение экспрессированного белка. К способам анализа, используемым в этой связи, относятся следующие [8, 9]:

Выбор метода анализа основан на ряде факторов и зависит от конкретного применения. Для более тщательной оценки клона/популяции используют несколько методов анализа.

Клонирование и отбор высокопродуктивных стабильных клонов

Клонирование – это процесс выделения отдельных наиболее продуктивных стабильно трансфицированных клеток (моноклонов) из первичной наиболее продуктивной популяции клеток. Помимо того, что моноклональность является регуляторным требованием, существуют и другие причины для её обеспечения [2].

В результате случайной интеграции чужеродного гена и последующего разрушения генома путём механизма амплификации гена, популяции клеток, из которых получены клоны во время создания линии клеток, могут быть весьма гетерогенны, что приводит к широкому диапазону клеток с удельной продуктивностью и низкому проценту высокопродуктивных клеток. Следовательно, в ситуациях, когда высокая продуктивность рекомбинантного белка важна для коммерческой жизнеспособности продукта (например, для производства препаратов моноклональных антител), тысячи клонов могут быть подвергнуты анализу для получения набора производственных клонов. Процессу скрининга могут способствовать современные технологии и роботизация, однако создание линии клеток по-прежнему остается трудоемким и капиталоемким процессом, на завершение которого обычно требуется 6-12 месяцев.

Наиболее широко используемый метод клонирования включает два этапа клонирования методом лимитирующих разведений (LCD) в 96- или 360-луночных планшетах при степени разведения, достаточной для статистического прогнозирования моноклональности. С недавних пор некоторые регуляторные органы рекомендуют более надежное наглядное документальное подтверждение моноклональности (рисунок 1), поскольку метод LCD не может исключать дублетов «липких» клеток. Из нескольких сотен или даже тысяч проверенных клонов, как правило, отбирают и наращивают в колбах для культивирования 20-30 из каждой популяции. После дополнительной оценки роста, продуктивности и некоторых характеристик качества, отбирают субпопуляцию клонов (например, 6-10) для определения стабильности линии клеток. На основании этих данных выбираются клон-лидер и запасной клон (ы). Второй этап клонирования может быть произведен на лучшем продуценте с целью обеспечения лучшей моноклональности. Кроме того, может быть применен один этап клонирования с последующей визуализацией многолуночных планшетов в день 0 и последующие дни (рисунок 1). В ходе данного процесса можно выбрать клон с помощью метода SPR > 50 пг/клетка/день. Генетическая стабильность клона и секвенирование трансгена не составляют клональных свойств, хотя могут использоваться среди других способов анализа для описания выбранного клона.

Рисунок 1. Демонстрация моноклональности с использованием технологии визуализации многолуночного планшета. Изображения были сделаны в день 0 до и после посева клеток. Клетки инкубировали. Изображения лунок, которые, как представляется, содержат только один клон клеток, были исследованы относительно дня 0 с целью подтверждения моноклональности.
День 0. Предварительное сканирование: изображение до посева клеток. Планшет содержит только культуральную среду. В лунке есть повреждение, похожее на клетку, однако по факту это искажение изображения. День 0. После культивирования: размножившиеся клетки из одного клона. Все показанные изображения относятся к области лунки с ростом одного клона клетки. Полное изображение лунки используется для демонстрации того, что в остальной части лунки не существует никакой иной клетки или роста (не показано).

Важно отметить, что для определения производительности клонов по белку используются дополнительные этапы культивирования клеток и анализ титра белка (твердофазный иммуноферментный анализ ELISA или система Octet). Определенный прогресс в методах скрининга клонов может сократить время и объём работы, необходимые для определения и отбора редких высокопродуктивных клонов клеток. Несколько таких методов кратко рассматриваются в данном разделе [2].

Сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS) на основе скрининга

Сортировщики FACS могут одновременно с высокой скоростью (108/ч) контролировать уровни множественных длин волн флуоресценции, связанных с клеткой. Клетки, подлежащие анализу, поступают по отдельности в сортировщик FACS в виде движущегося узконаправленного потока и подвергаются воздействию одного или нескольких лазерных лучей. Результирующая флуоресценция от клетки измеряется соответствующими оптическими детекторами, а собранные данные количественно измеряются и анализируются. Затем прибор подает заряд заданной силы на каплю, несущую клетку, с целью ее сортировки в специальные пробирки для сбора или лунки планшетов. В зависимости от сигнала флуоресценции так же могут быть получены свойства клетки, такие как гранулярность и размер клетки. Однако точность FACS на основе скрининга клонов клетки-суперпродуцента зависит от флуоресцентного сигнала, который остается связанным с клеткой. Следовательно, он больше подходит для отбора клонов клетки-суперпродуцента, которые не секретируют рекомбинантный белок в культуральную среду или которые имеют белок-репортер на клеточной поверхности, коэкспрессируемый с требуемым рекомбинантным белком [2, 10, 11].

Автоматизированная система ClonePix

Автоматизированная система ClonePix анализирует больше клонов за наименьшее время по сравнению с общепринятыми методиками, выбирает клетки с оптимальным уровнем экспрессии и отбирает колонии с максимальной точностью [12]. Процесс в ClonePix начинается с культивирования отдельных клеток в полутвердой среде, что позволяет создавать отдельные колонии. Высокая вязкость питательной среды позволяет потомству отдельной клетки оставаться одной колонией, а также улавливать секретируемые рекомбинантные белки в непосредственной близости от секретирующих колоний. Эти секретируемые рекомбинантные белки захватываются меченными флуоресцином антителами, которые ранее были добавлены в полутвердую среду. При захвате экспрессированных рекомбинантных белков антителами, они размещаются вокруг клона секретирующей клетки в виде иммунопреципитата, и, следовательно, образуют ореол флуоресцентной структуры. Следовательно, клоны ранжируются в соответствии с интенсивностью флуоресценции структуры ореола. Затем производится забор клонов клетки-суперпродуцента, которые переносятся на новый многолуночный планшет для определения характеристик. Весь процесс визуализации 10,000 клонов клетки и отбора клонов клетки-суперпродуцента завершается в течение часа, и он требует осторожного подхода для выделения редких высокопродуктивных клонов, которые составляют всего 0,003 % клеточной популяции. В силу высокой пропускной способности данного метода система ClonePix использовалась в различных исследованиях для последовательного отбора клонов клетки-суперпродуцента, экспрессирующих ряд рекомбинантных белков и антител [2].

Как и в случае с неавтоматизированными методами клонирования, для обеспечения моноклональности производственной клеточной линии следует выполнить как минимум два этапа клонирования с использованием систем FACS и ClonePix.

Cell XpressTM

Система Cell XpressTM состоит из модуля ПО Cell XpressTM и платформы для анализа и обработки с лазерной поддержкой (LEAPTM), основанные на принципе лазерных технологий производства полупроводников. Преимущество платформы LEAPTM заключается в том, что она предназначена для работы с высокой пропускной способностью, и, следовательно, весь процесс скрининга полностью автоматизирован и роботизирован. Система Cell XpressTM сочетает в себе визуализацию живых клеток и лазерно-опосредованное управление клетками с целью определения и очистки клона клетки-суперпродуцента в лунке планшета. Многоцветная визуализация живых клеток системой Cell XpressTM достигается за счет одновременного использования реагентов для флуоресцентного детектирования, которые специфически связываются либо с клонами клеток, либо с экспрессированными рекомбинантными белками. Кроме того, лунки планшета покрыты матрицей захвата для обеспечения захвата in situ экспрессированных рекомбинантных белков, так как большинство рекомбинантных белков секретируется из клетки. Например, если экспрессируются терапевтические антитела, для захвата секретируемых антител обычно используется белок G. Посредством измерения интенсивности флуоресценции соответствующих проявляющих реагентов, каждая клетка в одной и той же лунке будет квалифицирована на основе количества секретируемого рекомбинантного белка. Таким образом, «лучшая» клетка в лунке будет определена как клон клетки-суперпродуцента. Затем начинается лазерно-опосредованная очистка клетки, при которой пучок лазерного излучения направляется на клоны клеток «низшего уровня» в той же самой лунке с помощью оптического прибора с большим детектором и управления гальванометром для индуцирования фотомеханического лизиса. Любая высокопродуктивная клетка останется в лунке для роста, а затем будет перенесена в большую лунку для размножения [2].

Оценка клонов и создание банка

При выделении большого количества высокопродуктивных клонов, первичную оценку выбранных клонов позволит провести размножение клонов в колбе для культивирования. Клетки оценивают по их особенностям роста, коэффициенту использования питательной среды, образованию метаболитов, времени удвоения, размеру, морфологии, жизнеспособности, апоптозу и экспрессии белка. Секвенирование трансгена и стабильность клеточной линии также могут быть оценены на этой стадии. Клеточный рост, продуктивность, качество продукта и генетическая стабильность, продемонстрированные для определенного числа репликаций, необходимы для товарного производства. В заключение, если ранее не предпринимались попытки адаптации клона в новой среде для культивирования с химически определенным составом или в среде, не содержащей компоненты животного происхождения, то это можно сделать на данном этапе. Результатом оценки является сортировка и отбор клонов с наиболее желаемыми характеристиками в заданных условиях культивирования.

Предварительный банк клеток, как правило, формируется из раннего пассажа. Он служит в качестве исходного банка для размножения для банка клеток для производства. Предварительные банки клеток сначала подвергаются испытанию на чистоту, чтобы гарантировать отсутствие занесенных агентов (бактерий, вирусов и микоплазмы).

Формирование банков клеток

Регуляторное требование заключается в том, что перевиваемую клеточную линию, используемую для производства биопрепаратов, необходимо хранить в банке. Поэтому в руководстве Q5D подробно рассматриваются двухуровневая структура банка клеток и принципы, лежащие в основе определения параметров и испытаний банков клеток. Банки клеток, соответствующие стандартам GMP, включают в себя ГБК (главный банк клеток) и один или несколько РБК (рабочих банков клеток). Их получают в соответствии с принципами GMP, подвергают испытаниям и хранят (криоконсервированными) до дальнейшего использования в производстве.

Вопросы к рассмотрению при исследовании и создании клеточного субстрата

Создание клеточных субстратов, от конструирования начального вектора и выбора клетки-хозяина до формирования банков клеток, крайне трудоёмка. Эта деятельность требует специальных технических знаний, оборудования, а так же обширного набора реактивов и сырья. Для обеспечения стабильного производства продукции высокого качества и соответствия действующим регуляторным нормам, крайне важно выполнять высококачественную и документально подтвержденную работу на протяжении всего процесса. Особое внимание следует уделить минимизации риска, связанного с занесением случайных агентов, особенно вирусов и микоплазмы. Эти агенты могут сохраняться в клетках в качестве скрытых загрязняющих веществ, которые зачастую трудно обнаружить с помощью стандартных испытаний. Случайные агенты могут заноситься через загрязненное сырье и реактивы или операторами лаборатории/производственной средой. Поэтому важно внедрить эффективные средства контроля, такие как отбор высококачественного и безопасного сырья и реактивов, применение надлежащей лабораторной практики (GLP) и асептических лабораторных методов, надлежащим образом очищенное и продезинфицированное оборудование и рабочие зоны, а также задействовать только опытный персонал.

Сырьё и реактивы должны поставляться от надёжных поставщиков с сопроводительными сертификатами и протоколами. Следует отказаться от использования веществ человеческого и животного происхождения на самых ранних этапах создания линии клеток и клеточной адаптации. Прослеживаемость и происхождение клеточных субстратов имеют важное значение, и должны быть надлежащим образом задокументированы. Вся документация, связанная с конструированием экспрессионного вектора, клеткой-хозяина, трансфекцией, размножением, аналитической оценкой, созданием банка клеток и сырьем, используемым на протяжении всего процесса, должна быть чётко определена, детализирована и проста для извлечения, поскольку каждый клеточный субстрат требует утверждения регуляторного органа.

Так же на определенных этапах (например, на этапе предварительного банка клеток) должна выполняться оценка риска перекрёстной контаминации и определение уровня испытания биологической безопасности, специфичного для каждого клеточного субстрата до создания банка, соответствующего стандартам GMP.

Характеристика банка клеток

Характеристика клеточной линии рассматривается как главный компонент обеспечения качества и безопасности продукта, и эта тема подробно обсуждается в Q5D.

Установление характеристик банков клеток происходит на нескольких этапах, а именно: родительские клетки, предварительный банк клеток, ГБК, РБК и клеточный материал на конечном этапе производственного цикла. Вид и масштаб испытания зависит от вида банка клеток и использования материалов животного происхождения. Банки клеток, соответствующие стандартам GMP (ГБК, РБК, клеточный материал на конечном этапе производственного цикла) должны подвергаться испытаниям на подлинность, чистоту, кариологию, канцерогенность/онкогенность и генетическую стабильность.

Испытания на подлинность

Чтобы удостовериться в подлинности клеток в банке клеток, необходимо провести соответствующие испытания. При проверке подлинности могут быть оценены как фенотипические, так и генотипические характеристики, которые были установлены при разработке препарата. Испытания на подлинность обычно проводятся в отношении ГБК. Кроме того, ограниченный объем испытаний на подлинность, как правило, проводится в отношении каждого РБК. Раньше для подтверждения происхождения клеточных линий человеческого или животного происхождения было достаточно проведения изоферментного анализа. Теперь же изоферментный анализ заменяют более современные методы испытаний – баркодирование митохондриальной цитохромоксидазы I (CO1) (для клеток животных) и анализ короткой тандемной дупликации (STR) (для клеток человека) [13]. Они отвечают нормативным рекомендациям в отношении того, что «при установлении характеристики клеточного субстрата и проведении испытаний производителям рекомендуется использовать современные методы и технологические достижения (при их доступности), при условии, что специфичность, чувствительность и прецизионность новых методов, по крайней мере, эквивалентна таковым параметрам существующих методов» [1]. Демонстрация специфических клеточных маркёров, уникальных маркёров, экспрессии требуемого продукта, цитогенетический анализ, ДНК-фингерпринтинг и анализ точечного нуклеотидного полиморфизма так же являются методами испытания на подлинность.

Испытания на чистоту

Чистота клеточных субстратов определяется как отсутствие других типов клеток и занесенных микробных агентов (бактерий, грибов, микоплазмы и вирусов). Перекрёстная контаминация одной клеточной линии с другим типом клеток хоть и редко встречается при современных методах, однако всё же может произойти при определенных обстоятельствах [14]. Испытания клеточной линии на подлинность способны гарантировать отсутствие других типов клеток.

Клеточные культуры подвержены контаминации случайными микробными и вирусными агентами. Риск контаминации является не абстрактной проблемой – в ряде случаев были обнаружены вирусные контаминации во время производства биопрепаратов [15-23]. Загрязняющие вещества могут быть связаны с самими клеточными субстратами (например, эндогенный ретровирус) или могут быть непреднамеренно введены во время создания линии клеток и обработки клеточной культуры посредством использования загрязненных реактивов, сырья или несоблюдения надлежащей лабораторной практики или GMP. Клетки ЯКХ известны своей способностью производить эндогенные, неинфекционные ретровирусные частицы [24]. Контаминация процессов производства клеточной культуры ЯКХ занесенными агентами так же была документально зафиксирована. Было доказано, что клетки ЯКХ пермиссивны/чувствительны к вирусам, по крайней мере, к 11 семействам вирусов, включая парвовирусы (мелкий мышиный вирус), реовирусы (вирус эпизоотической геморрагической болезни), калицивирусы (везивирус 2117), буньявирусыирус долины Кэш), пикорнавирусы (вирус энцефаломиокардита) и многие другие [21].

Должно быть продемонстрировано, что банки клеток, предназначенные для использования в производстве биопрепаратов по стандартам GMP, не содержат вирусов, бактерий, грибов, микоплазм и других типов микробных клеток. Применяются довольно специфические методы обнаружения занесенных агентов, которые подробно описаны в руководстве ICH Q5A (R1) [25] (см. главу 10). В таблице 2 представлена общая обзорная информация об испытании на занесенные агенты с использованием клеточной культуры ЯКХ в качестве образца. Более подробная информация об испытании содержится в ICH Q5A(R1), в серии технических докладов ВОЗ 878, Приложении 3 [29] и в руководстве EMA по оценке вирусной безопасности биотехнологических исследуемых препаратов [30]. Просьба учесть, что в ICH Q5D непосредственно не содержатся требования к испытанию родительских клеток и предварительному банку клеток. Испытание предварительного банка клеток, отображенное в таблице 2, рекомендовано автором.

Кариология, туморогенность и онкогенность

Для высокоочищенных и не содержащих клеток (например, моноклональные антитела) лекарственных препаратов кариологический анализ и исследование туморогенности, как правило, не требуются при условии, что соответствующие предельные значения для остаточной ДНК клетки-хозяина последовательно соблюдаются либо в ходе исследований по валидации процесса, либо в ходе испытания при выпуске партии. Нет необходимости проводить кариологический анализ клеточных линий грызунов, не относящихся к диплоидным. Если для производства препаратов используются генетически немодифицированные клетки MRC-5 или WI-38, нет необходимости характеризовать клеточные субстраты по кариологическим или туморогенным параметрам, поскольку эти клеточные линии достаточно охарактеризованы и результаты опубликованы. Тем не менее для каждого созданного РБК MRC-5 и WI-38 производители должны один раз подтвердить, что клетки, полученные при культивировании в условиях, аналогичных планируемому к использованию в производстве, являются диплоидными и имеют ожидаемую продолжительность жизни. Для новых или ранее не охарактеризованных субстратов диплоидных клеток должно быть представлено подтверждение диплоидного кариотипа, а туморогенность должна быть установлена с использованием клеток из ГБК.

Туморогенность ― способность клеток образовывать опухоли у чувствительных животных в месте введения. Эти опухоли возникают из инокулированного клеточного субстрата и происходят из тех же клеток, что и клеточный субстрат. Несмотря на доступность анализов in vitro, испытания in vivo по-прежнему являются типовыми для исследования туморогенности. Клетки из ГБК или РБК, размноженные до предполагаемого возраста клеток in vitro, используемые для производства или в качестве клеточного материала на конечном этапе производственного цикла, должны быть исследованы на туморогенность. Дополнительная дупликация популяции гарантирует, что результаты исследования туморогенности могут быть использованы при общей оценке безопасности продукта даже в условиях «наихудшего случая», и, следовательно, обеспечивает профиль безопасности.

Изучение туморогенности в системе in vivo на бестимусных мышах. Подкожно или внутримышечно 10 бестимусным мышам (генотип nu/nu) в возрасте 4-7 недель вводят исследуемую клеточную линию или контрольные клетки. Животных обследуют ежедневно путем пальпации в течение минимум 4 месяцев для выявления образования опухоли в месте инокуляции клеток или в других местах (метастазирование), что указывает на туморогенность клеточного субстрата.

Таблица 2. Исследование банка клеток на наличие занесенных агентов на примере клетки-продуцента ЯКХ.

Анализ

Цель анализа

Предварительный БК (предлагаемый минимальный анализ)

ГБК

РБК

Клетки в пределах возраста in vitro

Микробиологические испытания

Стерильность

Выявление бактериальных и грибковых агентов

Да

Да

Да

Да

Микоплазмы

Выявление занесенных микоплазм

Да

Да

Да

Да

Испытания на занесенные вирусы

Анализ in vitro

Выявление занесенных вирусов в системах клеточных культур

Да

Да

Да

Да

Анализ in vivo

Выявление занесенных вирусов на нескольких животных моделей

Нет

Да

Нет

Да

Испытания на ретровирусы

Электронная микроскопия

Визуализация и подсчёт вирусоподобных частиц

Да

Да

Нет

Да

Обратная транскриптаза (ОТ)

Выявление ретровирусного фермента – ОТ

Нет

Да

Нет

Да

Инфекционность

Выявление инфекционных ретровирусов

Нет

Да

Нет

Да

Видоспецифичные испытания на вирусы

HAP

Определение антител к специфическим вирусам у хомяков после введения исследуемого препарата

Нет

Да

Нет

Нет

MAP

Определение антител к специфическим вирусам у мышей после введения исследуемого препарата

Нет

Да

Нет

Нет

Вирус свиней [1]

Выявление вирусов свиней

Нет

По необходимости

По необходимости

По необходимости

Вирусы крупного рогатого скота [2]

Выявление вирусов крупного рогатого скота

Нет

По необходимости

По необходимости

По необходимости

Определение иных вирусов

Мелкий вирус мышей

Несмотря на то, что выявление данных и дополнительных вирусов не требуется ICH Q5A и ICH Q5D, решение об их проведении определяется на основе оценки риска, характерной для каждого клеточного субстрата, учитывая происхождение, источник, сырьё животного происхождения, историю культуры клеток (см. также главу 14)

Везивирус 2117

Вирус лимфоцитарного хориоменингита

Введение испытаний на другие видоспецифические агенты следует рассматривать на индивидуальной основе в зависимости от происхождения клеток и применяемого производственного процесса. Также следует рассмотреть возможность использования секвенирования следующего поколения для испытания и описание характеристик клеточного субстрата.

Полиомавирус крупного рогатого скота

Цирковирус свиней 1/2

Парвовирус крупного рогатого скота 2/3

Другие специфические агенты

Испытания на вирусы свиней и крупного рогатого скота проводятся в тех случаях, если при создании и производстве клеточных субстратов используются компоненты животного происхождения [1, 2]. Для таких производных материалов разрабатываются методы испытаний в соответствии с руководствами 9 CFR [26] и EMA [27, 28]. Поскольку данные методы имеют определенные ограничения, некоторые вирусы могут быть не обнаружены, поэтому следует рассмотреть дополнительные подходы для обеспечения безопасности банков клеток. Действующее руководство EMA по использованию бычьей сыворотки [27] в производстве лекарственных препаратов для медицинского применения предусматривает, что «поставщики сыворотки и потребители должны быть информированы о появлении вирусов крупного рогатого скота и должны предлагать проводить соответствующее расследование на наличие таких агентов в бычьей сыворотке и принимать надлежащие меры по устранению или ограничению присутствия любого нового вируса в сыворотке».

Изучение туморогенности in vitro

Данное исследование основано на способности трансформированных клеток оставаться жизнеспособными и образовывать колонии при суспендировании в мягкой агарозе в силу уменьшенной потребности в межклеточной адгезии или адгезии клеток к субстрату для их пролиферации. Проявление данного свойства в мягком агаре является важным методом оценки потенциала образования опухоли у клеточного субстрата. В данном анализе серийные разведения испытуемых и контрольных клеток инокулируют в предварительно подготовленную агар-клеточную культуральную среду. Клетки инкубируют в течение 4 недель, регулярно исследуя под микроскопом видимые колонии из более чем 10 клеток, что будет указывать на туморогенность клеточного субстрата.

Изучение онкогенных свойств in vivo

Исследование онкогенных свойств выполняется на ГБК. Испытание проводят на новорожденных бестимусных мышах (не старше 3 дней), новорожденных крысах и хомяках. В то время как количество экспериментальных животных в испытании на туморогенность может составлять 10 на группу, количество в испытании на онкогенность должно быть больше в силу низкой ожидаемой частоты опухолей. Животных обследуют ежедневно путем пальпации в течение минимум 4 месяцев для выявления образования опухоли в месте инокуляции клеток или в других местах (метастазирование), что указывает на туморогенность клеточного субстрата.

Методы кариологического анализа и оценки туморогенности содержатся в документе ВОЗ «Требования к использованию клеток животных в качестве субстратов in vitro для производства биологических препаратов» [29].

Оценка генетической стабильности

Определение стабильности клеточного субстрата внесено в ICH Q5D и далее рассматривается в ICH Q5B [31] (глава 11). Любая форма генетической нестабильности может отразиться на качестве конечного продукта, поэтому важно знать, изменяются ли клетки в культуре таким образом, что это может повлиять на свойства или безопасность экспрессируемого продукта. Специфические испытания будут варьироваться в зависимости от свойств продукта, но в целом цель состоит в том, чтобы показать последовательность в количестве и характеристиках трансгена, полученного из клеток нескольких пассажей ГБК или РБК, с теми, которые получены из клеточного материала на конечном этапе производственного цикла. В случае с рекомбинантными белковыми продуктами основное внимание будет уделяться последовательности белка и посттрансляционным модификациям. Для клеточных линий, содержащих экспрессионные конструкции ДНК, определяется стабильность этих конструкций между ГБК/РБК/клеточным материалом на конечном этапе производственного цикла. Для испытания стабильности имеется несколько методов анализа. Более подробно об этом говорится в ICH Q5B [31] (глава 11):

Начальный рост и стабильность продуктивности (за пределами клеточного возраста in vitro для производства) как правило, оцениваются с использованием маломасштабных моделей в самом начале процесса создания во время отбора клонов. Рост и стабильность производства имеют важное значение для экономики процесса и его устойчивости. Однако, с регуляторной точки зрения, стабильное производство относится к способности сохранять подлинность белка, экспрессируемого клеткой-продуцентом. Чтобы продемонстрировать пригодность клеточного субстрата для производственного процесса, следует оценить, по крайней мере, две временные точки: при использовании клеток с минимальным числом удвоения популяции и при использовании клеток с предельным для производства клеточным возрастом in vitro или выходящие за рамки предельного возраста. Для демонстрации целостности конструкции и выявления возможных изменений в числе копий, уровне синтеза иРНК, сайте векторной интеграции с увеличением возраста клеток используются биохимические анализы (пептидное картирование, времяпролётная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы, масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией, ДНС-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование, активность белка или количественный анализ продукта) и методы генетических исследований (секвенирование, нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг и др.).

Краткие выводы

Положения, содержащиеся в ICH Q5D, необходимы для производителей, намеревающихся ввести новую молекулу в клинические исследования. Прежде чем рассматривать вопрос о создании клеток-продуцентов, следует тщательно изучить все требования, сформулированные в настоящем руководстве. Гораздо сложнее соответствовать требованиям к документации и снизить риск контаминации занесенными агентами, сосредоточившись на этих аспектах только к концу процесса формирования клеток-продуцентов. Новые аналитические технологии, возможно, помогут устранить сомнения относительно клеточных линий с неточностями в документации. Например, секвенирование следующего поколения применительно к испытанию клеточных линий на чистоту позволяет обнаруживать неизвестные вирусные и микоплазменные загрязнения, которые могут присутствовать в банке клеток в результате воздействия загрязненного сырья. Более новые технологии идентификации клеток, такие как STR-профилирование, могут распознавать клетки человека на уровне отдельного донора, а технологии распознавания клеток животных (например, CO1-баркодирование) имеют гораздо большую специфичность по сравнению с традиционными методами. Стратегии создания клеточной инженерии позволили получить клеточные субстраты с гораздо большей производительностью, а совершенствование технологии клонирования значительно облегчает обеспечение моноклональности клетки-продуцента.

Список литературы


Руководство по качеству ICH: Руководство по внедрению, Первое издание. Под редакцией Andrew Teasdale, David Elder, and Raymond W. Nims. © 2018 John Wiley & Sons, Inc. Published 2018 by John Wiley & Sons, Inc.