Робастность метода дКИЭФ для анализа моноклональных антител: Межлабораторное исследование

Робастность метода дКИЭФ для анализа моноклональных антител: Межлабораторное исследование

В Соединенных Штатах Америки и Швейцарии была сформирована международная группа, включающая 12 лабораторий 11 независимых биофармацевтических компаний, для оценки прецизионности и робастности метода динамического капиллярного изоэлектрофокусирования (дКИЭФ) в анализе гетерогенности моноклональных антител по заряду. Разные лаборатории определили предполагаемое значение pI и относительное распределение заряженных изоформ для характерного образца моноклонального антитела, используя один и тот же количественный анализ путем капиллярного изоэлектрического фокусирования. Проводилась статистическая оценка данных с целью определения согласованности как внутри одной лаборатории, так и между несколькими лабораториями, а так же отклонений от общей картины. Кажущаяся pI, полученная для пика каждого варианта, отличающегося зарядами, показала приемлемую прецизионность между лабораториями со значением относительного стандартного отклонения (ОСО) менее чем 0,8 %. Подобным образом ОСО процентного значения площади пика для вариантов терапевтических моноклональных антител, отличающихся зарядами, составляет менее 11 % в разных лабораториях, где разные специалисты используют различные партии амфолита и многочисленные приборы. Эти результаты подтверждают целесообразность использования динамического капиллярного изоэлектрофокусирования в биофарминдустрии в поддержку разработки технологий и официальных заявок на регистрацию лекарственных препаратов на основе моноклональных антител.

Ключевые слова: Биофармацевтический анализ / Капиллярный электрофорез / Капиллярное изоэлектрическое фокусирование / Динамическое капиллярное изоэлектрофокусирование / Межлабораторный DOI 10.1002/jssc.201200633

Бурное развитие и коммерческое использование терапевтических моноклональных антител (rMAbs) повысили необходимость в разработке независимых друг от друга аналитических методов для наблюдения и контроля гетерогенности качества препарата на основе данных белков. Регуляторные органы считают гетерогенность по заряду одним из главных показателей качества препарата, что объясняется возможным воздействием кислых и основных изоформ на фармакокинетику, биологическую активность и устойчивость при хранении¹. Недавно были опубликованы результаты межлабораторного сотрудничества десяти независимых биофармацевтических компаний в Северной Америке и Европе с целью оценить робастность обычно применяемой методики капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ) для определения гетерогенности моноклональных антител по заряду². Наблюдаемые данные pI, полученные для пика каждого варианта, отличающегося зарядами, показали приемлемую прецизионность между лабораториями со значением относительного стандартного отклонения (ОСО) менее чем 0,8 %. Подобным образом ОСО процентного значения площади пика для rMAbs, отличающихся зарядами, составляет менее 5,5 % среди разных лабораторий. Зачастую в биофарминдустрии бывает целесообразно иметь альтернативные или дополнительные методы для оценки одних и тех же качественных характеристик терапевтических белков. Такая практика снижает риски, связанные с использованием только одного источника аналитических приборов в производственно-контрольных лабораториях. Использование независимых друг от друга методов не только гарантирует непрерывный выпуск партий терапевтического препарата в случае изменений аппаратной конфигурации или доступности аналитических приборов, но и облегчает перенос метода в различные места осуществления производства лекарственного препарата. За последние несколько лет динамическое капиллярное изоэлектрофокусирование (дКИЭФ) стало важным инструментом в фармацевтической промышленности для измерения гетерогенности заряда терапевтических белков³,⁴,⁵,⁶. В дКИЭФ разделительная колонка представляет собой короткий капилляр (5 см в длину, 100 мкм – внутренний диаметр кварцевого капилляра), и процесс изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в пределах всего капилляра контролируется в режиме реального времени системой детектирования, работающей при 280 нм. Преимущество данного метода перед КИЭФ заключается в отсутствии необходимости мобилизации зон белка; поэтому различные отличающиеся зарядами варианты образца антитела могут одновременно регистрироваться детектором по всей длине капилляра, не нарушая эффективности разделения. Кроме того, продолжительность анализа дКИЭФ составляет менее 10 минут. С целью продемонстрировать возможности использования и робастности дКИЭФ в качестве общепринятой практики для определения характеристик, разработки процесса производства, выпуска партий и оценки стабильности rMAbs, был создан совместный проект 11 независимых фармацевтических компаний, куда входили 12 лабораторий, 10 из которых расположены в Северной Америке, а 2 – в Европе. В данном исследовании оценивали прецизионность одного и того же метода дКИЭФ как внутри одной лаборатории, так и между несколькими лабораториями в различных соответствующих условиях проведения испытаний, таких как разные специалисты по анализу, приборы и дни, чтобы (i) определить значение pI и (ii) относительное распределение отличающихся зарядами вариантов в образце rMAb. Робастность методики дКИЭФ была более подробно изучена с использованием двух разных партий амфолита для анализа характерного образца rMAb. Цель данного межлабораторного исследования состоит в том, чтобы облегчить признание дКИЭФ регуляторными органами и представителями фармацевтической промышленности надежной технологией, применяемой для оценки чистоты терапевтических белков, поскольку оно связано с гетерогенностью заряда.

Образец антитела представлял собой анти-альфа-1-антитрипсин мышиного mAb, приобретенный у компании EMD Calbiochem (г. Дармштадт, Германия), PN 178260. Буферный раствор для дКИЭФ был подготовлен путем добавления и смешивания следующих реактивов:

Раствор образца rMAb подготовлен путем добавления и смешивания следующих реактивов:

Образцы находились в приборе при температуре 10 °C, были подготовлены и исследованы в один и тот же день. Анолит представлял собой 80 мМ ортофосфорной кислоты, а католит – 100 мМ гидроксида натрия, оба в 0,1% метилцеллюлозе.

Все участники данного исследования использовали систему iCE280 от компании ProteinSimple, оснащенную ультрафиолетовым детектором при длине волны 280 нм и автоматическим пробозаборником PrinCE. В каждой лаборатории использовали собранную кассету для дКИЭФ от ProteinSimple и фторуглеродный капилляр с FC-покрытием длиной 5 см с внутренним диаметром 100 мкм (PN 101701). Образцы загружали в кассету и концентрировали, подавая напряжение в 1 500 В в течение 1 минуты, с последующим напряжением в 3 000 В на 4,5 минуты. Температура кассеты составляла 25 °C. Изображение концентрированных вариантов mAb, отличающихся зарядами, было получено пропусканием ультрафиолетового света с длиной волны 280 нм через капилляр и в цифровую камеру прибора с зарядовой связью.

Один и тот же испытуемый образец rMAb был предоставлен компанией ProteinSimple каждой из 12 лабораторий. Имелось 2 варианта проведения исследования. В первом варианте участники готовили и исследовали 2 разные пробоподготовки, используя одну партию веществ, включая одну партию амфолита (партия А1). Каждый образец вводили 6 раз. Во втором варианте участники готовили 2 разные пробоподготовки с использованием двух разных партий амфолита (партия А1 и партия А2) и одной партии других веществ. В этом случае каждый из четырех образцов вводился 6 раз. Названия компаний были зашифрованы в целях сохранения анонимности каждой организации. Поскольку в рамках одной компании участвовало несколько лабораторий, организации могут быть перечислены дважды. Каждый участник сообщал о выявленном значении pI и процентном значении площади пика заряженных изоформ rMAb.

Статистическая оценка проводилась на основе принципов Руководства ISO 5725-2⁷. Данные, предоставленные каждой лабораторией, были проанализированы самым внимательным образом для выявления отклоняющихся значений. Существуют 2 возможных вида отклоняющегося значения. (i) Выпадающие лаборатории, отличающиеся от других прецизионностью (сходимостью результатов). Это означает, что их результаты слишком низки или слишком высоки по сравнению с другими, что свидетельствует о систематической погрешности лаборатории. (ii) Отклоняющиеся результаты на заданном уровне отдельных лабораторий, отклоняющиеся или по прецизионности, или по среднему значению по сравнению с другими результатами на том же уровне. Со статистической точки зрения неравные значения сходимости результатов отклоняются от основополагающего предположения дисперсионного анализа, а именно от однородности дисперсий. Слишком низкие или слишком высокие результаты приводят к отклонению от нормального распределения, другого предположения при дисперсионном анализе. Графический способ оценки согласованности результатов удобен с точки зрения практического использования. В ISO рекомендуют статистики Манделя h и k. Они получаются следующим образом:

Статистический показатель kij представляет собой статистику внутрилабораторной совместимости, сравнивающую допустимое отклонение процентного отношения площади пика выбранного пика j в пределах одной лаборатории i и среднее стандартное отклонение других лабораторий для пика j, где i = 1 до p, тогда как p представляет общее количество лабораторий, а sij – допустимое отклонение параллельных анализов одного образца в пределах одной лаборатории. Статистический показатель hij – это статистика межлабораторной совместимости, которая измеряет для выбранного пика j стандартизированный вариант среднего значения процентного отношения площади пика, полученного лабораторией i ij от среднего значения этого пика ij. Статистические данные являются показателем систематической погрешности лаборатории. Величины ki и hi, полученные, как описано выше, для разных пиков, могут быть нанесены на диаграмму сгруппированно для каждой компании с критическим значением показателей k и h для уровня значимости 1 и 5 %, полученным из Руководства ISO 5725-2. Индикаторы для статистик Манделя h и k используются лишь для графического анализа совместимости лабораторий, а не для принятия решения об отказе учитывать в расчетах статистические выбросы.

Для методов числового определения наличия выбросов или квазивыбросов в дисперсиях используется критерий Кохрена, представляющий собой критерий внутрилабораторных изменчивостей и рассчитывающийся как:

где S²max – наибольшая величина дисперсии в выборке, а – дисперсия из лаборатории 1. Критерии для отказа от выбросов были взяты из Руководства ISO 5725-2. Значительные отклонения при α=0,01 считались статистическим выбросом и были удалены из набора данных, тогда как квазивыбросы (значительные отклонения при α=0,05) были оставлены для дальнейших расчетов. Критические значения для C содержатся в ISO 5725-2.

Для проверки наблюдений на одном уровне, сделанных количеством компаний p, на выбросы применяют критерии Граббса. Был применен критерий для 1 выброса, а значит, проверка на наличие в выборке одного наименьшего или наибольшего среднего значения по сравнению с другими. Проверка выполнялась с помощью следующего расчета:

где ij – наименьшее среднее лабораторное значение, p – наибольшее среднее лабораторное значение, j – среднее значение для всех лабораторий, и s –стандартное отклонение среднего лабораторного значения. Абсолютное значение G сравнивается с критическими значениями для данного критерия [7]. Значения, превышающие критическое значение для критерия Граббса, считаются выбросами. Общее среднее значение, стандартное отклонение и процент относительного стандартного отклонения относительной площади пика для каждого пика rMAb рассчитывались после удаления выпадающих значений.

На рисунке 1 показан пример электроферограммы 7 заряженных изоформ образца rMAb между маркерами pI 5,8 и 7,6.

Пики rMAb от 1 до 7 хорошо разделены между собой. Важно отметить, что однородная картина электрофоретического разделения была получена во всех лабораториях.

Рисунок 1. Показательное разделение образца rMAb, содержащего маркеры pI 5,8 и 7,6. Условия электрофореза описаны в Экспериментальной части.

Таблица 1. Измеренное значение pI для отличающихся зарядами вариантов rMAb с использованием разных партий амфолита. A) Двенадцать лабораторий использовали партию амфолитов A1. Б) Семь лабораторий использовали партию амфолитов А2.

Таблица 2. Средний процент площади пика отличающихся зарядами вариантов rMAb по лабораториям (амфолита A1). Среднее значение 12 циклов дКИЭФ двух разных образцов, вводимых 6 раз каждый.

3.1. Определение значения pI для пиков образца rMAb

Значение pI неизвестного белка обычно определяется на основе маркеров pI. Для определения pI испытуемого образца rMAb каждая из 12 лабораторий подготовила 2 отдельных образца, используя партию амфолита A1, одну партию других веществ и маркеров pI. Семь лабораторий также подготовили два дополнительных образца, используя партию амфолита А2. Каждая пробоподготовка rMAb подвергалась анализу с помощью системы iCE280 6 раз. Программное обеспечение данной системы автоматически вычисляет значение pI для пика образца, используя 2 позиции пика маркеров pI, предполагая, что градиент pH между двумя маркерами pI является линейным. Практика показала, что в условиях данного анализа градиент pH имеет хорошую линейность в диапазоне 5-8 [8]. В таблице 1 показаны средние значения pI всех данных, предоставленных участниками. Наблюдаемые данные pI, полученные для пика каждого варианта, отличающегося зарядами, показывают хорошую прецизионность между лабораториями со значениями ОСО ≤ 0,8 %, независимо от партии амфолита. В пределах данных лабораторных анализов ОСО было менее 0,1 % (данные не приводятся). Кроме того, величина pI каждого пика варианта, отличающегося зарядами, полученная с использованием партии амфолита А1, находится в пределах менее 0,1 единиц pI соответствующих значений pI, установленных с использованием партии амфолита А2. Данные продемонстрировали, что независимые компании получили одинаковое значение pI для пиков образцов rMAb при использовании дКИЭФ в различных лабораториях разными лаборантами, с двумя разными партиями амфолита и многочисленными приборами. Дисперсионный анализ для значений pI не проводился, поскольку внутри- и межлабораторная прецизионность была очень высока.

3.2 Количественный анализ отличающихся зарядом вариантов rMAb

Как показано в таблице 2, в каждой лаборатории измеряли относительную площадь пика заряженных изоформ в испытуемом образце rMAb. После расчета лабораторных средних значений и стандартного отклонения относительной площади пика, были выявлены и отсортированы резко отклоняющиеся значения для определения результатов окончательной прецизионности, включая общее среднее значение, стандартное отклонение и процентное значение ОСО. Существует 2 возможных типа выбросов: 1) отклоняющиеся результаты для каждого пика варианта, отличающегося зарядами, полученные в отдельных лабораториях и означающие, что данные слишком завышены или занижены по сравнению с другими результатами; 2) выпадающие лаборатории, отклоняющиеся либо в прецизионности, либо в средних значениях по сравнению с другими лабораториями. Как упоминалось выше, в данном исследовании применялся метод удаления выбросов, описанный в ИСО 5725-2. Сначала визуальная оценка согласованности результатов и лабораторий была выполнена с использованием статистики Манделя h и k. Затем были применены критерий Граббса и критерий Кохрена для отказа от использования отклоняющихся данных, полученных в отдельной лаборатории или в выпадающих лабораториях. Статистическая величина k была мерой внутрилабораторной согласованности путём сравнения стандартного отклонения относительной площади пика для выбранного пика в пределах одной лаборатории со средним стандартным отклонением различных лабораторий для того же пика. Затем однородность дисперсий была проверена по критерию Кохрена. Сначала описываются данные для образцов rMAb, приготовленных с использованием партии амфолита A1. Значения k для относительной площади пика вариантов rMAb, отличающихся зарядами, приведены на рисунке 2. Следует отметить, что некоторые результаты компаний F, H и I показывают большие значения k, которые равны или превышают 1% статистический предел, что предполагает более высокую внутрилабораторную дисперсию в этих компаниях по сравнению с остальными. Результаты критерия Кохрена приведены в таблице 3. Как и предполагалось по k-статистике Манделя, значения относительной площади пика для пика 2 компании F являются выпадающими значениями. Статистические значения критерия Кохрена для этих пиков выше 1% критического значения 0,232, и должны быть отклонены. Остальные выпадающие значения относительной площади пика, которые должны быть отклонены, составляют пик 6 от компании H и пики 1 и 3 от компании I. Межлабораторная изменчивость средних значений для относительной площади пика изоформ rMAb каждой из 12 лабораторий была проверена h-статистикой Манделя и критерием Граббса.

Рисунок 2. k-статистика Манделя для изучения внутрилабораторной непротиворечивости. Линии отображают 1% (-) и 5% (-) статистический предел.

Таблица 3. Результаты критерия Кохрена. Критические значения: 0,232 при 1% статистическом пределе и 0,202 при 5%.

Рисунок 3. h-статистика Манделя для изучения внутрилабораторной непротиворечивости.

Таблица 4. Результаты критерия Граббса. Критические значения: 2,55 при 1% статистическом пределе, 2,29 при 5%.

Таблица 5. Среднее значение относительной площади пика для отличающихся зарядами вариантов rMAb среди всех организаций (амфолит А2). Средние значения 12 циклов дКИЭФ, которые берутся из двух разных образцов препарата, вводимых шесть раз каждый.

h-статистика Манделя отображена на рисунке 3. У лаборатории могут быть положительные и отрицательные значения h. Приемлемые результаты должны быть распределены случайным образом около нуля. Согласно рисунку 3, в компании I показали более высокие значения h (более высокое лабораторное среднее значение) относительной площади пика для пика 1 и пика 4 по сравнению с другими лабораториями. Кроме того, h-статистика Манделя больше для пиков 3, 6 и 7 компании К. К данным возможным выбросам был применен критерий Граббса, результаты которого отражены в таблице 4. Средние значения относительной площади пика для пика 1 компании I и пиков 3, 6 и 7 компании K считаются выбросами. Статистические значения h для этих пиков выше 1% критического значения 2,55. Однако значение критерия Граббса, равное 2,40 для пика 4 компании I, ниже 1% критического значения 2,55. В результате среднее значение площади пика для пика 4 отклонено не было. После удаления межлабораторных и внутрилабораторных выбросов, оставшиеся данные были использованы для расчета конечного результата по прецизионности, в том числе общего среднего значения, стандартного отклонения и процентного относительного стандартного отклонения. В таблице 5 показано относительное распределение заряженных изоформ образцов rMAb, приготовленных с использованием партии амфолита А2. Для этих количественных данных была выполнена статистическая оценка с использованием того же подхода, который описан выше. Статистические результаты для амфолита A2, указанные в таблице, не показаны; однако окончательные результаты по прецизионности для этих образцов, приготовленных с использованием партии амфолита А2, описаны ниже. В таблице 6 приведены результаты дКИЭФ в анализе гетерогенности заряда образцов rMAb при разных лабораториях, партиях амфолита, лаборантах, приборах.

Таблица 6. Данные прецизионности для относительного распределения отличающихся зарядами rMAb.

a) n = 144 точки для каждого пика.

b) n = 144 точки для пиков 4 и 5; n = 120 точек для пиков 1, 2, 3, 6, и 7.

c) n = 84 точки для каждого пика.

d) n = 84 точки для пиков 2, 3, 4, и 6; n = 72 точки для пиков 1, 5, и 7.

Процент ОСО для значений относительной площади 1-го и 7-го пиков составлял менее 18 % для образцов, подготовленных либо из партии амфолита А, либо из В. С другой стороны, процент ОСО для значений относительной площади 2, 3, 4, 5, 6-го пиков составлял менее 6,.3 % для образцов, подготовленных с использованием партии амфолита А, и менее 4,9 % для образцов rMAb с использованием партии A2. При удалении выбросов, прецизионность данных значительно улучшается, в частности, для значений относительной площади 1-го и 7-го пиков. Процент ОСО значений относительной площади пика вариантов rMAb, отличающихся зарядами, составляет менее 11 % для образцов партии амфолита A1 и менее 9,0 % для образцов партии амфолита A2. Следует отметить, что существует высокое совпадение между абсолютными значениями относительной площади пика заряженных изоформ образцов антитела, подготовленных с использованием партий амфолита А1 и А2. Важно упомянуть, что прецизионность и робастность результатов дКИЭФ из таблицы 6 аналогичны результатам, полученным обычным КИЭФ и описанным в недавнем исследовании между отдельными компаниями. Как следствие, дКИЭФ может быть использован как альтернативный или дополнительный метод в оценке гетерогенности заряда терапевтических белков.

Таким образом, в данной работе подчеркивается, что анализ гетерогенности заряда моноклональных антител с помощью дКИЭФ является робастным и подтвержденным методом, используемым в лабораториях Северной Америки и Европы. Картина электрофоретического разделения отличающихся зарядами антител между организациями оказалась непротиворечивой. Количественные показатели pI и относительной площади пика отличающихся зарядами вариантов были получены разными лаборантами с использованием различных приборов одной и той же модели оборудования и разных партий амфолита. В силу вышесказанного, межлабораторное исследование, описанное в данном документе, подчеркивает, что дКИЭФ является надежной технологией для i) определения гетерогенности заряда лекарственных препаратов на основе моноклональных антител, когда метод прошел контроль и хорошо описан, и (ii) использования в качестве альтернативного или дополнительного метода для классической технологии КИЭФ. Данная проверка подтверждает применение метода дКИЭФ как в процессе разработки, так и при контроле качества биофармацевтических компаний. Так же ожидается, что эта работа будет способствовать большему признанию регуляторными органами и представителями промышленности использования капиллярного электрофореза в процессе разработки протеинотерапии.

Khawli, L., Goswami, S., Hutchinson, R., Kwong, Z., Yang, J., Wang, H., Yao, Z., Sreedhara, A., Cano, T., Tesar, D., Nijem, I., Allison, D.,Wong, P., Kao, Y., Quan, C., Joshi, A., Harris, R., Motchnik, P., Моноклональные антитела 2010, 14, 613–624.

Salas-Solano, O., Babu, K., Park, S., Zhang, X., Zhang, L., Sosix, Z., Boumajny, B., Zeng, M., Cheng, K. C., Reed- Bogan, A., Cummins-Bitz, S., Michels, D., Parker, M., Bonasia, P., Hong, M., Cook, S., Ruesch, M., Lamb, D., Bolyan, D., Kiessig, S., Allender, D., Nunnally, B., журнал Chromatographia 2011, 73, 1137–1144.

Meert, C., Brady, L., Guo, A., Balland, A., Аналитическая химия. 2010, 82, 3510–3518.

He, X., Que, A., Mo, J., Электрофорез 2009, 30, 714–722.

Zhang, J., Yip, H., Katta, V., Аналитическая биохимия. 2011, 410, 234–243.

Sosic, Z., Houde, D., Blum, A., Carlage, T., Lyubarskaya, Y., Электрофорез 2008, 29, 4368–4376.

ИСО 5725-2, Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений, Международная организация по стандартизации, Женева, Швейцария, 1994 год.