Глобальный подход к исследованиям сопоставимости биоподобных моноклональных антител с использованием протеомики на основе жидкостной хроматографии-тандемной масc-спектрометрии

Глобальный подход к исследованиям сопоставимости биоподобных моноклональных антител с использованием протеомики на основе жидкостной хроматографии-тандемной масc-спектрометрии

Шунь-Ли Чэньa, Шиау-Линь Уb, Ли-Цзюань Хуанa, Цзя-Бао Хуанc, Шу-Хуэй Чэньa,∗

c Biotechnology R&D Department, ScinoPharm Taiwan Ltd., Taiwan

Сведения

История статьи:

Received 27 October 2012

Received in revised form 26 February 2013 Accepted 28 February 2013

Available online 14 March 2013

Ключевые слова:

Биоподобный препарат

Протеомика

ЖХ-МС

Исследование сопоставимости

Трастузумаб

Резюме

Протеомное исследование методом жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии для пептидного картирования и секвенирования было использовано для описания характеристик доступного на рынке моноклонального антитела трастузумаба и сравнения его с двумя биоподобными препаратами: МАТ A, содержащим варианты D359E и L361M в Fc-сайте, и МАТ B без вариантов. С помощью карт, полученных в результате мультиферментативного расщепления, была идентифицирована полная последовательность (100 %), включая дисульфидные связи, гликозилирование и другие часто встречающиеся модификации (т.е. дезамидирование, окисление, дегидратацию и усечение лизина (K-clipping)). Помимо специфического сравнения относительных популяций целевых модифицированных форм, для глобального сравнения интенсивностей ионов в картах триптических пептидов был использован неспецифический подход. Неспецифическое сравнение дало дополнительную перспективу для изучения любых возможных различий, связанных с вариантами или модификациями. Пептид, содержащий два варианта в МАТ A, D359E и L361M, был обнаружен с использованием неспецифического сравнения карт триптических пептидов. Напротив, при сравнении трастузумаба с таким же антителом или МАТ B не было обнаружено каких-либо существенных различий. Эти результаты соответствовали данным, полученным в результате секвенирования пептидов посредством диссоциации, вызванной столкновениями или диссоциации при переносе электрона. Таким образом, сочетание специфического и неспецифического подходов с использованием мощных инструментов протеомики на основе масс-спектрометрии имеет большие перспективы для описания структуры биоподобных препаратов.

© 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Введение

В последнее время было налажено эффективное производство терапевтических моноклональных антител, как химерных, так и гибридных [1], таких как трастузумаб (Герцептин®), цетуксимаб (Эрбитукс®) и бевацизумаб (Авастин®), мишенью которых является рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2/neu), рецептор эпидермального фактора роста человека 1 и фактор роста эндотелия сосудов, соответственно. Эти препараты эффективны [2], но дорогостоящи. Биологические препараты, поступающие в продажу после истечения срока действия патентов на оригинальный препарат, могут сократить затраты учреждений здравоохранения [3,4]. Для обеспечения качества биоподобных препаратов необходимы точные и чувствительные аналитические методы, позволяющие в полной мере охарактеризовать и сравнить структуры оригинальных и биоподобных препаратов на молекулярном уровне [5–14]. Точное измерение массы исходного вещества, профилирование высвобожденных гликанов и информационно-независимое пептидное картирование методом жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии (LC-MSE) были использованы в качестве быстрых инструментов для описания характеристик инновационных и биоподобных МАТ [5–8].

_____________________________________

∗Автор для связи. Тел: +886 6 2757575x65339; факс: +886 6 2740552.

E-mail address: [email protected] (S.-H. Chen).

0731-7085/$ – see front matter © 2013 Elsevier B.V. Все права защищены. http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2013.02.040

При информационно-независимом пептидном картировании методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием используется альтернативный режим сканирования с низкоэнергетическим столкновением для точной идентификации массы предшественника и режим сканирования с высокоэнергетическим столкновением (MSE) для мультиплексной фрагментации пептидов по точно измеренной массе. Точное измерение массы может позволить отслеживать все модификации на уровне белков; однако, точность измерений массы на уровне белков с использованием современных технологий не позволяет дифференцировать незначительные модификации или мутации с небольшими различиями в массе. Таким образом, в этом исследовании для обнаружения и идентификации различий в первичной последовательности был использован подход «снизу вверх» [6,7].

Несмотря на наличие первичных последовательностей доступных на рынке оригинальных препаратов, для подтверждения правильной последовательности, дисульфидных связей и различных модификаций аминокислот необходима дополнительная фрагментация пептидов с использованием последовательной тандемной масс-спектрометрии (МСn). Обычно используемый метод фрагментации диссоциацией, индуцированной столкновениями (CID), позволяет получить достаточное количество фрагментов для однозначной идентификации остовной последовательности или посттрансляционных модификаций (ПТМ) белка. Подход синхронизированной по времени параллельной фрагментации с использованием уникальной конструкции двойной столкновительной ячейки и встроенной функции разделения ионов по их подвижности также успешно использовался для подтверждения сайта гликозилирования и гликановых структур [12].

Кроме того, было показано, что протеомные методы, использующие передовые доступные на рынке технологии фрагментации, такие как диссоциация при переносе электрона (ETD) с ЖХ-МС/МС в режиме реального времени через CID в сочетании с мультиферментативным расщеплением, всесторонне характеризуют дисульфидные связи оригинального и биоподобного препаратов. [13,14]. В CID и ETD используются разные механизмы получения фрагментов, включающих пептидный остов и модифицированные компоненты, тем самым снижается необходимость дополнительной обработки образцов, такой как высвобождение гликанов [15–17].

Данные передовые технологии анализа позволяют с уверенностью полностью охарактеризовать структуру биоподобных препаратов. Однако критически важно всестороннее детальное сравнение препаратов на молекулярном уровне. В дополнение к детальному описанию характеристик с помощью МС/МС секвенирования рассчитывают относительные интенсивности ионов специфических модификаций, таких как профили гликозилирования, для представления относительного процента различных модификаций для сравнения [5–11]. Такие сравнения могут помочь выявить основные различия между двумя препаратами, но сходство двух препаратов не может быть подтверждено с помощью только специфических сравнений. Нецеленаправленные или неспецифические сравнения интенсивностей ионов по всей последовательности позволяют получить дополнительное представление для изучения любых возможных различий в этих картах ЖХ-МС. В данном исследовании мы продемонстрировали стратегию системного трехэтапного сравнения с использованием информационно-зависимого секвенирования пептидов с помощью CID/ETD, специфическое сравнение различных форм модификаций и неспецифическое сравнение карты триптических пептидов с использованием ЖХ-МС для полного описания характеристик доступного на рынке anti-Her2 препарата трастузумаба и сравнения его с двумя биоподобными препаратами: МАТ A с двумя вариантами аминокислот и МАТ B без вариантов. Помимо дифференциации двух вариантов аминокислот путем прямого МС/МС секвенирования [6,7], неспецифические сравнения интенсивностей ионов карт триптических пептидов позволили повысить достоверность сравнения этих препаратов.

2. Материалы и методы

2.1. Экспрессия трастузумаба в клетках CHO

Последовательности для трастузумаба (МАТ B) и трастузумаба, содержащего две аминокислотные мутации (МАТ A), были сконструированы в патентованном экспрессионном векторе и экспрессированы с использованием клеток CHO DHFR–/–. После трансфекции путем электропорации клетки СНО культивировали и пассировали в среде, содержащей сыворотку, и отбирали с помощью G418 до восстановления жизнеспособности клеток до 90 %. Для получения достаточного количества белка после наращивания клеток в среде, содержащей сыворотку, стабильные клетки G418 переносили в бессывороточную среду и культивировали в течение 7 дней. Затем стабильные клетки G418 с правильной экспрессией трастузумаба подвергали селекции метотрексатом в сочетании с запатентованной процедурой обогащения. После завершения селекции метотрексатом клетки сортировали на отдельные клоны с использованием сортера Moflo FACS (США) с последующим наращиванием в среде, содержащей сыворотку. Высокопродуктивные клоны отбирали с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) для получения титра экспрессии и адаптировали к бессывороточной среде. Адаптированные высокопродуктивные клоны культивировали во вращающихся колбах, и трастузумаб очищали от собранной среды с использованием колонки с белком А. Конечные препараты трастузумаба получали в виде раствора МАТ A (1,4 мг/мл в трис-цитрате, pH 8) и МАТ B (2,1 мг/мл в 50 мМ натрия ацетате). Референтный препарат трастузумаба был предоставлен компанией ScinoPharm Co. (Тайвань) в виде раствора с концентрацией 1,0 мг/мл.

2.2. Реактивы

Гуанидина гидрохлорид (Gd-HCl), 1-дитиотреитол (DTT), йодацетамид (IAM), бикарбонат аммония (NH4HCO3) и муравьиная кислота (FA) были приобретены у Sigma-Aldrich (США). Ацетонитрил для ВЭЖХ (ACN) был приобретен у J.T Baker (США). Трипсин для секвенирования был приобретен у Promega (США). Протеаза Achromobacter I (Lys-C) была получена от Roche (Швейцария). Воду деионизировали до 18 МΩ с помощью системы Milli-Q. Центрифужный фильтр Amicon (MWCO 10 кДа) был получен от Millipore (США).

2.3. Ферментативное расщепление

Белковые растворы (1,0 мг/мл) референтного препарата трастузумаба, МАТ A и МАТ B денатурировали в 6 М гуанидина гидрохлорида, содержащим 100 мМ NH4HCO3, восстанавливали в 5 мМ 1-дитиотреитола в течение 30 минут при 37 °С и алкилировали в 20 мМ йодацетамида в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Восстановленный и алкилированный белок повторно растворяли в буфере для трипсинового расщепления (100 мМ NH4HCO3, pH 8) с использованием фильтра для отсечения молекулярной массы 10 кДа для замены буфера. Затем эндопротеиназу Lys-C (1:50, в пересчете на массу) добавляли в раствор белка в течение 4 ч при 37 °С. Для расщепления в раствор белка добавляли трипсин (1:50, в пересчете на массу) при комнатной температуре в течение 8 часов с последующим повторным добавлением в течение 12 часов при комнатной температуре. Во всех случаях расщепление было прекращено добавлением 1% муравьиной кислоты. Для расщепления без восстановления дисульфида применяли протокол расщепления, описанный выше, исключая этапы восстановления и алкилирования.

2.4. ЖХ-МС

Система нано-ВЭЖХ (Agilent 1200, США) с предколонкой (внутренний диаметр 300 мкм х 5 мм, 5 мкм С18) и нано-колонкой (внутренний диаметр 75 мкм х 15 см, 3 мкм C18, CVC technologies Inc., США), была подключена в режиме реального времени к масс-спектрометру с орбитальной ионной ловушкой (LTQ-Orbitrap XL MS, Thermo Fisher Scientific, США). Подвижная фаза A состояла из 0,1% муравьиной кислоты, а подвижная фаза B из 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле для ВЭЖХ. Градиентный режим включал: (i) 5 минут – 2% B для загрузки образца в предколонку, (ii) линейно от 2% до 40% B в течение 40 минут, (iii) линейно от 40% до 80%B в течение 10 мин и, наконец, (iv) изократически – 80% В в течение 10 мин. Скорость потока в предколонке составляла 1 л/мин, а в аналитической колонке поддерживалась на уровне 300 нл/мин. Время удерживания регистрировали после введения образца. Систему LTQ-Orbitrap XL MS использовали следующим образом: обзорные масс-спектры в полном диапазоне сканирования (300–2000 м/з) были получены в модуле Orbitrap с разрешающей способностью 60000 при 400 м/з (с величиной ионной мишени 5×105 ионов), после чего были сделаны пять последовательных сканирований в режиме МС/МС с использованием модуля орбитальной ионной ловушки (LTQ). Для определения дисульфидных связей оборудование использовали в информационно-зависимом режиме для автоматического переключения между МС (сканирование 1 на модуле Orbitrap), CID-МС/МС (сканирование 2 на модуле LTQ) и ETD-МС/МС (сканирование 2 на модуле LTQ). Вкратце, после обзорного МС-спектра от 400 до 2000 м/з последующие этапы CID-МС/МС или ETD-МС3 были выполнены на том же ионе-предшественнике с шириной изоляции ± 2,5 м/з. При необходимости этап CID-МС3 выполняли на ионе с наибольшей интенсивностью из спектра ETD-МС/МС (ширина изоляции ± 5 м/з).

2.5. Отнесение пептидов и модификаций

Спектры, полученные на этапе CID-МС/МС, искали в собственной библиотеке теоретических спектров фрагментации одиночных белков моноклональных антител anti-HER2 (ионы b и y) с допуском по массе ± 5 ppm ионов-предшественников и ± 0,6 Да дочерних ионов со специфичностью к трипсину или Lys-C и с 2 допустимыми неполными расщеплениями с использованием карбамидометилирования цистеина в качестве постоянной модификации и дезамидирования и окисления в качестве переменных модификаций. В качестве исходного фильтра использовалась оценка вероятности Mascot (р <0,05). Окончательное подтверждение расшифровки было получено путем неавтоматизированной проверки, чтобы сопоставить все многочисленные дочерние ионы с точностью массы ионов-предшественников (<5 ppm для LTQ-Orbitrap MS).

128 S.-L. Chen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 80 (2013) 126–135

Рис. 1. Карта триптических пептидов референтного препарата трастузумаба (сверху), МАТ A (посередине) и МАТ B (снизу). Заглавной буквой «Т» обозначены пептиды тяжелой цепи, строчной “t” – легкой цепи. Двумя звездочками “**”обозначены неосновные пики; t1(O) – окисление метионина на t1.

3. Результаты

3.1. Пептидное картирование и секвенирование

Хроматограммы основных пиков, показанные на рис. 1, иллюстрируют типичные триптические пептидные карты для препарата сравнения трастузумаба и МАТ A и B (расщепление трипсином после восстановления и алкилирования). Различные триптические пептиды препарата элюировали с разным временем удерживания на хроматограмме ЖХ-МС. Пептиды, элюировавшие одновременно, были идентифицированы с использованием точных измерений массы с высоким разрешением. Идентификация триптических пептидов, резюмированная в таблице 1 (для тяжелой цепи) и 2 (для легкой цепи), была подтверждена МС/МС секвенированием (данные фрагментации доступны по запросу). Была идентифицирована полная (100 %) последовательность, и данные МС/МС секвенирования, использованные для подтверждения мутаций D359E и L361M в пептиде T34-35Ha в таблице 1, показаны на рис. 2. За исключением мутированных сайтов, доступный на рынке и биоподобные препараты имеют идентичные первичные последовательности, включая N- и C-концевые пептиды тяжелых и легких цепей.

Для анализа дисульфидов использовали трипсиновое расщепление без дисульфидного восстановления. Соответствующие триптические пептиды с дисульфидными связями, которые были идентифицированы, представлены в таблице 3. Дисульфидные связи были подтверждены с помощью фрагментации CID-МС/МС в сочетании с ETD-МС/МС, как указано выше [13,14]. Всего 16 дисульфидов (7 × 2 + 2 = 16) было расшифровано с одинаковыми связями для всех препаратов. Дисульфидный пептид № 8 был расшифрован путем расщепления Lys-C, потому что соответствующий триптический пептид был слишком мал.

Теоретические массы гликановых структур были добавлены к триптическому пептидному остову (EEQYN300STYR) и использованы для сопоставления наблюдаемых масс на хроматограмме ЖХ-МС триптической карты. Референтный препарат трастузумаба и МАТ A и B все имеют одинаковое количество гликопептидов с одинаковым распределением гликанов (таблица 4). Сайт модификации и гликановые

структуры были подтверждены путем сочетания фрагментации CID и ETD без высвобождения гликанов. Образцы спектров CID-МС/МС и ETD-МС/МС, использованные для идентификации структуры гликанов G0 гликопептидов EEQYN300STYR, показаны на рис. 3А (спектры фрагментации CID-МС/МС), а соответствующая последовательность остова гликопептидов показана на спектрах фрагментации ETD-МС/МС (рис. 3B).

Моноклональные антитела с глутамином (Q) или глутаминовой кислотой на N-конце подвергаются химической дегидратации с образованием пироглутаминовой кислоты [18]. N-концевой аминокислотный остаток тяжелой цепи трастузумаба представляет собой глутаминовую кислоту (E), и кроме немодифицированной формы были обнаружены формы тяжелой цепи трастузумаба с пироглутаминовой кислотой (таблица 5). Кроме того, С-конец тяжелой цепи трастузумаба может подвергаться расщеплению из-за карбоксипептидазы в клетках СНО, используемых для продуцирования МАТ [19], и наблюдалось усечение лизина (K-clipping) на С-конце. У референтного препарата трастузумаба и МАТ A и B наблюдалось одинаковое незначительное образование пироглутаминовой кислоты на N-конце и почти полное усечение лизина на С-конце тяжелой цепи. Также были идентифицированы другие модификации, такие как дезамидирование аспарагина (N) [17] и окисление метионина (M) (таблица 5). Однако процент дезамидированного аспарагина также может включать изоаспарагин, поскольку он не был отделен от дезамидированного аспарагина на нашей хроматограмме.

3.2. Специфическое сравнение сайтов модификации

Количество ионов (площадь пика), полученное из выделенной ионной хроматограммы конкретной формы триптических пептидов, было разделено на сумму всех форм (модифицированных и немодифицированных) на той же хроматограмме ЖХ-МС.

Таблица 1

Обзор идентифицированных триптических пептидов тяжелой цепи.

Процентное содержание каждой гликозилированной формы по средним значениям трех циклов анализа ЖХ-МС использовали для относительного сравнения различных препаратов (таблица 4). Сравнение других типичных модификаций аминокислот, таких как образование пироглутаминовой кислоты, усечение лизина, дезамидирование и окисление, показано в таблице 5.

Специфическое сравнение в этом исследовании отличается от специфического сравнения, обычно используемого для МС-анализа в методе мониторинга множественных/заданных реакций [20].

130 S.-L. Chen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 80 (2013) 126–135

Рис. 2. Идентификация пептида T34-35H (A) трастузумаба и (B) МАТ A с мутациями в сайтах D359E and L361M путем CID-МС/МС (м/з 952,9776, 2+) и (м/з 936,9922, 2+), соответственно.

3.3. Неспецифические сравнения

В дополнение к специфическому подходу был также применен неспецифический подход для общего сравнения интенсивностей ионов на ферментативных картах по всей последовательности (таблица 1). Пример картирования триптических пептидов, включая восстановительное и нативное (расщепление без дисульфидного восстановления) расщепление, описан ниже.

Чтобы минимизировать изменение интенсивностей ионов между циклами анализа, для нормализации интенсивностей ионов использовали внутренний стандарт пептида. Этот стандарт был получен из пептида, который не содержит каких-либо модификаций или участков неполного гидролиза, обозначенного T13H (таблица 1). Триптические лизаты из той же партии референтного препарата были приготовлены и проанализированы отдельно в разные дни, и полученные данные были сопоставлены (рис. 4).

Рис. 3. Идентификация гликопептидов (A) путем CID для модификации пептида G0 (м/з 1317,53, 2+) и (B) путем ETD (м/з 879,02, 3+) для пептидного остова.

Рис. 4. Неспецифическое сравнение между циклами выделенных ионов триптических пептидов препарата, реализуемого на рынке. Некоторые значения были увеличены (×) на указанный фактор. Существенные различия при 99% доверительном интервале отсутствуют. Планка погрешности указывает стандартное отклонение трех повторных введений (n = 3).

Таблица 2

Обзор идентифицированных триптических пептидов легкой цепи.

27.02

17.21

19.39

132 S.-L. Chen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 80 (2013) 126–135

Рис. 5. Неспецифическое сравнение выделенных ионов триптических пептидов реализуемого на рынке и (A) препарата МАТ A, (B) препарата МАТ B. Некоторые значения были увеличены (×) на указанный фактор. *указывает на существенные различия при 99% доверительном интервале. препарат сравнения трастузумаба и МАТ A. Планка погрешности указывает стандартное отклонение трех повторных введений (n = 3).

Для сравнения дисульфидных связей в референтном препарате трастузумаба, МАТ A и МАТ B, связанные дисульфидными связями пептиды, полученные путем (нативного) расщепления в невосстановительных условиях, сравнивали с триптическими пептидами, полученными путем расщепления в восстановительных условиях, что показано на рис. 5A для МАТ A и рис. 5B для МАТ B.
4. Обсуждение

Несмотря на существование фундаментальных проблем эквивалентности образцов в производственных методах, целью данного исследования стало описание структурных характеристик и аналитическое сравнение готовых препаратов. Была охвачена полная (100%) последовательность (Таблицы 1 и 2), и несколько небольших

Таблица 3

Обзор идентификации дисульфидных связей.

пептидов были идентифицированы посредством неполного гидролиза или с помощью ферментов, таких как эндопротеиназа Lys-C. За исключением двух мутированных сайтов (D359E и L361M) в МАТ A, референтный препарат трастузумаба и МАТ A и B имели идентичные первичные последовательности, включая N- и C-концевые пептиды

Таблица 4

Обзор идентификации гликановых структур и относительное процентное значение.

тяжелой и легкой цепей, а также дисульфидные связи (таблица 3) и посттрансляционные модификации (таблицы 4 и 5). В дополнение к первичной последовательности и модификациям аминокислот модель модификаций является еще одним важным аспектом для сравнения.

134 S.-L. Chen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 80 (2013) 126–135

После того, как модификация расшифрована и подтверждена, с помощью специфического сравнения можно сравнить относительную совокупность форм модификации, включая немодифицированные формы. Поскольку дифференциально модифицированные пептиды имеют одинаковую последовательность, можно предположить, что все модифицированные формы имеют почти одинаковую эффективность ионизации. Следовательно, относительный сигнал иона-предшественника коррелирует с относительной концентрацией дифференциально модифицированных белков. Как показано в таблице 4, гликозилирование в консервативном Fc-сайте почти полное (более 98 %) и сопоставимо для референтного препарата трастузумаба и МАТ A и B. Кроме того, основные распределения гликанов в Fc-сайте для всех препаратов представляли G0-pep>G1-pep>(G0-Fu)-pep>G2-pep. Аналогичным образом, сходные модели были обнаружены и для других модификаций (таблица 5). Также были выявлены некоторые вариации, в том числе относительно высокий процент окисления T41H (T, H и L пептид триптический, тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно) и относительно низкий процент дезамидирования T6H для МАТ A, относительно высокий процент G0-pep, окисления T21H, дезамидирования T26H и относительно низкий процент дезамидирования T37H для МАТ B.

Все немодифицированные триптические пептиды сравнивали, используя метод без мечения (неспецифическое сравнение), чтобы исследовать сходство между трастузумабом и двумя МАТ. Почти все основные пики (рис. 1) соответствовали триптическим пептидам, за исключением некоторых автолизатов трипсина, которые элюировали вместе с триптическими пептидами анализируемых веществ (отмечены как **). Эти базовые пики были исключены из сравнения как артефакты. Интенсивность ионов среди триптических пептидов одного и того же препарата различалась на 4 порядка (рис. 4). Хотя различие в интенсивности ионов может быть связано с вариациями электрораспылительной ионизации ввиду различных последовательностей, все триптические пептиды с сигналами слабее внутреннего стандарта более чем на один порядок, по-видимому, содержат посттрансляционные модификации или имеют какие-либо посттрансляционные модификации в непосредственной близости от сайта узнавания трипсина. Например, триптический пептид T37H содержал почти 35 % дезамидированной последовательности (таблица 5), а интенсивность его недезамидированного аналога слабее, чем у других пептидов приблизительно на 3–4 порядка (рис. 4). Аналогично, слабые триптические пептиды T25H и T42H, которые содержат почти 98 % модификаций гликозилирования (таблица 4) и усечения лизина (таблица 5), были в 50 раз слабее, чем другие пептиды (рис. 4). Кроме того, хотя не была обнаружена какая-либо модификация триптического пептида T22H, его относительно слабый сигнал мог быть обусловлен близостью сайта окисления M255 – в трех аминокислотах от N-конца T22H (таблица 1). Слабый сигнал пептидов с модификациями в прилегающем сайте ожидаем, поскольку трипсин является очень специфическим ферментом, который распознает основные аминокислоты и расщепляет связи на их С-концах. Таким образом, любые модификации вблизи участка узнавания будут создавать помехи при узнавании субстрата. Поэтому неспецифический подход, использующий интенсивности ионов после соотношения с внутренним стандартом, может обеспечить быстрый диагностический анализ присутствия потенциальных неизвестных или неидентифицированных модификаций в карте ферментов. Несмотря на широкий динамический диапазон, приведенные интенсивности всех триптических пептидов были довольно постоянными между циклами анализа (рис. 4). Существенные различия были обнаружены для слабых сигналов, таких как T8-9H и T37H с 95% достоверностью (p <0,05), но не с 99% достоверностью (p <0,01) t-критерия. Не было обнаружено различий для не полностью расщепленных триптических пептидов, таких как T34-35H (р <0,01). Таким образом, мы решили использовать 99-процентную достоверность t-критерия, чтобы определить наличие существенных различий между референтным препаратом трастузумаба и МАТ A и B, чтобы компенсировать относительно существенную вариативность слабых сигналов между циклами анализа.

Сравнение стандартного препарата трастузумаба и МАТ A (рис. 5A) показало одно существенное отличие (p = 0,00009) для не полностью расщепленного пептида T34-35H, который содержал аминокислотные мутации D359E и L361M из МАТ A. Это наблюдение согласуется с предыдущим описанием характеристик с использованием масс-спектрометрического секвенирования, указывающим на то, что

чувствительности неспецифического сравнения с использованием метода без мечения достаточно для обнаружения различий. Другое незначительное различие (р = 0,0019) между референтным препаратом трастузумаба и МАТ A наблюдалось для связанного дисульфидной связью пептида T14H-T15H. Однако в одной из его укороченных последовательностей, T14H, значительных различий не было (рис. 5A). Хотя при анализе дисульфидных связей наблюдалось незначительное различие, вариативность все же может быть существенной, поскольку эффективность расщепления может быть ограничена дисульфидными связями белков. В будущем в оценке вариантов могут помочь многократные расщепления. Мы не могли исключить ненативные (scrambled) дисульфиды или свободные цистеины в этой области, которые могут возникать при расщеплении в щелочных условиях рН (например, при расщеплении трипсином при рН 8). Как и во многих научных исследованиях, очень важно провести достаточное количество повторных анализов или взять достаточное количество образцов для того, чтобы можно было сделать вывод. Однако этот метод обеспечивает быстрый скрининг для выявления возможных различий между двумя препаратами, поскольку позволяет идентифицировать модификации, которые могут повлиять на специфичность фермента (в данном случае наличие дисульфида в ближайшей области). После изучения всех пептидных ионов было показано, что слабые сигналы свидетельствуют о модификациях или наличии модификаций вблизи сайтов расщепления ферментом, но при этом значительные различия в приведенной интенсивности ионов двух препаратов отсутствуют. Основные различия были выявлены в пептидах с аминокислотными мутациями D359E и L361M по сравнению с референтным препаратом трастузумаба.

При использовании тех же специфических и неспецифических подходов для сравнения референтного препарата трастузумаба с МАТ B (рис. 5B) не было наблюдаемого различия в картах нативных и укороченных триптических пептидов, включая не полностью расщепленный T34-35H. Поскольку при использовании подхода неспецифического сравнения интенсивностей не было никаких различий, модели модификаций (известные или неизвестные) были одинаковыми для обоих препаратов. В целом, результаты сравнения согласуются с результатами масс-спектрометрического картирования, секвенирования и предыдущего специфического сравнения относительного процента моделей модификаций.

5. Заключение

При комплексном сравнении МАТ наша стратегия анализа была направлена ​​на идентификацию областей, которые могут потенциально повлиять на безопасность, эффективность и целостность молекулы, включая известные посттрансляционные модификации. Неспецифическое сравнение всей ионной хроматограммы (хроматограммы полного ионного тока и хроматограммы основного пика) карты триптических пептидов в дополнение к специфическим сравнениям позволило обнаружить различия (МАТ A с двумя аминокислотными мутациями), а также сходства (МАТ B) между референтным препаратом трастузумаба и МАТ A и B. Из-за различий в эффективности ионизации и специфичности ферментов различия в вариантах или модификациях между двумя препаратами были выявлены в рамках неспецифических сравнений приведенных интенсивностей ионов. Следовательно, неизвестные измененные последовательности в белке могут быть идентифицированы только при неспецифическом сравнении карты триптических пептидов, поскольку с помощью поиска в базе данных на основе данных МС/МС секвенирования можно идентифицировать только верную последовательность. В итоге, МС/МС секвенирование и неспецифические сравнения приведенных интенсивностей ионов в нашем исследовании дали аналогичные результаты. Трехступенчатый подход масс-спектрометрического секвенирования, специфического сравнения различных форм модификации и неспецифическое сравнение карты триптических пептидов в комбинации целесообразны для описания характеристик биоподобных препаратов.

Благодарности

Выражаем огромную благодарность Национальному совету по науке Китайской Республики в Тайбее за предоставленный грант.

Ссылки

unpaired cysteine status and complete mapping of the 17 disulfides of recombinant tissue plasminogen activator using LC–MS with electron transfer dissociation/collision induced dissociation, Anal. Chem. 82 (2010) 5296–5303.