Бактериальные вакцины

Подробнее
Текстовая версия:

ВАКЦИНЫ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ВАКЦИНЫ

ВВЕДЕНИЕ

Общая информация о вакцинах для медицинского применения содержится в монографии «Вакцины для медицинского применения – Общие подходы» 1235. Бактериальные вакцины могут быть получены из цельных клеток, убитых или аттенуированных в их способности вызывать заболевание, или из какого-либо компонента (-ов) интактной клетки, которые важны для вирулентности или повреждения клеток хозяина. Другой разновидностью бактериальных вакцин, полученных из токсинов, являются токсоиды. Бактериальные вакцины могут представлять собой смесь компонентов из разных видов, штаммов или серотипов одного и того же вида, или из разных компонентов клеток одного и того же вида. Простейшие бактериальные вакцины состоят из очищенных капсульных полисахаридов (CPS), взятых с наружного слоя клеточной мембраны таких организмов, как Сальмонелла энтерика серовар Тифи (Salmonella enterica serovar Typhi), различных менингококковых серологических групп или серотипов пневмококка, вызывающих менингит, средний отит, острые респираторные инфекции и пневмонию. Несмотря на то, что тифозные вакцины состоят из одного полисахарида, менингококковые вакцины содержат до четырех серогрупп CPS, а пневмококковая вакцина содержит 23 серотипа. Иммунологическая реакция на менингококковые и пневмококковые полисахариды, а так же на капсульный полисахарид из Гемофильной палочки типа b, улучшается путем ковалентного присоединения CPS или полученного из него олигосахарида, к подходящему белку-носителю. Иммунный ответ на введение таких гликоконъюгатных вакцин устанавливается с помощью механизмов, отличных от тех, которые активируются очищенными полисахаридами, в результате чего следует Т-зависимый ответ и формируется иммунологическая память. Белки-носители обычно представляют собой бактериальные токсоиды или везикулы наружной мембраны белка бактерий, но так же могут иметь и другое происхождение. Для данных продуктов анти-CPS антитела предоставляют достаточную защиту от заболеваний, несмотря на то, что гликоконъюгатные вакцины так же могут снизить распространение организмов в носоглотке. Из-за трудоемкого процесса производства гликоконъюгатные вакцинные препараты, как правило, содержат меньшее количество компонентов серотипа или серогруппы, чем очищенные полисахаридные вакцины. Многие бактериальные патогены, в том числе вызывающие дифтерию и столбняк, производят токсины, обладающие способностью к разрушению тканей. . Иммунологическая нейтрализация этих токсинов является достаточной мерой для предотвращения заболевания. Эти субъединичные вакцины состоят из химически детоксифицированных токсинов (токсоидов), очищенных от супернатанта клеточной культуры, и способных вызывать формирование нейтрализующих антител против нативного токсина. Могут разрабатываться и другие типы очищенных субъединиц и процессы очистки.

Несмотря на то, что раньше противококлюшнаые вакцины состояли из бесчисленных химически инактивированных цельноклеточных и токсиновых компонентов, нынешние бесклеточные препараты содержат различные сочетания специальных синтетических белков, иногда токсоидов (например, фимбрии или другие компоненты белков клеточной поверхности). По сравнению с прежними препаратами, эти вакцины несомненно обеспечивают защиту другим способом, но имеют меньшее число случаев нежелательных явлений. Комбинация дифтерийного и столбнячного токсоидов и бесклеточная противококлюшная вакцина составляют базовые компоненты поливалентных комбинированных вакцин для детей и взрослых. К ним так же могут быть добавлены гликоконъюгат гемофильной палочки, гепатит B, и/или инактивированные иммуногены полиовируса. Живые аттенуированные бактериальные вакцины в настоящее время ограничиваются Бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ), которая защищает от туберкулеза при введении через кожу, а так же конструкцией S. typhi Ty21a, представляющей собой вакцину от брюшного тифа для перорального введения. Иммунный ответ на бактериальный полисахарид и белковые антигены может быть более выраженным за счет включения адъювантов. Основной адъювант, лицензированный в США, основан на таких солях алюминия, как гидроксид алюминия и фосфат алюминия, хотя разработка новых адъювантов является активной областью исследований.

ИСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Исходные материалы могут непосредственно влиять на подлинность, активность, чистоту и качество бактериальных вакцин. Корректный процесс изготовления в значительной мере зависит от использования соответствующих исходных материалов (например, на этапах создания банков клеток, культивирования, сбора выросших в культуре клеток, очистки и получения лекарственной формы; см. Вакцины для медицинского применения – Общие подходы 1235). Исходные материалы для питательных сред размножения бактерий могут состоять как из четко определенных химических веществ (аминокислот, углеводов, витаминов, минералов), так и из более сложных компонентов (белковых гидролизатов, дрожжевых экстрактов, пептонов). Производители должны учитывать источник каждого из этих исходных материалов для обеспечения гарантии того, что они поступают от надежных изготовителей, придерживающихся стандартов качества GMP, а так же могут обеспечить долгосрочную поставку. Производители лекарственных средств и изготовители исходных материалов должны друг с другом взаимодействовать, чтобы избежать каких-либо изменений в источнике или производстве компонентов, а так же дефицита поставок. Отсутствие подобных коммуникаций может неблагоприятно сказаться на непрерывности культивирования и поставке вакцин. Однородность исходных материалов особенно важна для сложных компонентов культивирования, таких как дрожжевой экстракт или пептоны, в отношении которых изменения могут трудно поддаваться обнаружению, но которые могут напрямую сказываться на процессе культивирования.

Необходимо давать точное указание состава и источника питательных сред, используемых в ходе создания банков клеток и культивирования, а также критериев для выпуска сырья и готовых компонентов. Производители должны определить, имеют ли их исходные материалы животное происхождение. Если вспомогательные вещества животного происхождения добавляются в культуральную среду, они должны быть сертифицированы на отсутствие примесей и занесенных агентов, например, вызывающих губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота или трансмиссивную губчатообразную энцефалопатию. Изготовители/производители должны предоставлять информацию о подлинности и источнике вспомогательных веществ, и проверять наличие занесенных агентов. Использование антибиотиков должно быть минимальным или исключено во избежание попадания нежелательных антибиотиков в состав лекарственного препарата, если только они не используются в производстве преднамеренно (например, в качестве селективных маркеров). По мере того, как производители расширяют объем культивирования до производства пилотных партий вакцин (т.е. объем такого производства превышает промышленный масштаб не более чем в 10 раз), они так же должны по мере возможности обеспечить наличие нескольких источников для всех исходных материалов. Это будет гарантией того, что нестабильность работы отдельного поставщика не станет ограничивающим фактором в производстве вакцин.

БАНКИ КЛЕТОК

Источник и история

Используемый в банке клеток источник клеток должен быть задокументирован. Данные об исходном изоляте по возможности должны включать: возраст, пол и биологический вид донора; анамнез донора; и историю культуры, включая методы, используемые для выделения субстрата бактерий, если таковые имеются. Должен быть указан источник клеток, из которого получен штамм, а так же соответствующая справочная информация из научной литературы. Источник должен вырабатывать достаточное количество антигена(-ов) для удовлетворения медицинских потребностей. Предпочтительной является информация, полученная напрямую от исходной лаборатории. Когда это не может быть обеспечено, используется справочная литература для представления классификации бактерий (рода, вида, обозначения штамма) и фенотипических и/или генотипических признаков. Для таких микробных экспрессирующих систем, как кишечная палочка (E. Coli) или пневмококк (S. Pneumoniae), производитель должен описать метод, используемый для получения ДНК, кодирующей белок, включая клетку и происхождение исходной нуклеиновой кислоты. Культивирование, проводимое с использованием исходного изолята, должно быть задокументировано, и, по мере необходимости, данные должны включать информацию об используемом для субкультуры методе, любом использовании вещества животного происхождения, данные о пересевах и условиях хранения. Должны быть описаны компоненты культуральной среды, в том числе такие вещества человеческого или животного происхождения, как сыворотка крови, ферменты, гидролизаты или другие живые клетки.

Для микробных экспрессирующих систем должны быть подробно описаны этапы сборки экспрессирующей конструкции. Описание должно включать источник и функцию составных частей экспрессирующей конструкции (например, точки начала репликации, гены устойчивости к антибиотикам, промоторы, энхансеры, вне зависимости от того, синтезируется белок в виде слитого белка, или нет). Производители должны предоставить карты расщепления рестрикционной эндонуклеазы, которые иллюстрируют сайты, используемые при подготовке экспрессирующей конструкции, и сайты, используемые при определении фрагментов ДНК.

Должен быть выполнен анализ полной нуклеотидной последовательности кодирующего участка экспрессирующей конструкции исследуемого белка. Следует использовать метод секвенирования содержащий полную аннотацию, определяющую все важные особенности секвенирования. Необходимо определить число копий и физическое состояние экспрессирующей конструкции.

Генеалогия

Подготовка клеточной линии может быть представлена в виде карты производственного процесса, исходной точкой которого является источник клеточных линий, затем следуют предварительные банки клеток (или процесс создания банков клеток, в зависимости от того, что актуально), и конечным пунктом процесса являются Главный банк клеток (ГБК) и Рабочий банк клеток (РБК). Производители должны описать свою стратегию оказания непрерывной поставки клеток из своего банка(-ов) клеток, включая объем партии и предполагаемую частоту использования банка(-ов) клеток для производства, ожидаемые интервалы между созданием новых банков клеток, и показатели, по которым аттестуют банк(-и) клеток. Если для клинических исследований, валидации производственного процесса или коммерческих поставок было использовано несколько РБК, то карта производственного процесса может помочь проиллюстрировать общий источник (т.е. ГБК), из которого был получен РБК.

Как только создается ГБК, необходимо сформировать систему банков клеток для предотвращения нежелательного дрейфа, который может возникнуть в результате многократного субкультивирования или через несколько поколений. Такая система должна обеспечить достаточный запас идентичных клеток на протяжении всего жизненного цикла препарата. Как правило, система банков клеток состоит из двух уровней: ГБК и серии РБК, полученной из ГБК. Когда готовы дополнительные уровни РБК, производители должны четко определить используемое для РБК поколение.

Производство

В большинстве случаев ГБК создается из предварительного банка клеток, полученного из исходного источника или напрямую от исходного клона. Производители обычно готовят клетки для банкирования за счет увеличения объема культур в последовательно возрастающем количестве сосудов или в более крупных сосудах до тех пор, пока не будет получен пул клеток. Если производители используют более одного сосуда, однородный состав содержимого может быть получен путем объединения клеток из всех сосудов для культивирования в один.

Для микробных экспрессирующих систем отдельная клетка хозяина, содержащая экспрессирующую конструкцию, размножается для генерации ГБК. Производители должны фиксировать историю клонирования клеток и способ переноса экспрессирующей конструкции в клетку хозяина. Кроме того, необходимо подробно описать методы и критерии, которые использовались для амплификации экспрессирующей конструкции и отбора клона клеток в качестве будущего продуцента. Процесс создания РБК, используемого для клинических исследований и коммерческих поставок, должен в целом соответствовать процессу создания ГБК. РБК создается с помощью одного или более контейнеров с клетками из ГБК, и, как правило, предназначен непосредственно для нужд производственного процесса. По мере необходимости из ГБК создают дополнительные РБК. Желательно, чтобы ГБК и РБК были получены похожим образом, однако в некотором отношении они могут отличаться друг от друга, например компонентами культуральной среды и условиями культивирования. Аналогичным образом, условия культивирования, используемые при создании ГБК и РБК, могут отличаться от условий, используемых в процессе производства, при получении материалов для клинических исследований или коммерческой поставки. Должны быть описаны процедуры заготовки для всех процессов, связанных с культивированием клеток, и приведены подробности, касающиеся внесения изменений в технологический процесс. При изменениях технологического процесса между РБК, должна быть продемонстрирована сопоставимость качества продукции. Банки клеток должны быть изготовлены в соответствии с текущими правилами организации производства и контроля качества лекарственных средств (cGMP), поскольку, как предполагается, продолжительность их хранения рассчитана на весь срок службы препарата. Производители должны свести к минимуму вероятность микробной контаминации и располагать процедурами для предотвращения перекрестной контаминации с другими материалами, присутствующими в лаборатории. Оборудование, которое имеет наиболее важное значение при подготовке банка клеток, должно быть аттестовано. Банк клеток создается в соответствующей контролируемой среде в целях защиты как самого банка клеток, так и занимающегося им персонала. При создании банка клеток не допускается одновременная работа в этой же зоне с другими живыми инфекционными агентами(например, вирусами, клеточными линиями или клеточными штаммами).

Валидация

Процесс создания банка клеток следует считать отдельной операцией, которая должна быть валидирована. Процесс начинается с валидации пробирок, используемых для ГБК а также процессов, выполняемых для создания РБК. Пригодность РБК для предполагаемого назначения должна быть подкреплена данными о стабильности и качестве последующих партий препарата. Следует использовать аттестованные банки клеток для валидации процесса ферментации, фармацевтической субстанции и т.д. Если это не представляется возможным, производители должны провести мелкомасштабную демонстрацию пригодности банка клеток. Применяются основные подходы процесса валидации, включая использование утвержденных аналитических методик и оценку стабильности.

Производители должны описать методы приготовления банка клеток, используемые криопротекторы и среду, а так же контейнеры для хранения (сосуды, ампулы, и другие пригодные емкости), и систему укупорки. Укупорочные системы должны состоять из таких материалов и иметь такой дизайн, которые позволяют им, выдерживать хранение и извлечение без разрыва или утечки, а так же являются физически и химически совместимыми с хранящимися материалами.

Испытание

Свежеприготовленный банк клеток (ГБК или РБК) должен быть соответствующим образом квалифицирован путем установления его характеристик и проведения испытаний аликвоты или, по необходимости, полученной из нее культуры клеток. Требуемый для ГБК объем исследований может влиять на масштаб последующих испытаний РБК, а также испытаний, проводимых при производстве клеточных культур. Производители должны оценивать все банки клеток, включая бактериальные культуры или рекомбинантные бактериальные экспрессирующие системы для определения подлинности, жизнеспособности и культуральной чистоты. Кроме того, производители должны оценивать генетическую стабильность и продуктивность всех клеточных линий. Для подтверждения подлинности клеток в банке клеток, производителям необходимо провести соответствующие испытания. При проверке подлинности могут быть оценены как фенотипические, так и генотипические характеристики для классификации бактериальных штаммов на уровне видов и, при необходимости, могут быть проведены дополнительные серологические тесты. Для большинства микробных и трансфицированных клеток анализа роста на селективных средах обычно достаточно для подтверждения подлинности клетки-хозяина. В тех случаях, когда могут быть использованы разные штаммы, в качестве дополнительных методов испытания следует рассматривать такие методы определения биологических характеристик, как фаготипирование. Экспрессия требуемого продукта также может быть использована для подтверждения подлинности микробной экспрессирующей системы. Необходимо доказать, что банки клеток свободны от занесенных микробных агентов, т.е. биологически чисты. Испытания на занесенные агенты предполагают испытания на присутствие бактерий, грибов, микоплазм и вирусов. Кроме того, все банки клеток следует тестировать на жизнеспособность клеток. Чтобы доказать, что клеточная культура обладает достаточной жизнеспособностью и является пригодной для ее последующего предполагаемого использования, должны проводиться испытания на рост клеток или определение количества жизнеспособных клеток.

Оценка постоянства производительности и генетической стабильности являются отражением того, сколько удвоений могут перенести клетки без ущерба для их генетической целостности (например, сохранение плазмид) и продуктивности (объем продукта на клетку). Подобные испытания имеют решающее значение для обеспечения надежного функционирования клеточной линии в ходе полноценного производственного процесса от начальной стадии ГБК до предполагаемой к выпуску продукции. В рамках данной оценки производители должны задокументировать количество пассажей после получения первоначального источника, количество субкультивирований после получения первоначального источника до создания ГБК, после получения ГБК до создания РБК, и после создания РБК – до получения нерасфасованной продукции. Чтобы убедиться в сохранности желаемых характеристик, необходимо оценить самое раннее и самое позднее состояния клеточной культуры (например, ГБК и конечного продукта). Оценку стабильности клеточной линии проводят обычно один раз для каждого регистрируемого лекарственного препарата. Определение характеристик клеточных линий может быть полезным для демонстрации того, что банк клеток состоит из клеток с предполагаемыми фенотипическими/генотипическими характеристиками. Такие испытания могут включать изучение морфологических особенностей клеток и колоний (т.е. использование селективной и/или дифференциальной сред), определение биохимических профилей (ферментная активность или использование субстрата), иммунологической подлинности, особенности роста и чувствительность к антибиотикам. Кроме того, для клеточных линий, экспрессирующих рекомбинантные белки (например, E. Coli) молекулярное исследование может включать секвенирование ДНК гена-мишени вместе с фланкирующей областью, исследование устойчивости экспрессирующей конструкции и определение числа копий плазмид. Анализ экспрессирующей конструкции на уровне нуклеиновых кислот оценивает только кодирующую последовательность рекомбинантного гена. Для определения числа инсерций или делеций в экспрессирующей системе, а также количества сайтов интеграции следует применять картирование с использованием рестрикционных эндонуклеаз или другие подходящие методики. Для экстрахромосомных экспрессирующих систем процент клеток хозяина, сохраняющих экспрессивную конструкцию, должен определяться в выбранных и произвольных условиях роста. Для клеток с хромосомными копиями экспрессирующей конструкции нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, следует подтверждать с помощью клонирования и секвенирования хромосомных копий. Большая часть данных испытаний должна по возможности проводиться на ГБК, что исключает необходимость повторять испытания на каждом РБК или производственной партии, хотя иногда повторные испытания (и на ГБК, и на РБК) могут быть целесообразными.

Испытания подлинности обычно проводят для ГБК. Кроме того, ограниченный объем испытаний подлинности, как правило, проводят для каждого РБК. Для рекомбинантных препаратов подлинность РБК оценивается путем определения числа копий экспрессирующей конструкции, выявления в ней инсерций или делеций, применения картирования с использованием рестрикционных эндонуклеаз. В дополнение к этому, при необходимости, РБК должен определяться по фенотипической характеристике (ауксотрофия, устойчивость к антибиотикам). Для каждой партии РБК, полученной из ГБК, производители должны регулярно проводить испытания на примеси, которые могли быть занесены из культуральной среды в процессе изготовления. Анализы на чистоту и допустимые пределы примесей, как и проводимые на ГБК испытания на занесенные агенты, могут выполняться и на РБК. Особенности лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков могут так же применяться (см.ниже) в качестве еще одного параметра для определения максимальной производительности клеточной линии. В случае, если потребуется новый ГБК, анализ, проводимый на новом ГБК, должен совпадать с анализом предшествующего ГБК, если не обосновано иное. В случае, если новый ГБК будет производиться путем переноса экспрессирующей конструкции в клетки хозяина с последующей селекцией клона, тогда должны быть описаны и обоснованы критерии приемлемости как для нового клона, так и для белка, продуцируемого клоном.

Хранение

Для ГБК и РБК одного и того же продукта обычно используются похожие контейнеры (такие как криопробирки), для которых на время использования предусмотрено аналогичное обращение. Местонахождение, подлинность и подробная опись каждой ампулы с клетками должны быть тщательно задокументированы с помощью процедур, позволяющих отслеживать контейнеры банков клеток. В маркировке должно четко указываться биологическое наименование компонентов, индивидуальный номер контейнера, при необходимости номер партии/серии, и тип банка (ГБК или РБК). Маркировка должна выдерживать хранение и извлечение без потери информации или какого-либо ущерба для целостности.

Банки клеток должны создаваться, содержаться и использоваться таким образом, чтобы минимизировать риск контаминации или перекрестной контаминации с другими типами клеток, которые могут присутствовать при хранении. После выдачи материалы банка клеток не могут быть возвращены в контролируемую зону хранения. Доступ к банкам клеток должен контролироваться строгой системой контроля управления запасами и предоставляться ограниченному кругу лиц, имеющему на это полномочия. Банки бактериальных клеток следует хранить в жидкой или газовой фазе жидкого азота или в криогенных аппаратах (обычно при ≤−60°). Условия хранения (обычно ≤ -60 °) могут быть приемлемыми, если они подтверждены данными, демонстрирующими, что минимальный уровень жизнеспособности клеток сохраняется и достаточен для использования в производстве. Температура хранения и другие критические условия хранения должны поддерживаться в пределах допустимых значений. Температуры должны постоянно отслеживаться и фиксироваться, предпочтительно с помощью системы оповещения. Транспортировочные контейнеры, используемые для транспортировки криоконсервированных банков клеток на удаленные хранилища или производственные объекты, подлежат сертификации, аттестация груза так же должна быть выполнена. РБК следует хранить отдельно от ГБК в силу более частого использования РБК и для защиты ГБК. Банки клеток так же могут храниться в двух или более специально отведенных местах, расположенных далеко друг от друга в пределах производственного помещения, а так же в удаленном месте во избежание повреждений банка клеток (например, вызванными неисправностью в работе оборудования или аварией в производственном помещении). Условия хранения банков клеток не должны различаться при их хранении в разных местах.

В рамках плана аварийного восстановления производитель должен документально отразить меры и сроки, необходимые для восстановления производства новых банков клеток и/или планы действий на случай непредвиденных обстоятельств для дальнейшего производства.

Стабильность при хранении

ГБК и РБК должны быть включены в программу проверки стабильности. Подтверждение стабильности клеток в банке клеток в установленных условиях хранения обычно получают во время производства материала для клинических исследований или промышленного материала из банка клеток. Данные по определению жизнеспособности законсервированных клеток должны подтвердить, что клетки пережили процесс консервации и могут быть использованы для получения требуемого продукта. Данные о производстве материалов для клинических исследований позволяют удостовериться, что из восстановленных клеток можно получить требуемый продукт. Следует обеспечить стабильность достаточного количество материала РБК на период использования продукта. Объем может являться значительным, так как срок использования продукта может быть довольно длинным (например 50 лет). В процессе подготовки ГБК объем партии должен быть достаточно большим, чтобы обеспечить необходимое количество товарных запасов для поддержания исследования стабильности и производства на протяжении срока эксплуатации готового препарата. Контрольный момент времени для такого длительного исследования может включать 0, 6 и 12 месяцев, а затем, возможно, от 1 до 3 лет. Как правило, никакая дата истечения срока годности банков клеток не применяется, так как исследования стабильности осуществляются для подтверждения пригодности материала. Более важная роль отводится успешно функционирующей (типовой) культуре самих клеток. Предлагаемое наблюдение подлежит документированию в протоколах, имеющих заранее согласованную форму. Если имеющиеся данные свидетельствуют о стабильности, то количество контрольных точек может быть сокращено (например, увеличивая интервал между ними). Кроме того, при необходимости в дополнительном наблюдении и наличии достаточного материала могут быть добавлены дополнительные контрольные точки. Программа по изучению стабильности зависит от рабочего расхода в производстве.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Производство фармацевтической субстанции для бактериальной вакцины требует процесса культивирования, стабильного и достаточно продуктивного для поддержания промышленного производства. Такой подход стал довольно стандартизированным, обеспечивающим относительно высокую вероятность успеха начала серийного производства, способствуя программе развития. Обеспечение достаточной производительности в промышленном производстве лицензированных препаратов по-прежнему является значительной проблемой. Непосредственно после культивирования начинается процесс сбора выросших в культуре клеток, который служит переходной стадией между периодами увеличения биомассы и этапами выделения и очистки продукта. В целях настоящей главы сбор клеток, выросших в культуре, будет рассматриваться как продолжение процесса культивирования.

Исходные материалы для культивирования: клеточный инокулят

Клеточный инокулят для процесса ферментации является единственным наиболее важным компонентом для создания воспроизводимого процесса ферментации. На ранних этапах развития, предшествующих завершению культивирования, производители, как правило, должны создать временный источник инокулята, - Экспериментальный банк клеток (Process Development Cell Bank, PDCB). Происхождение PDCB создают из клона исходного трансфицированного или изолированного штамма, который обладает соответствующими ростовыми свойствами и продуцирует интересующий антиген в достаточном объеме и надлежащего качества для целевого назначения. Использование клона изолята гарантирует, что генетическое исходное положение каждого посева одинаково, и что незначительные изменения в производственном процессе не повлекут за собой доминирование одной популяции над другой в культуре клеток. Иными словами, PDCB используется в целях культивирования в отсутствии конкуренции между популяциями трансфицированных клеток. Первоначальный этап культивирования (предпочтительно с PDCB) обычно предшествует производству ГБК и РБК. Наилучшая практика состоит в том, чтобы произвести банки клеток из того же клона изолята, что и PDCB, чтобы снизить необходимость во второй стадии культивирования, когда задействован РБК. Замена РБК на PDCB на заключительных этапах культивирования является общепринятой практикой, однако необходимо соблюдать осторожность при частом использовании подобных экспериментов для оптимизации процесса ферментации. Более подробная информация содержится выше, в разделе, посвященном банкам клеток.

Оборудование для культивирования

Производство биомассы обычно начинается с небольшого объема инокулята на начальном этапе культивирования, который в 20-100 раз больше, чем первоначальный объем инокулята. После данного начального пассирования зачастую следует один или несколько промежуточных пассажей, в ходе которых объемы производства наращиваются в 20-100 раз на каждой стадии до тех пор, пока не будет достигнут производственный объем (до 500-3000 л). Регулярное производство в этих масштабах требует наличия материально-технической базы и строго контролируемых условий культивирования, отвечающих экономическим потребностям и текущим правилам организации производства и контроля качества лекарственных средств (cGMP), обеспечивающим получение успешной продукции. Культивирование бактерий традиционно осуществляется в стеклянных, футерованных стеклом ферментерах или в ферментерах, изготовленных из пассивированной нержавеющей стали, соответствующих требованиям cGMP, особенно при использовании больших ферментеров (например, с рабочим объемом более 1000 л) из-за проблем со сдерживанием такого большого объема жидкости. Традиционные системы культивирования требуют систем управления с жесткой трубной обвязкой, которые отвечают потребности в очистке и стерилизации паром на месте. Микробиологическая нагрузка и сложность технических средств увеличиваются, если операции, связанные с культивированием, рассчитаны на несколько линий продукции. Ферментация небольших партий всё чаще осуществляется в одноразовых биореакторах, таких как контейнеры разового использования с полностью одноразовой контактирующей поверхностью, включающей датчики и зонды. Такие системы становятся общедоступны и являются менее дорогостоящими и более гибкими по сравнению со стационарным оборудованием, отвечают потребностям конкурентоспособного бизнеса, растущим ожиданиям и требованиям cGMP. Однако следует проявлять определенную осторожность, так как в случае данной технологии разового использования вероятна смена материала, из которого изготавливается контактирующая поверхность. Такие изменения требуют повторной оценки, а иногда и повторной валидации технологии производства применительно к завершающему этапу разработки и серийно выпускаемым препаратам. Таким образом, сокращение очистных работ может приводить к увеличению потребности в исследовании содержания экстрагируемых и выщелачиваемых веществ.

Оборудование для сбора клеток

Сбор клеток, полученных в результате культивирования, может быть направлен либо на извлечение влажной клеточной массы, из которой будет получен препарат, либо культуральной жидкости, из которой препарат будет непосредственно выделен. В первом случае обычно используется центробежное разделение. Промышленные центрифуги могут быть либо периодического действия с установленным объемом ввода и ручной выгрузкой осадка, либо непрерывного действия, для которого характерно автоматическое извлечение и сбор осветленного супернатанта и/или накопившегося осадка. И хотя центрифуги эффективны при сборе продукта ферментации, сила трения может оказать существенное воздействие на поток продукции (например, подвергшиеся лизису клетки, расщепленные молекулы в растворе и, напротив, особенно, когда продукт секретируется в раствор, а не удерживается в клетках, могут быть использованы системы мембранной фильтрации в качестве очищения от примесей потока продукции для последующей очистки. Тангенциальная поточная и глубинная фильтрации могут быть эффективными средствами для выделения растворимого продукта, не вызывающей сильной обеспокоенности о силе сдвига. Во всех случаях контроль над процессом ферментации и извлечения твердой фазы из жидкой матрицы несложен и является эффективным средством для обеспечения последовательности и сопоставимости данных. Инструменты автономного режима, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС-ПААГ), или Вестерн-блоттинг могут использоваться для рассмотрения таких вопросов, связанных со стабильностью получаемой продукции, как, например, агрегация и протеолиз.

Разработка технологий

Эффективный процесс культивирования является результатом тщательного изучения широкого диапазона переменных величин, которые рассматриваются как самостоятельно, так и совместно с разработкой продукта и дальнейшей обработкой. К переменным величинам процесса ферментации относят химические вещества (источники углерода, минералы, витамины, микроэлементы, антивспениватели, газы), физические факторы (температура, приготовление смеси, pH) и биологические процессы (степень использования питательных веществ, концентрация метаболита, и индукторы [количество/тип/ продолжительность добавления]).

Требования к продукции

Важнейшим аспектом в разработке производственного процесса является определение необходимого объема продукции. Слишком малое количество продукции, произведенное в слишком малых масштабах, налагает ограничения на поставку, - в этом случае возникает необходимость увеличить масштаб производства. Избыточное количество продукции, наоборот, приводит к неликвидным запасам, партиям с истекающим сроком годности, редко повторяющимся партиям (что само по себе является проблемой) и, в большинстве случаев, неблагоприятной экономической составляющей. Необходимо провести оценку рынка, прежде чем планировать процесс производства или приступать к расширению или уменьшению масштабов производства.

Проектирование процесса

Если имеется достаточно определенная потребность в производстве и предварительная оценка объема выпуска продукции, можно экстраполировать масштаб культивирования на основании данных по объему (выходу готовой продукции), регулярности производства и ожидаемой производительности. Промышленное культивирование бактериальных культур обычно осуществляется в объемах до 3000 л., но также используются и большие объемы. Несколько крупных партий в год могут быть выгодны для организации стабильного процесса, однако данный показатель может быть ограничен возможностями последующих этапов процесса, а именно - выделения и очистки препарата, и/или стабильностью препарата, полученного в результате культивирования, и являющегося промежуточным полупродуктом. Следует так же учесть, что могут возникнуть трудности с созданием такого количества партий, которого было бы достаточно, чтобы подтвердить, что процесс культивирования действительно является стабильным. направленных на обеспечение действительно стабильного процесса ферментации. Несостоятельность крупной партии влечет за собой существенные финансовые и инвентарные риски. Слишком большое количество партий может вызвать проблемы, связанные с материально-техническим обеспечением, если период полного цикла слишком короткий, или координация последующих действий становится слишком сложной. Материально-техническое обеспечение включает контроль качества, выполнение которого зависит не от размера партий, а от их количества. Производство большого количества мелких партий может потребовать объединения нескольких промежуточных партий для производства конечной партии лекарственного препарата. Это может послужить источников проблем, связанных с качеством препарата, что является основанием для расследования первопричин события. В общих чертах, грамотное определение масштаба культивирования - это такой процесс, в котором полный цикл составляет менее одной недели, в ходе которого могут быть осуществлены один или несколько циклов очистки, и который завершается одной или несколькими фасовками готового препарата после каждого цикла очистки.

Ранний этап разработки биологического препарата

На ранних этапах развития биологического препарата наиболее важными элементами культивирования являются соответствующий, хорошо охарактеризованный ГБК и процесс ферментации, который в достаточной степени является производительным, репродуцируемым и масштабируемым. Последнее зачастую недооценивается при рассмотрении физического, химического и биологического управления процессом, поскольку масштаб процесса изменения в порядке возрастания.

Механика процесса ферментации является важным предметом для рассмотрения. Ферментация, как правило, изучается в экспериментах по культивированию в колбах или даже в маломасштабных реакторах, которые могут легко объединять в себе проводимые параллельно эксперименты. Хотя это и представляет интерес для первоначального определения условий производственного процесса, итоговый сосуд для культивирования должен быть регулируемым ферментатором, где можно обеспечить контроль и наблюдение за условиями роста более тщательным образом. Производителям следует приступать к работе в маломасштабных реакторах как можно раньше с целью обеспечения надежности экспериментов в контролируемых условиях для оптимизации начальных условий ферментации. Процессы, вязанные со сбором клеток, полученных в результате культивирования, также должны быть масштабируемыми. Несмотря на то, что можно масштабировать процессы центрифугирования, крайне сложно поддерживать эквивалентные условия центрифугирования, особенно в проточном режиме. Масштабирование процесса фильтрации, как правило, более предсказуемо, если предоставленная производителем мембрана предвосхищает потребности специалиста по разработке производственного процесса.

После того, как процесс разработки сформирован производителями, он должен пройти оценку робастности путем внедрения целенаправленных отклонений, таких как изменение источников исходных материалов, временных и температурных пределов для отдельных операций. Такие оценки лучше определяют целесообразность установления предельных значений, и дают понимание о том, какие из них имеют наиболее важное значение для успешного производственного процесса.

Контроль производственного процесса

На основе характеристик раннего этапа разработки производители должны определить ключевые аналитические показатели, которые (если они применяются ко всем партиям) могут подтвердить правильность продвижения процесса или выступить в качестве индикатора для установления признаков отклонения конкретной партии от стандартного профиля. В отсутствие таких данных не соответствующий норме процесс может остаться незамеченным или не сможет быть установлен до тех пор, пока испытание промежуточного вещества не покажет не соответствующие предыдущим данным или не удовлетворяющие техническим условиям результаты. Многие определяющие переменные процесса ферментации (например, оптическая плотность, pH, уровни питательных веществ) могут измеряться интерактивно и в режиме реального времени, что теоретически создает возможность для корректировки конкретного процесса до диапазона нормальных значений или, по крайней мере, определения этапа, в котором произошло отклонение. Эти данные могут быть весьма полезными в определении возможных усовершенствований производственных процессов. В противном случае при отсутствии таких данных для отыскания неисправностей процесс может быть затруднительным и затянутым.

Масштабирование технологического процесса

Подобно тому, как ранние этапы развития требуют сосредоточения внимания на мелкомасштабных операциях, масштабирование на определенном этапе приобретает особое значение ради того, чтобы достаточно крупные партии соответствовали требованиям программы. Поскольку эти требования становятся все более сложными, крупные партии необходимы для обеспечения того, чтобы несколько экспериментов и наблюдений могли относиться к одной партии изделий, что, в свою очередь, имеет крайне важное значение для понимания важнейших технологических параметров процесса и продукта. Если надлежащая технология производства была учтена при проведении мелкомасштабного производства, масштабирование, как правило, осуществляется с увеличением в десятки раз с учетом разумных ожиданий, что существенные показатели производственного процесса или изменений продукции будут не видны. Данный подход может потребовать соответствующих изменений в промежуточном масштабе, если начальная ферментация была основана на незначительном объеме, или если масштаб производства конечного продукта слишком велик. Как и в предыдущем случае данные контроля производственного процесса могут быть весьма полезны при оценке успешности масштабирования. Если клинические испытания проводятся на уровне, меньшем, чем полный промышленный масштаб, как это обычно бывает, производители будут обязаны установить сопоставимость показателей производственного процесса и характеристик продукции в различных масштабах. Данные анализа должны быть основательны, но при отсутствии таковых или наличии различий, производители должны продемонстрировать, что связанные с масштабом производства различия не являются клинически значимыми. Однако использование протоколов сопоставимости данных для крупномасштабных изменений требует согласования с местным органом регулирования и контроля. Во избежание ошибок, лаборанты должны обеспечить разграничивание различий, вызванных масштабированием ферментации от изменений, вызванных сбором клеток или масштабированием очистки. Одним из способов достижения этой цели является сравнение полученных промежуточных веществ, по мере возможности, в процессах ферментации и культивирования. В качестве примера можно привести онлайновую систему мониторинга условий ферментации, таких как pH или уровень глюкозы, которая может быть использована для демонстрации сходства за время осуществления ферментации. Таким же образом измерение соответствующих показателей по завершении процесса ферментации (например, конечной плотности клеток, жизнеспособности клетки) и промежуточных показателей в процессе культивирования (например, мутности осветленной питательной среды, влажной клеточной массы на осадке в пробирке) является источником полезной информации для оценки сходства или различий во время масштабирования.

ОЧИСТКА

Общий обзор очистки вакцин бактериального происхождения представлен в USP <1235> Вакцины для медицинского применения – Общие подходы. В дополнение к описанию особо важного технологического оборудования, реактивов и этапов технологической обработки, производители должны представить обоснование для процесса очистки, выбранного для компонентных антигенов, извлеченных из неочищенного материала. Как и в случае с другими процессами, лаборанты должны рассмотреть вопрос об источниках всех исходных материалов и обеспечить их долгосрочную поставку от надежных поставщиков, придерживающихся стандартов cGMP, которые будут применяться на заключительном этапе производства промышленных материалов и поставки в клинику. Необходимо обеспечить проверку удаления примесей, не связанных с продуктом (например, используемых реактивов, эндотоксинов, загрязняющих белков клеток-хозяина или нуклеиновых кислот и других остаточных примесей).

Фармацевтическая субстанция может быть одной из нескольких типов соединений: например, полисахаридом (дикий тип или модифицированный), белком (дикий тип, мутирующий, рекомбинантный), продуктом конъюгации полисахаридов и белков или продуктом конъюгации пептидов и белков. Для определения и контроля процессов очистки фармацевтической субстанции и лекарственных средств производитель должен установить целевые показатели в отношении параметров обработки и допустимых отклонений для всех основных стадий процесса, включая урожайность, способ производства, отсутствие примесей для обеспечения эффективности, безопасности и стабильности показателей качества готового препарата. При необходимости следует разработать требования по депонированию. Требования и условия хранения промежуточных продуктов, нерасфасованной готовой продукции и препаратов в окончательной упаковке должны быть установлены официальной программой проверки стабильности. Необходимо подтверждать проверку достоверности использования, многократного использования, обновления и обработки всего контактного оборудования, используемого при производстве лекарственного средства/фармацевтической субстанции (например, фильтры, хроматографические колонки и иониты, резервуары, и паточные линии). Кроме того, исследования на наличие выщелачиваемых/вымываемых веществ должны проводиться для всего оборудования, контактирующего с продукцией (одноразовые пакеты, хроматографические колонки с ионитами, паточные линии).

Очистка полисахаридов

Стадии очистки полисахаридов зависят от фенотипа (например, грамотрицательного или положительного), формы полисахарида (например, мембраносвязанной или экскретированной в супернатанте), химических свойств самого полисахарида [например, связи основной цепи (гликозидная связь, фосфодиэфирная связь), суммарного заряда, типов заряженных групп , типов изменений боковых групп (цепей) (O-ацетила, уроновой кислоты, сиаловой кислоты, N-ацетила, пирувата, О-метила)]. Способы сбора полисахарида определяют требования к очистке от примесей и последующей очистке. Методы очистки от примесей зависят от наличия необходимости выполнения лизиса клеток или только отделения бесклеточной жидкой среды от продуктов распада клеток. Техники сбора выросших в культуре клеток включают центрифугирование, глубинную фильтрацию, фильтрование тангенциальным потоком, микрофильтрацию, метод гель-фильтрации или сочетание нескольких техник. Культура клеток может быть инактивирована, либо остаточные примеси могут быть удалены посредством селективного осаждения (например, денатурация белка) с использованием тепловой или химической обработки (соли, детергенты, энзимы или фенол). В этом случае до отчистки от примесей может потребоваться осаждение в холодильной камере. Способы осаждения полисахарида после очистки от примесей используются как для выделения, так и для очистки. Методы фракционного осаждения основаны на суммарном заряде или катионной связывающей способности полисахарида (спиртовое осаждение, ионообменная хроматография). Такие агенты, как катионные детергенты, соли и растворители могут быть использованы для дифференциального осаждения заряженных частиц из незаряженных молекул. Осаждение может быть выполнено поэтапно для удаление остаточных примесей из полисахарида или серией осаждений для достижения желаемой степени чистоты. В зависимости от заряда и природы полисахарида, он может содержаться либо в осадке, либо в супернатанте. После осаждения следуют стадии выделения, такие как центрифугирование и / или фильтрация, в ходе которых осадок или отбрасывается, или ресуспендируется в дополнительном осаждающем агенте до извлечения полисахарида. Для удаления посторонних примесей иногда используется экстрагирование с помощью таких растворителей, как фенол. Альтернативным и дополнительным подходом к методам селективного осаждения является использование хроматографических методов. Ионообменная хроматография (например, ДЭАЭ-сефароза), гидрофобная хроматография (ГХ) и гель-фильтрация, применяемые по отдельности или в сочетании друг с другом, успешно используются для очистки полисахаридов. При нейтральном показателе pH заряд кислых полисахаридов может использоваться на анионообменниках для очищения кислых полисахаридов от посторонних примесей. Так же могут использоваться ионообменники для очистки нейтральных полисахаридов в проточном режиме, извлекая посторонние примеси, в то время как нейтральные полисахариды пропускают через колонку. ГХ может так же применяться для извлечения примесей в то время как полисахарид проходит в проточную фракцию. При отсутствии групп, легко образующих связи с щелочами, заряд нейтральных и кислых полисахаридов можно изменить путем добавления щелочи для ионизации гидроксильной группы перед хроматографией. Основные выбранные условия используются для контроля уровня N-ацетилирования, таким образом, полисахариды могут по мере необходимости подвергаться повторному ацетилированию. Возможно использование боратных солей для усиления разделения во время ионообменной хроматографии. Может так же осуществляться сочетание мер осаждения, очистки и хроматографических методов.

В случае необходимости используются диафильтрация, ультрафильтрация и промежуточная сушка для сбора полисахаридов при удалении низкомолекулярных примесей или замене солей и растворителей. Осадки или фракции колонки могут быть дополнительно очищены с использованием приемлемых методов (ферментативная обработка, экстракция растворителями или колоночная хроматография) для удаления таких посторонних примесей, как нуклеиновые кислоты, белки и липополисахариды. Предварительная модификация боковой группы так же может быть включена в процесс очистки (например, де-O-ацетилирование или частичное депирувилирование). Конечная стадия очистки может состоять из замены буфера и фильтрации с последующим хранением очищенного жидкого полисахарида (замороженного) или дополнительного конечного осаждения и промывки осадка растворителем перед сушкой с последующим хранением. Сушка может осуществляться различными способами, например, сушка в вакууме или эксикаторе, или с помощью лиофильной сушки. Сушка полисахаридов может проводиться в эксикаторах (при воздействии различных температур) и может включать в себя несколько стадий измельчения или разрыхления и возврата в эксикаторы для дальнейшей сушки. Лиофилизация полисахаридов возможна при надлежащем контроле, если для процесса требуется удержание остаточной воды. Некоторым полисахаридам может потребоваться остаточное количество влаги для длительного поддержания стабильности. Затем полисахарид хранится в соответствующих условиях во избежание влагопоглощения.

Внутрипроизводственный контроль

Производители определяют наиболее важные стадии процесса и проводят соответствующие испытания для контроля над процессом очистки. К ним относятся испытания фильтра на целостность, Микробиологическое исследование нестерильной продукции: Испытания на определение микробного числа 61, Испытание на бактериальные эндотоксины 85, и другие соответствующие испытания на остатки реагентов (например, остаточные реагенты, растворители, энзимы или катионы), используемых в очистке. На размер молекулы полисахарида может оказывать влияние весь производственный процесс, начиная с условий ферментации, заканчивая условиями сушки, а так же воздействия механических и лопастных мешалок, или устройств фильтрации. Если размер молекулы представляет собой один из исключительно важных показателей качества, специалисты могут выполнить производственное испытание на его определение (например, высокоэффективная эксклюзионная хроматография в сочетании с многоугловым рассеянием лазерного излучения [HPSEC-MALLS]) на соответствующих стадиях процесса для наблюдения и контроля над размером полисахарида. С тем, чтобы продемонстрировать производственные показатели и надежность технологического процесса, производители должны подвергнуть анализу концентрацию остаточных примесей (например, белок, ДНК и эндотоксины). Если результаты валидационных исследований покажут, что остаточные реактивы удалены, то исследование полисахаридов, прошедших очистку, можно не проводить. Если материал должен быть стерильным, специалисты могут провести Испытания на стерильность 71.

Очистка белка

Классы бактериальных белковых вакцин включают в себя анатоксины, антитоксины (коклюшные антигены), мутантов природного происхождения (например, CRM197) в виде белков-носителей, и рекомбинантные генно-инженерные препараты.

АНАТОКСИНЫ

В конце ферментации токсиносодержащую культуральную среду следует как можно скорее отделить от бактериальной массы или поместить в холодильную камеру, пока не произойдет разделение. Содержание токсина (ЕА/мл) проверяется с помощью количественного определения флокуляции с использованием соответствующего стандартного образца антитоксина для контроля над стабильностью параметров производства (культура должна содержать не менее 40 ЕА/мл). Сначала токсин очищают, чтобы удалить любые компоненты, которые могут вызвать нежелательную реакцию у человека. Типовой технологический процесс включает глубинную фильтрацию с последующей фильтрацией с использованием мембраны с диаметром пор0,2 мкм для облегчения удаления продуктов клеточного распада. После предварительной очистки токсин детоксифицируют формальдегидом или глутаральдегидом, или любым подходящим реактивом таким способом, который позволяет избежать как разрушения иммуногенной активности анатоксина, так и реверсии анатоксина на токсин, особенно при воздействии тепла. Некоторым анатоксинам требуется однократное добавление формальдегида, но другим может потребоваться многократное. При другом подходе токсин может быть сначала детоксифицирован, а затем очищен или частично очищен путем глубинной фильтрации, детоксифицирован добавлением соответствующего альдегида, фильтрован путем фильтрацией с использованием мембраны с диаметром пор 0,2 мкм, и затем объединен. Объединенный раствор анатоксина дополнительно очищают путем удаления примесей активированным углем, а затем несколькими стадиями фракционирования сульфатом аммония, которые дополнительно концентрируют анатоксин. Стандартные меры дополнительной очистки подразумевают концентрирование, диафильтрацию и/или хроматографию. Очистка перед детоксификацией приводит к более чистой продукции и может быть выгоднее, если анатоксин будет использоваться в качестве белкового компонента белково-углеводного конъюгата (поскольку перед детоксификацией будут удалены очищенные высокомолекулярные гликаны). Во время очистки и детоксификации в соответствии с Испытанием на бактериальные эндотоксины 85 проводится испытание на содержание эндотоксина, а так же анализ на содержание формальдегида, белка и тест на отсутствие необратимых воздействий с целью обеспечения контроля и согласованности процесса очистки. Если материал должен быть стерильным, могут проводиться Испытания стерильности <71>.

БЕЛКИ/РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ

Используемые для изготовления вакцин белки могут быть рекомбинантными (в их нативном состоянии или генетически модифицированные для модификации некоторых аминокислот), или они могут быть мутантами природного происхождения, которые не обладают активностью дикого типа, но способны индуцировать соответствующий иммунный ответ. Белки извлекают из ферментера и экстрагируют (например, механическим и химическим разрушением), затем очищают подходящими методами, обычно состоящими из этапов фильтрации и концентрирования (к примеру, ультрафильтрация, тангенциальная поточная фильтрация, диафильтрация, центрифугирование, селективное осаждение, и даже прямой сбор с использованием хроматографии в расширяющемся слое или технологий big-bead). Концентрированный белковый раствор можно дополнительно очистить, используя соответствующие стадии фильтрации и хроматографии. Производители должны оценивать экстрагируемые и выщелачиваемые вещества для всего оборудования, контактирующего с фармацевтическими субстанциями (для хроматографических смол, мембран, систем применения одноразовых пакетов, или производственных линий). Специалисты должны определить срок службы колонки со смолой для всех хроматографических систем, используемых при очистке (включая количество случаев применения, требования регенерации и условия хранения).

Вид хроматографии, используемый при очистке белков, зависит от физических/химических свойств белка, который планируется получить, а так же от других молекулярных соединений в урожае клеточной культуры. Например, CRM197 может быть очищен с использованием многоступенчатого хроматографического процесса: производственный материал сначала подвергают диафильтрации, а затем отделяют с помощью ионообменной хроматографии (ДЭАЭ-сефароза) в целях очистки белка-мишени от других молекулярных соединений, присутствующих в потоке очистки. Как только представляющий интерес пик собран, добавляется сульфат аммония с последующей фильтрацией диаметром с использованием 0,2 мкм мембраны с целью обработки материала перед загрузкой на колонку гидрофобной хроматографии (с фенил-сефарозой) для очистки белка-мишени, исходя из его поверхностной гидрофобности. Затем пиковую фракцию разбавляют водой для инъекций и отделяют на колонке с керамическим гидроксиапатитом для дальнейшей очистки белка-мишени в зависимости от его поверхностного заряда. После элюирования пика производится замена элюирующего буфера на буфер для хранения путем ультрафильтрации/ диафильтрации с использованием мембранной фильтрации в поперечном потоке с последующей фильтрацией с использованием мембраны диаметром 0,2 мм для обеспечения стерильного очищенного концентрата. Внутрипроизводственный контроль очистки белка включает контроль над содержанием белка и особо важными стадиями технологического процесса, а так же мониторинг удаления нежелательных компонентов, которые могут образовываться в процессе культивирования и очистки. Показатель рН имеет решающее значение для ионообменной хроматографии, поэтому должен контролироваться. Для обеспечения мер, направленных на удаление эндотоксина, используются процедуры, описанные в Испытании на бактериальные эндотоксины 85, для наблюдения за элюентом колонки. Бионагрузка контролируется в соответствии с Микробиологическим испытанием нестерильной продукции: испытание на определение микробного числа 61 после стадий фильтрации и хроматографии. Если материал должен быть стерильным, могут проводиться Испытания на стерильность 71.

ПОЛИСАХАРИД-БЕЛКОВЫЙ КОНЪЮГАТ

Полисахаридные препараты и активированные полисахариды, используемые в реакциях конъюгации, варьируют в размере от нативного высокомолекулярного полисахарида до олигосахаридов, полученных путем контролируемой деполимеризации. Некоторые полисахариды также могут быть модифицированы (к примеру, де-O-ацетилированы, частично депирувилированы). Определение структуры/деполимеризация полисахаридов осуществляется различными способами (кислотно-основный катализ, химические процессы окисления или восстановления, микрофлюидизация или механическая обработка). Активация полисахаридов может осуществляться несколькими различными способами в зависимости от лабильности отдельных эпитопов при различных условиях деполимеризации или желаемого типа конъюгата (например, неогликонъюгат или конъюгат решетчатой структуры, использование связующей молекулы, прямой конъюгации или восстановительного аминирования). Соответствующего размера и/или активированные полисахариды очищают приемлемыми методами, обычно состоящими из различных комбинаций концентрирования и фильтрации (ультрафильтрация/диафильтрация) и хроматографических методов (гель-фильтрация, гидрофобная интерактивная хроматография). Производственные испытания, проводимые для контроля над процессами деполимеризации и активации, определяются процессом производства. Стандартными контрольными испытаниями являются измерение показателей pH, оценка структуры, контроль за температурными режимом реакций активации. Измерение полисахарида во время деполимеризации может осуществляться соответствующим хроматографическим методом (эксклюзионная ВЭЖХ или детектирование рассеивания лазерного излучения с кратными углами). При необходимости исследования деполимеризованного полисахарида на присутствие определенных функциональных групп (например, О-ацетил, N-ацетил, или пирувильных групп), могут определяться методами магнитно-ядерного резонанса (см. Ядерная магнитно-резонансная спектроскопия 761). Выбор способов внутрипроизводственного контроля активированного полисахарида зависит от используемого процесса активации. Например, если для присоединения линкера к деполимеризованному полисахариду используется восстановительное аминирование, контрольные испытания включают измерение восстанавливающей способности (например, доступных восстанавливающих сахаров), содержание полисахарида (для определения коэффициента использования в конъюгации), общее и свободное содержание линкеров (для определения активных сайтов для конъюгации). В зависимости от используемых процессов активации и конъюгации (т.е. незамедлительной конъюгации после активации) стабильность активации полисахаридов так же может быть продемонстрирована как часть валидации процесса или отражена характеристиками конечной массы конъюгата. Этапы концентрирования/фильтрации процесса очистки отслеживаются в целях контроля над коэффициентом фильтрации для подтверждения удаления солей.

КОНЪЮГАЦИЯ

Химическая структура конъюгации определяет тип полученного конъюгата (т.е. неогликоконъюгата или решетки). Конъюгат получают путем ковалентного связывания активированных полисахаридов с белком-носителем. Конъюгаты подвергаются очистке соответствующими методами, предназначенными для удаления остаточных реактивов, применяемых при конъюгации, а так же для удаления непрореагировавшего полисахарида и белка. Удаление остаточных реактивов подтверждается соответствующими испытаниями или валидацией процесса очистки. Данные испытания проводятся с целью определения остатков реагентов, используемых при инактивации или очистке. Если валидационные исследования показали удаление остаточных реагентов, испытания на конъюгатные полисахариды можно не проводить. Соответствующие хроматографические методы (гидрофобная и эксклюзионная хроматография) и/или фильтрация (ультрафильтрация/диафильтрация, тангенциальная фильтрация) применяются для удаления непрореагировавших полисахаридов, белков, остаточных химических веществ и солей, используемых при конъюгации или которые являются побочными продуктами конъюгации. Определение микробиологической чистоты (см. Микробиологическое исследование нестерильных продуктов: определение числа микроорганизмов 61) проводится до стерилизующей фильтрации.

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Промежуточным продуктом или промежуточным веществом в производстве вакцин является продукт реакции каждого этапа процесса за исключением последнего, формирующего конечный продукт. Примерами промежуточных продуктов являются суммарные очищенные полисахариды, белки, и активированные полисахариды, которые конъюгируют с белком. Большинство процессов производства вакцин является поэтапным, и требует более одной элементарной стадии для завершения процесса. Промежуточный продукт получают из исходных материалов на одном или нескольких этапах процесса (к примеру, рост бактерий, экстрагирование, очистка или химическое модифицирование), что в конечном итоге приводит к получению фармацевтической субстанции. Определение ключевых промежуточных продуктов, их производство и отбор для аналитических испытаний должны быть определены в контролируемых документах (протоколы серии, аналитические протоколы). Перед дальнейшей обработкой промежуточные продукты могут продолжительное время храниться, а так же могут быть включены в официальную программу стабильности (см. Стабильность при хранении выше). Для определения максимального времени удержания промежуточных продуктов и при осуществлении значительных изменений процесса должны выполняться исследования стабильности в условиях нормальных или ускоренных испытаний.

Проведение испытаний на протяжении всего процесса производства от исходных материалов до готовой фармацевтической субстанции гарантирует получение качественного препарата. Испытание промежуточных продуктов является основным этапом контроля качества для обеспечения их подлинности и чистоты. Параметры качества промежуточного продукта обычно испытываются совместно с дальнейшей обработкой, и их испытания при выпуске продукции следует принимать во внимание. Для аналитических контрольных испытаний должны быть надлежащим образом определены Стандартные операционные процедуры (СОП). Некоторые основные промежуточные продукты, из-за их решающей роли в производстве, могут быть включены в официальное испытание при выпуске продукции в дополнение к промежуточным продуктам, подлежащим испытанию в процессе производства. Примеры испытаний для определения структурных характеристик промежуточных углеводных продуктов включают следующее:

Примеры испытаний на чистоту промежуточных углеводных продуктов, основанных на оценочных данных родственных и технологических примесей, включают следующее:

Примеры испытаний для определения структурных характеристик и оценки чистоты белковых промежуточных продуктов включают следующее:

Ранее описанные испытания промежуточных продуктов на основе белков так же применяются в тех случаях, когда в качестве фармацевтической субстанции используется лекарственный препарат на основе белков. В дополнение к приведенным выше примерам могут быть применены и другие методики для определения подлинности и оценки чистоты.

Испытания на стабильность промежуточных продуктов могут включать физико-химические методы (см. раздел Промежуточные продукты выше), официально включенные в расчетный блок исследования стабильности. Кроме того, могут быть включены биологические и иммунохимические испытания (например, Ферментный иммуносорбентный анализ, ELISA). Если исследования проводятся на соответствующих этапах общего процесса производства, то определение микробиологической чистоты и испытание на эндотоксины на каждом этапе (для каждого промежуточного продукта, фармацевтической субстанции) могут не потребоваться. Определение микробиологической чистоты обычно проводится перед стерилизующей фильтрацией в рамках внутрипроизводственных испытаний. Стабильность промежуточных продуктов должна быть подтверждена, если они подлежат хранению или должны быть отправлены в другое место для дальнейшей обработки.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ СУБСТАНЦИЯ

Фармацевтическая субстанция представляет собой готовый нерасфасованный продукт, содержащий антиген в желаемой концентрации, и готовый для добавления других компонентов (например, разбавителей, объемообразующих агентов, стабилизирующих наполнителей, адъювантов или стабилизаторов вакцин) для получения готовой лекарственной формы. Фармацевтическая субстанция является конечным продуктом процесса производства антигена перед изготовлением готовой вакцины. Готовый нерасфасованный продукт может быть получен в асептических условиях или включать стадию стерилизации. Порядок отбора проб для проведения аналитических испытаний по исследованию стабильности и выпуску готового продукта (см. Стабильность при хранении выше) должен быть описан в контролируемых документах (например, в протоколе на производство серии, аналитических протоколах). Перед дальнейшей обработкой фармацевтические субстанции могут храниться продолжительное время, однако в этом случае фармацевтическая субстанция должна быть включена в официальную программу проверки стабильности (см. Стабильность при хранении выше). Для определения максимального времени удержания исследования стабильности должны выполняться в условиях нормальных или ускоренных испытаний. Программа проверки стабильности необходима для официальных исследований стабильности, которые должны выполняться в соответствии с протоколом, содержащим подробную информацию о видах испытаний, спецификациях, периодичности проведения испытаний, контрольных точках. Испытания фармацевтической субстанции должны выполняться для обеспечения ее чистоты и подлинности. Все испытания должны проводиться в соответствии с установленными СОП, а так же иметь спецификацию (или предварительные технические условия при необходимости). Примеры испытаний для определения структурной характеристики препаратов на основе углеводов включают следующее:

Примеры испытаний на чистоту фармацевтической субстанции на основе углеводов, основанных на оценочных данных родственных и технологических примесей, включают следующее:

В дополнение к приведенным выше примерам могут быть применены и другие методики для определения подлинности и оценки чистоты. Например, отдельные подлежащие измерению примеси определяются в ходе переговоров между производителями и государственным агентством по контролю за лекарственными средствами в процессе выдачи лицензии. Если исследования проводятся на соответствующих этапах общего процесса производства, то определение микробиологической чистоты и испытание на эндотоксины на каждом уровне (для каждого промежуточного продукта, фармацевтической субстанции) могут не потребоваться. Определение микробиологической чистоты обычно проводится перед стерилизующей фильтрацией посредством производственных испытаний. Все результаты должны быть представлены в контролируемом документе. Испытания по проверке стабильности могут включать физико-химические методы (см. Данные о стабильности выше), и биологические и иммунохимические испытания [например, ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), сывороточный бактерицидный тест (SBA), см. Качество биотехнологических препаратов: исследование стабильности биотехнологических/биологических препаратов 1049].

ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ И ВЫПУСК ПАРТИЙ

Общие принципы описаны в разделе Вакцины для медицинского применения – Общие подходы 1235, где излагается процедура выпуска партий в соответствии с 21 CFR 610.1 и 21 CFR 610.2. В отношении препаратов, используемых на территории США, образцы и протоколы, содержащие все соответствующие испытания, должны быть представлены в FDA для экспертизы и/или проверки. Если FDA определит, что партия соответствует стандартам безопасности, чистоты и нормативу удельной активности, необходимым для данной вакцины, партия допускается к выпуску, распространению и сбыту.

Протокол выпуска партии включает испытания на количественное содержание активного вещества, общую безопасность, стерильность, чистоту, подлинность, и используемые вещества. Испытания на количественное содержание активного вещества различны для каждой бактериальной вакцины. Включение данных испытаний делает каждый протокол выпуска партии бактериальных вакцин уникальным.

Содержимое упаковки каждого наполнения каждой партии проверяется на подлинность после завершения маркировки. Подлинность определяется физическими или химическими свойствами вакцины, проверяется макроскопическим или микроскопическим методами, отдельно взятыми культуральными пробами, иммунологическими реакциями in vivo или in vitro. В основном испытание подлинности проводится для того, чтобы отличить вакцину от других веществ, производимых в том же месте (21 CFR 610.14). Испытания по определению подлинности так же могут использоваться для определения количества иммуногена, присутствующего в готовом флаконе. Это особенно важно для вакцин на основе углеводов, которые дозируются по массе, и для которых используются физико-химические показатели качества антигена. Были бы полезны иммунохимические методы, которые включают методы иммунной преципитации и иммуноэлектрофоретические методы. Методы иммунной преципитации, флокуляция и осаждение могут выполняться в растворе или гелевой матрице и включать смешивание антигена с соответствующим антителом, что приводит к образованию флокулирующих или осаждающих агрегатов, которые могут быть обнаружены визуально или путем рассеивания света (или с помощью нефелометрии). Соотношение реактантов подлежит изменению в целях оптимизации полученного ответа. В растворе это может быть достигнуто путем титрования одного реагента с другим, а повышенная чувствительность может быть получена с использованием частиц, покрытых антигеном или антителом (например, латексом) в качестве реактантов. В гелеобразных системах градиент создается, когда один или несколько реагентов диффундируют, создавая видимую линию, где происходит осаждение. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) представляет собой качественный метод, объединяющий два подхода: гель-электрофорез с последующей иммунодиффузией. Перекрёстный иммуноэлектрофорез является разновидностью метода ИЭФ, который подходит как для качественного, так и для количественного анализа. Визуализация и определение параметров линий иммунопреципитации могут выполняться селективной или неселективной окраской, флуоресценцией, введением ферментных или изотопных меток или другими подходящими методами. Для определения в осадке небелковых веществ обычно используются методы селективного окрашивания. В полупрозрачных гелях, таких как агар или агароза, линия преципитации хорошо различима при условии наличия достаточной концентрации каждого из реактантов.  При наличии нескольких активных компонентов в результате совместной очистки (например, некоторых бесклеточных противококлюшных вакцин) производитель должен продемонстрировать, что состав препарата однороден между партиями, если это не было утверждено во время разработки производственного процесса. Для некоторых вакцин, особенно использующих очищенные полисахаридные иммуногены, подлинность и количество иммуногена можно оценить с использованием одного или нескольких химических или физико-химических подходов, таких как колориметрические определения различных групп сахарных остатков, которые, как ожидается, будут присутствовать, хроматография или ЯМР-спектроскопия с полем высокой напряженности.

Для определения состава полисахаридов, используемых в качестве вакцин, используется ряд классических колориметрических испытаний для количественного определения различных классов сахара, включая количественное определение орцина для рибозы, фосфора, сиаловой кислоты, уроновых кислот и аминосахаров. В большинстве случаев данные подходы заменяются хроматографическими методами, включая газовую и высокоэффективную анионообменную хроматографии, которые широко используются для определения гликоконъюгатных иммуногенов Hib PRP в моновалентных или комбинированных вакцинах и в менингококковых конъюгатных иммуногенах. Иммунохимические методы, которые используются для количественного определения полисахаридных антигенов, включают (а) ракетный иммуноэлектрофорез и (b) кинетическую нефелометрию. Электроиммуноанализ, также известный как ракетный иммуноэлектрофорез, представляет собой количественный метод определения антигенов, которые отличаются зарядом от антител. Электрофорез определяемого антигена проводят в геле, который содержит более низкую концентрацию соответствующего антитела. Методы нефелометрии используются для количественного определения антигена в пневмококковых конъюгатных вакцинах.

Однородность молекулярных размеров и распределение по размеру молекул полисахаридных и углеводсодержащих конъюгатных вакцин можно определить с помощью гель-проникающей хроматографии на соответствующих ионитах, откалиброванных надлежащими маркерами молекулярного веса или связанных с оборудованием рассеяния лазерного излучения, указывающей на абсолютный молекулярный вес, если известно значение инкремента показателя преломления (dn/dc). Измерение молекулярного размера конъюгатов может оказаться невозможным для поливалентных гликоконъюгатных вакцин. Целостность конъюгата может быть продемонстрирована альтернативными, связанными с продуктом методами. Еще одним вариантом подтверждения целостности гликоконъюгатов в конечном продукте является измерение молекулярных размеров в рамках исследований стабильности на моновалентном конъюгате перед изготовлением поливалентной вакцины. Если препарат получен из токсоидного материала или содержит его, производители должны продемонстрировать, что возврат токсичности не произошел (и не будет происходить в течение срока годности). Это может потребовать использование клеточной линии или исследования in vivo, несмотря на то, что проверяются ферментативные подходы.

Антигенный анализ на содержание примесей представляет собой метод количественного определения, который определяет количество антигена и используется для столбнячной и дифтерийной токсоидных вакцин. Содержание антигена определяется с помощью флокуляционного теста. Производитель должен обеспечить высокий и постоянный уровень адсорбции антигена для любого твердофазного адъюванта (такого как фосфат алюминия или гидроксид алюминия), который соответствует спецификация для выпуска. Для таких вакцин как сибиреязвенная и токсоидная, производитель обязан продемонстрировать, что по результатам исследований на животных, которые были подвергнуты заранее определенной дозе целевого патогена, вакцины являются мерой защиты против болезни и смерти. Для этого, как правило, требуется определение животной модели, способа введения, необходимого разведения вакцины, устройства для наблюдений за результатами воздействия, и определение эталонной вакцины, относительно которой сравниваются результаты воздействия. Данные должны быть надлежащим образом проанализированы (см. Анализ количественного биологического метода 1034). Характеризующие стабильность испытания аналогичны тем, которые используются для определения стабильности продукта. Самым важным из них является количественное определение активного вещества, тем не менее, деградация гликанов может иметь важнее значение для гликоконъюгатных вакцин.

Другие компоненты вакцин и
свойства вакцин

Соединения алюминия являются основными адъювантами, используемыми в вакцинах на территории США. Общая глава Вакцины для медицинского применения – Общие подходы 1235 содержит положения 21 CFR 610.15, регулирующие использование алюминия и его разрешенное количество. Адъюванты, широко используемые в бактериальных вакцинах, включают алюминия-калия сульфат (алюминиевые квасцы), фосфат алюминия, гидроксид алюминия, и комбинации этих соединений. Бактериальные вакцины, разработанные с применением таких адъювантов, называются адсорбированными вакцинами, и данный термин может быть включен в официальное наименование вакцины. Могут применяться и другие адъювантные системы. Количественный анализ алюминия производится с использованием колориметрической, титриметрической, эмиссионной или атомно-абсорбционной спектроскопии, или масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. Инструкции по остаточным производственным реагентам, см. в Отраслевой инструкции FDA 1999 года: Содержание и формат химических свойств, производства и контроля, и официальной описательной информации для производства вакцины или сопутствующего изделия. Производственные реагенты, такие как формальдегид и глутаральдегид, иногда используются при инактивации, процессах производства анатоксина или где-нибудь еще в процессе производства, и могут присутствовать в остаточных количествах в конечном продукте. Допустимая норма формальдегида и других остаточных продуктов должна быть сведена к минимуму в соответствии с утвержденной лицензией на лекарственный препарат. Стандартные консерванты, используемые в бактериальных вакцинах, включают тимеросал, фенол, 2-феноксиэтанол и хлорид бензалкония. Вакцины для медицинского применения – Общие подходы 1235 и 21 CFR 610.15 содержат дополнительную информацию о минимизации содержания тимеросала и производстве вакцин, свободных от тимеросала. Допустимые нормы и спецификации содержания для каждой бактериальной вакцины устанавливаются в лицензии на лекарственный препарат. Каждая партия контейнеров готовой лекарственной формы вакцины, предназначенная для инъекций, проверяется на бактериальные эндотоксины, как указывается в Испытании на бактериальные эндотоксины 85. Каждая партия контейнеров готовой лекарственной формы вакцины, предназначенная для инъекций, может испытываться на пирогенные вещества, как указано в Испытании на пирогенность 151 и 21 CFR 610.14. Каждая партия сухого препарата должна испытываться на наличие остаточной влажности (см. Потеря в массе при высушивании 731 и Руководство FDA от января 1990 года по определению остаточной влажности в сухих биологических препаратах). Остаточная влажность должна определяться и для лиофилизированных вакцин. Проводится общее испытание на безопасность биологических препаратов, предназначенных для введения людям с целью обнаружения посторонних вредных примесей. Порядок проведения и допустимые исключения предусмотрены в 21 CFR 610.11.

Содержание и подлинность вспомогательных веществ, консервантов, разбавителей, адъювантов, посторонних белков; а так же вакцины и антибиотики, изготовленные с помощью клеточной культуры, испытываются в соответствии с 21 CFR 610.15 и/или соответствующими руководящими документами. «Свободный» или неконъюгированный сахарид в гликоконъюгатных вакцинах считается нежелательным и регулируется установленным пределом. В качестве альтернативы контроля за свободным или неконъюгированным сахаридом, целостность конъюгатов в готовом продукте может быть продемонстрирована с помощью соответствующего метода, выбор которого зависит от свойств готового продукта (состава, адсорбции и т.д.). Методика анализа, характеризующая увеличение количества свободного сахарида, представляет собой метод оценки стабильности. Перечень применяемых методов зависит от отделения сахарида от конъюгата и использования упомянутых выше методов для количественного определения неконъюгированного сахарида. Используемые методы разделения включают мембранное разделение (например, диализ), использование гидрофобных сред для улавливания конъюгата особым образом, экстрагирование растворителями, и селективное иммунохимическое осаждение конъюгата с использованием антитела против носителя. Стерильность каждой партии препарата регулируется согласно процедурам, указанным в Испытаниях на стерильность 71 и 21 CFR 610.12 как для нерасфасованной субстанции, так и итогового содержимого контейнера.

Информация о лекарственном препарате

Маркировка вакцин регулируется в соответствии с 21 CFR 201 и 610. Требования устанавливаются как для маркировки контейнеров, так и упаковки.

ПРОЧИЕ ТРЕБОВАНИЯ

Контрольные образцы находятся у производителей не менее шести месяцев после даты истечения срока годности. Запасы материала каждой партии препарата сохраняются для анализа и испытания на безопасность и удельную активность. На протяжении всех этапов производства и распределения продукции ведется соответствующая учетная документация, так что в любой момент можно отследить последовательные этапы производства и распределения (см. 21 CFR 600.12). Условия хранения см. в 21 CFR 610.50 и 53. Срок хранения/дату окончания срока годности см. в 21 CFR 610.50 и 53.