Исследование о роли аминокислот в регуляции аппетита

Содержание

Введение 3

Методы 7

Контроль кислотной промывки 11

Протокол оспаривания/повторного оспаривания 15

Временной курс стимуляции клеток вестерн-блоттинга 18

Заключение 27

Ссылки 29

Введение

Рецептор нейромедина U типа 2 (NMU2) в настоящее время классифицируется как семейство рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). NMU2 активируется эндогенными пептидами Neuromedin U (NmU) и Neuromedin S (NmS). В различных исследованиях было показано, что активация NMU2 как NmU, так и NmS оказывает анорексигенное действие. В настоящее время противоречивые роли лептина, действующего на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось (HPA) после активации NMU2, означают, что путь, по которому NMU2 регулирует питание и аппетит, в настоящее время неясен. Расширение нашего понимания механизмов внутриклеточной передачи сигналов NMU2, опосредованных NmU и NmS, дает возможность понять роль NMU2 в регуляции питания. Показано, что NmS обладает несколько более высокой активностью по отношению к NMU2 по сравнению с NmU. Поэтому наше расследование было сосредоточено на выявлении причины этого. Поскольку NMU2 связан с Gaq, первоначально сравнивали изменение [Ca2+]I, вызванное активацией NmU и NmS NMU2. Это не показало существенной разницы. Поэтому сравнивали активацию Erk1/2, вызванную NmU и NmS. Было показано, что время активации Erk1 / 2 NmS больше, чем NmU, что позволяет предположить, что NmU и NmS активируют Erk1 / 2 разными путями. Чтобы определить, активировался ли Erk1/2 зависимым от G-белка или независимым от G-белка путями, использовали протокол вестерн-блоттинга с кислотной промывкой pH2 для удаления внеклеточного и лиганда, связанного с NMU2, и для регистрации уровня активированного pERK1/2. Таким образом, как NmU, так и NmS демонстрируют зависимую от G-белка активацию Erk1/2. Однако NmU демонстрирует как зависимую от G-белка, так и независимую активацию Erk1/2.

Нейромедин U (NmU) и Нейромедин S (NmS) являются эндогенными лигандами, принадлежащими к семейству пептидов нейромединов.

Существуют две основные формы НмУ. 23 аминокислоты NmU-23 и 25 аминокислот NmU-25 являются длинными формами. Также были выделены усеченные формы длиной 8 (NmU-8) и 9 (NmU-9) аминокислот. NmU-25 и NmU-8 были выделены сначала из спинного мозга свиньи из-за их способности сокращать матку крысы, отсюда и суффикс U (Хосоя и др.., 2000). Недавно новые варианты сращивания NmU были идентифицированы из кишечника и мозга золотой рыбки (NmU-21, NmU-25 и NmU-38), а также китайской краснобрюхой жабы (NmU-17). Таким образом, НмУ был идентифицирован в различных организмах. Показано, что только NmU-25 присутствует в кДНК человека и расположен в хромосоме 4q12. Усеченные пептиды NmU представляют собой варианты spice длинных форм, и все варианты NmU имеют пять консервативных аминокислотных остатков на С-концевом конце пептида (-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH2). (Остин и др., 1995; Ли и др., 2005). Единственными исключениями являются золотые рыбки NmU-25 и NmU-21. Сохраненные аминокислоты необходимы для активности NmU. Замена аминокислот в консервативной области снижает способность NmU сокращать мышцы. Было также показано, что N-конец необходим для активности NmU в экспериментах по замене аминокислот.

NmS представляет собой нейропептид из 36 аминокислот, который также содержит те же пять консервативных аминокислотных остатков, что и NmU. NmS был выделен из суперхиазматического ядра гипоталамуса крысы и является частью семейства пептидов нейромединов (Мори и др., 2005). Ген NmS расположен на хромосоме 2q11.2, которая отличается от NmU (Митчелл и др.., 2009). Несмотря на это, было показано, что NmU и NmS играют сходную физиологическую роль в регуляции сокращения. NmU и NmS являются циркулирующими гормонами (Митчелл и др.., 2009; Митчелл и др. 2009a).

Консервативные аминокислоты, общие для NmU и NmS, лежат в основе способности обоих агонистов связывать два рецептора нейромедина. Впервые было показано, что радиоактивно меченый NmU связывается с рецептором нейромедина U типа 1 (NMU1) (Нандха и др.., 1993).  Впоследствии несколько групп показали, что NmU является мощным лигандом для NMU1 (Фуджи и др.., 2000; Раддац и др.., 2000; Брайтон и др.., 2004). Ген, кодирующий 403 аминокислоты человеческого NMU1, расположен на хромосоме 2q34-q37. Варианты 406 и 402 аминокислот NMU1 обнаружены у мышей (Раддац и др.., 2000). Однако из-за различных местоположений инициирующего кодона из NMU1 точная длина аминокислоты может варьироваться. NMU1 был классифицирован как рецептор, связанный с G-белком (GPCR), из-за пониженного связывания лигандов в присутствии негидролизуемого субстрата GTP (Нандха и др.., 1993). Вскоре после открытия NMU1 был идентифицирован второй рецептор, который связывает NmU, известный как рецептор нейромедина U типа 2 (NMU2) (Фуджи и др.., 2000; Раддац и др.., 2000; Брайтон и др.., 2004). NMU2 имеет 51% гомологии белка с NMU1 (Шан и др.., 2000). Этот уровень гомологии в сочетании с сохраненными границами экзон-интрон предполагает, что NMU1 и NMU2 могут быть продуктами события дублирования (Шан и др.., 2000). Ген, кодирующий 412 аминокислот человеческого NMU2, расположен на хромосоме 5q33.1. NMU1 и NMU2 демонстрируют сходство последовательностей до 75 и 817 у мышей и крыс соответственно. Однако из-за различных местоположений инициирующего кодона из NMU1 точная длина аминокислоты может варьироваться. (Шан и др., 2000). Таким образом, могут встречаться человеческие NMU1 и NMU2 разной длины, хотя оба являются GPCR (Раддац и др.., 2000).

Распределение NMU1 и NMU2 охватывает несколько мест. Идентификация NMU1 и NMU2 в организме человека использует несколько методов, включая обратную транскриптазно-полимеразную цепную реакцию (RT-PCR) и гибридизацию на месте (Хосоя и др.., 2000). Следовательно, определение уровней экспрессии белка лежит в основе этих методов. NMU1 преимущественно экспрессируется в периферических тканях, таких как тонкий кишечник, желудок, легкие, почки, поджелудочная железа, матка и надпочечники (Хосоя и др.., 2000). Присутствие NMU1 в головном мозге продемонстрировало противоположные доказательства. Хедрику (2000) не удалось показать присутствие мРНК NMU1 в головном мозге. Однако Ховард (2000) показал, что NMU1 присутствует в мозге. Тем не менее, уровни NMU1 в головном мозге существенно ниже, чем его присутствие в периферических тканях (Хосоя и др.., 2000). И наоборот, NMU2 присутствует преимущественно в центральной нервной системе человека (Брайтон и др.., 2004). NMU2 в большом количестве содержится в гиппокампе, продолговатом мозге, таламусе и спинном мозге. NMU2 также присутствует в меньших количествах в периферических тканях (Хосоя и др.., 2000).

NMU1 и NMU2 оба сигнализируют как семейство GPCR. Это связано с тем, что NMU1 и NMU2 обладают консервативными аминокислотными триплетами (D/ERY мотив) для связывания с лигандом и связывания с G-белком. Кроме того, оба они имеют характерно расположенные остатки цистеина во внеклеточных петлях 2 и 3 (Брайтон и др.., 2004). Эти особенности NMU1 и NMU2 характерны для GPCR семейства 1. Показано, что NMU2 проявляет свойства Gaq и Gai (Брайтон и др.., 2004). При исследованиях других потенциальных лигандов для NMU1 показано, что только NmU и NmS повышают уровни [Ca2 +]I и инозитол фосфата (IP3). В настоящее время было обнаружено, что только различные формы NmU и NmS являются агонистами NMU1. Однако показано, что NmS (IC50=1,0 ×10-10 м) обладает несколько большей активностью по отношению к NMU2 в ЦНС, чем NmU (IC50 = 6,8 ×10-10 М) (Мори и др., 2005).

NmU и NmS, связывающие NMU1 и NMU2, играют различные роли во всем организме человека.  Этого следует ожидать из-за широкого распространения NMU1 и NMU2. В настоящее время исследования сосредоточены на роли NmU в сокращении гладких мышц и регулировании питания (Митчелл и др.., 2009).

Показано, что эффект NmU, вызывающий сокращение гладкой мускулатуры, является видоспецифичным. Мышиные модели показывают, что NmU косвенно усиливает сокращение мышц в толстой кишке, воздействуя на электрическую активность, контролирующую сокращение, уменьшая интервал между последовательными сокращениями (Дасс и др., 2007). Было показано, что это относится только к NMU1. Также было показано, что NmU опосредует сокращение желчного пузыря мыши и нижнего пищеводного сфинктера (Дасс и др., 2007). Однако у людей показано, что NmU непосредственно влияет на кровоток, вызывая сокращение гладких мышц при стимуляции как NMU1, так и NMU2 (Джонс и др., 2006). Исследования нокаута показывают, что NmU связывает NMU1 при сокращении желчного пузыря (Джонс и др., 2006). И наоборот, действие NmU в опосредовании сокращения мышиной матки и семявыносящего протока происходит через NMU2. Это показывает, что рецептор, с которым связывается NmU, зависит от места действия NmU.

Центральные эффекты NmU проявляются в том, что внутримозговая (внутривенная) инъекция NmU снижает аппетит и кормление. ОТ-ПЦР показывает, что NmU экспрессируется централизованно в различных моделях мышей, перепелов и золотых рыбок (Говард и др., 2000; Рен и др., 2002). У всех видов наблюдается снижение аппетита и увеличение потребления пищи после внутривенной инъекции NmU.

Первоначально было показано, что NmU ингибирует питание, поскольку внутривенная инъекция NmU в паравентрикулярное ядро (PVN) демонстрирует дозозависимое ингибирование приема пищи, воздействуя на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось (HPA), вызывая опосредованное NmU повышение уровня кортикотропин-рилизинг-гормона (CRH). Это привело к регулируемому лептином увеличению адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортикостерона, которое, как было показано, уменьшается, когда NmU блокируется с помощью анти-NmU IgG.

Считается, что влияние NmU на регуляцию аппетита происходит через NMU2. Это связано с экспрессией NMU2 в стенке 3-го бокового желудочка гипоталамуса (Хосоя и др.., 2000). Агонист NMU2 EUK2010 уменьшал потребление пищи и снижал массу тела мышей. Лечение препаратом EUK2010 показало увеличение гормонов, регулирующих аппетит, CRH и ACTH. Эти гормоны контролируются рецептором лептина. Следовательно, первоначально считалось, что NmU оказывает свое анорексигенное действие ниже по течению пути лептина.

Однако были выявлены противоположные доказательства того, что мыши, у которых отсутствовала экспрессия лептина, по-прежнему имели меньший вес при внутривенной инъекции NmU. Кроме того, инъекция лептина мышам не смогла изменить экспрессию гена NmU в гипоталамусе. Это свидетельствует о лептинн-независимой природе NmU (Ханада и др., 2004). Кроме того, у мышей NmU KO наблюдалось повышение CRH, но без изменения уровней АКТГ. Показано, что NmU частично воздействует на CRH, поскольку мыши CRH KO не демонстрируют снижение кормления (Ханада и др., 2004).  Следовательно, механизм, с помощью которого лептин действует на ось HPA, неясен. Однако, несмотря на отсутствие четкого пути, очевидно, что показано, что NmU снижает кормление и аппетит.

Пирс (2009) показывает, что сниженные эффекты кормления NmU и NmS при связывании NMU2 отменяются у мышей NMU2 KO. Это проявляется как после острого, так и после хронического введения NmU. Более селективный KO PVN NMU2 у крыс не оказывает существенного влияния на питание, но показывает повышенное предпочтение крыс продуктам с высоким содержанием жира.

Таким образом, точный механизм NMU2 при кормлении в настоящее время неясен. Чтобы понять роль NMU2 в регуляции питания и аппетита, необходимо понять внутриклеточную передачу сигналов NMU2 после стимуляции NmU или NmS.

NmU и NmS функционируют через рецептор NMU2. NmS проявляет несколько более высокую активность по отношению к NMU2 по сравнению с NmU (Мори и др., 2005). Поэтому наше исследование было направлено на то, чтобы определить, вызывает ли это различие в аффинности NmS другой внутриклеточный сигнальный путь. Чтобы исследовать это, первоначально регистрировали внутриклеточные уровни кальция из NmU и NmS на NMU2 в присутствии протокола кислотной промывки. Уровни кальция были зарегистрированы из-за природы Gaq NMU2. Передача сигналов Gaq также приводит к активации митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK), таких как внеклеточно регулируемая киназа (Erk1/2). Следовательно, уровень активации Erk1 /2 NMU2 с NmU и NmS соответственно также сравнивали, чтобы определить, активируется ли Erk1 / 2 зависимым от G-белка или независимым от G-белка путями. Любые потенциальные различия, предполагаемые из этих данных, могут объяснить эволюционную потребность в двух лигандах, NmU и NmS, связывающихся с одним и тем же рецептором NMU2 для опосредования аппетита и питания. Впоследствии выяснение внутриклеточной передачи сигналов NMU2 может позволить использовать потенциал NMU2 для фармакологического воздействия для лечения нарушений питания, таких как ожирение.

Методы

Культура клеток

NMU2, стабильно экспрессируемый в эмбриональных стволовых клетках почки человека (HEK293-NMU2) и культивируемый в колбах, исследовали на слияние и контаминацию. Клетки промывали 5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS). для удаления клеток с поверхности колбы использовали 3 мл раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,04% ЭДТА и 0,05% трипсина). После отделения клеток добавляли 5 мл питательной среды и клетки повторно суспендировали. Затем клетки центрифугировали на высокой скорости в течение 4 мин. надосадочную жидкость сливали, а осадок повторно суспендировали в 5 мл питательной среды и переносили в колбу для инкубации при 37°C, 95% увлажненном воздухе и 5% CO2 до тех пор, пока клетки не станут пригодными для использования.

Посев и кальциевая сигнализация

Для проведения регистрации кальция 96 и 24 лунки/планшеты покрывали 100 мкл или 500 мкл гидробромида поли-D-лизина соответственно и инкубировали в течение 30 мин при 4 °C. Затем гидробромид поли-D-лизина удаляли, и каждую лунку промывали 200 мкл DPBS. 100 мкл клеточного раствора из инкубированной колбы высевали в лунки и культивировали в течение 24 часов для создания монослоя клеток. Затем питательную среду удаляли и клетки промывали раствором KHB (4,7мМ KCl, 118 мм NaCl, 11,7 мМ глюкозы, 1,2 мМ MgSO4, 4,2 мМ NaHCO3, 1,2 мМ KH2PO4 и 1,3 мМ CaCl2, рН 7,4, BSA (0,1%)). Каждую лунку заполняли раствором флуо-4-ацетоксиметилового эфира (флуо-4-АМ) (2 мкл флуо-4-АМ +1 мл KHB) и инкубировали при 37°C, 95% увлажненном воздухе и 5% CO2 в течение 45 мин. Затем fluo-4-AM удаляли, и каждую лунку промывали KHB, а затем KHB добавляли в каждую лунку после окончательной промывки. Fluo-4-AM - это чувствительный к кальцию краситель, используемый для измерения изменений уровня свободного внутриклеточного кальция путем увеличения флуоресценции при связывании с кальцием. Изменение флуоресценции регистрировалось планшетным считывателем NOVOstar при длине волны возбуждения 488 нм и детекции 510 нм. Изменение флуоресценции регистрировали из монослоев клеток, содержащих NMU2, стимулированных NmU и NmS в различных концентрациях, и использовали в качестве представления [Ca2+]I для построения кривой зависимости концентрации. Данные были нанесены на график с помощью программного обеспечения.

Контроль кислотной промывки

Клетки HEK293-NMU2 высевали на 96 лунок/планшеты и загружали Fluor-4-AM, как показано ранее. Клетки подвергали воздействию раствора pH2 (KHB, 1M HCl) в течение 20 секунд, после чего раствор pH2 удаляли аспирацией. Клетки промывали 100 мкл KHB два раза, и 100 мкл KHB добавляли в каждую лунку после окончательной промывки. Это происходило до стимуляции лиганда с помощью считывателя пластин NOVOstar. Монослои клеток HEK293-NMU2 затем стимулировали NmU или NmS, и изменение флуоресценции Fluo-4-AM регистрировали как представление изменений в [Ca2+]I с помощью считывателя пластин NOVOstar.

Рисунок 1: Каждый круг представляет лунку из 96 лунок/ пластин. Здесь показаны перекодирующие и измерительные пластины, используемые в считывателе пластин NOVOstar. К планшету с реагентами добавляли 100 мкл KHB в первые две лунки каждой колонки в качестве контроля. Три нижеприведенные лунки содержали 30-нм НмУ. Последние три скважины содержали 100-миллиметровый NmU. Измерительная пластина содержала ячейки, загруженные Flou-4-AM и промытые либо раствором pH2, либо KHB (pH7.4). Тот же протокол был повторен для NmS.

Протокол оспаривания/повторного оспаривания

Клетки HEK293-NMU2 высевали на 96 лунок/планшеты и загружали Fluor-4-AM, как показано ранее. Концентрации 100 мкл 30 нм NmU и NmS добавляли в течение 1 мин в каждую лунку для стимуляции клеток HEK293-NMU2 (первая стимуляция). Затем лиганды удаляли с помощью аспирации. Одну колонку на измерительной пластине промывали с использованием 100 мкл раствора pH2 (KHB, 1 м HCl) в течение 20 секунд. Соседнюю колонку промывали 100uL KHB (рН 7,4) в течение 20 секунд (показано на фиг.2). Затем все лунки промывали два раза с использованием KHB, и KHB добавляли в лунки после окончательной промывки. Изменение флуоресценции Fluo-4-AM регистрировалось как представление изменений [Ca2+]I для каждой полоски с помощью считывателя пластин NOVOstar.

Рисунок 2: Каждый круг представляет лунку из 96 лунок/ пластин. 2А показывает временной ход событий в протоколе вызова/повторного вызова. На рис. 2B показана измерительная пластина и пластина с реагентами. К планшету с реагентами добавляли 100 мкл KHB в первые две лунки каждой колонки в качестве контроля. Три нижеприведенные лунки содержали 30-нм НмУ. Последние три лунки были пусты. Измерительная пластина содержала клетки, загруженные Flou-4-AM и стимулированные NmU или NmS.

Вестерн - блоттинг

Вестерн-блоттинг проводили для регистрации изменений фосфорилирования внеклеточной регулируемой сигналом киназы 1/2 (Erk1/2). 24 лунки/планшета, покрытые 200 мкл гидробромида поли-D-лизина, были засеяны клетками HEK293-NMU2. Добавляли 200 мкл питательной среды для голодания и подвергали клетки голоданию в течение как минимум 18 часов. После голодания носитель был заменен на 200uL KHB.

Временной курс стимуляции клеток вестерн-блоттинга

Каждую лунку стимулировали 200 мкл 30 нм NmU или NmS в течение различной продолжительности от 0 до 120 минут.

Стимуляция клеток вестерн-блоттинга кислотной промывкой

Монослои клеток HEK293-NMU2 стимулировали 200 мкл 30 нм NmU или NmS в течение 1 мин (первая стимуляция). Добавление 200uL KHB в две лунки использовали в качестве контроля. Лиганды были удалены аспирацией. Клетки промывали 100 мкл рН2 раствором (KHB, 1 м HCl) в течение 20 секунд. Затем клетки промывали 200uL KHB, и KHB добавляли в лунки после окончательной промывки. Каждую лунку оставляли для восстановления на различную продолжительность от 0 до 120 мин после промывки раствором рН2. Чтобы гарантировать, что все реакции заканчиваются в одно и то же время, первая стимуляция проводилась с наибольшим временем восстановления (120 мин). Затем весь процесс повторяли, используя время первой стимуляции 5 минут.

Подготовка образцов

Затем клетки дважды промывали охлажденным DPBS. Затем клетки инкубировали на льду с буфером для образцов 200 мкл (125 мм трис-HCL, 10% SDS, 20% глицерина, 0,01% бромфенолового синего, 250 мм дитиотрейтола) для лизиса клеток. Затем лизаты переносили в пробирку с микрофугой и центрифугировали на высокой скорости в течение 1 мин. затем лизаты помещали на нагревательный блок при температуре 100°C на 5 мин. Затем лизаты будут нанесены на гель.

Приготовление геля

Раствор 10 мл для 10% рассасывающегося геля был приготовлен в соответствии с теорией Самбрук (2006). Система электрофореза mini-BioRad использовалась для получения геля толщиной 1,5 мм. Раствор оставляли на 30 мин, чтобы дать ему затвердеть. добавляли 1 мл изопропанола, чтобы убедиться, что края геля были плоскими. После 4 мл 10% раствора геля для укладки (акриламид, 30% Трис-HCL, 10% APS, 1 м pH 6,8 SDS, 10% Temed и доливали до 4 мл воды) добавляли поверх затвердевшего рассасывающегося геля и добавляли гребенку на 18 лунок для формирования лунок. Через 30 мин растворяющийся гель затвердел, и гель mini-BioRead поместили в емкость для электрофореза, заполненную проточным буфером (25 мм Трис-HCL, 25 мм глицин, 192 мм SDS 0,1% pH8.6). Затем в лунки загружали 20 мкл лизата и проводили электрофорез при 180 В в течение 52 минут.

Полусухой перенос

После промывки проводили полусухой перенос с использованием фильтровальной бумаги и мембраны, которую разрезали по размерам до геля. Мембрану активировали, поместив ее в 100%-ный метанол на 10 секунд, затем промыв в воде в течение 2 минут. Затем фильтровальную бумагу и мембрану хранили в буфере для переноса (48 мм Трис, 40 мм глицина, 0,0375% sdsи 20% метанола) в течение 10 минут. Бумага и мембрана были удалены из буфера переноса. Затем гель помещали поверх мембраны с тремя фильтровальными бумагами сверху и снизу. Затем полусухой перенос проводили с использованием BioRad Power Pac 300 при 15 В в течение 30 мин.

После этого мембрану погружали при легком покачивании на один час в 5 мл Трис-буферного физиологического раствора с твином 20 и 5%-ным обезжиренным молоком (TBST). Затем мембрану промывали TBST (без молока) три раза в течение 1 минуты при легком покачивании. Затем мембрану сворачивали в пробирку Falcon и инкубировали при 4°C в течение ночи с прокаткой с первичным моноклональным антителом к Erk1/2 (фосфор-p44/42 митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK)). После этого мембрану промывали TBST (без молока) в течение 8 минут три раза. Затем мембрану инкубировали с анти-кроличьим HRP-связанным вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре при умеренном встряхивании. Затем мембрану промывали TBST (без молока) в течение 8 минут три раза.

Для обнаружения активации pERK1/2 использовали хемилюминесцентный реагент UptiLightTM. Время воздействия на мембрану рентгеновской пленки составляло от 10 до 100 секунд. Программное обеспечение Image J было привлечено к ответственности за количественную оценку сигнала pERK1 / 2 путем сравнения размера маркера pERK1 / 2.

Рисунок 3: Здесь показано изменение флуоресценции как показателя внутриклеточного кальция ([Ca2+]I), зарегистрированное с помощью считывателя пластин NOVOstar. Монослои клеток HEK293-NMU2 стимулировали NmU (синим) или NmS (красным) при различных концентрациях лиганда. Изменение флуоресценции Fluo-4-AM регистрировалось как представление изменений в [Ca2+]I с помощью считывателя пластин NOVOstar. Этот эксперимент был проведен в рамках N=5.

Приведенная выше кривая зависимости концентрации показывает, что при добавлении каждого лиганда возникает кальциевая реакция. Чем выше концентрация добавленного лиганда, тем сильнее изменяется флуоресценция, следовательно, увеличивается содержание кальция. Реакция кальция была низкой, когда любой лиганд добавляли при 0,1 нМ, 0,3 нМ и 1 нм. Реакция кальция увеличивается от 3 нм до 10 нм. Затем плато отклика находится в диапазоне от 30 нм до 10 нм. В целом, две кривые показывают, что NmU и NmS вызывают сходные кальциевые реакции. Кривая зависимости концентрации была записана для идентификации значений EC50 для NmU и NmS. Зарегистрированное значение EC50 для NmU показано как 3,03 +- 0,0468 (нМ). Значение NmS EC50 составляет 2,77 +- 0,049074773 (нМ).

Рисунок 5: Монослои клеток HEK293-NMU2 промывали либо кислотой pH2 (3 нм и 30 нм), либо KHB pH7.4 (контроль). После 5-минутного периода восстановления монослои клеток HEK293-NMU2 затем стимулировали NmU, и изменение флуоресценции Fluo-4-AM регистрировали как представление изменений в [Ca2+]I с помощью планшетного считывателя NOVOstar. Это было проведено в рамках N=3.

Это было проведено в рамках N=3.

Этот эксперимент был использован для определения того, влияет ли 20-секундное применение кислоты на способность клеток инициировать кальциевый ответ. Были использованы концентрации лиганда 3 нм и 30 нм, поскольку предыдущий эксперимент показал, что кальциевая реакция происходит при обеих концентрациях. Сравнивая реакции промывки раствором кислоты pH2 и промывки кальцием pH7.4 KHB при стимуляции 30 нм NmS (рисунок 5), не наблюдается существенной разницы (значение P = 0,6379). Сравнение реакций промывки раствором кислоты pH2 и промывки кальцием pH7.4 KHB при стимуляции 30 нм NmS (рисунок 6), существенной разницы (значение p = 0,0740) снова не наблюдается. В результате было показано, что кислотная промывка не влияет на кальциевую реакцию клеток на лиганд при 30 нм. Этот эксперимент показал, что кислотная промывка рН2 не оказывала существенного влияния на кальциевую реакцию по сравнению с промывкой рН7,4 KHB. Следовательно, протокол кислотной промывки был использован в последующих экспериментах для удаления лиганда, связанного с рецептором.

Монослои клеток HEK293-NMU2 сначала подвергли воздействию 30 нм NmU или NmS. Затем клетки промывали раствором кислоты с рН2 (NmU и NmS) или с рН 7,4 KHB (контроль). После периода восстановления клетки повторно обрабатывали 30-нм НмУ. Изменение флуоресценции после повторного вызова Fluo-4-AM регистрировалось как представление изменений в [Ca2+]I с помощью считывателя пластин NOVOstar. Контроль показывает кальциевую реакцию при первом воздействии с KHB, без лиганда. Этот эксперимент был проведен в рамках N=3.

Этот эксперимент был проведен, чтобы исследовать, заставляет ли немного более высокая активность NmS по отношению к NmU NMU2 изменять [Ca2+]I по-разному. Гистограмма показывает изменение [Ca2 +] I, зарегистрированное после первого воздействия NmS, вызывает несколько больший отклик по сравнению с NmU. Однако анализ не показывает существенной разницы между кальциевыми реакциями при первом воздействии NmU и NmS после удаления кислотной промывкой и заражения NmU. Это подтверждается значением p, равным 0,3013. Кроме того, кальциевая реакция была значительно выше, чем в контроле.

Временной курс стимуляции клеток вестерн-блоттинга

Целью этого эксперимента было зарегистрировать изменения в фосфорилировании внеклеточной регулируемой сигналом киназы 1/2 (pERK1/2) после активации NmU или NmS в течение различных периодов времени. Уровень активации pERK1/2 для NmS выше в каждый момент времени по сравнению с pERK1/2 для NmU. Кроме того, уровни pERK1/2 поддерживаются от 5 мин до 120 мин временных точек для обоих лигандов.

Монослои клеток HEK293-NMU2, культивированных на 24-луночных планшетах. Их стимулировали 30-нм NmU (красный и зеленый) или NmS (синий и фиолетовый). Затем лиганд удаляли либо через 1 мин (синий и зеленый), либо через 5 мин (красный и фиолетовый) с использованием кислотного раствора рН2. Клетки промывали с использованием 100uL pH2 KHB в течение 20 секунд. Затем клетки промывали 200uL KHB, и KHB добавляли в лунки после окончательной промывки. Каждую лунку оставляли для восстановления на различную продолжительность от 0 до 120 мин после промывки раствором рН2. Активацию pERK1/2 регистрировали для каждого лиганда в каждый момент времени и наносили на график выше. Каждый график представляет один повторный эксперимент. Это исследование было проведено при N=3.

Этот эксперимент был проведен, чтобы определить, вызывает ли несколько более высокая активность NmS по отношению к NmU NMU2 изменение уровней pERK1/2 по-разному для каждого лиганда, и определить, активируют ли NmU и NmS pERK1/2 независимым от G-белка образом. В целом результаты исследования кислотной промывки вестерн-блоттинга несопоставимы из-за больших различий в данных, полученных для каждого повтора. Следовательно, статистические тесты не показывают последовательных выводов между каждым повторным экспериментом. Несмотря на это, ключевой особенностью всех экспериментов является постепенное снижение отклика pERK1 / 2 по мере увеличения временных точек. Когда либо NmU, либо NmS сначала стимулировали в течение 1 мин или 5 мин, NMUR2 будет активирован. Поскольку внеклеточный лиганд и связанный с NMUR2 лиганд удаляются кислотной промывкой, ответы pERK1 / 2 со временем уменьшаются. Это показано, поскольку 120-минутный момент времени для обоих лигандов приводит к более низкому отклику pERK1/2 по сравнению с 5-минутным моментом времени.

Из N=1 показано, что отклик pERK1/2 NmU 5 мин (красный) значительно больше, чем NmU 1 мин (зеленый) в моменты времени 5 мин и 10 мин. Это подтверждается значением p 0,0269 и 0,0192 для временных точек 5 мин и 10 мин соответственно. Также показано, что NmU 5 мин (красный) значительно больше, чем NmU 1 мин (зеленый) в момент времени 10 мин. Это подтверждается значением p, равным 0,0205.

Кроме того, как NmU, так и NmS демонстрируют активацию pERK1/2 после кислотной промывки, предполагая, что оба лиганда могут сигнализировать, когда лиганд не связан с рецептором.

Заключение

NMU2 в настоящее время классифицируется как семейство GPCR. NMU2 представляет собой GPCR, связанный с Gaq, следовательно, активация NMU2 с помощью NmU или NmS приводит к увеличению внутриклеточного кальция и активации Erk1/2.

Показано, что NmS обладает несколько большей активностью по отношению к NMU2 по сравнению с NmU (Мори и др., 2005). Это подтверждается значениями EC50, полученными в результате нашего исследования кальциевой сигнализации (рис. 3). Исследование "вызов / повторный вызов" (рисунок 6) не показало существенной разницы (p<0,05) в изменении внутриклеточного кальция между NmU или NmS, связывающимися с NMU2. Следовательно, показано, что повышенная активность NmS по отношению к NMU2 по сравнению с NmU не влияет на кальциевую передачу сигналов NMU2. Высвобождение кальция приводит к активации Erk1/2. Активация Erk1/2, опосредованная GPCR семейства A, может происходить через зависимый от G-белка или независимый от G-белка механизм.

Вестерн-блоттинг с течением времени (рисунок 7) показывает длительную активацию Erk1/2 после воздействия NMU2 на NmU или NmS. Длительная активация Erk1/2 во время вестерн-блоттинга во времени может быть обусловлена интернализацией NMU2, который затем возвращается обратно на поверхность мембраны. Интернализации предшествует десенсибилизация. Десенсибилизация происходит для предотвращения чрезмерной стимуляции GPCR.

Как правило, это влечет за собой фосфорилирование рецептора. Это осуществляется протеинкиназами, опосредованными вторым мессенджером (такими как PKA или PKC), которые воздействуют на рецептор, уменьшая выработку второго мессенджера. Альтернативно, рецепторные киназы, связанные с G-белком (GRK), фосфорилируют рецептор.

Фосфорилирование с помощью GRK вызывает рекрутирование β-аррестина, которое не вызывается протеинкиназами, опосредованными вторым мессенджером. Сам рецептор активирует GRKs для фосфорилирования остатков серина и треонина во внутриклеточных доменах GPCR. GRK2-6 регулирует фосфорилирование GPCR.

Различные различные комбинации фосфорилирования приводят к увеличению аффинности рецептора и приводят к последующему связыванию различных β-аррестинов с рецептором.

Это приводит к отсоединению G-белка от рецептора и, следовательно, к десенсибилизации.

Десенсибилизация после фосфорилирования GRK вызвана тем, что β-аррестин стерически препятствует G-белкам, предотвращая их ассоциацию с GPCR для предотвращения передачи сигналов. Также β-аррестин действует как каркас для киназ, которые разрушают вторичные мессенджеры при десенсибилизации.

После десенсибилизации одной из функций β-аррестина является действие в качестве адаптерного белка для GPCR для привлечения мембраноактивируемых рецепторов для интернализации. После интернализации рецептор может быть разрушен или повторно сенсибилизирован и возвращен на поверхность клетки.

Передача сигналов интернализованному рецептору должна быть прекращена, чтобы могла произойти повторная сенсибилизация или деградация. Первоначально было показано, что сродство β-аррестина к рецептору регулирует судьбу рецептора после интернализации. Совсем недавно было показано, что B-аррестин является частью актин–сортирующего комплекса nexin 27 (SNX)–ретромерные канальцы (ASTR). Судьба эндосомы регулируется комплексом ASTR путем формирования, который действует как молекулярный тормоз для уменьшения передачи сигналов интернализованного рецептора.

Комплекс ASTR состоит из многих белков, включая β-аррестин, ретромер, белок-адаптер постсинаптической плотности (PDZ) SNX27 и комплекс WASH. Они работают вместе, чтобы упаковать интернализованный рецепторный комплекс в канальцы, которые затем маркируются для разложения или утилизации. Рециркуляция рецептора происходит либо посредством ASTR-зависимого, ASTR-независимого, либо ретроградного транспорта (Pavlos et al., 2016). Однако присутствие комплекса ASTR в настоящее время ограничено рецептором паратиреоидного гормона класса В (PTHR), который образует раннюю эндосому.

Эта ранняя эндосома может быть разрушена, может образовывать сигналосому или приводить к рециркуляции рецептора посредством ASRT-зависимой или независимой рециркуляции. Следовательно, NmU может вызывать последующую десенсибилизацию, интернализацию и повторную сенсибилизацию NMU2, возвращаясь на поверхность клетки подобно PTHR.

Предыдущая работа в нашей лаборатории показала, что использование промывки KHB с pH 7,4 (APPEDIX X) для удаления внеклеточного свободного лиганда вызывает длительную активацию Erk1 / 2 после стимуляции NmS NMU2. И наоборот, стимуляция NmU NMU2 показывает уменьшение активации Erk1/2 с течением времени. Сравнение вестерн-блоттинга с промывкой pH7.4 KHB показывает, что активация Erk1/2 уменьшается с течением времени, тогда как активация Erk1/2 в вестерн-блоттинге с течением времени сохраняется после стимуляции NmU. Это показывает, что активация NmU Erk1/2 требует присутствия лиганда, чтобы позволить повторно сенсибилизированному NMU2 связывать внеклеточный NmU и продолжать демонстрировать длительный ответ Erk1/2.

Однако активация Erk1/2 после стимуляции NmS NMU2 не ослабевает при промывке pH7.4. Это подтверждает доказательства того, что NmU заставляет NMU2 подвергаться рециркуляции рецептора подобно PTRH, но ставит под сомнение роль NmS в рециркуляции рецептора. Следовательно, показано, что NmU и NmS активируют Erk1/2 разными путями.

Временной ход вестерн-блоттинга также показывает, что после стимуляции NMU2 NmS активация Erk1 / 2 немного выше, чем активация Erk1 / 2, вызванная NmU.

Это может объяснить цель повышенной активности NmS по отношению к NMU2 по сравнению с NmU, поскольку лиганд может оставаться связанным с рецептором дольше, чем NmU. Это также дает дополнительные доказательства того, что NmU и NmS активируют Erk1 / 2 по-разному. Активация NmS Erk1/ 2 может быть обусловлена интернализированной передачей сигналов NMU2 независимым от G-белка образом, поскольку для пролонгированной активации Erk1/ 2 не требуется внеклеточный лиганд. Рецепторы, включая, но не ограничиваясь ими, PTHR, GLPR и V2R, все показали устойчивую передачу сигналов после интернализации.

Вестерн-блоттинг с кислотной промывкой pH2 демонстрирует доказательства независимой от G-белка передачи сигналов, поскольку стимуляция NMU2 как NmU, так и NmS приводила к активации Erk1/ 2. Это предполагает, что как NmU, так и NmS могут вызывать интернализацию NMU2, поскольку эта активация Erk1 /2 после промывки кислотой может происходить только от интернализованного рецептора, поскольку кислота pH2 удаляет свободный и связанный с рецептором лиганд.

Интернализация, также известная как секвестрация, необходима для обеспечения независимой от G-белка передачи сигналов. Интернализация также позволяет GPCR стать повторно сенсибилизированным или пониженным после десенсибилизации.

Интернализация может происходить с помощью трех основных механизмов.

Во-первых, клатрин-зависимая интернализация требует опосредованного GRK фосфорилирования и связывания β-аррестина. Показано, что это происходит как в отсутствие, так и после стимуляции рецептора агониста.

Впоследствии адаптерный белок AP-2 связывается с карбоксиконцевым хвостом β-аррестина (Kern et al., 2009). AP-2 способствует привлечению клатрина для образования инвагинаций в мембране, известных как клатриновые ямки (CCP), содержащие GPCR с β-аррестином и AP-2, связанными.

Затем этот КПК удаляется с мембраны с помощью ГТФазы, известной как динамин, и образуется эндосома. Это известно как клатрин-зависимая интернализация. Со временем N-этилмалеимид-чувствительный слитый белок (NSF), малый G-белок ARF6 и PI4P-киназа были идентифицированы как партнеры по связыванию B-аррестина, которые способствуют интернализации.

Также показано, что убиквитинирование β-адренорецептора 2 убиквитинлигазой E3 усиливает связывание клатрина с β-аррестином и стабилизирует эндосому в большей степени, чем неубиквинтированную эндосому.

Рецептор также может быть интернализован без первоначального фосфорилирования GRK. Этот второй механизм интернализации связан с образованием кальвеол вместо клатриновых ямок.

Альтернативно, интернализация может происходить через непокрытые пузырьки. Показано, что механизм, с помощью которого каждый рецептор интернализуется, регулируется рецептором. Это очевидно, поскольку рецептор CCR5 интернализуется β-аррестин-зависимым образом, тогда как рецептор нейропептида Y2 интернализуется β-аррестин-независимым образом (Walther et al., 2013). Однако большинство GPCR интернализуются β-аррестин-зависимым и клатрин-зависимым образом. Будущие исследования NMU2 с использованием конфокальной микроскопии могут подтвердить, интернализуется ли NMU2 после стимуляции NmU и NmS.

В дополнение к предположению о том, что NMU2 интернализован, стимуляция клеток кислотной промывки вестерн-блоттингом показывает интернализованные сигналы NMU2. Это показало, что как NmU, так и NmS заставляют NMU2 подвергаться интернализированной передаче сигналов рецептора. Это связано с тем, что активация Erk1 / 2 все еще происходит, даже когда кислотная промывка удаляет любой лиганд, связанный с рецептором. Следовательно, отсутствие лиганда, связанного с рецептором, предполагает, что ответ Erk1/2 может исходить только от интернализованного рецептора. Интернализованный рецептор подает сигналы, образуя комплекс, известный как сигналосома. Это представляет собой внутриклеточный комплекс внутри эндосомы, состоящий из интернализованного рецептора с β-аррестином, действующим в качестве каркаса для AP2 и клатрина.

Сигналосома опосредует независимую от G-белка передачу сигналов и регулируется действием β-аррестина.

Рецепторы класса В, которые обладают высоким сродством к β-аррестину 1 и 2, связаны с устойчивой активацией MAPK после интернализации. Принимая во внимание, что рецепторы класса А связывают β-аррестин 2 преимущественно, но временно, следовательно, в основном связаны с повторной сенсибилизацией рецептора. Химерные рецепторы класса А и класса В показали, что карбоксильный конец рецепторов регулирует судьбу рецептора, поскольку рецепторы класса А не имеют богатой серией области на карбоксильном конце.

Химерные рецепторы, содержащие карбоксильный конец β2-адренергического рецептора класса А (β2AR), предпочтительно подвергаются рециркуляции рецептора. Химерные рецепторы, содержащие карбоксильный конец рецепторов вазопрессина класса B V2, не проявляют повторной сенсибилизации, но демонстрируют длительную активацию MAPK, которой не хватает ректорам класса A.  Это связано с тем, что рецепторы класса В связывают гормоны или β-аррестин по двухэтапному механизму, сначала связываясь с N-концом, затем С-концом, и образуют стабильную раннюю эндосому, которая обеспечивает интернализованную передачу сигналов рецептора.

Следовательно, состав С-конца рецептора определяет тип рекрутируемого β-аррестина. NmS показывает интернализованную независимую от G-белка передачу сигналов NMU2. NmU показывает контрастные пути активации Erk1/2. Это показано сравнением вестерн-блоттинга с течением времени и вестерн-блоттинга pH7.4 KHB. Они предполагают, что для активации Erk1 / 2 должен присутствовать NmU. Следовательно, это наводит на мысль о зависимом от G-белка характере. Однако вестерн-блоттинг с отмыванием pH2 противоречит требованию лиганда активировать Erk1/2, следовательно, предполагая независимый от G-белка путь.

Каннабиноид 1 GPCR также первоначально демонстрирует зависимую от G-белка сигнализацию, которая позже заменяется независимой от G-белка сигнализацией в более поздние моменты времени. Этот принцип может объяснить, почему NmU демонстрирует активацию Erk1 / 2 как через зависимые от G-белка, так и независимые пути.

NmS может проявлять большее предпочтение независимой от G-белка передаче сигналов по сравнению с NmU. Это связано с тем, что NmS показывает активацию Erk1 /2 через независимые от G-белка пути из вестерн-блоттинга с кислотной промывкой pH2. Однако NmS не проявляет какой-либо зависимой от G-белка природы, потому что, когда свободный лиганд удаляют с помощью промывки pH7.4 KHB, реакция Erk1/ 2 остается устойчивой. Поскольку сигналосома по существу является эндосомой, независимая от G-белка передача сигналов пространственно отличается от зависящей от G-белка передачи сигналов рецептора на поверхности клетки. Следовательно, первоначально GPCR может активировать зависимую от G-белка передачу сигналов.

Это в конечном итоге приведет к рекрутированию β-аррестина. Затем, когда β-аррестин 2 связывается (класс B), это может вызывать независимую от G-белка передачу сигналов. Следовательно, внутриклеточная последующая передача сигналов рецептором может происходить посредством G-белка зависимой или независимой передачи сигналов. Было показано, что различные лиганды могут вызывать активацию одного из вышеуказанных сигнальных путей в большей степени, чем другого. Это известно как предвзятый агонизм.

Примером этого может служить рецептор серотонина. Показано, что серотонин действует на рецептор серотонина 2А, вызывая опосредованную β-аррестином активацию Erk1/2 и приводя к движению головы у мышей. Однако другой лиганд (DOI) вызывает движение головы путем активации Erk1/2 в β-аррестин-независимом пути.

Эта специфичная для лиганда передача сигналов вниз по течению может объяснить, почему стимуляция NMU2 с помощью NmU активирует Erk1 / 2 через зависимые от G-белка и независимые механизмы, а NmS стимулирует только независимую от G-белка активацию Erk1 / 2.

5-минутная кислотная промывка pH2 показывает значительно большую активацию Erk1/2 по сравнению с 1-минутной кислотной промывкой pH2 для NmU в моменты времени 5 мин и 10 мин (рисунок 8). Это говорит о том, что более независимая от G-белка активация Erk1 / 2 происходит через 5 минут по сравнению с 1 минутой. Это ожидаемо, поскольку показано, что передача сигналов, независимых от G-белка, занимает больше времени по сравнению с передачей сигналов, зависящих от G-белка.

Независимая от G-белка передача сигналов, показанная NmS, включает связывание β-аррестина с рецептором. Показано, что для обеспечения высокоаффинного связывания β-аррестина фосфорилирование GPCR требуется многими GPCR, такими как β2AR, ангиотензин II типа 1 и a2-AR и т.д. (см. Обзор, возможно, см. Актуальные статьи). Показано, что пептидные рецепторы, связанные с геном дофамина D1A и кальцитонина, ассоциируются с GRK5 и GRK6. GRKS могут быть тканеспецифичными путем рекрутирования множества различных киназ для потенциального фосфорилирования рецептора множеством различных комбинаций аминокислот (Tobin et al., 2008). Также показано, что GRK6 регулирует скорость фосфорилирования рецептора, в частности β2AR (Violin et al., 2006). Следовательно, каждая комбинация рекрутируемых протеинкиназ или GRK приводит к уникальной сигнатуре фосфорилирования и, следовательно, к специфическому сигнальному результату.

Некоторые GPCR также могут связывать β-аррестин независимо от фосфорилирования, такие как рецептор хемокина D6 (Walther et al., 2013). Различные β-аррестины связываются с различными GPCR с различным сродством. Тип GRK, участвующий в фосфорилировании и последующем рекрутировании β-аррестина, вызывает различные внутриклеточные сигналы. Например, фосфорилирование рецептора ангиотензина II типа 1A с помощью GRK5 вызывает β-аррестинзависимую активацию передачи сигналов Erk1/2. Однако GRK2 вызывает β-аррестинзависимый эндоцитоз в том же рецепторе. (Walther et al., 2013). Следовательно, β-аррестин, рекрутируемый рецептором, может опосредовать специфический сигнальный путь.

Могут быть проведены дальнейшие исследования для выделения типа β-аррестина, рекрутируемого для интернализации NMU2 с помощью NmU или NmS. Это поможет определить роль зависимой от G-белка и независимой активации Erk1 / 2 с помощью NmU и NmS.

Общее связывание NmU с NMU2 показывает как зависимую от G-белка, так и независимую от G-белка активацию Erk1 /2, что вызывает сомнение в возможной рециркуляции NMU2 в ходе вестерн-блоттинга. Альтернативно, более вероятной теорией является то, что NmU демонстрирует способность избирательно активировать Erk1/2, следуя либо зависимому от G-белка, либо независимому пути. NmU демонстрирует более независимую от G-белка активацию Erk1 / 2 после более длительной стимуляции NMU2 с помощью NmU. Следовательно, продолжительность воздействия NmU на NMU2 может быть вовлечена в процесс селективности. NmS может обладать несколько более высокой активностью по отношению к NMU2 из-за большей активации Erk1/2. Также NmS, связывающий NMU2, демонстрирует независимую от G-белка активацию Erk1/2.

Впоследствии, путем идентификации β-аррестина, участвующего в опосредовании того, по какому внутриклеточному сигнальному пути следуют NmU и NmS, повысится потенциал NMU2 для целенаправленного лечения таких расстройств, как ожирение.

Ссылки

Брайтон, П.Дж., Секерес, П.Г. и Уилларс, Г.Б. (2004) "Нейромедин U и его рецепторы: структура, функция и физиологические роли",Фармакологические обзоры,56 (2), стр. 231-248.

Чан, А.С., Клерфейль, Т., Ландао-Бассонга, Э., Кинна, Г., Нг, П.Ю., Лу, Л.С., Ченг, Т.С., Чжэн, М., Хонг, У., Тисдейл, Р.Д., Коллинз, Б.М. и Павлос, Н.Дж. (2016) ‘Сортировка nexin 27 связывает транспорт PTHR с ретромером для регуляции сигнала в остеобластах во время роста кости’,Молекулярная биология клетки,27 (8), стр. 1367-1382.

Дасс, Н., Бассил, А., Норт‐Лейдлер, В., Морроу, Р., Азиз, Э., Туладхар, Б.Р. и Сэнгер, Г. (2007) ‘Нейромедин U может оказывать специфическую для толстой кишки, кишечно‐нервную прокинетическую активность через путь, включающий активацию рецептора NMU1’,Британский журнал фармакологии,150(4), стр. 502-508.

Дельгадо-Пераза, Ф., Ан, К.Х., Ногерас-Ортис, С., Мангру, И.Н., Макки, К., Кендалл, Д.А. и Юдовски, Г.А. (2016) "Механизмы смещенной бета-аррестин-опосредованной передачи сигналов

Ниже по течению от рецептора каннабиноида 1’,Молекулярная фармакология,89 (6), стр. 618-629.

Девайр, С.М., Ан, С., Лефковиц, Р.Дж. и Шеной, С.К. (2007) "β-аррестины и клеточная сигнализация",Annu.Rev.Physiol.,69, стр. 483-510.

Ханада, Р., Тераниши, Х., Пирсон, Дж.Т., Курокава, М., Хосода, Х., Фукусима, Н., Фукуэ, Ю., Серино, Р., Фуджихара, Х. и Уета, Ю. (2004) ‘Нейромедин U обладает новым анорексигенным эффектом, независимым от сигнального пути лептина",Природа медицина,10 (10), с. 1067-1073.

Хасимото Т., Масуи Х., Утида Ю., Сакура Н. и Окимура К. (1991) ‘Агонистическая и антагонистическая активность аналогов нейромедина U-8, замещенных глицином или D-аминокислотой, на сократительную активность препаратов гладких мышц цыплят",Химический и фармацевтический бюллетень,39 (9), стр. 2319-2322.

Хедрик, Дж.А., Морс, К., Шан, Л., Цяо, Х., Панг, Л., Ван, С., Лаз, Т., Густафсон, Э.Л., Бейн, М. и Монсма, Ф.Дж., младший (2000) ‘Идентификация рецептора желудочно-кишечного тракта и иммунной системы человека для пептидный нейромедин U’,Молекулярная фармакология,58 (4), стр. 870-875.

Хейман, М.Л., Ахима, Р.С., Крафт, Л.С., Шонер, Б., Стивенс, Т.В. и Флиер, Дж.С. (1997) "Ингибирование лептином гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в ответ на стресс 1",Эндокринология,138 (9), стр. 3859-3863.