УФ метод определения L-яблочной кислоты

L-яблочная кислота

УФ метод определения L-яблочной кислоты в продовольственных товарах и других материалах

Только для обеспечения безопасности продуктов питания

Хранить при 2-8 °C

№ кат. 10 139 068 035

Набор для испытаний, 30 определений на каждое

Рекомендации по методам и стандартизированным процедурам см. в списке литературы (2)

Принцип (1)

L-яблочная кислота (L-малат) окисляется до оксалоацетата никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) в присутствии L-малатдегидрогеназы (L-МДГ) (1).

Данная реакция вызывает смещение химического равновесия в сторону L-малата. Удаление оксалоацетата из реакционной системы вызывает смещение равновесия в сторону оксалоацетата. В реакции, катализируемой ферментом глутаматоксалоацетаттрансаминазы (ГОТ), оксалоацетат превращается в L-аспартат в присутствии L-глутамата (2).

Количество НАДН, получившееся в результате данной реакции, находится в стехиометрическом соотношении с количеством L-малата. НАДH измеряется по увеличению оптической плотности при длине волны 334, 340 или 365 нм.

Набор для испытаний содержит:

1. Бутылка 1 с прим. 30 мл раствора, в состав которого входят: глицил-глициновый буфер, pH прим. 10,0; L- глутаминовая кислота, 440 мг.

2. Бутылка 2 с прим. 210 мг лиофилизата НАД.

3. Бутылка 3 с прим. 0,4 мл суспензии глутаматоксалоацетаттрансаминазы; прим. 160 ЕД.

4. Бутылка 4 с прим. 0,4 мл раствора L- малатдегидрогеназы; прим. 2400 ЕД.

5. Бутылка 5 с контрольным раствором для использования в количественном определении L-яблочной кислоты (для расчета результатов контрольный раствор не нужен). Контрольный раствор применяют в неразбавленном виде. (Дата истечения срока годности: см. этикетку).

Приготовление растворов

1. Содержимое бутылок 1, 3 и 4 используют в неразбавленном виде.

2. Содержимое бутылки 2 растворяют в 6 мл дважды дистиллированной воды.

Стабильность реактивов

Содержимое бутылок 1, 2, 3 и 4 стабильно при температуре 2-8 °C (см. этикетку).

Перед использованием раствор 1 нагревают до 20-25 °C.

Раствор 2 сохраняет стабильность в течение 3 недель при температуре 2-8 °C и в течение 2 месяцев при температуре от -15 до -25 °C.

Методика

Длина волны¹: 340 нм, Hg 365 нм или Hg 334 нм

Стеклянная кювета²: длина оптического пути 1,00 см

Температура: 20-25 °C

Итоговый объем: 2,220 мл

Считывают результат по сравнению с воздухом (без кюветы на пути светового пучка), по сравнению с водой или холостой пробой³.

Раствор образца: 0,5-35 мкг L-яблочной кислоты на одно количественное определение⁴ (на объем образца 0,100-1,000 мл).

* Перед набором раствора образца ополаскивают пипетку для фермента или кончик поршневой пипетки раствором образца.

** Например, пластиковой лопаткой или осторожными круговыми движениями после закрытия кюветы пленкой «Parafilm» (торговая марка «American Can Company», Гринвич, Коннектикут, США).

Определяют разности показателей оптической плотности (A2-A1) и для холостой пробы, и для образца.

Вычитают разность оптической плотности холостой пробы из разности оптической плотности образца.

ΔA = (A2-A1)образец - (A2-A1)холостая проба

Чтобы результаты испытания были достаточно прецизионными, разность измеренной оптической плотности, как правило, должна составлять минимум 0,100 единиц оптической плотности (см. «Инструкции по проведению количественного определения» и «Чувствительность и предел обнаружения», пункт 4).

Расчеты

По общей формуле для вычисления концентрации:

[г/л], где

V = итоговый объем [мл],

v = объем образца [мл],

MW = молекулярный вес вещества, количество которого требуется определить [г/моль],

d = длина оптического пути [см],

ε = коэффициент экстинкции НАДH при:

340 нм = 6,3 [л × ммоль-1 × см-1],

Hg 365 нм = 3,4 [л × ммоль-1 × см-1],

Hg 334 нм = 6,18 [л × ммоль-1 × см-1].

Для L-яблочной кислоты это:

[г L-яблочной кислоты/раствор образца]

Если при подготовке образец был разбавлен, результат обязательно надо умножить на коэффициент разведения F.

При анализе образцов в твердой и мягкой форме, навеска которых берется для подготовки образца, результат вычисляется по взвешенному количеству.

СодержаниеL-яблочной кислоты = (cL-яблочной кислоты [г/л раствора образца]/ Весобразца в г/л раствора образца) × 100 [г/100 г]

1. Инструкции по проведению количественного определения

Количество L-яблочной кислоты при количественном определении должно составлять от 1 до 35 мкг (измерение проводится при 365 нм) или от 0,5 до 20 мкг (измерение проводится при 340, 334 нм), соответственно. Чтобы получить достаточную разницу оптической плотности, раствор образца разбавляют, чтобы концентрация L-яблочной кислоты была в диапазоне 0,08 и 0,35 г/л или 0,04 и 0,2 г/л, соответственно.

Таблица разведения

Если разность измеренных величин оптической плотности (ΔA) слишком маленькая (например < 0,100), следует подготовить новый раствор образца (взять навеску больше или разбавлять меньше) или можно увеличить объем образца, переносимый пипеткой в кювету вплоть до 1,000 мл. Объем добавленной воды в таком случае обязательно сократить, чтобы итоговый объем образца и холостой пробы в количественном определении не изменился. Новый объем образца (v) обязательно должен быть учтен в расчете.

2. Техническая информация

2.1 При проведении расчетов следует четко указать, должны ли результаты быть представлены в виде L-яблочной кислоты (молярная масса = 134,09 г/моль) или в виде L-малата (молярная масса = 132,07 г/моль). (В ферментативных определениях измеряется ион L-малата.)

2.2 При оценке результатов анализа следует принимать во внимание, что при ацидиметрическом определении «общей кислотности, рассчитанной по L-яблочной кислоте» измеряются протоны, а при ферментативном определении измеряются ионы L-малата. Таким образом, невозможно напрямую сопоставлять данные таких результатов.

3. Специфичность (1)

Этот метод специфичен для L-яблочной кислоты. D-изомер не вступает в реакцию. L-молочная кислота, D-молочная кислота, L-аспарагиновая кислота и фумаровая кислота не конверсируются. Сложные эфиры L-яблочной кислоты не вступают в реакцию (см. 3.3). При анализе имеющейся на рынке L-яблочной кислоты следует ожидать результатов прим. 99 %.

4. Чувствительность и предел обнаружения (1.2)

Наименьшая оптическая плотность для различения аналитов этой методикой – 0,005 единиц оптической плотности. Это соответствует максимальному объему образца v = 1,000 мл и измерению концентрации L-яблочной кислоты в 0,25 мг/л растворе образца при 340 нм (если v = 0,100 мл, это соответствует раствору образца с концентрацией 2,5 мг/л). Предел обнаружения 0,5 мг/л выводится из разницы оптической плотности в 0,010 (при измерении на длине волны 340 нм) и максимального объема образца v = 1,000 мл.

5. Линейность

Линейность определения наблюдается, начиная с 0,5 мкг L-яблочной кислоты на количественное определение (раствор образца с концентрацией 0,5 мг L-яблочной кислоты /л и объемом v = 1,000 мл) и до 35 мкг L-яблочной кислоты на количественное определение (раствор образца с концентрацией 0,35 г L-яблочной кислоты /л и объемом v = 0,100 мл).

6. Прецизионность

В двойном определении с использованием 1 раствора образца может наблюдаться разница оптической плотности от 0,005 до 0,010 единиц. При объеме образца v = 0,100 мл и измерении при 340 нм это соответствует концентрации L-яблочной кислоты ок. 2-5 мг/л. (Если при подготовке образец разбавляют, полученный результат надо умножить на коэффициент разведения F. Если при подготовке образца берется навеска, например, 1 г образца/100 мл = 10 г/л, можно ожидать разницу в диапазоне 0,02-0,05 г/100 г).

Приведенные ниже данные взяты из опубликованной литературы:

x = 2.97 г/л, вино

CV = 1,8 %

n = 12 (1.1, 1.2)

Фруктовый сок:

r = 0,014 + 0,030 × x

R = 0,032 + 0,070 × x

x = содержание L-яблочной кислоты в г/л (2.6)

Вино:

r = 0,03 + 0,034 × xi

R = 0,05 + 0,071 × xi

x = содержание L-яблочной кислоты в г/л (2.10, 2.11)

7. Интерференция/источники погрешностей

Остаток глутаматдегидрогеназы (ГлДГ) в ГОТ приводит к медленным изменениям свойств, зависимым от реактива. Экстраполяция измеряемого значения с помощью А2 не требуется, если оптическая плотность холостой пробы и образца определяется друг за другом.

8. Распознавание интерференции во время процедуры количественного определения

8.1 Если превращение L-яблочной кислоты успело завершиться за время, указанное под заголовком «Методика», в целом, можно заключить, что интерференции не было.

8.2 По завершении реакции определение можно начать заново, добавив L-яблочной кислоты (качественно или количественно): если оптическая плотность после такого добавления стандартного материала изменится, это также указывает на отсутствие интерференции.

8.3 Ошибку оператора или интерференцию определения из-за присутствия веществ, содержащихся в образце, можно распознать с помощью двойного определения с двумя разными объемами образца (например, 0,100 мл и 0,200 мл): измеренные различия в оптической плотности должны быть пропорциональны используемым объемам образца.

При анализе твердых образцов рекомендуется брать разные навески (например, 1 г и 2 г) в 100-мл мерные колбы. Измеренная разница значений оптической плотности и веса использованных образцов должна быть пропорциональной для идентичных объемов образцов.

8.4 Возможную интерференцию, вызываемую веществами, содержащимися в образце, можно распознать, используя в качестве контроля внутренний стандарт: помимо определений образца, холостой пробы и стандарта, следует провести дополнительное определение образца и контрольного раствора для количественного определения в одном и том же количественном определении. Степень извлечения можно затем вычислить по измеренным разностям значений оптической плотности.

8.5 Возможные потери во время определения можно выявить путем проведения испытаний на степень извлечения: образец должен быть подготовлен и проанализирован с добавлением и без добавления стандартного материала. Введенное должно быть извлечено количественно в пределах погрешности метода.

9. Класс опасности реактивов

Реактивы, используемые при определении L-яблочной кислоты, не являются опасными веществами в соответствии с Положениями об опасных веществах, Законом о химических веществах или Регламентом ЕС 67/548/EEC, а так же дополнительными руководствами по внесению изменений, дополнений и модификациям. Однако следует соблюдать общие меры безопасности, применимые ко всем химическим веществам. После использования реактивы можно утилизировать вместе отходами лаборатории, но при этом всегда необходимо соблюдать местные предписания. Упаковочный материал может быть утилизирован в отходы, предназначенные для переработки.

10. Общая информация о подготовке образцов

При проведении анализа:

- Используют прозрачные, бесцветные и практически нейтральные жидкие образцы непосредственно или после разведения в соответствии с таблицей разведения и объемом до 1,000 мл.

- Фильтруют мутные растворы.

- Дегазируют образцы, содержащие двуокись углерода (например, путём фильтрации).

- Доводят образцы кислоты, которые при количественном определении используются в неразбавленном виде, до уровня pH 8-10 путём прибавления раствора гидроксида натрия или калия, после чего инкубируют в течение 30 мин (приблизительно).

- Измеряют «окрашенные» образцы (при необходимости доводят до уровня pH 8-10) по отношению к холостой пробе (= буфер или вторично очищенная вода + образец), корректируют фотометр до 0,000 с раствором сравнения под лучом, в частности, если происходит медленное изменение свойств перед прибавлением раствора 4 (L-МДГ).

- «Сильно окрашенные» образцы, которые используются неразбавленными или с большим объемом пробы, обрабатывают поливинилполипирролидоном (PVPP) или полиамидом, например, 1 г/100 мл.

- Раздавливают или гомогенизируют твёрдые или полутвёрдые образцы, экстрагируют водой или растворяют в воде и фильтруют при необходимости.

11. Примеры применения

Определение L-яблочной кислоты в вине

Свободная L-яблочная кислота может быть определена в белом или красном вине или после разведения в соответствии с таблицей разведений без предварительного обесцвечивания.

Определение свободной и эстерифицированной L-яблочной кислоты в вине (3.3)

Для определения общего содержания L-яблочной кислоты (общее количество свободной и эстерифицированной L-яблочной кислоты), белое или красное вино обрабатывают следующим образом: нагревают 20 мл вина и 6 мл гидроокиси натрия (2 М) в течение 30 минут с обратным холодильником при перемешивании (запрещено использовать аммиак для щелочного гидролиза, так как чрезмерно высокая концентрация ионов аммония препятствует реакции!), охлаждают до 20-25 °C и нейтрализуют серной кислотой (1 М) (индикаторная бумага). Количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки. В соответствии со стандартной процедурой используют образец для количественного анализа.

Определение L-яблочной кислоты во фруктовом соке, концентратах и напитках

Используют прозрачные, бесцветные и практически нейтральные жидкие образцы непосредственно или после разведения водой (концентрация L-яблочной кислоты прибл. 0,04-0,35 г/л). Фильтруют мутные соки и разводят до тех пор, пока концентрация L-яблочной кислоты не достигнет 0,04-0,35 г/л. Разбавленный раствор можно использовать для анализа, даже если он слегка окрашен. Только сильно окрашенные соки требуют предварительного обесцвечивания, если они используются для анализа в неразбавленном виде. В таких случаях действуют следующим образом: прибавляют прибл. 0,1 г порошка полиамида или поливинилполипирролидона (PVPP) к 10 мл сока, перемешивают в течение 1 мин и фильтруют. Для анализа используют прозрачный, слегка окрашенный раствор.

При использовании окрашенных соков или красного вина в качестве образца, который применяется в неразбавленном виде, может возникнуть, что оптическая плотность А1 не будет постоянной из-за изменения значения рН (образец является кислотным, смесь для количественного определения показывает рН 10). В этом случае рекомендуется довести образец до рН 10 перед анализом и инкубировать в течение прибл. 30 минут.

Определение L-яблочной кислоты в пиве

Чтобы удалить углекислоту, образец фильтруют или перемешивают прибл. 5-10 мл пива в лабораторном стакане около 1 мин со стеклянной палочкой. Разбавляют образец, не содержащий CO2, в соответствии с таблицей разведения. Или же подщелачивают образец пива путем добавления твердого гидроксида натрия или калия.

Определение L-яблочной кислоты в твердых продовольственных товарах

Гомогенизируют твёрдые или полутвёрдые образцы (например, плодоовощную продукцию) с помощью ступки, мясорубки или гомогенизатора. Взвешивают смешанный образец и экстрагируют водой - при необходимости нагревают до 60 °C. Количественно переносят в мерную колбу и доводят до метки. Фильтруют и используют прозрачный раствор для анализа. При необходимости разбавляют раствор в зависимости от содержания L-яблочной кислоты (см. таблицу разведений).

12. Дополнительные варианты применения

Метод также может быть использован, например, в исследованиях при анализе биологических образцов. Для получения более подробной информации об отборе образцов, обработке и стабильности образца см. Gutmann, I. & Wahlefeld, A. W. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1586-1587, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York and London, as well as Ref. 1.2, pp. 43-44. Данный метод так же может быть использован при исследованиях косметических средств и фармацевтических препаратов, например, инфузионных растворов.

Максимум поглощения НАДH – 340 нм. Спектрофотометрические измерения выполняют на максимуме поглощения; если фотометр спектральной линии оборудован ртутной газоразрядной лампой, измерения проводят на длине волны 365 или 334 нм.

При желании вместо стеклянных кювет можно пользоваться одноразовыми.

Например, при использовании двухлучевого фотометра.

См. инструкции по проведению количественного определения.