Влияние снижения передачи сигналов ERKMAPK на аутоиммунитет и заболевание

Содержание

Введение 3

Результаты 5

Влияние Mek мутации на эритропоэз 10

Обсуждение 15

МЕТОДЫ 17

Колониеобразующие анализы 21

Период полураспада эритроцитов 28

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ФИГУР 30

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 32

Введение

Сигнальные пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) состоят из каскадов протеинкиназ, которые связывают внеклеточные стимулы с мишенями, расположенными в разных клеточных компартментах1. У млекопитающих путь внеклеточной регулируемой сигналом киназы (ERK) представляет собой наиболее охарактеризованное семейство MAPK. Путь ERK активируется множеством поверхностных рецепторов, включая рецепторы фактора роста, рецепторы антигенов В и Т-клеток и рецепторы, связанные с G-белком, что приводит к различным физиологическим эффектам, включая определение судьбы, дифференцировку, пролиферацию, выживание, миграцию и апоптоз1,2,3,4,5,6,7,8.

После запуска рецептора RAS связывает GTP и образует гетеродимеры с протеинкиназами RAF, которые непосредственно фосфорилируют и активируют MEK1 и MEK2. Активный MEK1/2 затем фосфорилируют и активируют ERK1 и ERK29,10. Хотя множественные киназы могут активировать MEK1 и MEK2, они являются единственными киназами, способными фосфорилировать и активировать ERK1/2. MEK1 и MEK2 действуют как привратники и как таковые считаются перспективными терапевтическими мишенями при раке и аутоиммунных заболеваниях. Первый ингибитор MEK был введен более 20 лет назад.

С тех пор было разработано несколько новых соединений, и некоторые из них в настоящее время проходят клинические испытания III фазы в качестве моно- или комбинированной терапии при множественных видах рака, включая меланому, колоректальный рак и немелкоклеточный раклегких 11,12. Хотя хорошие результаты были получены при солидном раке, они дали неутешительные результаты при ревматоидном артрите, предполагая, что MEK1 / 2 играют более сложную роль в регуляции иммунного ответа13.

У млекопитающих белки MEK1 и MEK2 идентичны на 80%14.Нулевоймутант Mek1 погибает на эмбриональный (E) день 10,5 беременности от недоразвития экстраэмбриональных тканей плаценты15,16,17. И наоборот,мыши Mek2-/-являются жизнеспособными и фертильными, что указывает на компенсаторные эффектыMek118. Условная делецияMek1в собственно эмбрионе дает жизнеспособных и фертильныхмышей Mek1-/-, что указывает на функциональную избыточность междугенами Mek1иMek2при формировании эмбриона. Это представление дополнительно подтверждается отсутствием очевидных фенотипов у животных, у которых ткани-мишени сохраняют только одинMek1 or Mek2функциональный аллель Mek1 или Mek219,20,21,22,23,24,25,26. Действительно, дефекты развития наблюдаются только тогда, когда всеаллели Mek1иMek2удалены. Совсем недавно мы показали, что белки MEK1 и MEK2 также функционально избыточны для развития экстраэмбриональных тканей. Таким образом, хотя MEK1 и MEK2 могут заменять друг друга, минимальное количество MEK имеет решающее значение для развития плаценты и выживания эмбриона14.  

Несколько исследований установили решающую роль пути ERK/MAPK в пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток4,5,6,7,8,27. Передача сигналов ERK необходима для поддержания гемопоэтических стволовых клеток, при положительном отборе В- и Т-клеток, а также при созревании В-клеток5,28,29,30,31,32,33. Он участвует в активации и выживании В-клеток после сшивания В-клеточного рецептора (BCR) и CD4032,34,35. Кроме того, путь ERK активен в зародышевом центре, где активированные В-клетки, следующие за Т-клетками, помогают пролиферировать, переключать класс изотипа и увеличивать аффинность их BCR30. Однако в некоторых исследованиях был описан специфический фенотип, связанный с делецией отдельной киназы пути ERK/MAPK. УдалениеErk1увеличивает эритропоэз в селезенке и нарушает пролиферацию и созревание тимоцитов7,36. Активация пути ERK/MAPK также играет решающую роль в регуляции продукции цитокинов антигенпредставляющими клетками (APC), а именно макрофагами, дендритными клетками (DC) и Т-клетками37,38,39,40,41,42. Нарушения пути ERK/MAPK могут изменять соотношение IL-10 и IL-12 и дифференцировку Т-хелперных (Th) клеток37,41,43,44. Умутантов Erk1-/-изменения в соотношении IL-10/IL-12 благоприятствуют поляризации клеток Th1 по сравнению с дифференцировкой клеток Th237. Аналогичным образом, макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM), выделенные изMek1нулевых мутантов Mek1 (Mek1-/-;Tg+/Sox2-cre), также показали изменение соотношения IL-10/IL-12 в ответ на активацию TLR4 липополисахаридами (LPS), тогда как ингибирование пути MEK1/2 илиMek1Делеция Mek1 в BMDM усиливает поляризацию BMDM M2 в ответ на стимуляцию IL-4 / IL-1342,45. Вместе эти данные предполагают, что функциональная избыточность ERK1 / 2 и MEK1 / 2 может быть специфичной для типа клетки.

Чтобы конкретно рассмотреть рольMek1иMek2в дифференцировке и функционировании лимфоидных и миелоидных клеток, а также обойти раннюю эмбриональную летальностьмутантовMek1 null, удалениеMek1функции Mek1 наMek2фоне Mek2 null было направлено на линии гемопоэтических клеток с использованием линиимыши Vav1-icredeleter. Мыши,Mek1укоторыхгены Mek1 и Mek2 не функционируют в кроветворных линиях, родились с ожидаемой менделевской частотой, но они были анемичными и умерли вскоре после рождения. Мыши, которые сохраняют один функциональный аллельMek1илиMek2в линии гемопоэтических клеток,Mek1+/floxMek2-/- Tg+/Vav1-iCre(далее 1Mek1) иMek1flox/floxMek2+/- Tg+/Vav1-iCre(1Mek2), являются жизнеспособными и фертильными. Однако более 50%самок 1Mek1и1Mek21Mek2 и 15% самцов умерли в возрасте до 14 месяцев.Mek1Мутанты 1 Mek1 и 1Mek2демонстрируют почти нормальный эритропоэз, но аномалии созревания и активации их линий В- и Т-клеток приводят к выработке аутоантител против ядерных белков и двухцепочечной ДНК, что является признаком системной красной волчанки (СКВ). 1Mek1Мутанты Mek1 умерли от тяжелой анемии, и их вскрытие показало хронический гломерулонефрит, связанный с отложением антител и комплементов, что, скорее всего, приводит к дисфункции почек, тяжелым угрожающим жизни состояниям, напоминающим состояние, наблюдаемое у пациентов с СКВ. Таким образом,Mek1мутанты мыши 1 Mek1 предоставляют новый генетический инструмент для изучения роли пути ERK/MAPK в иммунном ответе и в патогенетических механизмах аутоиммунного заболевания.Он также предлагает уникальную модель для характеристики молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза гломерулонефрита, и для рассмотрения различий в прогрессировании СКВ у женщин и мужчин.

Результаты

Потеря функции MEK в линиях гемопоэтических клеток приводит к смерти после рождения из-за тяжелой анемии.

АбляциюMek1функции Mek1 в линиях гемопоэтических клеток производили спомощью линии мыши Vav1-icredeleter наMek2фоне Mek2 null46. Mek1+/floxMek2-/- Tg+/Vav1-iCreсамцов скрещивали сMek1flox/floxMek2-/-самками для полученияэмбрионов Mek1flox/floxMek2-/-Tg+/Vav1-icre, после чего вызывалимутанты Mek сгемопоэтическим нулевым (Mekhema null). Ожидаемые менделевские соотношения были получены в разных тестируемых эмбриональных возрастах и при рождении.

E16.5Mekhema нулевыеэмбрионы и новорожденные оказались фенотипически нормальными по сравнению с контрольными пометами. Их васкуляризация и кровообращение не имели явных дефектов при E16.5. Однако, даже еслиMekу новорожденных с нулевым уровнем Mek hemaне было никаких признаков цианоза при рождении, все они умерли в течение первых 36 часов. Их гематокрит был сильно снижен, а также размер селезенки, что указывает на дефект эритропоэза и кроветворения.

Чтобы определить, была ли анемия и уменьшение размера селезенки умутантов Mekhema nullвызваны дефектами в определенных линиях гемопоэтических клеток, спленоциты новорожденных анализировали методом проточной цитометрии с использованием маркеров, ограниченных происхождением. Популяция CD11b+и Ly6G+одиночных положительных и незрелых LY6G+CD11b+дважды положительных миелоидных клеток, а также популяция CD19+В-клеток были резко снижены умутантов Mekhema null, что указывает на снижение моноцитов, макрофагов, гранулоцитов, естественных клеток-киллеров и В-клеток.

Если данные были нормализованы с поправкой на уменьшенный размер селезенки, то уменьшение было еще более серьезным.

Окрашивание Ter119 и CD71 и параметр прямого рассеяния (FSC) использовали для мониторинга субпопуляций эритробластов: проэритробластов (ProE; Ter119medCD71highFSChigh), базофильных (Ery.A; Ter119highCD7highFSChigh), позднебазофильных и полихромных (Ery.B; Ter119highCD71highFSClow)., и ортохроматические эритробласты (Ery.C; Ter119высокийCD7низкийFSCнизкий) в селезенке и печени матки из помета отскрещивания Mek1+/floxMek2-/- Tg+/Vav1-iCrexMek1flox/floxMek2-/-7,47. Ter119+компартмент имел тенденцию к уменьшению (данные не показаны), тогда как доля эритробластов в дифференцировке, а именно ProE и Ery.C, была значительно снижена в селезенкемутантов Mekhema null.

Напротив, популяция Ery.B-клеток была увеличена. В целом эти результаты показали роль пути ERK в экспансии эритроидных клеток и их дифференцировке, влияющих на последние этапы созревания эритроидных клеток.

Кроветворение происходит в последовательных местах во время эмбриогенеза, мигрирующих из желточного мешка (от E7.5 до E 10.5), области аорты, гонад и мезонефроса (AGM) (от E8.5 до E11.5), плаценты от E10.5 до E 13.5 и печени (от E10.5 до рождения)48. Чтобы определить, была ли анемия и снижение общего количества клеток селезенки вызваны дефектом экспансии определенного предшественника, общее количество эритроидных взрывообразующих единиц (BFU-E, примитивный эритроидный предшественник), мультипотентный миелоидный предшественник (КОЕ-GEMM) и гранулоцитарно-макрофагальный предшественник (КОЕ-GM) колонии в AGM при E10.5, периферическую кровь при E12.5 и печень при E14.5 контролировали в анализах колониеобразования метилцеллюлозы.

Не наблюдалось статистических различий в количестве различных миелоидных и эритроидных предшественников, полученных контрольным иMekhema nullAGM. Напротив, из периферической крови и печени плода от нулевых эмбрионов Mek hema не было получено ни одного или нескольких колоний КОЕ-GM и КОЕ-GEMMMekhema null. Количество колоний BFU-E не было изменено в периферической крови, но уменьшилось в печени плода. В целом эти результаты показали, что в отсутствие передачи сигналов ERK кроветворение было нарушено. На ранней стадии, до действия рекомбиназы Cre, предшественники были продуцированы в AGM, что позволило вызвать первую волну эритропоэза, но на более поздней стадии, когдаMek1гены Mek1иMek2 были инактивированы, экспансия и / или выживание различных предшественников миелоидных клеток снижается и способствует анемии, наблюдаемой при рождении49.

Преждевременная гибельмышей - мутантов 1 Mek1и 1Mek2mutant mice

Чтобы оценить важность пути ERK в кроветворении на более поздних стадиях,Mek за мутантами Mek наблюдали на предмет выживаемости в течение 14 месяцев. Как показано на, более 60 и 80% женщин, которые сохраняют один функциональный аллельMek1илиMek2в линии гемопоэтических клеток,Mek1+/floxMek2-/- Tg+/Vav1-iCre(1Mek1) иMek1flox/floxMek2+/- Tg+/Vav1-Мутанты iCre(1Mek2) умерли до 14-месячного возраста по сравнению с 20% и 50% для самцов, тогда как в когорте контрольных однопометников или wt мертвых животных не наблюдалось. Около 1мутантаMek1 и 1Mek2мутанта Mek2 были найдены мертвыми, но большинство из них были подвергнуты эвтаназии. ДляMek1мутантов 1 Mek1 эвтаназия была обязательной, потому что у них были признаки анемии, такие как бледные конечности, торчащие волосы и одышка. Гематокрит оценивали во время эвтаназии или у здоровыхMek1животных с мутацией 1 Mek1 в конце исследования.

Уровень гематокрита был нормальным у здоровыхMek1 мутантов 1 Mek1, но сильно снижен у мышей, подвергнутых эвтаназии. Напротив, в 1Mek2мутанты подверглись эвтаназии: у пяти были слабые и увеличенные лимфатические узлы, у шести были образования в печени из-за экстрамедуллярного кроветворения, а у одного был дерматит. Только у 2мутантов 1Mek2 были признаки анемии, что подтверждается снижением уровня гематокрита у проанализированных мутантов.

Более того, 7Mek2мутантов 1 Mek2 были найдены мертвыми, и их вскрытие не могло быть проведено. Несмотря на то, что оба мутанта 1Mek1и 1Mek2Mek2 умирают преждевременно, причины смерти различны.

Дефектный гемопоэз у мутантов 1Mek1и 1Mek2mutants

Чтобы определить, проявляли лиMek1 мутанты 1 Mek1 признаки анемии уже в более раннем возрасте, анализировали периферическую кровь от мышей-мутантов в возрасте от 2 до 4 месяцев и сравнивали сwtи единственнымMekмутантом Mek null:Mek1flox/floxTg+/Sox2-cre(Mek1-/-),Mek1flox/floxTg+/Vav1-icre(Mek1hema null) иMek2-/-мыши. Не наблюдалось различий в гематологических параметрах между мутантами wt,Mek2-/-иMek1hema null. Напротив,мутанты Mek1-/-, 1Mek1и 1Mek2 Mek2 показали снижение количества эритроцитов (эритроцитов) на 10-13%, концентрации гемоглобина и уровня гематокрита, что указывает на тенденцию к развитию анемии. Количество циркулирующих лейкоцитов как у мутантов 1Mek1, такиMek2 у мутантов 1 Mek2 было нормальным. Более того, отношение массы селезенки к массе тела было в два и три раза выше у мутантов 1Mek1и 1Mek2соответственно.

Индекс пролиферации с использованием иммуноокрашивания фосфогистоном H3 выявил повышенную пролиферацию вMek1 and 1Mek2красной и белой пульпах мутантов 1 Mek1 и 1 Mek2, что указывает на то, что спленомегалия была обусловлена дефектом в экспансии эритроидных и лимфоидных клеточных линий. В совокупности эти результаты свидетельствовали о том, что лимфопоэз и эритропоэз были затронуты у 1мутанта Mek1и 1Mek2мутанта Mek2.

Чтобы определить, было ли увеличениеMek1 and 1размера селезенки 1 Mek1 и 1Mek2 вызвано увеличением специфического гемопоэтического предшественника, был проведен анализ колониеобразующих клеток в среде на основе метилцеллюлозы. Никаких статистических различий в количестве предшественников не наблюдалось в костном мозге контрольных и 1Mek2 мутантов Mek2. Только количество мультипотентных предшественников CFU-GEMM и миелоидных предшественников CFU-GM было снижено у 1Mek1мутанта Mek1. В селезенке доля предшественников CFU-GEMM и BFU-E была снижена в 1Mek1; но их общее количество в органе значительно не уменьшилось по сравнению с контролем.

Напротив, общее количество предшественников CFU-GM, CFU-GEMM и BFU-E было увеличено уMek2мутантов 1 Mek2. В целом, эти результаты показали, что гемопоэтические предшественники присутствовали у мутантов 1Mek1и 1Mek2 Mek2, и их увеличенное количество у мутанта 1Mek2 Mek2 активно способствовало расширению селезенки.

Влияние Mek мутации на эритропоэз

Нормальный ответ на сигнал эритропоэтического стресса у мутантов 1Mek1и 1Mek2/

Нормальный эритропоэз и реакция на эритропоэтический стресс у мутантов 1Mek1и 1Mek2mutants

Увеличение селезенки у мутантов 1Mek1и 1Mek2 Mek2 может быть вызвано гематологической реакцией на стресс с целью выработки большего количества эритроцитов для компенсации снижения циркулирующих эритроцитов50,51. Повышенная пролиферация, наблюдаемая в красной пульпе селезенки, подтверждает эту гипотезу. Умеренная анемия и повышенная пролиферация в красной пульпе также могут быть вызваны для компенсации снижения выживаемости эритроцитов. Чтобы оценить период полураспада эритроцитов в кровообращении, мы измерили оборот меченных биотином эритроцитов методом проточной цитометрии. 1Mek1и 1Mek2эритроциты показали период полураспада, аналогичныйwtиMek1-/-мутантам. Для непосредственного тестирования способности мутантов реагировать на эритропоэтический стресс использовали гемолитическую анемию, индуцированную фенилгидразином (PHZ)50. Мышам вводили PHZ, и количество их гематокрита и ретикулоцитов контролировали в течение 14 дней.

Гематокрит резко снизился до 25% через два дня после лечения PHZ. Восемь дней спустя все генотипы были возвращены к нормальному уровню гематокрита. Не наблюдалось существенной разницы между контролем, 1мутантамиMek1 и 1Mek2 мутантами Mek2 (P= 0,96 по ANOVA). Фракцию ретикулоцитов периферической крови также использовали в качестве показателя эритропоэтического ответа с помощью FACS-анализа. Количество базальных ретикулоцитов было ниже 2,5% в контроле, 1мутанте Mek1и 1Mek2 мутанте Mek2. После PHZ-лечения индуцируется эритропоэз, и количество ретикулоцитов увеличивается во всех генотипах до максимального уровня, достигнутого на 6-й день, существенных различий между генотипами обнаружено не было (P= 0,97 по ANOVA). Затем была протестирована реакция мутантов 1Mek1и 1Mek2на эритропоэтин. Была сделана однократная подкожная инъекция ЭПО, и количество ретикулоцитов контролировалось с помощью FACS в течение 10 дней. Обе контрольные группы и 1мутантMek1 и 1Mek2 мутант Mek2 показали аналогичный ответ; P= 0,97 по ANOVA). 

В совокупности эти результаты показали, что эритропоэз у мутантов 1Mek1и 1Mek2 Mek2 существенно не пострадал и вряд ли мог объяснить развитие тяжелой анемии, приводящей к эвтаназии уMek1мутантов 1 Mek1.

Дефекты созревания и активации В- и Т-клетокMekу мутантов Mek

Умутантов 1 Mek1и 1Mek2 mutants, Mek1Mek2 делеция гена Mek1 спомощьюлинии мыши Vav1-icre deleter также происходит во всех лимфоидных и миелоидных линиях нафоненулевого мутанта Mek2. Следовательно,Mekмутация Mek может влиять на дифференцировку лейкоцитов и гомеостаз.  Как 1Mek1, так и 1Mek2 мутантная селезенка Mek2 содержали значительно увеличенное количество популяции миелоидных клеток (субпопуляции Gr-1+, Mac-1+и Gr-1+Mac-1+), а также T (CD3+) и B (CD19+) клеток, что указывает на то, что специфическая делецияMek1иMek2или, альтернативно, комбинированное восстановление белка MEK были вовлечены в эти возмущения.

Чтобы определить, на какой стадии дифференцировки миелоидных или лимфоидных клеток происходит нарушение гомеостаза, сначала была проведена более систематическая характеристика дифференцировки и активации лейкоцитов наMek2-/-и 1Mek1однопометниках отMek1+/floxMek2-/-Tg+/Vav1-iCrexMek1flox./флоксМек2-/-размножение. Тимоциты отMek1мутантов 1 Mek1 не показали статистической разницы в переходе дважды негативных Т–клеток из стадии DN1 в стадию DN4 (CD25–CD44+, CD25+CD44+, CD25+CD44–и CD25–CD44-соответственно) при сравнении сMek2-/-контролем.

Более того, доля CD4+CD8+двойных положительных, а также CD4+и CD8+одиночных положительных Т-клеток статистически не различалась. Аналогичным образом, анализ В-клеток в костном мозге (BM) не выявил значительных изменений в дифференцировке от pro-B (CD19+CD93+B220+c-kit+), pre-B (CD19+CD93+B220+c–kit-IgM), незрелых рециркулирующих В-клеток (CD19+CD93+B220+c-kit-IgM+) и плазмоциты (B220–CD138+) междумутантами wt,Mek2-/-и 1Mek1.

Более того, никаких изменений в миелоидной субпопуляции: дендритных (CD11b–Cd11c+), моноцитов (CD11b+Cd11c–) и монофагов (CD11b+Cd11c+) также не наблюдалось в BM.

Напротив, основное влияние на созревание и активацию В- и Т-клеток наблюдалось вMek1спленоцитах 1 Mek1. Компартмент В- и Т-клеток также был поражен вMek2спленоцитах мутантов 1 Mek2.

Поэтому мы продолжили нашу характеристику спленоцитов наMek1 Mek2аллельной серии Mek1 Mek2, включающеймутанты Mek1- /-,Mek2- /-, 1Mek1и 1Mek2, иwtв качестве контроля. Количество спленоцитов было значительно увеличено у 1Mek2мутанта Mek2 через 2,5 и 9 месяцев, а уMek1-/-через 9-10 месяцев и тенденция к увеличению у 1Mek1через 9-10 месяцев (P=0,072). Соответственно, количество В–клеток (B220+CD19+CD93-) было значительно увеличено у 1Mek2мутанта Mek2 через 2,5 месяца и умутантов Mek1-/-, 1Mek1и 1Mek2через 9-10 месяцев.

Количество незрелых переходных (B220+CD19+CD93+) и фолликулярных (B220+CD19+CD93–CD23+CD21int) В-клеток также было значительно увеличено уMek2мутантов 1 Mek2 через 9-10 месяцев, а также через 2,5 месяца для фолликулярных В-клеток.

Количество В–клеток зародышевого центра (B200+FAS+GL7+), обогащенных аутореактивными незрелыми В–клетками (B220+CD19+CD93–CD23-CD21-), плазматическими клетками (B220+CD138+) и фолликулярными хелперными Т-клетками (CD4+BCL6+PD+Foxp3lo+CXCR5+). были увеличены умутантов Mek1-/-, 1Mek1и 1Mek2Mek2 через 2,5 и 9-10 месяцев, показывая также градацию в зависимости от генотипа.

Увеличение количества В-клеток зародышевого центра и плазматических клеток в 1Mek1указывало на увеличение активации В-клеток, что было подтверждено увеличением+популяции В-клеток с переключением IgG1+ и+количества секретирующих IgG1+anticorps клеток.

Кроме того, количество активированных CD4+ и CD8+Т-клеток (CD44hihiCD62LOlo) было увеличено за 2,5 месяцав селезенке 1мутанта Mek1, и тенденция к увеличению или уменьшению наблюдалась в костноммозге мутантов Mek1-/-, 1Mek1и 1Mek2.

Наконец, как упоминалось ранее, лимфатические узлы часто увеличивались у подвергнутых эвтаназииMek2мутантов 1 Mek2 и в образцах, проанализированных FACS в возрасте 9-10 месяцев.

Однако распределение B (B220+), CD4+и CD8+Т-клеток не изменилось уMek2мутантов 1 Mek2.

Напротив, популяция В-клеток была увеличена уMek1мутантов 1 Mek1 в ущерб CD4+ и CD8+ Т-клеткам. В совокупности эти результаты показали, что нарушение пути ERK оказывает значительное влияние на созревание и активацию В- и Т-клеток.

Дефекты активации иммунного сигнального пути уMekмутантов Mek

Ранее мы показали с помощью анализаMek1 Mek2аллельных серий Mek1 Mek2, что тяжесть фенотипов плаценты коррелировала с количеством белка / активности MEK, независимо от того, какая изоформа MEK была продуцирована14. Чтобы определить, возникает ли аналогичная ситуация в кроветворении, мы сначала оцениваем активацию пути ERK в ответ на иммунные стимулы вMek1 Mek2аллельных сериях Mek1 Mek2. B220+спленоциты стимулировали анти-IgG+IgM (H+L), и кинетику активации ERK исследовали с помощью фосфоспецифической проточной цитометрии. Ранее мы показали, чтоMek1ген Mek1 продуцирует в два раза больше белка MEK, чемMek214. Следовательно, активация ERK в B220+спленоцитах была пропорциональна уровням белков MEK, которые были максимальными вwtи снижались вMek2-/-,Mek1-/-, 1Mek1и были самыми низкими уMek2 мутантов 1 Mek2 Снижение активации пути ERK было связано со снижением фосфорилирования S6 рибосомального белка, являющегося последующей мишенью .

Удивительно, но активация/фосфорилирование SYK и AKT также были снижены после снижения активации пути ERK.

Аналогично, активация пути ERK в+CD44мутантных Т-клетках CD4+CD44+MekMek в ответ на обработку анти-CD3 и -CD28 перекрестными связываниями также была пропорциональна уровням белков MEK.

Снижение фосфорилирования AKT также наблюдалось уMekмутантов Mek.

Вместе эти данные указывают на градиент активации ERK в этойMek1 Mek2аллельной серииMekMek1 Mek2 мутантов Mek в ответ на иммунные стимулы и влияют на другие сигнальные пути, которые коррелируют с наблюдаемым иммунным фенотипом и, скорее всего, способствуют нарушению развития иммунной системы.

у 1Mek1мутанта Mek1 развивается гломерулонефрит

ВскрытиеMek1мутантов 1 Mek1 с тяжелой анемией выявило наличие бледных почек по сравнению с красноватыми почками у контрольных или здоровыхMek1мутантов 1 Mek1.

Гистопатологический анализ почки с использованием окрашивания H & E и PAS показал явное повреждение почек, характеризующееся мезангиальной пролиферацией с увеличением мезангиального матрикса, образованием полумесяца и уменьшением пространства Боумена. Кроме того, также наблюдался внутрикапиллярный с облитерированными просветами капилляров и утолщенными стенками капилляров. Также были отмечены разрушение и расширение трубок с помощью гиалиновых слепков. Кроме того, у анемичных Mek1 мутантов 1 Mek1 наблюдалась заметно повышенная интерстициальная инфильтрация иммунных клеток, что указывает на воспаление.

Наличие интерстициального фиброза исследовали методом иммуноокрашивания -SMA. У контрольных и здоровыхMek1мутантов 1 Mek1 анти--SMA окрашивал гладкие мышцы сосудов, выстилающие кровеносные сосуды. В анемичныхMek1 клубочках мутанта 1 Mek1 с серповидными клубочками, -SMA обнаруживал фиброзно-клеточный серповидный, указывающий на гломерулонефрит.

У контрольных и здоровых мутантов 1 Mek1 значительных повреждений клубочков обнаружено Mek1 не было. Иммунофлуоресцентное и иммуногистохимическое окрашивание выявило наличие отложений комплемента IgA, G, M и C3 в клубочкахMek1мутантов 1 Mek1. Принимая во внимание, что в клубочках контрольных или здоровых1 мутантов Mek1 не было обнаружено отложения иммуноглобулина или комплементаMek1. Вместе эти результаты указывали на гломерулонефрит уMek1мутантов 1 Mek1 из-за аутоиммунного заболевания.

Напротив, вскрытие девяти умерщвленных из 15Mek2мутантов 1 Mek2 показало нормальную гистопатологию почек, за исключением двух образцов, у которых была умеренная или тяжелая анемия и гломерулонефрит (гематокрит ниже до 40%). Однако у 4 из 15Mek2проанализированных мутантов 1 Mek2 наблюдалась инфильтрация иммунных клеток в почках и печени (3 умерщвленных и 1 здоровый мутант). 

В совокупности эти данные свидетельствовали о том, что мутанты 1Mek1и 1Mek2Mek2 имеют дефекты созревания и активации своей иммунной системы, но что только 1Mek1более восприимчив к развитию тяжелого гломерулонефрита из-за аутоиммунного заболевания, приводящего к воспалительному состоянию.

Снижение передачи сигналов MEK приводит к нарушению регуляции лимфопоэза, что приводит к аутоиммунитету

Аутоиммунное заболевание, такое как системная красная волчанка (СКВ), вызывает гломерулонефрит из-за выработки аутоантител, направленных против ядерной и двухцепочечной (ds) ДНК с отложением иммуноглобулина и комплемента в клубочках и образованием гиалинового слепка. Сначала присутствие аутоантител в сыворотке 1мутантовMek1 и 1Mek2 мутанта Mek2 оценивали с использованием анализа на антинуклеарные антитела (ANA).

В контрольной сыворотке не было обнаружено аутоантител, направленных против ядерного белка, тогда как 15 из 16 и 12 из 13 сывороток от усыпленных издоровых1мутантов Mek1 были положительными для теста ANA, соответственно. Все сыворотки, протестированные наMek21 мутантов Mek2, также были положительными (8 сывороток от умерщвленных и 3 от здоровых мутантов). Наличие антител против двухцепочечной ДНК также было проверено методом ИФА. Значительно более высокий титр анти-дсДНК наблюдался как у мутантов 1Mek1, такиMek2у мутантов 1 Mek2 (рис. 8B).

Активация В - и Т-клеток

Аутоантитела

Гапло-недостаточность MEK1 приводит к спонтанной выработке аутоантител

от количества специфичных к dsDNA IgG1+секретирующих клеток IgG1+ вMek1-/-и 1Mek1. Скорее всего, также в 1Mek2, но ELISpot не сработал. Принимая во внимание

Фенотип увеличивается с уменьшением активации пути ERK

Обсуждение

Наши исследования изоформ MEK выявили уникальные функции, отраженные различными фенотипамиMek1 and Mek2одиночных мутантов Mek1 и Mek217,18,54. Эта специфичность может быть объяснена исключительными ролями и / или различным пространственным распределением или уровнями белков MEK 14. Наши генетические исследованияMekфункции гена Mek в кроветворении показали, что наличие только одного функциональногоMekаллеля Mek в линиях кроветворных клеток является достаточным для поддержания нормального развития клеточного компартмента крови и обеспечения выживания мутантных щенков. Таким образом,гены Mek1иMek2Mek2 проявляют избыточные функции во время процесса гемопоэтической дифференцировки. Фенотипы, возникающие в результате абляцииMekгенов Mek в гемопоэтических предшественниках, были ожидаемыми из-за большого спектра действий лигандов, опосредующих их действие через путь ERK/MAPK.

В этом исследовании мы описали генерацию гиперморфного

Наше исследование предоставляет генетические доказательства функциональной избыточности MEK1 и MEK2 в процессе развития. 

В наших исследованиях мы продемонстрировали новую роль пути MEK1/2

ff–v:

+f–v et ff+-v:

МЕТОДЫ

Штаммы мышей, генотипирование и сбор тканей

Линии мышей-мутантов Mek1flox/flox и Mek2-/- и линии мышей-делетеров Sox2-creиVav-icreбыли описаны ранее 17,18,46,56. Линия мыши сохранялась в фоновом режиме 129S6. Возраст эмбрионов оценивали, рассматривая утро дня вагинальной пробки как E0,5. Геномную ДНК из эмбриональных желточных мешочков и биоптатов хвоста мыши извлекали, очищали и генотипировали с помощью саузерн-блоттинга и ПЦР-анализов, как описано ранее16,46. Для извлечения РНК и белка органы подвергали мгновенной заморозке в N2. Эксперименты проводили в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и одобрены институциональным комитетом по уходу за животными.

Гематологические параметры

Количество клеток крови анализировали с помощью UniCel DxC 600 Synchron Clinical Systems. Гематокрит оценивали на гематокритной центрифуге (центрифуга IEC Micro MB). Количество ретикулоцитов измеряли, как описано ранее 7. Вкратце, 2 мкл цельной крови инкубировали с тиазольным оранжевым при 10-4-4мг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 1 часа. Образец крови, разведенный в PBS, использовали в качестве неокрашенного контроля. Подсчет ретикулоцитов проводили методом FACS.

Препараты гемопоэтических клеток и анализ сортировки клеток, активируемых флуоресценцией

Суспензии отдельных клеток получали из кроветворных тканей мыши путем просеивания и аккуратного пипетирования через нейлоновую сетку толщиной 70 мкм. Клетки периферической крови и одноклеточные суспензии (610,6) насыщали Fc-блоком перед окрашиванием. Окрашивание проводили следующими антителами: анти-CD138 APC (281-2), анти-CD19 FITC (eBio1D3), анти-B220 Pacific Blue (RA3-6B2), анти-CD38 PE (90), анти-CD43 биотин (ebioR2-60), анти-CXCR4 PE (2B11), анти-CXCR3 биотин (CXCR3-173) и стрептавидиновые Pe-Cy7 антитела к Ter119, -CD4, -CD8, -CD19, -CD71, -Mac-1 (CD11b) и -Gr-1 (Ly6 G/C) стандартными процедурами18,57,58. Анализ FACS проводили на клеточном анализаторе BD LSRFortessa.

Колониеобразующие анализы

Колониеобразующие анализы на метилцеллюлозу проводили в полной среде MethoCult M3434 с рекомбинантными цитокинами. Вкратце, 2 ×104и 1 ×5105 клетки из костного мозга и селезенки взрослого человека, 2 ×104клетки периферической крови из E12.5 и клетки фетальной печени из эмбрионов E14.5 и области мезонефроса аорты и гонад (AGM) из эмбрионов E8.5 были посеяны для анализа КОЕ. Культуры инкубировали при 37°C в 5% CO2 в течение 2 дней для КОЕ-Е и 7 дней как для колониеобразующих клеток (CFC), BFU-E, так и для колоний гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (КОЕ-GM). Все культуры были сделаны в двух экземплярах. Представленные данные представляют собой среднее значение ± SEM и являются результатом анализа от трех до восьми независимых образцов.

Гистологический, ИГХ и иммунофлуоресцентный (ИФ) анализы

Образцы собирали и обрабатывали для получения парафиновых (5 мкм) или замороженных (6 мкм) срезов, как описано. Срезы почек окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и периодическим окрашиванием кислотой Шиффа (PAS) в соответствии со стандартными гистологическими процедурами. Эксперименты IHC и IF были выполнены, как описано ранее15,16. Активность пероксидазы хрена определяли с помощью набора реагентов диаминобензидина. Для ИГХ предметные стекла окрашивали гематоксилином.  Для анализа co-IF ядра визуализировали с помощью окрашивания DAPI.

Индекс пролиферации измеряли путем подсчета количества pHH3-иммунореактивных клеток, деленного на общее количество клеток для каждого проанализированного участка от мышей в возрасте от 2 до 4 месяцев. Были проанализированы восемь случайных полей со средним количеством 500 ячеек на поле. Было проанализировано по четыре образца на каждый генотип.

Первичными используемыми антителами были: кроличье моноклональное антитело против pHH3 (1/200; Cell Signaling), кроличье поликлональное антитело против SMA (разведение 1/200; Abcam), конъюгированный с биотином SP козий антитело против тяжелой и легкой цепи IgG мыши, крысиное моноклональное антитело против комплемента C3 (1/50; Abcam) и FITC-конъюгированный козий анти-мышиный IgG / IgA / IgM с тяжелой и легкой цепью. Биотинилированным вторичным антителом было: козье анти-кроличье. Флуоресцентным вторичным антителом было: Cy5-конъюгированное козье анти-крысиное (1/250; Молекулярные зонды).

Период полураспада эритроцитов

Период полураспада эритроцитов оценивали с использованием биотинилирования целых клеток крови и мониторинга замены клеток59. Биотинилирование клеток крови проводили путем внутривенной инъекции 150 мкл 3,25 мг/мл сложных эфиров N-гидроксисульфосукцинимида (NHS) в течение двух последовательных дней. Эритроциты (3×106), полученные из 1-5 мкл крови из медиальной подкожной вены, мечили 1 мкг де стрепавидин-алексафлуор647-R-PE в 1 мл PBS. Количество биотинилированных клеток в циркулирующей крови контролировали через регулярные промежутки времени с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре Coulter EPICS XL-MCL.

Стресс-тест на фенилгидразин и реакция на индукцию эритропоэтина

Мышам вводили подкожно 80 мг/кг раствора фенилгидразина гидрохлорида (PHZ) в PBS на 0-й день и 40 мг/кг на 1-й день. Индукцию эритропоэтина (EPO) проводили путем подкожной инъекции 50U человеческого рекомбинантного EPO (Eprex) на 0-й день. Кровь брали через среднюю подкожную вену через регулярные промежутки времени для измерения гематокрита и/ или количества ретикулоцитов. Представленные данные представляют собой среднее значение ± SEM и являются результатом анализа 4-5 независимых образцов.

Анализы на антиядерные антитела (АНА) и анти-дцДНК

Анализы антиядерных антител к HEp-2 (ANA) проводили, как описано60. Сыворотки от мышей разводили (1:80) в PBS и инкубировали с предметными стеклами на клеточном субстрате HEp-2 в закрытой увлажненной камере в течение 30 мин при RT°C. Затем предметные стекла дважды промывали в PBS в течение 5 мин, и связывание антител определяли с использованием AlexaFluo 594-конъюгированного ослиного анти-мышиного IgG в соотношении 1:250 в течение 30 мин при RT°C. Ядра визуализировали с помощью окрашивания DAPI. Затем предметные стекла промывали в PBS и устанавливали с покровными стеклами для флуоресцентной микроскопии с помощью микроскопа Leica DM5500 B. Мышиные антитела против dsDNA IgG измеряли методом ИФА в соответствии с инструкциями производителя (набор для диагностического ИФА Alpha; Сан-Антонио, Техас).

Антинуклеарные антитела (ANAs) были обнаружены методом иммунофлуоресценции с использованием предметных стекол Hep-2. Предметные стекла Hep-2 сначала инкубировали в течение 30 минут с последовательными разведениями сыворотки (от 1/50 до 1/200), а затем промывали, и ANA определяли с помощью кроличьего анти-мышиного Ig (H L) вторичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488.

Ядра были окрашены 4,6-диамидино-2-фенилиндолом.

Специфичный к dsDNA IgG в сыворотке крови был обнаружен методом ИФА. Вкратце, планшеты ELISA предварительно покрывали поли-L-лизином (Sigma-Aldrich) в дозе 20 г/мл в течение 3 часов при комнатной температуре, а затем покрывали 20г/мл дцДНК тимуса теленка в течение ночи при 4°C. Пластины пропитывали PBS/2% BSA при 37°C в течение 2 часов. Затем добавляли сыворотки в начальной концентрации 1/100, последовательно разбавляли и инкубировали в течение 2 часов при 37°C. Связанные иммуноглобулины определяли с помощью козьего анти-мышиного IgG Fc–специфического конъюгата с HRP и выявляли с помощью TMB. В качестве стандарта использовали объединенную сыворотку от шести мышей NZB/W.

ЭЛИСПОТ

Для выявления общего количества IgG-секретирующих плазматических клеток планшеты ELISPOT (Millipore) покрывали смесью козьих антител против мышей IgG1 + IgG2bIgG2a + IgG3 (все по 2 г/мл) в течение ночи при 4°C.

Для обнаружения специфичных к dsDNA антитело–секретирующих клеток планшеты ELISPOT предварительно покрывали 20г/мл поли-L-лизина (Sigma- Aldrich). Предварительно нанесенные пластины затем покрывали дцДНК тимуса теленка (20г/мл) и инкубировали в течение ночи при 4°C.

Почки сначала переваривали 30 минут коллагеназой (1 мг/мл) и ДНКазой (100 нг/мл). Затем получали одноклеточные суспензии почек и селезенки путем гомогенизации на 70-метровых клеточных ситах (BD Bioscience) со средой для культивирования клеток (DMEM с 10% [об./об.] FCS, пенициллином [100 ед/мл] и стрептомицином [100г/мл].

Костный мозг вымывали из кости и пропускали через 70-метровое клеточное сито. Ячейки были добавлены к

насыщали планшеты ELISPOT со скоростью 105 клеток на мл и 106 клеток на мл в четырех экземплярах и инкубировали в течение ночи при 37°C в 5% CO2 в увлажненном инкубаторе с культуральной средой. Антителообразующие клетки были обнаружены с помощью козьего антитела IgG против мыши, адсорбированного против других видов и конъюгированного с пероксидазой хрена.

Планшеты были разработаны с использованием 3-амино-9-этилкарбазола (Sig- ma-Aldrich). Таблички считывались с помощью считывателя AID ELISPOT в соответствии с инструкциями производителя. Абсолютные цифры были умножены на 2 для почек и на 7,9 для костного мозга, чтобы экстраполировать общее количество плазматических клеток в обеих почках и в целом в костном мозге.32

Статистический анализ

Выборки статистически сравнивались с использованием критерия Хи-квадрат, t-критерия Стьюдента, логарифмического рангового критерия и дисперсионного анализа на линейных моделях (ANOVA), когда это было необходимо. Р< 0,05 считался статистически значимым.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ФИГУР

Мыши, у которых отсутствует Mek функция Mek в линиях гемопоэтических клеток, умирают вскоре после рождения.

(A-B) Общая морфология контрольных эмбрионов E16.5 и D0 иноворожденных мышей Mek1 flox/floxMek2-/-Tg+/Vav1-iCre. Нормальная васкуляризация и кровообращение наблюдались у контрольных иMek1flox / floxMek2- /-Tg+/Vav1-iCreэмбрионов при E16.5. (C) При рождении не было обнаружено признаков цианоза при рождении, но эмбрионы погибают в первые 36 часов. (D) Макроскопические снимки, показывающие гипопластическийфенотипселезенки Mek1 flox / floxMek2-/-Tg+/Vav1-iCre при D1 по сравнению с селезенкой контрольной группы. (E) Гематокрит был значительно снижен у мышей D1Mek1flox/floxMek2-/- Tg+/Vav1-iCre.

Анализ проточной цитометрии клеток селезенки от контрольных,Mek1+/flox;Mek2-/-;Tg+/Vav1-icreиMek1flox/flox;Mek2-/-;Tg+/Vav1-icreноворожденных мышей.

Развитие миелоидных клеток было нарушено умышей Mek1flox/floxMek2-/- Tg +/VaviCre, о чем свидетельствует уменьшенное количество CD11b и Ly6 G/Csingle-позитивного или двойного позитивного окрашивания. Развитие В-клеток также было затронуто умышей Mek1flox/floxMek2-/- Tg +/VaviCre, количество CD19-позитивных клеток было уменьшено по сравнению с контрольными животными. Представленные данные представляют собой среднее значение ± SEM и являются результатом анализа от пяти до 10 независимых образцов (Контрольные, n = 10;Mek1+ / floxMek2- /-Tg+ / VaviCre, n= 8; Mek1flox/floxMek2-/-Tg+/VaviCre, n=5).

Потеря предшественников эритроидных и миелоидных клеток уэмбрионов Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCreво время беременности.

Количество колоний КОЕ-GM, КОЕ-GEMM и BFU-E, полученных послеin vitroвыращивания in vitro области аорты E10.5, гонад и мезонефроса (AGM) (A), и 2 ×104Клеток периферической крови E12.5 (B) и E14.5 клеток печени плода (C) из контроли иэмбрионы Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCre. Представленные данные представляют собой среднее значение ± SEM и являются результатом количества независимых выборок, указанных в верхней части графика. СТАТИСТИКА Нормальное количество предшественников наблюдалось при E10.5 до действия рекомбиназы CRE.ВыражениеVav1 начинается с E11.5. Количество всех протестированных предшественников было значительно уменьшено при E14.5 после рекомбинации CRE.

Преждевременная гибель самокMek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCre.

(A, C) Кривые Каплана-Мейера, показывающие дифференциальную выживаемостьMek1+/flox;Mek2-/-;Tg +/Vav1-icre(A) иMek1flox/flox;Mek2+/-;Tg +/Vav1-icre(C) мутантных самок и самцов, подвергнутых мониторингу на 14 месяцев. ЗначениеPвычисляли с помощью логарифмического рангового критерия; n: количество мышей, проанализированных на каждый генотип. (B. D) Измерение гематокрита у здоровых и подвергнутых эвтаназиисамок+/floxи самцов мутантов Mek1+/flox Mek2-/-Tg +/VaviCre в возрасте 14 месяцев для здоровых мышей и от 3 до 14 месяцев для подвергнутых эвтаназии животных.

Период полураспада популяций предшественников эритроцитов и крови не изменяется умутантов Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCre.

(А) Внутривенная инъекция реагирующего с биотином агента в хвостовую вену мышей служила для мониторинга выживаемости эритроцитов через регулярные промежутки времени (дни). Скорость исчезновения биотинилированных эритроцитов определяли количественно для определения периода полураспада клеток. Для каждого генотипа оценивали от трех до семи мышей. Никакой статистической разницы не наблюдалось. (B) CFCs-GEMM, КОЕ-GM и BFU-Es были измерены через 7 дней в полной метилцеллюлозе с цитокинами. Данные представляют собой среднее число колоний с SEMs из 7 мас, 4Mek1flox / floxTg+/ Sox2Cre, 4Mek1+/ floxMek2-/-Tg+/VaviCreи 5 Mek1flox / floxMek2- /-Tg+/VaviCre. *,P< 0,05; **,P< 0,01; ***,Р<0,001.

Нормальный эритропоэз уMek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCreи Mek1flox/floxMek2-/-Tg+/VaviCre вответ на эритропоэтический стресс и фактор роста.

(А) Десяти мышам дикого типа и 10 мышам-мутантам вводили PHZ в дни 0 и 1. Гематокриты (верхняя панель) и количество ретикулоцитов (нижняя панель) оценивали каждые два дня в течение двух недель. Данные представляют собой среднее значение ± SEM. Статистическая разница для обеих мутантных линий указана над кривой, тогда как статистическая разница только длямутанта Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCreуказана под кривой (*P< 0,05). Однако при использовании ANOVA не было обнаружено никаких статистических различий между генотипами. (B) Влияние однократной внутривенной инъекции ЭПО на количество ретикулоцитов умышей-мутантов Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCreи Mek1flox/floxMek2-/-Tg+/VaviCre. Мыши ICR (/ группа) получали однократную подкожную инъекцию ЭПО (Eprex; 50 ЕД / мышь). Образцы крови были взяты после 1, 3, 4, 5, 7, 9 и 11 дней, и подсчитывали ретикулоциты. Результаты представлены в виде среднего ±SEM значений, наблюдаемых у 4 дикого типа и 4Mek1flox/floxTg+/Sox2Cre, 5Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCreи 4 Mek1flox/floxMek2-/-Tg+/VaviCre. При использовании ANOVA не наблюдалось статистической разницы между генотипами.

Гломерулонефрит умышей Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCre mice.

Окрашивание гематоксилином/эозином (A-C) и SMA IHC (D-F) на срезах почек отwt(A, D),Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCre здоровых (B, E) и усыпленных (C,F) мышей. У умерщвленных мутантов с анемией наблюдаются увеличенные клубочки и кисты с отложением белка (С) и фиброзом, как показано окрашиванием клубочков SMA (наконечники стрел). Стрелы, кровеносные сосуды.

В периодическом срезе, окрашенном кислотой Шиффа (PAS), почка у мышей, получавших носитель, обнаруживала умеренную гиперцеллюлярность клубочков без образования полумесяца. Существенных тубулоинтерстициальных изменений не было. Напротив, у животных, получавших темпол, наблюдалось тяжелое повреждение клубочков с большими фиброзно-клеточными полумесяцами. Имелись также значительная атрофия канальцев и интерстициальный фиброз с выраженным интерстициальным воспалительным инфильтратом (исходное увеличение 400).

Обнаружение отложения IgG в почкахMekhemaмышей Mek hema.

Иммуноокрашивание IgG (A-D) срезов почекмышей wt(A-B) иMekhema(C-D) через 4 (A), 7 (C) и 14 (B, D) месяцев (M). Мышь в С была подвергнута эвтаназии из-за тяжелой анемии. IgG-положительное окрашивание обнаруживается в C и D (коричневое окрашивание). Черные стрелки, клубочки.

Рисунок 10. Умышей Mek1+/floxMek2-/-Tg+/VaviCre со временем вырабатываются аутоантитела и анти-dsDNA.

(А) Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Hep2 сыворотками отwt(через 4 и 14 месяцев) и здоровых и подвергнутых эвтаназииMek1+ / floxMek2-/-Tg+/VaviCre(указан возраст в месяцах). (Б) Обнаружение антител к дсДНК методом ИФА. Черный бриллиант, сыворотка от старыхwt мышей wt (n = 9); черные точки, сыворотка от старыхмышейMek1+/floxMek2-/-Tg+/Vav1Cre (n=12) и красные точки, сыворотка от усыпленных мышейMek1+/floxMek2-/-Tg+/Vav1Cre(n=7). ***р<0,005.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Вортцель И., Сегер Р. Каскад ERK: различные функции в различных субклеточных органеллах. Гены и рак2, 195-209 (2011).

2. Шауль Ю. Д., Сегер Р. Каскад MEK / ERK: от специфичности передачи сигналов к разнообразным функциям.  Acta1773, 1213-1226 (2007).

3. Сунь У, Лю ВЗ, Лю Т, Фэн С, Ян Н, Чжоу ХФ. Сигнальный путь MAPK/ERK в клеточной пролиферации, дифференцировке, миграции, старении и апоптозе. J Приемный преобразователь сигнала Res35, 600-604 (2015).

4. Альберола-Ила Дж., Эрнандес-Ойос Дж. Каскад Ras/MAPK и контроль положительного отбора. Immunol Rev191, 79-96 (2003).

5. Фишер А.М., Катаяма К.Д., Пейджес Г., Пуйссегур Дж., Хедрик С.М. Роль erk1 и erk2 в нескольких стадиях развития Т-клеток. Иммунитет23, 431-443 (2005).

6. Геест К.Р., Коффер П.Дж. Сигнальные пути MAPK в регуляции кроветворения. Журнал биологии лейкоцитов86, 237-250 (2009).

7. Гихард С.и др.МАРК ERK1 является отрицательным регулятором эритропоэза селезенки в стационарном состоянии у взрослых. Кровь115, 3686-3694 (2010).

9. Роскоски Р., младший ERK1/ 2 MAP киназы: структура, функция и регуляция. Фармакологические исследования: официальный журнал Итальянского фармакологического общества66, 105-143 (2012).

10. Роскоски Р., Младший протеинкиназы двойной специфичности MEK1/2: структура и регуляция.  Communun417, 5-10 (2012).

11. Каунт Си Джей, Сейл М.Дж., Смит П.Д., Кук С.Дж. Ингибиторы MEK1 и MEK2 и терапия рака: долгий и извилистый путь. Nat Rev Cancer15, 577-592 (2015).

12. Чжао И, Аджей А.А. Клиническая разработка ингибиторов МЭК. Nat Rev Clin Oncol11, 385-400 (2014).

13. Линдстром Т.М., Робинсон В. Х. Множество киназ – какие из них являются наилучшими мишенями при лечении ревматоидного артрита? Ревматоидный артрит 36, 367-383 (2010).

15. Надо В., Шаррон Дж. Существенная роль пути ERK / MAPK в формировании гематоплацентарного барьера. Разработка141, 2825-2837 (2014).

16. Надо В., Гильеметт С., Белангер Л.Ф., Джейкоб О., Рой С., Шаррон ДжMap.Гены Map2k1 и Map2k2 способствуют нормальному развитию синцитиотрофобластов во время плацентации. Разработка136, 1363-1374 (2009).

17. Биссонаут В., Рой С., Гравел М., Гильеметт С., Шаррон Дж. Потребность во внематочной эктодерме во время плацентогенеза. Разработка133, 3429-3440 (2006).

19. Шолль Ф.А. и др.Киназы Mek1 / 2 MAPK необходимы для развития млекопитающих, гомеостаза и гиперплазии, вызванной raf. Ячейка разработчика12, 615-629 (2007).

20. Ньюберн Дж. и др.Фенотипы мыши и человека указывают на критическую консервативную роль передачи сигналов ERK2 в развитии нервного гребня, A105, 17115-17120 (2008).

21. Ямасита С., Тай П., Чаррон Дж., Ко К., Асколи М. Путь MEK / ERK клеток Лейдига имеет решающее значение для поддержания функциональной популяции взрослых клеток Лейдига и для фертильности. Моль Эндокринола25, 1211-1222 (2011).