3

Введение

Neuromedin S (NmS). В различных исследованиях было показано, что

активация NMU2 как NmU, так и NmS оказывает анорексигенное действие. В

настоящее время противоречивые роли лептина, действующего на

гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось (HPA) после активации

NMU2, означают, что путь, по которому NMU2 регулирует питание и аппетит,

в настоящее время неясен. Расширение нашего понимания механизмов

внутриклеточной передачи сигналов NMU2, опосредованных NmU и NmS,

дает возможность понять роль NMU2 в регуляции питания. Показано, что NmS

обладает несколько более высокой активностью по отношению к NMU2 по

сравнению с NmU. Поэтому наше расследование было сосредоточено на

зависимым от G-белка или независимым от G-белка путями, использовали

протокол вестерн-блоттинга с кислотной промывкой pH2 для удаления

внеклеточного и лиганда, связанного с NMU2, и для регистрации уровня

активированного pERK1/2. Таким образом, как NmU, так и NmS

демонстрируют зависимую от G-белка активацию Erk1/2. Однако NmU

демонстрирует как зависимую от G-белка, так и независимую активацию

Erk1/2.

Нейромедин U (NmU) и Нейромедин S (NmS) являются эндогенными

лигандами, принадлежащими к семейству пептидов нейромединов.

4

Существуют две основные формы НмУ. 23 аминокислоты NmU-23 и 25

способности сокращать матку крысы, отсюда и суффикс U (Хосоя и др.., 2000).

Недавно новые варианты сращивания NmU были идентифицированы из

кишечника и мозга золотой рыбки (NmU-21, NmU-25 и NmU-38), а также

китайской краснобрюхой жабы (NmU-17). Таким образом, НмУ был

идентифицирован в различных организмах. Показано, что только NmU-25

присутствует в кДНК человека и расположен в хромосоме 4q12. Усеченные

пептиды NmU представляют собой варианты spice длинных форм, и все

варианты NmU имеют пять консервативных аминокислотных остатков на С-

концевом конце пептида (-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH2). (Остин и др., 1995; Ли

и др., 2005). Единственными исключениями являются золотые рыбки NmU-25

NmU. NmS был выделен из суперхиазматического ядра гипоталамуса крысы и

является частью семейства пептидов нейромединов (Мори и др., 2005). Ген

NmS расположен на хромосоме 2q11.2, которая отличается от NmU (Митчелл

и др.., 2009). Несмотря на это, было показано, что NmU и NmS играют сходную

физиологическую роль в регуляции сокращения. NmU и NmS являются

циркулирующими гормонами (Митчелл и др.., 2009; Митчелл и др. 2009a).

Консервативные аминокислоты, общие для NmU и NmS, лежат в основе

способности обоих агонистов связывать два рецептора нейромедина. Впервые

было показано, что радиоактивно меченый NmU связывается с рецептором

нейромедина U типа 1 (NMU1) (Нандха и др.., 1993). Впоследствии несколько

5

групп показали, что NmU является мощным лигандом для NMU1 (Фуджи и

2000). Однако из-за различных местоположений инициирующего кодона из

NMU1 точная длина аминокислоты может варьироваться. NMU1 был

классифицирован как рецептор, связанный с G-белком (GPCR), из-за

пониженного связывания лигандов в присутствии негидролизуемого

субстрата GTP (Нандха и др.., 1993). Вскоре после открытия NMU1 был

идентифицирован второй рецептор, который связывает NmU, известный как

рецептор нейромедина U типа 2 (NMU2) (Фуджи и др.., 2000; Раддац и др..,

2000; Брайтон и др.., 2004). NMU2 имеет 51% гомологии белка с NMU1 (Шан

и др.., 2000). Этот уровень гомологии в сочетании с сохраненными границами

экзон-интрон предполагает, что NMU1 и NMU2 могут быть продуктами

разной длины, хотя оба являются GPCR (Раддац и др.., 2000).

Распределение NMU1 и NMU2 охватывает несколько мест.

Идентификация NMU1 и NMU2 в организме человека использует несколько

методов, включая обратную транскриптазно-полимеразную цепную реакцию

(RT-PCR) и гибридизацию на месте (Хосоя и др.., 2000). Следовательно,

определение уровней экспрессии белка лежит в основе этих методов. NMU1

преимущественно экспрессируется в периферических тканях, таких как

тонкий кишечник, желудок, легкие, почки, поджелудочная железа, матка и

надпочечники (Хосоя и др.., 2000). Присутствие NMU1 в головном мозге

продемонстрировало противоположные доказательства. Хедрику (2000) не

6

удалось показать присутствие мРНК NMU1 в головном мозге. Однако Ховард

преимущественно в центральной нервной системе человека (Брайтон и др..,

2004). NMU2 в большом количестве содержится в гиппокампе, продолговатом

мозге, таламусе и спинном мозге. NMU2 также присутствует в меньших

количествах в периферических тканях (Хосоя и др.., 2000).

NMU1 и NMU2 оба сигнализируют как семейство GPCR. Это связано с

тем, что NMU1 и NMU2 обладают консервативными аминокислотными

триплетами (D/ERY мотив) для связывания с лигандом и связывания с G-

белком. Кроме того, оба они имеют характерно расположенные остатки

цистеина во внеклеточных петлях 2 и 3 (Брайтон и др.., 2004). Эти особенности

NMU1 и NMU2 характерны для GPCR семейства 1. Показано, что NMU2

×10-10 М) (Мори и др., 2005).

NmU и NmS, связывающие NMU1 и NMU2, играют различные роли во

всем организме человека. Этого следует ожидать из-за широкого

распространения NMU1 и NMU2. В настоящее время исследования

сосредоточены на роли NmU в сокращении гладких мышц и регулировании

питания (Митчелл и др.., 2009).

Показано, что эффект NmU, вызывающий сокращение гладкой

мускулатуры, является видоспецифичным. Мышиные модели показывают, что

NmU косвенно усиливает сокращение мышц в толстой кишке, воздействуя на

электрическую активность, контролирующую сокращение, уменьшая

7

интервал между последовательными сокращениями (Дасс и др., 2007). Было

непосредственно влияет на кровоток, вызывая сокращение гладких мышц при

стимуляции как NMU1, так и NMU2 (Джонс и др., 2006). Исследования

нокаута показывают, что NmU связывает NMU1 при сокращении желчного

пузыря (Джонс и др., 2006). И наоборот, действие NmU в опосредовании

сокращения мышиной матки и семявыносящего протока происходит через

NMU2. Это показывает, что рецептор, с которым связывается NmU, зависит от

места действия NmU.

Центральные эффекты NmU проявляются в том, что внутримозговая

(внутривенная) инъекция NmU снижает аппетит и кормление. ОТ-ПЦР

показывает, что NmU экспрессируется централизованно в различных моделях

гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось (HPA), вызывая

опосредованное NmU повышение уровня кортикотропин-рилизинг-гормона

(CRH). Это привело к регулируемому лептином увеличению

адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортикостерона, которое, как было

показано, уменьшается, когда NmU блокируется с помощью анти-NmU IgG.

Считается, что влияние NmU на регуляцию аппетита происходит через

NMU2. Это связано с экспрессией NMU2 в стенке 3-го бокового желудочка

гипоталамуса (Хосоя и др.., 2000). Агонист NMU2 EUK2010 уменьшал

потребление пищи и снижал массу тела мышей. Лечение препаратом EUK2010

показало увеличение гормонов, регулирующих аппетит, CRH и ACTH. Эти

8

гормоны контролируются рецептором лептина. Следовательно,

мыши, у которых отсутствовала экспрессия лептина, по-прежнему имели

меньший вес при внутривенной инъекции NmU. Кроме того, инъекция

лептина мышам не смогла изменить экспрессию гена NmU в гипоталамусе.

Это свидетельствует о лептинн-независимой природе NmU (Ханада и др.,

2004). Кроме того, у мышей NmU KO наблюдалось повышение CRH, но без

изменения уровней АКТГ. Показано, что NmU частично воздействует на CRH,

поскольку мыши CRH KO не демонстрируют снижение кормления (Ханада и

др., 2004). Следовательно, механизм, с помощью которого лептин действует

на ось HPA, неясен. Однако, несмотря на отсутствие четкого пути, очевидно,

что показано, что NmU снижает кормление и аппетит.

Таким образом, точный механизм NMU2 при кормлении в настоящее

время неясен. Чтобы понять роль NMU2 в регуляции питания и аппетита,

необходимо понять внутриклеточную передачу сигналов NMU2 после

стимуляции NmU или NmS.

NmU и NmS функционируют через рецептор NMU2. NmS проявляет

несколько более высокую активность по отношению к NMU2 по сравнению с

NmU (Мори и др., 2005). Поэтому наше исследование было направлено на то,

чтобы определить, вызывает ли это различие в аффинности NmS другой

внутриклеточный сигнальный путь. Чтобы исследовать это, первоначально

регистрировали внутриклеточные уровни кальция из NmU и NmS на NMU2 в

9

присутствии протокола кислотной промывки. Уровни кальция были

активации Erk1 /2 NMU2 с NmU и NmS соответственно также сравнивали,

чтобы определить, активируется ли Erk1 / 2 зависимым от G-белка или

независимым от G-белка путями. Любые потенциальные различия,

предполагаемые из этих данных, могут объяснить эволюционную потребность

в двух лигандах, NmU и NmS, связывающихся с одним и тем же рецептором

NMU2 для опосредования аппетита и питания. Впоследствии выяснение

внутриклеточной передачи сигналов NMU2 может позволить использовать

потенциал NMU2 для фармакологического воздействия для лечения

нарушений питания, таких как ожирение.

Рисунок 3: Здесь показано изменение флуоресценции как показателя

концентрациях лиганда. Изменение флуоресценции Fluo-4-AM

регистрировалось как представление изменений в [Ca2+]I с помощью

считывателя пластин NOVOstar. Этот эксперимент был проведен в рамках

N=5.

Приведенная выше кривая зависимости концентрации показывает, что

при добавлении каждого лиганда возникает кальциевая реакция. Чем выше

концентрация добавленного лиганда, тем сильнее изменяется флуоресценция,

следовательно, увеличивается содержание кальция. Реакция кальция была

низкой, когда любой лиганд добавляли при 0,1 нМ, 0,3 нМ и 1 нм. Реакция

кальция увеличивается от 3 нм до 10 нм. Затем плато отклика находится в

pH2 (3 нм и 30 нм), либо KHB pH7.4 (контроль). После 5-минутного периода

восстановления монослои клеток HEK293-NMU2 затем стимулировали NmU,

и изменение флуоресценции Fluo-4-AM регистрировали как представление

изменений в [Ca2+]I с помощью планшетного считывателя NOVOstar. Это

было проведено в рамках N=3.

Это было проведено в рамках N=3.

Этот эксперимент был использован для определения того, влияет ли 20-

секундное применение кислоты на способность клеток инициировать

кальциевый ответ. Были использованы концентрации лиганда 3 нм и 30 нм,

поскольку предыдущий эксперимент показал, что кальциевая реакция

происходит при обеих концентрациях. Сравнивая реакции промывки

кальцием pH7.4 KHB при стимуляции 30 нм NmS (рисунок 6), существенной

разницы (значение p = 0,0740) снова не наблюдается. В результате было

показано, что кислотная промывка не влияет на кальциевую реакцию клеток

на лиганд при 30 нм. Этот эксперимент показал, что кислотная промывка рН2

не оказывала существенного влияния на кальциевую реакцию по сравнению с

промывкой рН7,4 KHB. Следовательно, протокол кислотной промывки был

использован в последующих экспериментах для удаления лиганда, связанного

с рецептором.

Монослои клеток HEK293-NMU2 сначала подвергли воздействию 30 нм

NmU или NmS. Затем клетки промывали раствором кислоты с рН2 (NmU и

Этот эксперимент был проведен, чтобы исследовать, заставляет ли

немного более высокая активность NmS по отношению к NmU NMU2

изменять [Ca2+]I по-разному. Гистограмма показывает изменение [Ca2 +] I,

зарегистрированное после первого воздействия NmS, вызывает несколько

больший отклик по сравнению с NmU. Однако анализ не показывает

существенной разницы между кальциевыми реакциями при первом

воздействии NmU и NmS после удаления кислотной промывкой и заражения

NmU. Это подтверждается значением p, равным 0,3013. Кроме того,

кальциевая реакция была значительно выше, чем в контроле.

Временной курс стимуляции клеток вестерн-блоттинга

времени. Уровень активации pERK1/2 для NmS выше в каждый момент

времени по сравнению с pERK1/2 для NmU. Кроме того, уровни pERK1/2

поддерживаются от 5 мин до 120 мин временных точек для обоих лигандов.

Монослои клеток HEK293-NMU2, культивированных на 24-луночных

планшетах. Их стимулировали 30-нм NmU (красный и зеленый) или NmS

(синий и фиолетовый). Затем лиганд удаляли либо через 1 мин (синий и

зеленый), либо через 5 мин (красный и фиолетовый) с использованием

кислотного раствора рН2. Клетки промывали с использованием 100uL pH2

KHB в течение 20 секунд. Затем клетки промывали 200uL KHB, и KHB

добавляли в лунки после окончательной промывки. Каждую лунку оставляли

несколько более высокая активность NmS по отношению к NmU NMU2

изменение уровней pERK1/2 по-разному для каждого лиганда, и определить,

активируют ли NmU и NmS pERK1/2 независимым от G-белка образом. В

целом результаты исследования кислотной промывки вестерн-блоттинга

несопоставимы из-за больших различий в данных, полученных для каждого

повтора. Следовательно, статистические тесты не показывают

последовательных выводов между каждым повторным экспериментом.

Несмотря на это, ключевой особенностью всех экспериментов является

постепенное снижение отклика pERK1 / 2 по мере увеличения временных

точек. Когда либо NmU, либо NmS сначала стимулировали в течение 1 мин

или 5 мин, NMUR2 будет активирован. Поскольку внеклеточный лиганд и

сравнению с 5-минутным моментом времени.

Из N=1 показано, что отклик pERK1/2 NmU 5 мин (красный)

значительно больше, чем NmU 1 мин (зеленый) в моменты времени 5 мин и 10

мин. Это подтверждается значением p 0,0269 и 0,0192 для временных точек 5

мин и 10 мин соответственно. Также показано, что NmU 5 мин (красный)

значительно больше, чем NmU 1 мин (зеленый) в момент времени 10 мин. Это

подтверждается значением p, равным 0,0205.

Кроме того, как NmU, так и NmS демонстрируют активацию pERK1/2

после кислотной промывки, предполагая, что оба лиганда могут

сигнализировать, когда лиганд не связан с рецептором.

Заключение

кальция и активации Erk1/2.

Показано, что NmS обладает несколько большей активностью по

отношению к NMU2 по сравнению с NmU (Мори и др., 2005). Это

подтверждается значениями EC50, полученными в результате нашего

исследования кальциевой сигнализации (рис. 3). Исследование "вызов /

повторный вызов" (рисунок 6) не показало существенной разницы (p<0,05) в

изменении внутриклеточного кальция между NmU или NmS,

связывающимися с NMU2. Следовательно, показано, что повышенная

активность NmS по отношению к NMU2 по сравнению с NmU не влияет на

кальциевую передачу сигналов NMU2. Высвобождение кальция приводит к

быть обусловлена интернализацией NMU2, который затем возвращается

обратно на поверхность мембраны. Интернализации предшествует

десенсибилизация. Десенсибилизация происходит для предотвращения

чрезмерной стимуляции GPCR.

Как правило, это влечет за собой фосфорилирование рецептора. Это

осуществляется протеинкиназами, опосредованными вторым мессенджером

(такими как PKA или PKC), которые воздействуют на рецептор, уменьшая

выработку второго мессенджера. Альтернативно, рецепторные киназы,

связанные с G-белком (GRK), фосфорилируют рецептор.

Фосфорилирование с помощью GRK вызывает рекрутирование β-

GPCR. GRK2-6 регулирует фосфорилирование GPCR.

Различные различные комбинации фосфорилирования приводят к

увеличению аффинности рецептора и приводят к последующему связыванию

различных β-аррестинов с рецептором.

Это приводит к отсоединению G-белка от рецептора и, следовательно, к

десенсибилизации.

Десенсибилизация после фосфорилирования GRK вызвана тем, что β-

аррестин стерически препятствует G-белкам, предотвращая их ассоциацию с

GPCR для предотвращения передачи сигналов. Также β-аррестин действует

как каркас для киназ, которые разрушают вторичные мессенджеры при

Передача сигналов интернализованному рецептору должна быть

прекращена, чтобы могла произойти повторная сенсибилизация или

деградация. Первоначально было показано, что сродство β-аррестина к

рецептору регулирует судьбу рецептора после интернализации. Совсем

недавно было показано, что B-аррестин является частью актин–сортирующего

комплекса nexin 27 (SNX)–ретромерные канальцы (ASTR). Судьба эндосомы

регулируется комплексом ASTR путем формирования, который действует как

молекулярный тормоз для уменьшения передачи сигналов

интернализованного рецептора.

Комплекс ASTR состоит из многих белков, включая β-аррестин,

разложения или утилизации. Рециркуляция рецептора происходит либо

посредством ASTR-зависимого, ASTR-независимого, либо ретроградного

транспорта (Pavlos et al., 2016). Однако присутствие комплекса ASTR в

настоящее время ограничено рецептором паратиреоидного гормона класса В

(PTHR), который образует раннюю эндосому.

Эта ранняя эндосома может быть разрушена, может образовывать

сигналосому или приводить к рециркуляции рецептора посредством ASRT-

зависимой или независимой рециркуляции. Следовательно, NmU может

вызывать последующую десенсибилизацию, интернализацию и повторную

сенсибилизацию NMU2, возвращаясь на поверхность клетки подобно PTHR.

течением времени, тогда как активация Erk1/2 в вестерн-блоттинге с течением

времени сохраняется после стимуляции NmU. Это показывает, что активация

NmU Erk1/2 требует присутствия лиганда, чтобы позволить повторно

сенсибилизированному NMU2 связывать внеклеточный NmU и продолжать

демонстрировать длительный ответ Erk1/2.

Однако активация Erk1/2 после стимуляции NmS NMU2 не ослабевает

при промывке pH7.4. Это подтверждает доказательства того, что NmU

заставляет NMU2 подвергаться рециркуляции рецептора подобно PTRH, но

ставит под сомнение роль NmS в рециркуляции рецептора. Следовательно,

показано, что NmU и NmS активируют Erk1/2 разными путями.

Временной ход вестерн-блоттинга также показывает, что после

к NMU2 по сравнению с NmU, поскольку лиганд может оставаться связанным

с рецептором дольше, чем NmU. Это также дает дополнительные

доказательства того, что NmU и NmS активируют Erk1 / 2 по-разному.

Активация NmS Erk1/ 2 может быть обусловлена интернализированной

передачей сигналов NMU2 независимым от G-белка образом, поскольку для

пролонгированной активации Erk1/ 2 не требуется внеклеточный лиганд.

Рецепторы, включая, но не ограничиваясь ими, PTHR, GLPR и V2R, все

показали устойчивую передачу сигналов после интернализации.

Вестерн-блоттинг с кислотной промывкой pH2 демонстрирует

доказательства независимой от G-белка передачи сигналов, поскольку

обеспечения независимой от G-белка передачи сигналов. Интернализация

также позволяет GPCR стать повторно сенсибилизированным или

пониженным после десенсибилизации.

Интернализация может происходить с помощью трех основных

механизмов.

опосредованного GRK фосфорилирования и связывания β-аррестина.

Показано, что это происходит как в отсутствие, так и после стимуляции

рецептора агониста.

Впоследствии адаптерный белок AP-2 связывается с карбоксиконцевым

связанными.

Затем этот КПК удаляется с мембраны с помощью ГТФазы, известной

как динамин, и образуется эндосома. Это известно как клатрин-зависимая

интернализация. Со временем N-этилмалеимид-чувствительный слитый белок

(NSF), малый G-белок ARF6 и PI4P-киназа были идентифицированы как

партнеры по связыванию B-аррестина, которые способствуют

интернализации.

Также показано, что убиквитинирование β-адренорецептора 2

убиквитинлигазой E3 усиливает связывание клатрина с β-аррестином и

стабилизирует эндосому в большей степени, чем неубиквинтированную

интернализуется, регулируется рецептором. Это очевидно, поскольку

рецептор CCR5 интернализуется β-аррестин-зависимым образом, тогда как

рецептор нейропептида Y2 интернализуется β-аррестин-независимым образом

(Walther et al., 2013). Однако большинство GPCR интернализуются β-

NMU2 с использованием конфокальной микроскопии могут подтвердить,

интернализуется ли NMU2 после стимуляции NmU и NmS.

В дополнение к предположению о том, что NMU2 интернализован,

стимуляция клеток кислотной промывки вестерн-блоттингом показывает

интернализованные сигналы NMU2. Это показало, что как NmU, так и NmS

заставляют NMU2 подвергаться интернализированной передаче сигналов

что ответ Erk1/2 может исходить только от интернализованного рецептора.

Интернализованный рецептор подает сигналы, образуя комплекс, известный

как сигналосома. Это представляет собой внутриклеточный комплекс внутри

эндосомы, состоящий из интернализованного рецептора с β-аррестином,

действующим в качестве каркаса для AP2 и клатрина.

Сигналосома опосредует независимую от G-белка передачу сигналов и

регулируется действием β-аррестина.

Рецепторы класса В, которые обладают высоким сродством к β-

аррестину 1 и 2, связаны с устойчивой активацией MAPK после

интернализации. Принимая во внимание, что рецепторы класса А связывают

адренергического рецептора класса А (β2AR), предпочтительно подвергаются

рециркуляции рецептора. Химерные рецепторы, содержащие карбоксильный

конец рецепторов вазопрессина класса B V2, не проявляют повторной

сенсибилизации, но демонстрируют длительную активацию MAPK, которой

не хватает ректорам класса A. Это связано с тем, что рецепторы класса В

связывают гормоны или β-аррестин по двухэтапному механизму, сначала

связываясь с N-концом, затем С-концом, и образуют стабильную раннюю

эндосому, которая обеспечивает интернализованную передачу сигналов

рецептора.