Сенсорная система типа «электронный язык»

РЕЗЮМЕ

Достигнутый недавно прогресс в области сенсорных технологий привёл к разработке и

применению электронных вкусовых сенсорных систем. В частности, особый интерес

представляет предварительное определение вкусовых качеств лекарственных средств, которое

всё чаще выполняется с использованием электронных языков. Ранее уже были опубликованы

исследования на тему использования электронных языков, однако аналитический метод,

описывающий успешно проведенную квалификацию, еще не был представлен.

Была проведена квалификация эксплуатации вкусовой сенсорной системы SA402B (Insent

Inc., г. Ацуги-си, Япония), оснащённой семью липидными мембранными сенсорами, с

уделением особого внимания оценке горькости. Сенсоры представляют собой вкусовые

раздражители горькости, кислоты, умами, солёности и ноцицептивного ощущения терпкости. В

соответствии с руководством ICH Q2 (R1) для каждого типа сенсора были установлены

специфичность, линейность, диапазон аналитической методики, точность, прецизионность,

робастность, пределы обнаружения и количественного определения. Не все пункты

руководства оказались применимы, – некоторые из них пришлось скорректировать в силу

различий системы. Хинина гидрохлорид, являющийся одним из самых горьких лекарственных

препаратов, служил модельным веществом. Для большинства сенсоров был установлен

большой диапазон линейности (0,01-100 ммоль) с соответствующей прецизионностью (RSD < 4

%). Один сенсор имел более низкий порог обнаружения (0,0025 ммоль) хинина гидрохлорида

по сравнению с обычно имеющимся у человека. Были осуществлены и обсуждены с точки

зрения рациональности и практической реализации разные методы установления пределов

обнаружения и количественного определения. Подход, основанный на визуальной оценке, был

признан наиболее приемлемым. Было разработано адаптированное руководство в соответствии

с ICH Q2, служащее для квалификации вкусовых сенсорных систем в будущем.

1. ВВЕДЕНИЕ

Сегодня задействование дегустационных комиссий для оценки вкусовых качеств

лекарственных препаратов является широко применяемой практикой. Однако существуют

некоторые ограничения, которые ранее привели к разработке альтернативных методов оценки.

Чувство вкуса человека представляет собой высокоразвитую структуру, которая также

варьируется между людьми [1]. Даже если участники дегустационной комиссии обучены и

аттестованы, восприятие вкуса остается субъективным. Другими проблемами задействования

дегустационной комиссии являются угроза безопасности и соображения этического характера,

возникающие в силу возможного токсического действия активных фармацевтических

ингредиентов, особенно новых химических соединений. Кроме того, детям трудно делать

обоснованные утверждения о различиях в восприятии вкуса [2]. В частности, могут возникнуть

трудности с проведением исследования вкуса с участием пациентов детского возраста, а общий

подход, основанный на конкретных особенностях детей, еще не установлен [3].

В качестве альтернативы были разработаны электронные вкусовые сенсорные системы,

которые все чаще используются для прогнозирования вкусовых качеств фармацевтических

препаратов [4-6]. С помощью электронных языков можно преодолеть некоторые проблемы

этического характера, связанные с оценкой вкусовых качеств лекарственных средств,

поскольку число образцов, предназначенных для дегустационной комиссии, может быть

уменьшено. В частности, оценка вкусовых качеств на ранней стадии разработки препарата

может проводиться без сведений о его токсичности. Помимо этого, сенсорные системы могут

применяться и в других областях: контроль качества, испытания стабильности и скрининг [7,8].

В продаже имеются две системы типа «электронный язык»: вкусовая сенсорная система

SA402B (Insent Inc., г. Ацуги-си, Япония) и электронный язык α-ASTREE (Alpha M.O.S, г.

Тулуза, Франция) [9]. Обе системы оценивают изменения электронного потенциала при

исследовании жидких образцов, но основные сенсорные технологии различны. Вкусовая

сенсорная система SA402B оснащена липидными мембранными сенсорами [10-14], тогда как α-

ASTREE использует ChemFET (полевой транзистор, изготовленный химическим методом).

Кроме того, разрабатываются и другие вкусовые сенсорные системы, такие как, например,

вольтамперометрический электронный язык [9].

На сегодняшний день проведено несколько исследований с использованием электронных

языков [15-17]. При производстве липидных пеллет натрия бензоата была исследована

маскировка вкуса с использованием электронных языков, испытания на растворение и

привлечением дегустационной комиссии [18]. Результаты этих подходов сравнивались между

собой. Стала возможна корреляция между предварительными оценками вкусовых качеств,

полученных с помощью электронного языка, испытания на растворение и дегустационной

комиссии. Kayumba и соавт. [19] разработали покрытые оболочкой пеллеты, содержащие

хинина сульфат, и для обнаружения изменения интенсивности горькости в зависимости от

времени был использован электронный язык α-ASTREE. По этой причине электронный язык

служил инструментом для выбора наилучшего состава среди пеллет с различной толщиной

покрытия.

Тем не менее, по-прежнему существует необходимость узнать больше о вкусовых

сенсорных системах. Ни одно из исследований ранее не касалось валидации метода, и

систематического подхода для испытаний эксплуатационных ограничений до сих пор не

существует. Исследователи и фармацевтическая отрасль требуют достоверные и

воспроизводимые данные анализа [8].

Квалификация состоит их четырёх основных элементов. Квалификация проекта (DQ)

означает документальное подтверждение пригодности предлагаемого проекта оборудования

для его предусмотренного использования; квалификация монтажа (IQ) является

документальным подтверждением того, что оборудование работает эффективно и в

соответствии со спецификацией; квалификация функционирования (OQ) предполагает

документальное подтверждение соответствия работоспособности оборудования; и

квалификация эксплуатации (PQ) означает документированное подтверждение соответствия

надежности и эффективности эксплуатационных параметров технологического оборудования

[20]. В то время как IQ и OQ были изучены и представлены в других исследованиях,

квалификация эксплуатации еще не была продемонстрирована для вкусовых сенсорных систем.

В данном исследовании для проведения измерений использовалась вкусовая сенсорная система

SA402B с целью создания сертифицированной системы. Семь липидных мембранных сенсоров,

представляющих различные вкусовые раздражители, были исследованы в отношении

специфичности, линейности, диапазона аналитической методики, точности, прецизионности,

предела обнаружения и количественного определения, а также робастности. Были опробованы

подходы в соответствии с руководством ICH Q2 [21], и реализованы адаптированные

альтернативные методы.

Поскольку активные фармацевтические ингредиенты часто проявляют горький вкус, что

может привести к нарушению пациентами режима лечения, в качестве модельного препарата

был выбран хинина гидрохлорид. Хинина гидрохлорид является одним из самых горьких

препаратов, значение показателя горечи которого принято за 200 000 [22]. В соответствии с

Европейской фармакопеей показатель горечи определяется как «величина, обратная

максимальному разведению исследуемого вещества, жидкости или экстракта, в которых всё

еще ощущается горький вкус». Для аттестации членов дегустационной комиссии необходимо,

чтобы каждый участник попробовал определенные концентрации водных растворов хинина

гидрохлорида. При испытании растворов участники аттестовываются или исключаются из

комиссии, если они не способны различить на вкус самую высокую концентрацию (0,015

ммоль). Тем не менее, основное внимание было уделено выяснению того, возможно ли создать

сертифицированную систему и надёжный метод, а не описать характеристики хинина

гидрохлорида. Цель состояла в том, чтобы приобрести опыт и знания о вкусовой сенсорной

системе, а также определить, как и в какой степени электронный язык может использоваться в

качестве аналитического средства.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Химические вещества и реагенты

 Хинина гидрохлорид (Caesar & Loretz GmbH, г. Хильден, Германия).

 Стандартный образец USP хинина гидрохлорида (PHAST Quality standards GmbH, г.

Хомбург, Германия).

 Хлористый калий (Grüssing GmbH, г. Фильзум, Германия).

 Винная кислота (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, г. Зельце, Германия).

 Абсолютный этанол [чистота 99,8 %] (VWR International, г. Лёвен, Бельгия).

 Хлороводородная кислота [1 моль/л] и раствор гидроксида калия [0,1 моль/л] (Merck

KGaA, г. Дармштадт, Германия).

 Внутренний раствор для сенсоров и электродов сравнения [3,33 моль/л хлорида калия

в насыщенном растворе хлорида серебра] (Insent Inc., г. Ацуги-си, Япония).

 Ацетаминофен (Rhodia Deutschland GmbH. г. Фрайбург, Германия).

 Натрия бензоат (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, г. Зельце, Германия).

 Хлорид натрия (VWR International, г. Лёвен, Бельгия).

 Хинина сульфат и сахарин натрия (Caesar & Loretz GmbH, г. Хильден, Германия).

 Хинина бензоат (S.C. Microsin S.R.L, г. Бухарест, Румыния).

Вода была деминерализована методом обратного осмоса. Дистиллированная вода была

получена в лабораторных условиях путём дистилляции деминерализованной воды.

2.2. Сенсоры

Сенсоры и электроды сравнения были приобретены у компании «TecLabS» Europe OHG

(г. Эссен, Германия). Для обеспечения воспроизводимости электрохимических измерений

каждый сенсор перед испытанием наполняли 0,2 мл насыщенного раствора хлористого серебра

(AgCl), называемого «внутренним раствором» (см. Раздел 2.1). Электрод сравнения полностью

заполняли внутренним раствором. Все сенсоры были предварительно обработаны стандартным

раствором за один день до измерения.

2.3. Приготовление стандартного, промывочного и испытуемого растворов

Растворы хинина гидрохлорида готовили в деминерализованной воде в различных

концентрациях (0,0005-150 ммоль). Два промывочных раствора для отрицательно и

положительно заряженных сенсоров были получены путём разбавления абсолютного этанола

дистиллированной водой до 30 % этанола и прибавления 100 ммоль хлороводородной кислоты

для отрицательно заряженных сенсоров или 100 ммоль хлористого калия и 10 ммоль

гидроксида калия для положительно заряженных сенсоров. Стандартный раствор,

предназначенный для очистки, а так же служащий в качестве «раствора сравнения», готовили

путём растворения 30 ммоль хлористого калия и 0,3 ммоль винной кислоты в

дистиллированной воде.

2.4. Система типа «электронный язык» и измерительная установка

Все измерения проводились на вкусовой сенсорной системе SA402B (Insent Inc., г. Ацуги-

си, Япония). Данный электронный язык оснащён семью липидными мембранными сенсорами,

обеспечивающими распознавание различных вкусовых качеств, и тремя соответствующими

электродами сравнения. Система предполагает потенциометрический принцип измерения, а

реакции сенсора получают в виде значений мВ. Согласно уравнению Нернста, потенциал

электрода логарифмически зависит от активности вещества [23,24].

(1)

Где:

U = потенциал электрода

U0 = стандартный потенциал

R = универсальная газовая постоянная

T = температура (по Кельвину)

z = ионная валентность вещества

F = константа Фарадея

ai = активность вещества

ai = fi ci (2)

Где:

ci = концентрация вещества

fi = коэффициент активности вещества

Имелось три сенсора, специфичных для определения показателя горечи: сенсор горечи 1

(SB2AC0), сенсор горечи 2 (SB2AN0) и сенсор горечи 3 (SB2C00). Другие сенсоры отвечают на

вкусовые раздражители умами (SB2AAE), солености (SB2CT0), кислости (SB2CA0) и

терпкости (SB2AE1). Кроме того, на горечь, умами и терпкость может быть измерен

остаточный вкус.

Проверка сенсоров проводилась регулярно перед каждым измерением, чтобы убедиться,

что они работают на правильном пределе мВ. Каждый образец измеряли четыре раза, тогда как

один цикл измерения (рис. 1) состоял из измерения стандартного раствора (Vr), затем

испытуемого раствора (Vs), короткой процедуры очистки (2 × три секунды) и измерения

остаточного вкуса (Vr'). Остаточный вкус измеряли путем определения изменения потенциала

мембраны, вызванного адсорбцией вещества на липидную мембрану после короткой процедуры

очистки. Интерпретация остаточного вкуса не получила дальнейшей оценки, поскольку

полученный результат в большей степени зависит от типа исследуемого вещества или состава,

чем от сенсора. Как выходной сигнал сенсора по вкусовому показателю, также называемый

относительным значением (R), так и выходной сигнал сенсора по остаточному вкусу,

именуемый значением CPA (изменение потенциала мембраны, вызванное адсорбцией),

рассчитывали по отношению к предварительно установленной реакции сенсора на стандартный

раствор (Vr).

R = Vs - Vr (3)

CPA = Vr' - Vr (4)

Рисунок 1. Методика измерения образца

Вся процедура измерения была выполнена для всех образцов и впоследствии повторялась

до четырех раз. Для дальнейшей обработки данных первый цикл был исключен в соответствии

с рекомендациями поставщика в силу доведения сенсоров до установленных технических

требований. Кроме того, была предусмотрена возможность вычисления так называемой

вкусовой информации по реакции сенсора для установления сопоставимости со вкусовыми

ощущениями человека. Чтобы не сравнивать исходные данные без какой-либо предварительной

обработки или преобразования, данный расчёт был здесь пропущен.

2.5. Оценка результатов

Результаты выражали в виде исходных данных (мВ) относительного измерения

испытуемого образца в сравнении со стандартным. Оценивали или отдельные результаты

сигнала сенсора или объеденные за счёт многофакторного анализа данных. Для

многофакторного анализа исходные данные предварительно обрабатывали с помощью

центрирования путём вычитания среднего значения и масштабирования до единичной

дисперсии. Обработку данных, графические иллюстрации и статистическую интерпретацию

результатов выполняли с использованием Excel 2007 (Microsoft, г. Редмонд, США) и SIMCA-P

+ v11.5 (Umetrics AB, г. Умео, Швеция).

2.6. Квалификация эксплуатации (PQ)

Для проведения квалификации электронного языка в качестве модельного вещества

неприятных на вкус препаратов использовали хинина гидрохлорид. Руководство ICH Q2 [20]

служило в качестве справочного источника для обработки информации, необходимой для

создания сертифицированной системы, а также достоверного метода. Все пункты, упомянутые

в руководстве, были рассмотрены и обсуждены.

2.6.1. Специфичность

Подходы к определению специфичности, предложенные в руководстве ICH Q2, оказались

непригодны, поскольку они направлены на валидацию метода, специфичного для исследуемого

вещества. Так как проверка маскировки вкуса является основной целью измерения, сенсоры не

могут быть специфичными только для одного вещества. Каждый агент, присутствующий в

растворе, который измеряется, более или менее взаимодействует с липидной мембраной

сенсоров, из чего рассчитывается сигнал (мВ). В качестве альтернативного метода три

различных лекарственных вещества были исследованы в деминерализованной воде по 1,0

ммоль чистого вещества и в смеси, содержащей 1,0 ммоль каждого вещества. В дополнение к

катионному хинину гидрохлориду в качестве вещества с горьким вкусом, обладающего

нейтральными свойствами, был выбран ацетаминофен. В качестве анионного горького

вещества был выбран сахарин натрия, известный своим горьким вкусом при высоких

концентрациях. Второй подход предусматривал исследование хинина гидрохлорида, хинина

бензоата, натрия бензоата и хинина сульфата по 0,1 ммоль в деминерализованной воде с целью

оценки влияния противоиона вещества. Из-за плохой растворимости в воде концентрации

хинина бензоата составляли 0,1 ммоль. Кроме того, были измерены смеси хинина гидрохлорида

и натрия бензоата (0,1 ммоль) с добавлением 0,1 ммоль хлорида натрия и без него. Хлорид

натрия был добавлен для имитации ионной пары, полученной в результате смешивания хинина

гидрохлорида и натрия бензоата.

2.6.2. Линейность

Для определения зависимости между концентрацией и реакцией сенсора, выраженной в

виде разницы со стандартным образцом (см. уравнение (3)), были построены калибровочные

кривые 31 различной концентрации (0,0005-150 ммоль хинина гидрохлорида в

деминерализованной воде). Самая низкая концентрация составляла 0,0005 ммоль. Верхний край

серий концентраций соответствовал пределу растворимости хинина гидрохлорида (150 ммоль).

Затем линейность определялась в соответствии с руководством путем повторного исследования

пяти концентраций в наблюдаемом диапазоне линейно-логарифмической зависимости при

помощи линейной регрессии. Путём построения зависимости реакции сенсора (мВ) от

логарифма концентрации были получены графики. Результаты были выражены путем

3. Диапазон аналитической

методики

– линейность,

точность, прецизионность

определения сдвига по оси Y, наклона линии регрессии, остаточного стандартного отклонения

и коэффициента детерминации.

2.6.3. Диапазон аналитической методики

Соответствующий диапазон оценивался путем подтверждения допустимой степени

линейности, точности (98-102 %) и прецизионности (RSD < 4 %) для каждого сенсора.

Линейность считалась приемлемой, если коэффициент детерминации (R2) превышал 0,98, а

остаточные погрешности были равномерно распределены.

2.6.4. Точность

Точность сенсоров была определена при трех различных концентрациях препарата (0,2,

0,3 и 1,0 ммоль хинина гидрохлорида в деминерализованной воде) в образце, используемом при

лабораторных условиях, и в стандартном образце USP. Образцы были измерены три раза, а

реакции сенсоров каждого цикла сравнивались друг с другом по каждому образцу и сенсору.

Точность оценивалась путем расчёта разности между образцом, используемом при

лабораторных условиях, и стандартным образцом USP совместно со стандартными

отклонениями и доверительными интервалами [95 %].

2.6.5. Прецизионность

Путем измерения образцов в трех параллельных испытаниях в один и тот же день была

определена повторяемость, тогда как внутрилабораторная прецизионность была установлена в

три разных дня для разных образцов. Прецизионность была исследована в трех различных

концентрациях (хинина гидрохлорид в деминерализованной воде) в пределах линейного

диапазона каждого сенсора и выражалась как относительное стандартное отклонение (RSD).

Воспроизводимость, обычно подтверждаемая межлабораторным сличением, не исследовалась.

Внедрение руководства ICH Q2

1. Специфичность – реакция сенсора [мВ]

неспецифична 

возможно распознавание

маскировки вкуса

2. Линейность – функция логарифмически

зависит от концентрации (5 конц.), n = 3, s,

наклон, сдвиг по оси Y, R2, остаточное СО

4. Точность – сравнение со стандартным

образцом USP; 3 концентрации, n = 3, RSD

[%], доверительный интервал [95 %].

5. Прецизионность – в пределах одного

дня n = 3, RSD [%] (повторяемость);

в разные дни n = 9, RSD [%]

(внутрилабораторная прецизионность)

6. Предел обнаружения – визуальная

оценка

Рисунок 2. Руководство по квалификации вкусовой сенсорной системы

2.6.6. Предел обнаружения

Были измерены различные концентрации хинина гидрохлорида (0,0005-100 ммоль в

деминерализованной воде), и каждый метод, упомянутый в руководстве ICH Q2, был опробован

с целью оценки наилучшего подхода для определения предела обнаружения (таблица 1).

Деминерализованная вода использовалась в качестве холостого раствора. Кроме того, были

исследованы концентрации, необходимые для проведения испытания с участием человека, в

соответствии с Европейской фармакопеей (0,009-0,015 ммоль в деминерализованной воде) для

достижения сопоставимости со вкусовыми ощущениями человека [22].

2.6.7. Предел количественного определения

Были измерены различные концентрации хинина гидрохлорида (0,0005-100 ммоль в

деминерализованной воде). В соответствии с оценкой предела обнаружения, были выполнены

все методы, упомянутые в руководстве ICH Q2, для выявления соответствующего подхода,

определяющего предел количественного определения сенсоров.

2.6.8. Робастность

Обычно робастность оценивается путем внесения незначительных изменений в систему,

чтобы показать её стабильность во время типового использования. Поскольку известно, что

небольшие изменения температуры, рН и срока службы сенсоров могут оказывать огромное

влияние на сигнал, испытание робастности не проводилось в явном виде, как это было

предложено в ICH Q2. Дополнительные факторы, не упомянутые в руководстве, влияющие на

робастность, были отмечены во время измерений и будут обсуждаться в разделе результатов,

поскольку они могут быть специфичны для вкусовой сенсорной системы.

Таблица 1. Походы к установлению пределов обнаружения и количественного определения,

перечисленные и пронумерованные в соответствии с ICH Q2.

Предел обнаружения

Предел количественного определения

6.1. На основе результатов визуальной

оценки

7.1. На основе результатов визуальной

оценки

6.2. На основе соотношения сигнал/шум (2:1

или 3:1)

7.2. На основе соотношения сигнал/шум

(10:1)

6.3. На основе стандартного отклонения

отклика и угла наклона

7.3. На основе стандартного отклонения

отклика и угла наклона

6.3.1. На основе стандартного отклонения

холостой пробы

7.3.1. На основе стандартного отклонения

холостой пробы

6.3.2. На основе калибровочной кривой

7.3.2. На основе калибровочной кривой

7. Предел количественного определения –

визуальная оценка

8. Робастность – важные параметры:

температура, срок службы и перечень работ

по ремонту сенсоров

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Квалификация эксплуатации (PQ)

После выполнения квалификации проекта (DQ), квалификации монтажа (IQ) и

квалификации функционирования (OQ) можно было квалифицировать вкусовую сенсорную

систему, используя рекомендации ICH Q2. С точки зрения DQ были исследованы все

имеющиеся в продаже сенсоры. IQ и OQ проводились путем регулярных проверок сенсоров

перед каждым измерением и ежемесячных измерений при техническом обслуживании.

Определение специфичности и робастности проводилось измененным способом, и был

определен наилучший метод оценки предела обнаружения. Кроме того, было разработано

усовершенствованное руководство на основе руководства ICH (рис. 2).

3.1.1. Специфичность

В силу принципа измерения вкусовой сенсорной системы ни подлинность, ни чистота, ни

содержание аналита не могут быть определены. Но рассматривая результаты выполненных

альтернативных методов (табл. 2 и 3) можно сделать некоторые интересные выводы.

Таблица 2. Специфичность – реакции сенсора [мВ] на различные горькие на вкус препараты

(1,0 ммоль чистого вещества и 1 ммоль эквимолярной смеси); x ± s (n = 3).

1 ммоль

[мВ] ± s

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

Хинина

гидрохлорид

70,98

(±3,05)

29,34

(±0,78)

29,38

(±1,09)

−18,74

(±0,13)

59,40

(±0,30)

−3,55

(±0,23)

69,48

(±0,28)

Ацетаминофен

−91,49

(±2,13)

−83,94

(±3,53)

−14,44

(±6,32)

−43,16

(±2,07)

76,80

(±0,27)

−54,15

(±1,65)

111,97

(±1,62)

Сахарин

натрия

−76,15

(±0,14)

−65,99

(±1,00)

−121,28

(±0,83)

−43,06

(±0,34)

−31,56

(±1,84)

−54,67

(±0,53)

−103,26

(±0,05)

Хинина

гидрохлорид +

ацетаминофен

+ сахарин

натрия

55,94

(±3,30)

29,18

(±0,53)

−99,73

(±0,12)

−26,11

(±0,41)

−23,60

(±1,16)

−9,00

(±0,27)

−100,55

(±0,11)

3.1.1.1. Влияние ионной структуры на реакции сенсора. Сенсоры определения горькости 1 и 2

могли бы обнаружить хинина гидрохлорид лучше, чем ацетаминофен или сахарин натрия,

поскольку сигнал сенсора, полученный для 1 ммоль эквимолярной смеси из трех веществ, был

аналогичен одиночному сигналу сенсора определения хинина гидрохлорида (таблица 2).

Сенсор определения горькости 3 обнаружил все три вещества, но реакция сенсора на смесь

была наиболее похожа на одиночный сигнал сахарина натрия. Сенсор определения горькости 2

дал практически идентичную реакцию мВ на чистый хинина гидрохлорид и в присутствии

ацетаминофена и сахарина натрия. Для визуализации результатов по данным наблюдениям

были получены схемы PCA (метода главных компонент) (рис. 3a и b). Для обеих схем PCA

основная дисперсия объясняется первой компонентой, осью X. Меньшая доля дисперсии,

охватываемая второй главной компонентой, показана на оси Y. Таким образом, различия

образцов можно наблюдать вдоль оси X, в то время как разброс значений одного образца по

причине шума при измерении показан по оси Y. Схема PCA, полученная с помощью сенсоров

определения горькости 1 и 2, умами и кисловатости (рис. 3a) показывает, что реакции сенсора

на смесь были похожи на реакции сенсора на хинина гидрохлорид, в то время как схема PCA,

построенная с помощью остальных сенсоров, свидетельствует о том, что смесь оказалась

аналогичной сахарину натрия (рис. 3b). Это можно объяснить разным покрытием липидной

мембраны сенсоров. Сенсоры определения горькости 1 и 2 более специфичны для

катионогенных поверхностно-активных веществ, поскольку они покрыты отрицательно

заряженными липидами, в то время как сенсор определения горькости 3 покрыт положительно

заряженными липидами и особенно реагирует на анионогенные поверхностно-активные

вещества. В заключение следует отметить, что некоторые сенсоры более аффинны к какому-

либо типу вещества, однако не существует специфичности только к одному веществу, что

является важным условием для оценки того, была ли маскировка вкуса успешной или нет.

Заостряя внимание на ацетаминофене, он не был обнаружен вблизи смеси ни одним

сенсором. Кроме того, были определены отклонения выходных сигналов сенсора при

последующих измерениях, что привело к заключению, что выявление неионогенных веществ

может вызвать трудности, поскольку для получения достоверного сигнала сенсора необходима

проводимость. Это предположение нуждается в дальнейшем анализе путем исследования

большего количества неионогенных веществ совместно с измерениями линейности.

3.1.1.2. Влияние противоиона. При изменении противоиона различия между образцами были в

основном обнаружены тремя сенсорами определения горькости (таблица 3). Из всех сенсоров

определения горькости самые высокие значения мВ были получены для хинина гидрохлорида и

хинина сульфата, тогда как самое низкое значение было найдено для натрия бензоата. Между

ними была установлена реакция сенсора на хинина бензоат. Поэтому можно предположить, что

хинина бензоат был обнаружен как своего рода смесь между хинином гидрохлорида и натрием

бензоата. Этот факт может быть доказан на примере смесей хинина гидрохлорида и натрия

бензоата с хлоридом натрия и без него (рис. 4). Обе смеси приводят к тому же сигналу сенсора,

что и чистый хинина бензоат. Чтобы смоделировать образование ионной пары путем

смешивания хинина гидрохлорида и натрия бензоата, прибавляют NaCl. В результате

присутствие хлорида натрия не оказывает влияния на реакцию сенсора определения горькости,

в то время как присутствие различных горьких на вкус веществ имеет определенное влияние.

Из данного испытания можно сделать вывод о целесообразности дальнейших измерений

маскировки вкуса, так как сенсоры не являются специфичными только для одного вещества, и

произошло столкновение различных веществ на мембране сенсора. Это важный результат,

показывающий достоверность работы сенсоров. При измерении маскировки вкуса можно

обнаружить присутствие маскирующего агента и неприятный на вкус АФИ, и можно было бы

добиться сравнения с приятным на вкус плацебо. Учитывая этот аспект, становится очевидным,

насколько важно предварительное измерение отдельных и вспомогательных веществ для

анализа сложных матриц.

Рисунок 3 (a,b). Анализ главных компонент, представляющих собой реакции сенсора на

ацетаминофен [1 ммоль], хинина гидрохлорид [1 ммоль], сахарин натрия [1 ммоль] и смеси из 1

ммоль каждого вещества

Таблица 3. Специфичность – реакции сенсора [мВ] на лекарственные средства с разными

противоионами (0,1 ммоль чистого вещества и в 0,1 ммоль эквимолярной смеси); x ± s (n = 3).

0,1 ммоль

[мВ] ± s

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

Хинина

гидрохлорид

−2,82

(±1,03)

−47,34

(±0,49)

−16,13

(±4,49)

−46,53

(±1,82)

91,03

(±0,42)

−52,45

(±1,71)

107,14

(±3,12)

Хинина

бензоат

−16,56

(±1,18)

−70,09

(±1,03)

−20,67

(±3,96)

−49,96

(±2,02)

92,92

(±0,81)

−62,37

(±2,31)

84,06

(±1,32)

Хинина

бензоат +

NaCl

−17,21

(±1,17)

−70,58

(±0,67)

−19,29

(±3,47)

−45,52

(±0,42)

90,23

(±1,13)

−58,91

(±1,15)

80,37

(±1,20)

Хинина

гидрохлорид +

натрия

бензоат

−18,87

(±0,99)

−71,46

(±0,23)

−19,48

(±3,59)

−46,52

(±0,80)

90,10

(±0,97)

−59,26

(±1,68)

85,42

(±1,99)

Натрия

бензоат

−113,26

(±0,93)

−118,98

(±1,28)

−56,23

(±6,53)

−53,49

(±1,58)

91,05

(±0,49)

−73,87

(±1,51)

89,70

(±1,37)

Хинина

сульфат

22,94

(±1,16)

−25,42

(±0,24)

−7,56

(±2,84)

−39,42

(±0,89)

96,66

(±0,98)

−39,62

(±0,76)

111,91

(±5,12)

3.1.2. Линейность

Для каждого сенсора наблюдалась линейность, логарифмически зависящая от

концентрации. Установлено, что для прибора характерна логарифмическая зависимость между

концентрацией и откликом сенсора. Это можно объяснить уравнением Нернста, которое

включает в себя логарифм активности измеряемого вещества (уравнение (1)). Восприятие вкуса

у человека зачастую имеет ту же природу. Согласно закону Вебера-Фехнера реакция человека

на интенсивность вкусовых раздражителей логарифмически зависит от концентрации

пробуемого вещества. Как только достигается определенная пороговая концентрация,

дифференциация интенсивности вкуса становится невозможной [25, 26].

В таблице 4 приведены диапазоны логарифмической линейности для семи сенсоров со

сдвигом по оси Y, наклоном линии регрессии, остаточным стандартным отклонением и

коэффициентом детерминации.

Наклон калибровочных кривых сенсоров определения терпкости и солёности был

отрицательным, тогда как для остальных сенсоров был получен положительный наклон. Это

имеет важное значение при интерпретации дальнейших измерений (маскировки вкуса). Не

существует абсолютного значения, указывающего на вкусовые качества препарата. Результаты

всегда должны быть интерпретированы в соответствии с предварительно выполненной

калибровкой, чтобы оценить вкусовые качества. Это может быть сделано путем оценки одного

определенного сенсора, а также с помощью многофакторного анализа данных. Используя

регрессию по методу дробных наименьших квадратов можно построить модель, состоящую из

соответствующих откликов сенсоров. Препараты с маскировкой вкуса можно сравнить либо с

одномерной калибровкой, либо с многомерной моделью. Что касается выявления горькости, то

сенсор определения горькости 1 имел большой диапазон линейности (0,01-10 ммоль) с R2 =

0,995, тогда как сенсор определения горькости 2 также имел большой диапазон,

расположенный в более высоких диапазонах концентраций (0,02-50 ммоль) с R2 = 0,993. Сенсор

определения горькости 3 показал логарифмическую линейность, зависимую от концентрации, в

пределах меньшего интервала концентрации (0,03-5 ммоль). И это неудивительно, поскольку

сенсор определения горькости 3 имеет положительно заряженную липидную мембрану, которая

точнее обнаруживает отрицательно заряженные вещества. В конце концов все сенсоры

демонстрируют надлежащий линейный диапазон с приемлемым R2, что актуально для

аналитических измерений. Диапазоны линейности включают концентрации доз хинина,

которые терапевтически используются для лечения малярии [27].

Таблица 4. Линейность сенсоров относительно хинина гидрохлорида (используемый в

лабораторных условиях образец).

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

Линейный

диапазон

концентраций

(ммоль); 5

концентраций

0,01-10

0,02-50

0,03-5

0,1-10

0,2-100

0,05-10

0,2-100

Сдвиг по оси

73,21

42,01

12,67

-9,91

70,97

10,57

73,02

Наклон линии

регрессии

75,49

81,09

28,43

41,00

-45,32

54,57

-48,61

Остаточное

стандартное

отклонение

7,14

10,52

1,94

4047

3,37

5,59

1,57

Коэффициент

R2 = 0,995

R2 = 0,993

R2 = 0,995

R2 = 0,985

R2 = 0,996

R2 = 0,991

R2 = 0,999

детерминации

3.1.3. Диапазон аналитической методики

Диапазон был установлен путем демонстрации надлежащей степени линейности,

прецизионности и точности для каждого сенсора (табл. 4-6). Точность определялась при трех

соответствующих концентрациях и считалась допустимой для более высоких и более низких

концентраций.

3.1.4. Точность

Определение точности проводилось по методу испытания с применением стандартного

образца USP хинина гидрохлорида. В таблице 5 показана разница между стандартным и

используемым в лабораторных условиях образцами с соответствующими стандартными

отклонениями и доверительными интервалами. Значения (98,00-100,53 %) в допустимом

диапазоне были найдены для всех сенсоров, несмотря на сенсор определения горькости 2,

который имел 109,2 % по отношению к СО с относительным стандартным отклонением 11,2 %.

Причина такого отклонения остается неясной, поскольку линейность была задана для всего

диапазона, а прецизионность считалась удовлетворительной. Для остальных сенсоров точность

считалась установленной для заданного диапазона.

Таблица 5. Точность – сравнение используемого в лабораторных условиях образца хинина

гидрохлорида со стандартным образцом USP.

ммоль

Точность между используемым в лабораторных условиях образцом и

стандартным образцом USP [%]

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

0,2

97,90

108,85

101,39

100,21

99,23

101,41

99,94

0,3

97,21

121,61

98,48

100,57

100,08

103,81

99,35

1,0

98,88

97,12

101,72

100,13

100,64

96,24

101,20

Среднее

значение [%]

98,00

109,19

100,53

100,30

99,98

100,49

100,16

Стандартное

отклонение

0,84

12,25

1,78

0,23

0,71

3,87

0,95

Относительное

стандартное

отклонение

[%]

0,86

11,22

1,77

0,23

0,71

3,85

0,95

95 % ДИ (с)

97,04

95,33

98,52

100,04

99,18

96,11

99,09

95 % ДИ (до)

98,95

123,06

102,55

100,57

100,79

104,87

101,24

3.1.5. Прецизионность

В пределах линейного диапазона были исследованы промежуточная прецизионность в

пределах суток и межсуточная прецизионность (табл. 6). Допустимые значения относительных

стандартных отклонений были определены как < 4 %. Повторяемость была обнаружена при

значениях относительных стандартных отклонений менее 4 % для всех сенсоров, кроме сенсора

определения горькости 3 и сенсора определения кисловатости. Различия в выходном сигнале

сенсора при последующих измерениях того же образца обусловлены дрейфом, который был

вызван наименьшей аффинностью положительного заряженного сенсора и отрицательного

заряженного вещества. На рис. 5 показаны значения напряжения [мВ] всех сенсоров для

четырех последующих измерений 1,0 ммоль хинина гидрохлорида в водном растворе.

Принимая во внимание тот факт, что первый цикл не учитывается, можно увидеть, что для

сенсоров определения горькости 1, 2, 3 и кисловатости имеются отклонения. Однако

коэффициент вариации для сенсоров определения горькости 3 и кисловатости был высок.

Внутрилабораторная прецизионность, которая была исследована в течение 6 месяцев, не

показала приемлемых значений ни для одного сенсора. Можно отметить, что относительные

стандартные отклонения были в целом выше по сравнению с отклонениями, полученными от

промежуточной прецизионности в пределах суток, а сенсоры со слабой реакцией при

измерениях в течение суток показали еще более высокие отклонения при межсуточном

сравнении. Это позволяет сделать вывод, что отклонения были вызваны общими изменениями,

влияющими на метод испытания. Дальнейшие предположения будут обсуждаться в разделе о

робастности.

Таблица 6. Прецизионность для хинина гидрохлорида при трех концентрациях в пределах

оцениваемого линейного диапазона: промежуточная прецизионность в пределах суток n = 3,

межсуточная прецизионность n = 9.

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

Линейный диапазон

концентрации

[ммоль]

0,01-10

0,02-50

0,03-5

0,1-10

0,2-100

0,05-10

0,2-100

Повторяемость

(внутрисуточная)

RSD [%]

0,01 ммоль

1,92

1 ммоль

1,39

10 ммоль

0,47

0,02 ммоль

3,35

2 ммоль

0,82

50 ммоль

1,19

0,03 ммоль

10,17

1 ммоль

7,51

5 ммоль

3,02

0,1 ммоль

2,63

1 ммоль

0,47

10 ммоль

1,89

0,2 ммоль

0,69

2 ммоль

0,03

100 ммоль

1,8

0,05 ммоль

4,35

5 ммоль

6,65

10 ммоль

5,03

0,2 ммоль

1,86

2 ммоль

0,19

100 ммоль

0,71

Внутрилабораторная

прецизионность

(межсуточная) RSD

[%]

0,01 ммоль

32,29

21 ммоль

12,76

10 ммоль

5,55

0,02 ммоль

20,07

2 ммоль

21,40

50 ммоль

3,17

0,03 ммоль

32,38

1 ммоль

54,75

5 ммоль

6,72

0,1 ммоль

0,92

1 ммоль

11,65

10 ммоль

10,96

0,2 ммоль

8,52

2 ммоль

7,97

100 ммоль

2,37

0,05 ммоль

8,01

5 ммоль

25,63

10 ммоль

22,31

0,2 ммоль

3,87

2 ммоль

4,00

100 ммоль

2,47

Рисунок 4. Сигналы сенсоров определения горькости 1-3 на хинина гидрохлорид, хинина

бензоат, хинина бензоат + хлорид натрия, смесь хинина гидрохлорида и натрия бензоат, и

хинина сульфат (по 0,1 ммоль каждого вещества), x ± s (n = 3).

3.1.6. Предел обнаружения

Наиболее точным и удобным методом определения предела обнаружения был подход,

основанный на визуальной оценке. Это обусловлено рядом причин. В целом можно заключить,

что предел обнаружения (ммоль) варьировался между различными подходами (таблица 7). Для

каждого сенсора предел обнаружения хинина гидрохлорида определялся при более высоком

значении концентрации с использованием подхода ICH Q2 6.3.1. При использовании отношения

«сигнал/шум» будут оцениваться равнозначные или несколько более высокие пределы

обнаружения в сравнении с визуальной оценкой. В качестве холостой пробы выступала

деминерализованная вода, а диапазон трех последующих измерений деминерализованной воды

рассматривался как шум.

Таблица 7. Пределы обнаружения хинина гидрохлорида, установленные с помощью различных

подходов, описанных в руководстве ICH Q2.

Метод

(ICH Q2)

Предел обнаружения [ммоль]

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

6.1. Визуальная

оценка

0,0025

0,02

0,03

0,05

0,2

0,05

0,1

6.2. Отношение

сигнал/шум

0,0025

0,02

0,1

0,2

0,1

0,2

6.3.1. На основе

стандартного

отклонения

холостой пробы

0,05

0,04

1,00

0,45

0,25

0,28

0,21

6.3.2. На основе

калибровочной

кривой

0,06

0,02

0,23

0,05

0,09

0,04

Поэтому в некоторых случаях предел обнаружения смещался к более высоким значениям

концентрации за счет изменения сигналов сенсоров на деминерализованную воду (рис. 6).

Результаты метода ICH Q2 6.3.2 оказались непригодны, поскольку кривая изменения

концентрации не пересекала исходную точку и приводила к слишком высоким пределам

обнаружения по сравнению с визуальной оценкой. По сравнению со вкусовым ощущением

человека сенсор определения горькости 1 смог пройти калибровку, которая требуется

Европейской фармакопеей [22]. В соответствии с этой калибровкой участникам разрешается

вступить в дегустационную комиссию, если они способны оценить горькость водных растворов

хинина гидрохлорида в концентрациях от 0,009 до 0,015 ммоль. Предел обнаружения сенсора

определения горькости 1

составил 0,0025 ммоль (рис. 7).

Рисунок 5. Дрейф сигналов при четырех последующих измерениях хинина гидрохлорида (1,0

ммоль в водном растворе).

Рисунок 6. Установление предела обнаружения/предела количественного определения с учётом

шума. Сигнал/шум 2:1; сигнал/шум 10:1 для сенсора определения горькости 3.

Рисунок 7. Установление предела обнаружения/предела количественного определения с учётом

шума. Сигнал/шум 2:1; сигнал/шум 10:1 для сенсора определения горькости 1 и сравнение с

требуемым восприятием вкуса у членов дегустационной комиссии согласно Европейской

Фармакопее.

3.1.7. Предел количественного определения

Как уже было выяснено для предела обнаружения, подходы, основанные на стандартном

отклонении отклика и наклоне, не подходили по тем же причинам. Результаты были получены с

помощью визуальной проверки и подхода «сигнал/шум» (табл. 8). Визуально установленные

пределы количественного определения соответствовали нижнему пределу линейности, за

исключением сенсора определения горькости 3 из-за отсутствия уровня прецизионности. Тем

не менее, необходимо обсудить, будет ли определение содержания являться целью измерения

вкусовых качеств и как это можно было бы сделать наилучшим образом. Учитывая результаты

испытаний внутрилабораторной прецизионности и робастности, количественное определение

может быть выполнено только при наличии актуальной калибровки. Для определения

прецизионности количественных измерений потребуются дальнейшие исследования.

Таблица 8. Пределы количественного определения хинина гидрохлорида, установленные с

помощью различных подходов, описанных в руководстве ICH Q2.

Метод

(ICH Q2)

Предел обнаружения [ммоль]

SB2AC0

Горькость

SB2AN0

Горькость

SB2C00

Горькость

SB2AAE

Умами

SB2CT0

Солёность

SB2CA0

Кисловатость

SB2AE1

Терпкость

7.1. Визуальная

оценка

0,01

0,02

0,06

0,2

0,05

0,2

7.2. Отношение

сигнал/шум

0,005

0,05

2,0

5,0

1,0

7.3.1. На основе

стандартного

отклонения

холостой пробы

0,14

0,13

3,04

1,36

0,75

0,85

0,65

7.3.2. На основе

калибровочной

кривой

0,18

0,07

0,71

0,15

0,28

0,11

0,14

3.1.8. Робастность

Результаты определения межсуточной прецизионности показывают, что вкусовая

сенсорная система чувствительна к незначительным изменениям в условиях аналитических

исследований. В качестве примера на рисунке 8a и 8b приведены последовательности

измерений возрастающих концентраций хинина гидрохлорида, выполненные в различных

условиях. Были обнаружены различия в выходном сигнале сенсора, вызванные изменениями

температуры, сроком службы, а так же перечнем работ по ремонту сенсоров. На рисунке 8a

показано, что более высокие значения мВ были получены для более низких концентраций по

сравнению с более высокими концентрациями, указанными на рисунке 8b. Это можно

объяснить разницей в температуре окружающей среды (от 22 до 28 °C). Кроме того, можно

заметить меньшие различия между сигналами сенсора тех измерений, которые были

выполнены в течение пяти последующих дней при постоянной температуре окружающей среды

22 °C (рис. 8b), по сравнению с измерениями, проведенными в течение шести месяцев (рис. 8a),

показывающими, что срок службы и ранее выполненные измерения оказывают влияние на

значение мВ.

Рисунок 8. Сигналы сенсоров определения горькости 1 и 2 на хинина гидрохлорид в разных

условиях аналитического исследования; (a) = 1-10 ммоль и (b) = 20-100 ммоль.

Даже если процедура очистки является достаточной, необратимое связывание веществ с

липидной мембраной не может быть предотвращено, и поэтому срок службы сенсоров, а также

предварительные измерения играют важную роль. С точки зрения эффекта следового переноса

обоснованность процедуры очистки была установлена во время квалификации

функционирования путём измерения метиленовых синих растворов. Изменение рН не

исследовалось, поскольку известно, что сенсоры реагируют на ионы, присутствующие в

растворе. Следовательно, изменения pH могут повлиять на реакции сенсора. В соответствии с

этими наблюдениями рекомендуется всегда иметь внешний стандарт с известной

концентрацией и ожидаемым сигналом сенсора.

Поскольку внешний стандарт должен быть исследован одновременно с подготовкой

образцов, он должен подвергаться воздействию тех же параметров среды, что и образцы.

Поэтому можно быть уверенным, что эти изменения могут быть скорректированы. Кроме того,

с целью оценки результатов актуальная калибровка должна проводиться путем исследования

определенных концентраций односоставных веществ, близких к концентрации, содержащейся в

составе препарата.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Это первый системный анализ, описывающий квалификацию вкусовой сенсорной

системы. В качестве справочной информации использовалось руководство ICH Q2 по

валидации аналитических методик, а пункты, которые были невыполнимы, адаптировали к

принципу измерения системы типа «электронный язык». Был разработан подход к

квалификации эксплуатации в соответствии с руководством ICH, который может быть

использован для квалификации других вкусовых сенсорных систем в будущем. Вкусовая

сенсорная система SA402B (Insent Inc., г. Ацуги-си, Япония) была успешно квалифицирована и

предлагает новый аналитический метод определения свойств лекарственных препаратов.

Нижний предел обнаружения хинина гидрохлорида свидетельствует о сопоставимости со

вкусовыми ощущениями человека. Тем не менее, необходимо помнить, что на сигнал сенсора

может влиять температура и, в частности, ранее проведенные измерения, а так же срок службы

сенсора. Поэтому необходимо выполнять калибровку, используя внешний стандарт. Валидация

метода для лекарственных препаратов, содержащих активный фармацевтический ингредиент и

испытание пригодности системы будут следующими шагами для получения надежного метода

оценки вкусовых качеств.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. L.M. Bartoshuk, Chem. Senses 25 (2000) 447-460.

2. J. Sjцvall, A. Fogh, B. Huitfeldt, G. Karlsson, O. Nylйn, Eur. J. Pediatr. 141 (1984) 243–247.

3. E.H. Davies, C. Tuleu, J. Pediatr. 153 (2008) 599-604.

4. P. Ciosek, W. Wrуblewski, Analyst 132 (2007) 963-978.

5. T. Ishizaka, Y. Miyanaga, J. Mukai, K. Asaka, Y. Nakai, E. Tsuji, T. Uchida, Chem. Pharm. Bull.

52 (2004) 943-948.

6. Tanigake, Y. Miyanaga, T. Nakamura, E. Tsuji, K. Matsuyama, M. Kunitomo, T. Uchida, Chem.

Pharm. Bull. 51 (2003) 1241-1245.

7. R. Daniels, Pharm. Ind. 67 (2005) 945–949.

8. R. Daniels, Pharm. Ind. 67 (2005) 1096–1100.

9. V. Anand, M. Kataria, V. Kukkar, V. Saharan, P.K. Choudhury, Drug Discov. Today 12 (2007)

257-265.

10. K. Toko, T. Matsuno, K. Yamafuji, K. Hayashi, H. Ikezaki, K. Sato, R. Toukubo, S. Kawarai,

Biosens. Bioelectron. 9 (1994) 359-364.

11. K. Toko, T. Matsuno, K. Yamafuji, Int. J. Intell. Syst. 12 (1997) 311-322.

12. K. Toko, Electroanalysis 10 (1998) 657-669.

13. K. Toko, Biosens. Bioelectron. 13 (1998) 701-709.

14. K. Toko, M. Habara, Chem. Senses 30 (Suppl. 1) (2005) i256-i257.

15. A. Legin, A. Rudnitskaya, D. Clapham, B. Seleznev, K. Lord, Y. Vlasov, Anal. Bioanal. Chem.

380 (2004) 36–45.

16. S. Takagi, K. Toko, K. Wada, T. Ohki, J. Pharm. Sci. 90 (2001) 2042-2048.

17. A. Y: Vlasov, A. Legin, Rudnitskaya, Anal. Bioanal. Chem. 373 (2002) 136-146.

18. J. Krause, Novel pediatric formulations for the drug sodium benzoate, Ph.D. thesis, Heinrich-

Heine-University, Duesseldorf, 2008.

19. P.C. Kayumba, N. Huyghebaert, C. Cordella, J.D. Ntawukuliryayo, C. Vervaet, J.P. Remon, Eur.

J. Pharm. Biopharm. 66 (2007) 460-465.

20. C. Burgess, D.G. Jones, R.D. McDowall, Analyst 123 (1998) 1879-1886.

21. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of

Pharmaceuticals for Human Use (ICH), Q2 (R1): Validation of Analytical Procedures: Text and

Methodology.

22. European Pharmacopoeia, 6th ed. (6.4), Strasbourg Cedex, France, 2008, pp. 255-256, pp. 2800-

2801.

23. J.G. Schindler, M.M. Schindler, Bioelektrochemische Membranelektroden, Walter de Gruyter,

Berlin, 1983.

24. J.A. Plambeck, Electroanalytical Chemistry: Basic Principles and Applications, Wiley-VCH, New

York, 1982.

25. R.F. Schmidt, Physiologie des Menschen, 30th ed., Springer, Heidelberg, Germany, 2007.

26. E. Mutschler, H.-G. Schaible, P. Vaupel, Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie des Menschen,

6th ed., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, Germany, 2007.

27. World health organization, Guidelines for the treatment of malaria, Geneva, Switzerland, 2006,

http://apps.who.int/malaria/docs/TreatmentGuidelines2006.pdf.