Разработка, валидация и внедрение капиллярного гель-электрофореза в качестве замены ДСН-ПААГ для анализа чистоты моноклональных антител к IgG2

DOI 10.1002/jssc.200900597

Научная статья

Разработка, валидация и внедрение капиллярного гель-электрофореза в качестве замены ДСН-ПААГ для анализа чистоты моноклональных антител к IgG2

Авторы: Nathan A. Lacher, Rachel K. Roberts, Yan He, Holly Cargill, Katrina M. Kearns, Heidi Holovics, Margaret N. Ruesch. Аналитические исследования и разработки, Pfizer BioTherapeutics R&D, Честерфилд, Миссури, США.

Для анализа моноклональных антител (МАТ) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях были разработаны методы капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) с УФ-детектированием. Эти методы могут использоваться для оценки чистоты МАТ, предлагая более воспроизводимые результаты количественного определения по сравнению с традиционными методами ДСН-ПААГ. Методы КГЭ использовались в качестве технологической платформы для разработки биопроцесса и рецептуры/состава, определения характеристик МАТ, испытания при выпуске действующего вещества/лекарственного препарата, а также в качестве необходимой методологии для исследования стабильности. Мы обнаружили, что методы КГЭ применимы к МАТ при доклинической и клинической разработке, при этом большинство моноклональных антител не требуют изменений условий метода. Эта методология была валидирована ICH и передана нескольким вспомогательным организациям. Представленные здесь данные описывают разработку методологии КГЭ, применение платформы для анализа чистоты МАТ, валидацию ICH, показатели достоверности и аспекты технологического усовершенствования для улучшения рабочих характеристик и пропускной способности.

Ключевые слова: антитело IgG2, КЭ, квалификация.

Сокращения: КГЭ (капиллярный гель-электрофорез), IgG (иммуноглобулин класса G), PNGase F (пептид-N-гликозидаза F), ЭХ (эксклюзионная хроматография).

Разработка биотерапевтических лекарственных средств требует аналитической технологии, позволяющей точно определить структуру, чистоту и стабильность белка. Технологии, способные надлежащим образом обнаруживать и количественно оценивать посттрансляционные модификации, такие как дезамидирование, окисление, агрегация и гидролиз пептидных связей, являются необходимым условием успешной реализации биомолекул [1-3]. Из-за присущей биофармацевтическим препаратам естественной гетерогенности необходимо использовать несколько методов, чтобы получить полное представление о препарате со сложной структурой. Использование нескольких хроматографических и электрофоретических методов, как правило, является необходимостью для точной оценки качества на всех этапах исследований и разработок.

ДСН-ПААГ используется более 25 лет в качестве основного метода анализа белков в зависимости от их размера [4]. Ряд недостатков ДСН-ПААГ, в том числе использование токсичных реагентов, высокая вариабельность внутри- и межгелевой эффективной подвижности, изменчивость окрашивания, ограниченные возможности количественного определения и его трудоёмкость, привели к замене на капиллярный гель-электрофорез (КГЭ) [5-9]. Преимущества выполнения анализа по размеру частиц с помощью капиллярной технологии включают автоматизацию, повышенную прецизионность, высокую скорость анализа, улучшенное разделение близко мигрирующих соединений и количественное УФ-детектирование в режиме онлайн (чувствительность к Кумасси синему) [5, 8, 10-14] или ЛИФ-детектирование для более высокой чувствительности (чувствительность к окрашиванию серебром) [8, 12, 15].

Для анализа МАТ с помощью КГЭ образцы нагревают в присутствии додецилсульфата натрия для денатурации белка и придания ему равномерного отрицательного заряда приблизительно равной величины. Подготовка образца для анализа в восстанавливающих условиях включает восстановитель, такой как β-меркаптоэтанол, приводящий к восстановлению всех дисульфидных связей с образованием двух легких и двух тяжелых цепей [16]. Если требуется проведение анализа в невосстанавливающих условиях, то для предотвращения перетасовки дисульфидных связей внутри цепи во время подготовки образца используется алкилирующий агент ― иодоацетамид, иодуксусная кислота или N-этилмалеимид [10, 11, 15]. Образец вводят в капилляр, заполненный разделяющим гелем, содержащим линейный или разветвлённый полимер ― полиакриламид, ПЭГ, полиэтиленоксид или декстран [16-18]. Электроосмотический поток (ЭОП) подавляется с помощью высокой концентрации буфера (компания “Beckman”, г. Фуллертон, США, буфер CE-SDS) или с помощью нанесения жидкой фазы динамическим способом (компания “Bio-Rad”, г. Геркулес, США, буфер CE-SDS). Додецилсульфат натрия придает чистый отрицательный заряд всем компонентам образца. Таким образом, электрофоретическая подвижность через гель при подаче напряжения строго зависит от гидродинамического радиуса белка [18].

КГЭ довольно часто применяется в биотехнологической отрасли, о чём свидетельствует недавняя публикация, демонстрирующая робастность технологии с одной моделью прибора, теми же реагентами и теми же методами в нескольких фармацевтических компаниях, участвовавших в совместном анализе [7]. Этот метод оптимизирован для обнаружения фрагментов и способен отделять агликозилированную тяжелую цепь от гликозилированной, что позволяет получать воспроизводимые результаты количественной оценки чистоты и определять степень гликозилирования [10]. Недавний отчет также показал применимость КГЭ для мониторинга гетерогенности дисульфидных изомеров [19].

В данной статье мы опишем разработку платформенного метода КГЭ для анализа МАТ и продемонстрируем его применимость к нескольким моноклональным антителам. Мы обсудим валидацию ICH и перенос аналитической методики, применение метода для очистки МАТ, трудности, связанные с определенными молекулами МАТ, и показатели эффективности метода. Также мы рассмотрим дальнейшие действия по улучшению разделения, формы пиков, чувствительности и пропускной способности разделения на основе геля для обработки расширяющейся линейки продуктов с увеличением количества образцов для разработки биопроцесса, состава, а также контроля качества.

2.1 Материалы

Буферы для образцов, буфер для образцов eCAP SDS (120 ммоль Tris/HCl/1 % SDS, pH 6, номер по каталогу 241525) и буфер для образцов ProteomeLab SDS-MW (100 ммоль Трис-HCl, 1 % SDS, pH 9, номер по каталогу 390960), гелевый буфер SDS-MW (номер по каталогу 391163), кислый раствор для промывки (0,1N HCl, номер по каталогу 391646) и основной раствор для промывки (0,1N NaOH, номер по каталогу 391988) были приобретены у компании “Beckman Coulter”. Дополнительный гелевый буфер CE-SDS (номер по каталогу 148-5032) и β-меркаптоэтанол (номер по каталогу 161-0710) закуплены у компании “Bio-Rad Laboratories, Inc”. Иодоацетамид (номер по каталогу A-3221) приобретен у компании “Sigma-Aldrich” (г. Сент-Луис, Миссури, США). Пептид-N-гликозидаза F закуплена у компании “Prozyme” (г. Сан-Леандро, Калифорния, США, номер по каталогу GKE5006B). Лёгкие цепи каппа бесплатно предоставлены компанией “Sigma-Aldrich”. Капилляры из плавленого кремния без покрытия с внутренним диаметром 50 мм были приобретены у компаний “Polymicro Technologies” (г. Феникс, Аризона, США, номер по каталогу 2000017) и “Beckman Coulter” (номер по каталогу 338451). МАТ IgG2 являются собственными стандартными образцами лаборатории.

2.2 Подготовка образца

Конечный объем образца составлял 100 мл белка при концентрации белка 1 мг/мл. Если не предусмотрено иное, образцы МАТ готовили, отбирая 50 мл буфера для образцов (ProteomeLab SDS-MW), 5 мл β-меркаптоэтанола (в восстанавливающих условиях) или 250 ммоль иодацетамида (в невосстанавливающих условиях) с остаточным объёмом, состоящим из H2O и образца для получения концентрации МАТ 1 мг/мл. Образцы нагревали при температуре 65 °С на водяной бане в течение 10 минут. Образец помещали в пробирку для ПЦР и анализировали. Дегликозилированное МАТ получали путем инкубации моноклонального антитела с PNGaseF в ночное время при температуре 37 °С в 100 ммолях тригидроксиметиламинометана, рН 8,0. Образцы с добавлением стандартного раствора для определения точности в восстанавливающих условиях готовили путём прибавления дегликозилированного вещества к необработанному МАТ при заданных соотношениях. Алкилированную легкую цепь получали путем инкубирования имеющихся в продаже легких цепей каппа в течение 2 часов на льду в 40 ммолях йодацетамида и последующего диализа против буферной смеси. Образцы с добавлением стандартного раствора для определения точности в невосстанавливающих условиях готовили путём прибавления заранее определенного количества алкилированной легкой цепи к необработанному МАТ.

2.3 Оборудование

Для всех анализов КЭ (если не указано иное) использовалась система Beckman Coulter ProteomeLab PA800, оснащённая детектором с фотодиодной матрицей (PDA) и программным обеспечением Beckman 32Karat, а также системой сбора данных Waters Empower Chromatography (г. Милфорд, Массачусетс, США).

2.4 Методика

Методы анализа основывались на методике, описанной в наборах реагентов Beckman Coulter IgG Purity/Heterogeneity kit для анализа чистоты и гетерогенности. Для анализа в восстанавливающих условиях использовали капилляр из плавленого кремния без покрытия диаметром 50 мкм с эффективной длиной 20,2 см и общей длиной 30,2 см (образцы вводили в капилляр со стороны входа). Тот же капилляр использовался для анализа в невосстанавливающих условиях, однако ввод пробы осуществлялся со стороны выхода на эффективной длине разделения 10,0 см. Перед введением и разделением образца капилляр промывали основным раствором для промывки в течение 3 минут при 70 psi, кислым раствором в течение 1 минуты при 70 psi, водой в течение 1 минуты при 70 psi и гелевым буфером в течение 10 минут при 70 psi. После промывки концы капилляров и электродов дважды погружали в отдельные флаконы с водой до введения образца при 5 кВ. Еще одно погружение в воду с последующим разделением было выполнено при 15 кВ. Во время разделения к обоим концам капилляра было применено давление в 20 psi. Детектирование проводили при 220 нм с использованием детектора с фотодиодной матрицей. Рабочие параметры анализа в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях методом КГЭ можно найти в таблицах 1 и 2 соответственно.

3.1 Разработка методики

Для разработки переносимого метода, пригодного для длительного использования в контрактных и GMP лабораториях, первоначальная разработка методики была начата с использованием реагентов и общих условий, поддерживаемых стандартным рабочим протоколом анализа Beckman Coulter IgG Purity/Heterogeneity Assay (номер по каталогу A10424AB). Несмотря на то что флуоресцентная маркировка и детектирование повысят чувствительность [12, 15, 20], детектирование с использованием УФ требует меньшей подготовки образца, чем флуоресцентная маркировка, и исключает любые вопросы, связанные с систематической ошибкой, обусловленной эффективностью маркировки. Для этого метода было выбрано УФ-детектирование при 220 нм, поскольку оно обеспечивало чувствительность, подходящую для намеченного использования метода, отражая чистоту МАТ, связанную с их размером.

Таблица 1. Метод КГЭ в невосстанавливающих условиях (внутренний диаметр 50 мкм, эффективная длина 10,0 см), температура картриджа 40 °С.

Таблица 2. Метод КГЭ в восстанавливающих условиях (внутренний диаметр 50 мкм, эффективная длина 20,2 см), температура картриджа 25 °С.

а Время ввода образца регулировали на основании его начальной концентрации и последующей концентрации соли.

b Во время разделения на входе и выходе капилляра было применено давление в 20 psi.

Как сообщалось ранее, в случае ДСН-ПААГ и КЭ-ДСН (КГЭ) было обнаружено, что условия подготовки образца оказывают значительное влияние и могут вызвать фрагментацию во время пробоподготовки [5, 10, 11, 21]. Было установлено, что в невосстанавливающих условиях время и температура приготовления образца влияют на вызванную методом фрагментацию образцов IgG2, как показано на рисунке 1А. Это было похоже на эффект, наблюдаемый ранее в методах ДСН-ПААГ (данные не указаны). Поэтому для данного метода были выбраны минимальная температура и время нагрева, которые привели к полной денатурации, но при этом минимизировали фрагментацию. Как видно на рисунке 1А, нагревание при 65 °С в течение 10 минут является достаточным, поскольку пики, обусловленные неполной денатурацией, отсутствуют (неденатурированный белок мигрирует дальше по сравнению с основной полосой). Нагревание при 45 °С также приводило к тому же общему количественному определению интактного антитела, поскольку пик, непосредственно предшествующий основной полосе (тяжелая-тяжелая-легкая, HHL), и вышедший на ~6,5 минуте пик (легкая цепь, LC) оставались постоянными, тогда как при суровых условиях денатурации при 95 °С число этих фрагментов возросло. Для метода КГЭ в невосстанавливающих условиях, как уже сообщалось ранее для молекул IgG1, использование алкилирующего агента имело решающее значение для минимизации перетасовки дисульфидных связей внутри цепи и последующей фрагментации, как показано на рисунке 1В [10, 11]. Для платформенного метода антител к IgG2 рН буфера не оказал существенного влияния на фрагментацию при оценке с использованием набора собственных антител IgG2. Однако в соответствии с опубликованными отчетами было выявлено, что рН влияет на фрагментацию антител к IgG1 во время приготовления образца, как показано на рисунке 1С [22, 23].

Рисунок 1. Оценка подготовки образца IgG. (A) Влияние температуры и времени нагревания на разделение МАТ в невосстанавливающих условиях: 1-45 °С в течение 15 минут, 2-65 °С в течение 5 минут, 3-65 °С в течение 10 минут, 4-65 °С в течение 15 минут, 5-95 °С в течение 5 минут, 6-95 °С в течение 10 минут, 7-95 °С в течение 15 минут. (B) Приготовление образца с иодоацетамидом и без него. (C) Влияние рН буфера образца на фрагментацию антител.

Набор Beckman Coulter IgG для определения чистоты/гетерогенности также включает внутренний стандарт рекомбинантного белка 10 кДа, который может быть включен в пробоподготовку для использования в качестве стандартного маркёра при идентификации пика, а также маркёра подвижности. Следует отметить, что внутренний стандарт 10 кДа мигрировал совместно с возможным продуктом деградации 10 кДа, присутствующим в некоторых МАТ. Для предполагаемого использования метода, сообщающего относительную чистоту в процентах, прецизионность скорректированной по времени области была приемлемой даже без внутреннего стандарта (данные не указаны). Поэтому было решено, что использование внутреннего стандарта не требуется. Чтобы гарантировать, что вводимая проба была достаточной для валидированного предела количественного определения, в качестве критерия приемлемости анализа была включена минимально скорректированная по времени область.

Гелевый буфер был разработан главным образом для отделения агликозилированной тяжелой цепи (НС) от гликозилированной и, таким образом, наилучшее разделение имело место для антител с восстановленными дисульфидными связями, как показано на рисунке 2А. Колебания базовой линии примерно через 28 мин (рис. 2В) потребовали разработки альтернативного метода КГЭ для анализа МАТ в невосстанавливающих условиях, поскольку базовая линия затрудняла точное интегрирование. В ходе обсуждений с производителем было установлено, что наблюдаемая волнистость базовой линии обусловлена составом гелевого буфера и джоулевым нагревом. Во избежание этого образец вводили с выхода (эффективная длина 10,0 см), и проводили разделение при температуре капилляра 40 °С, как описано в таблице 2. При уменьшении эффективной длины капилляра на 50 % ожидалось, что произойдет потеря разрешения, поскольку разрешение пропорционально квадратному корню из длины капилляра. Наблюдалось некоторое снижение разделения пиков, мигрирующих непосредственно перед (HHL) интактным IgG2 с использованием данного метода, но интегрирование основного пика было улучшено за счет уменьшения волнистости базовой линии, как и интегрирование любых более поздних мигрирующих пиков, что делает метод пригодным для его предполагаемого использования (рисунок 2С, таблица 1).

Для анализа в восстанавливающих условиях приемлем либо стандартный метод с использованием капилляра с эффективной длиной 20,2 см при 25 °С во время разделения, либо упрощённый метод с использованием капилляра с эффективной длиной 10,0 см при 40 °С во время разделения. Для некоторых МАТ был выбран «более длинный» метод (эффективная длина 20,2 см, таблица 2) с целью оптимального разделения видов, связанных с тяжелой цепью. Основываясь на испытаниях по ферментативному дегликозилированию, эти редковстречающиеся в природе виды, связанные с тяжелой цепью, согласуются с агликозилированной тяжелой цепью, как сообщалось ранее (данные не предоставлены) [6, 7, 9-12, 14, 21, 24].

Несмотря на то что метод КГЭ может использоваться для нескольких МАТ, охватывающих разные разделы медицины и классы IgG, одинаковое разделение достигается не всегда. На рисунке 2 показано сравнение анализов антител к IgG1, IgG2 и IgG4, выполненных с использованием нескольких различных условий метода. Как видно из рисунка 2А, было достигнуто достаточное разделение при анализе МАТ к IgG1, IgG2 и IgG4 в восстанавливающих условиях для количественного определения агликозилированной тяжелой цепи с использованием метода, представленного в таблице 2. В этом случае полученное разделение, по-видимому, является одинаковым для всех показанных МАТ, что так же имело место в нашем исследовании.

Рисунок 2. Оценка различных классов антител к IgG (IgG1, IgG2 и IgG4). (A) Анализ антител в восстанавливающих условиях с использованием гелевого буфера Beckman SDS-MW (эффективная длина 20,2 см, общая длина 30,2 см). (B) Анализ антител в невосстанавливающих условиях с использованием гелевого буфера Beckman SDS-MW (эффективная длина 20,2 см, общая длина 30,2 см). (C) Анализ антител в невосстанавливающих условиях с использованием гелевого буфера Beckman SDS-MW (эффективная длина 10,0 см, общая длина 30,2). (D) Анализ антител в невосстанавливающих условиях с использованием буфера BioRad CE-SDS (эффективная длина 20,2 см, общая длина 30,2 см).

На рисунке 2B показано наложение антител в невосстанавливающих условиях также с использованием эффективной длины капилляра 20,2 см, представленной в таблице 2, а на рисунке 2C продемонстрировано наложение антител с использованием эффективной длины капилляра 10,0 см, приведенной в таблице 1. Эти разделения иллюстрируют различия в разрешении и форме пиков среди подклассов IgG; большинство предыдущих публикаций обычно использовали молекулы IgG1. Следует отметить, что некоторые антитела IgG2 имеют улучшенное разрешение по сравнению с примером IgG2, включенным в рисунок 2C. Однако, как правило, в случае IgG2 разрешение снижается по сравнению с IgG1 или IgG4.

Вероятной причиной снижения разрешающей способности для IgG2 является присутствие дисульфид-опосредованной гетерогенности в классе молекул IgG2. Недавние публикации, описывающие КГЭ анализ дисульфидной гетерогенности молекул IgG2, показывают, что эта гетерогенность может быть частично разрешена в системе на основе КГЭ [19, 25]. Наложение электрофореграмм IgG1, IgG2 и IgG4, полученных с использованием условий метода, приведенных в таблице 2, с буфером Bio-Rad CE-SDS в качестве матрицы просеивания вместо гелевого буфера Beckman SDS-MW показано на рисунке 2D. В соответствии с наличием дисульфид-опосредованной гетерогенности в IgG2, но не в IgG1 или IgG4, в образце IgG2 наблюдался сдвоенный пик. Определение этих пиков было подтверждено с использованием обогащенных изомером фракций ортогональным методом (данные не приводятся). По сравнению с образцами IgG1 и IgG4, дисульфидные изомеры IgG2 приводят к сдвоенному пику с использованием геля Bio-Rad и расширенному пику при использовании геля Beckman SDS-MW при данных условиях. Несмотря на необходимость в отдельном методе для изучения дисульфид-опосредованной гетерогенности, метод КГЭ в невосстанавливающих условиях с использованием буфера Beckman применяется и для оценки других неоднородностей (фрагментов, агрегатов).

3.2 Метод, валидированный ICH

Эта методология была использована с условиями метода, ранее описанными в поддержку разработки нескольких кандидатных антител. На ранних стадиях разработки квалифицированные методы проверяются на эффективность для новых кандидатных антител, чтобы гарантировать, что метод подходит для анализа чистоты продукта. По мере того как МАТ продвигается в процессе разработки, показатели производительности существенно ужесточаются. Как только молекула переходит в позднюю фазу разработки (фаза III), необходимо провести валидацию метода в соответствии с руководствами ICH.

Метод КГЭ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях был валидирован для анализа чистоты МАТ к IgG2 в соответствии с ICH и японскими руководствами (http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm073381.pdf; http://www.fda.gov/downloads/RegulatoryInformation/Guidances/UM128049.pdf) [26-28]. Совместная валидация была проведена на двух различных производственных площадках вместо последующего переноса аналитической методики. Лаборатория 1 провела оценку всех параметров валидации, а лаборатория 2 выполнила испытания по оценке прецизионности. Для этого исследования было приготовлено дегликозилированное МАТ с обработкой PNGase F того же самого МАТ. Полученная в результате дегликозилированная тяжелая цепь может быть отделена от гликозилированной в восстанавливающих условиях и использована для исследования точности (степень извлечения при 2,6 и 6,5 %) и линейности. Третья степень точности (32,3 %) была получена путем извлечения лёгкой цепи лекарственного препарата без добавленного вещества. Кроме того, линейность была продемонстрирована с использованием цельной молекулы как в восстанавливающих, так в невосстанавливающих условиях, причем отдельные компоненты были нанесены на график как отдельно, так и суммировано. Также были оценены предел количественного определения, предел детектирования, специфичность и стабильность образца. Исследования прецизионности и воспроизводимости продемонстрировали приемлемые характеристики как при восстанавливающих, так и при невосстанавливающих условиях. Обзор результатов валидации ICH приведен в таблице 3.

Образцы анализа в восстанавливающих условиях показали более высокую прецизионность и улучшенную стабильность по сравнению с образцами анализа в невосстанавливающих условиях, но результаты того и другого анализов продемонстрировали пригодность метода для использования при выпуске партии. Также было доказано, что данный метод пригоден для оценки стабильности и включён в исследования состава для определения фрагментации и агрегации (см. рис. 3) в условиях ускоренных испытаний в режиме реального времени.

Во время валидации ICH другого МАТ точность образцов анализа в невосстанавливающих условиях не могла быть выведена из точности, продемонстрированной для образцов анализа в восстанавливающих условиях, поскольку для разных анализов использовались использовались различные эффективные длины (эффективная длина 20 см для анализа в восстанавливающих условиях и 10 см для анализа в невосстанавливающих). Поэтому для оценки точности и прецизионности метода в невосстанавливающих условиях были использованы образцы МАТ, добавленные в заранее определенные соотношения с алкилированной легкой цепью с результатами, которые продемонстрировали согласованность метода со спецификацией (данные не приводятся).

3.3 Применение метода и его характеристики

Разработанная методология была использована для анализа чистоты антител на разных платформах, как правило, с небольшим количеством молекулярных ограничений. Это следовало ожидать в силу сходства в последовательностях и структурах антител, а также природы разделения. Применение метода для анализа чистоты МАТ показано на рисунке 3. Разделение замороженного контрольного образца МАТ показано на рисунке 3А, а условия ускоренных испытаний (25 °С в течение 104 недель) отображены на рисунке 3В. В этом случае предполагался пик фрагмента, совместно мигрирующий с агликозилированным пиком непосредственно перед тяжелой цепью, поскольку остаток ковалентно связанного гликана был бы весьма маловероятным. Чтобы подтвердить это, образец в условиях ускоренных испытаний дегликозилировали с помощью PNGase F, и пик фрагмента остался. Улучшенное разрешение наблюдалось за счет удаления гликана (рис. 3C). Восстанавливающие условия имеют преимущество в виде улучшенного разрешения, а также возможность обнаруживать фрагменты, связанные с МАТ через дисульфидную связь. Анализ в невосстанавливающих условиях может предоставить дополнительную информацию о фрагментах, таких как свободная легкая цепь и HHL, а также о возможных трудностях с IgG4, таких как образование полумолекул. Невосстанавливающие условия также обеспечивают разделение ковалентных агрегатов. На рисунке 3D показано наложение замороженного контрольного образца МАТ и образца ускоренного испытания стабильности, хранящегося при 25 °С в течение 104 недель, иллюстрируя предполагаемый пик ковалентного агрегата. Это соединение также наблюдалось с помощью ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и эксклюзионной хроматографии (ЭХ) (данных нет). Анализ КГЭ в денатурирующих невосстанавливающих условиях предоставляет ортогональную информацию для ЭХ, поскольку ДСН разрушает нековалентные агрегаты, в то время как ЭХ без средств для денатурации измеряет общее содержание агрегатов.

Таблица 3. Результаты валидации ICH метода КГЭ для моноклонального антитела в поздней фазе.

а) Для предела количественного определения лекарственный препарат готовили в восстанавливающих условиях в концентрации, которая давала размер пика легкой цепи 0,3 % от пика образца заданной нагрузки. Извлечение легкой цепи было рассчитано по отношению к известному количеству легкой цепи в используемой молекуле.

b) RSD площади с поправкой на время, % (LC + HC).

c) RSD площади с поправкой на время, % IgG.

Реализация методов КЭ для повседневного использования в отрасли не всегда была успешной из-за трудностей с рабочими параметрами процесса. Чтобы лучше понять эффективность метода, были собраны данные о частоте отказов во время повседневного использования в исследованиях по разработке состава в течение примерно 6 месяцев. Как видно из обобщенной информации о цикле КГЭ в таблице 4, при анализе в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях частота отказов прибора составляла около 7-9 %. Наиболее распространенные неисправности прибора дополнительно отображены на рисунке 4. В этом случае 70 % отказов прибора связаны с неправильной установкой планшетов для буферного реагента, что привело к поломке капилляров или согнутым электродам. Недавно компания “Beckman” внесла несколько модификаций в систему PA800 CE, что должно существенно снизить частоту отказов приборов. Имелись дополнительные источники сбоев, которые были связаны с несоблюдением требования пригодности системы минимальной общей площади; однако это не было включено в таблицу 4. Следует также отметить, что некоторые проблемы могут возникать чаще у новых лаборантов, хотя все лаборанты в данном исследовании были обучены работе с оборудованием.

3.4 Выявление неисправностей и факторы, специфичные для МАТ

Поскольку метод КГЭ широко применялся в лабораториях, возникло несколько проблем, которые препятствовали эффективности метода. В недавнем обзоре обсуждалось несколько вопросов, в том числе нестабильность питания, использование геля с истекшим сроком годности, образование микропузырьков, нестандартная форма пика в силу буферного состава, эксплуатация плохой лампы, недостаточное предварительное кондиционирование, использование неправильной апертуры, дисбаланс давления и ненадлежащий нагрев образца, демонстрируя характерные электрофореграммы для каждого случая [19]. Дополнительный обзор технологии капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия выявил дальнейшие проблемы, которые включали ошибки в виде сбоя в подаче давления, размывание границы пика, пики образцов с добавлением известного количества определяемого вещества и изменчивость времени выхода пика [21]. Наряду с этими общими вопросами были также затронуты некоторые специфичные для МАТ аспекты, которые привели к дополнительной работе по разработке.

Рисунок 3. Применение КГЭ при исследовании стабильности МАТ к IgG2. (A) Анализ КГЭ в восстанавливающих условиях замороженного контрольного образца МАТ, (B) Анализ КГЭ в восстанавливающих условиях образца МАТ после хранения при 25 °C в течение 104 недель, (C) Анализ КГЭ в восстанавливающих условиях образца МАТ после хранения при 25 °C в течение 104 недель, дегликозилированный путем предварительной обработки PNGase F, (D) Наложение замороженного контрольного образца МАТ (1) и образца МАТ после хранения при 25 °C в течение 2 лет (2) при анализе КГЭ в невосстанавливающих условиях.

В первом случае наблюдается размывание границы пика легкой цепи либо тяжелой цепи при разделении определенных МАТ. Образование размытых пиков ранее было описано как результат использования просроченного или подвергшегося процессу разложения геля [14]. Расширение площади пика также возникало из-за следов предыдущей пробы в силу неполного удаления образца с внешней стороны капилляра [21]. В случае антитела, показанного на рис. 5, размывание границы пика не может быть описано ни одним из вышеупомянутых объяснений, поскольку данный случай специфичен для МАТ. Асимметрия пика тяжелой цепи присутствовала во всех испытанных партиях гелевого буфера и с оптимизированной стадией погружения капилляра во избежание переноса остатка предыдущей пробы. Расширение площади пика, вероятно, было вызвано адсорбцией тяжелой цепи на поверхности капилляра. Подавление электроосмотического потока в геле Beckman Coulter SDS-MW достигается за счет использования высокой концентрации буферных солей (около 0,6 М трис-бората) [29]. Поверхностное покрытие может быть недостаточным для предотвращения адсорбции определенных белков. Мы обнаружили, что проблема может быть устранена благодаря нанесению жидкой фазы динамическим способом, которая вводится путем смешивания двух гелевых буферов. На рисунке 5 сравнивается разделение одного МАТ с гелем SDS-MW от Beckman Coulter и с использованием смешанного геля с динамическим нанесением фазы. Динамическое нанесение фазы представляет собой положительно заряженный триэтаноламин декстран в геле КЭ-ДСН от Bio-Rad Laboratories [30]. Взаимодействие белка со стенкой может быть уменьшено путем включения в буфер содержащих амин добавок, приводящих к улучшению формы пика [31]. В этом случае можно увидеть улучшение формы пика тяжелой цепи, достигаемое с помощью смешанных гелевых матриц с динамическим нанесением фазы, поскольку наблюдается обычный профиль, при котором тяжелая цепь примерно в 1,5-2 раза больше по высоте, чем легкая цепь.

Таблица 4. Частота повторения КГЭ

Рисунок 4. Причины неисправности прибора (2276 образцов за 6 месяцев).

Второй пример специфичных для МАТ факторов связан с подготовкой образцов. Было несколько случаев, когда для повышения эффективности метода требовалась дополнительная корректировка пробоподготовки. Наиболее ярким примером является МАТ, содержащее дополнительный сайт гликозилирования в Fab-фрагменте антитела. Было отмечено, что метод КГЭ в невосстанавливающих условиях дает непоследовательные и необычно высокие уровни предполагаемых высокомолекулярных соединений, и эти результаты не подтверждаются анализом ЭХ или ДСН-ПААГ.

Рисунок 5. Измененные гелевые буферы для улучшения формы пика. (А) Разделение МАТ к IgG2 в восстанавливающих условиях с использованием гелевого буфера Beckman SDS-MW, (B) Разделение МАТ к IgG2 в восстанавливающих условиях с использованием смешанной буферной матрицы, содержащей гелевый буфер Beckman SDS-MW, буфер Bio-Rad CE-SDS и 2 М декстрана.

При исследовании было установлено, что дополнительный сайт гликозилирования препятствует полной денатурации интактного антитела при использовании протокола приготовления стандартного образца с нагреванием при 65 °С в течение 10 мин, как показано на рисунке 6. Однако при использовании более агрессивных условий денатурации, таких как увеличенное время нагрева на водяной бане (10-25 мин) при температуре 65 °С (данные не показаны) или повышенная концентрация ДСН (рис. 6), предполагаемые высокомолекулярные соединения исчезали, подтверждая свою принадлежность к МАТ, которое не было полностью денатурировано. Интересно, что в случае удаления перед анализом с помощью сиалидазы видов, содержащих сиаловую кислоту, преимущественно связанных с дополнительным сайтом гликозилирования, более мягкие условия денатурации были достаточными (рис. 6).

КГЭ использовался для предоставления количественных данных о чистоте фрагментации и примесей с большими массами для разработки биопроцесса, состава, выпуска ЛС/ЛП и исследований стабильности. Было доказано, что данная технология подходит для применения на платформе, поскольку аналогичная производительность может быть получена для большинства МАТ в процессе разработки без каких-либо изменений методологии. Это позволяет организации осуществлять больше проектов, поскольку сокращается время, необходимое для разработки методов, а также сокращается само количество методов. В то время как КЭ-ДСН все чаще признается в качестве заманчивой альтернативы ДСН-ПААГ в биофармацевтической отрасли, возможности для улучшения вариантов метода КГЭ все еще существуют.

Рисунок 6. Изменение этапа подготовки образца требовалось для полной денатурации кандидатного МАТ, которое имело дополнительный сайт гликозилирования. (A) Контрольный образец МАТ показал предполагаемый высокомолекулярный пик при стандартной подготовке образца. (B) Дополнительная денатурация путем удвоения концентрации ДСН привела к ожидаемому профилю с аналогичным уровнем агрегатов, подтвержденным ЭХ. (C) Десиализация МАТ привела к получению ожидаемого профиля с использованием стандартной пробоподготовки.

Существующий метод КГЭ имеет преимущества перед ДСН-ПААГ с точки зрения автоматизации, точности количественного определения и прецизионности. Тем не менее, общая пропускная способность улучшена лишь отчасти. Чтобы удовлетворить растущие потребности как существующих, так и вновь возникающих способов применения в быстро меняющейся биофармацевтической отрасли, в будущем необходимо будет улучшить разделение, чувствительность, скорость и робастность. Дальнейшие совершенствования измерительного оборудования в традиционном формате и формате микрочипов, а также разработка новых буферных составов позволят повысить пропускную способность, чувствительность, улучшить промежуточную прецизионность и разрешение между близко мигрирующими соединениями. Кроме того, как обсуждалось в данной статье, разделение МАТ к IgG2 в невосстанавливающих условиях также может быть улучшено для обнаружения/анализа дисульфидных изомеров или фрагментов. Мы продемонстрировали, что использование гелевой матрицы с динамическим нанесением фазы, как показано на рисунке 5, обеспечивает улучшенную форму пика и разрешение в некоторых случаях. Пропускная способность может быть улучшена за счет использования микросхемного оборудования на основе КЭ (Caliper Lifesciences, Agilent Technologies, Bio-Rad Laboratories). До сих пор сообщалось о применении имеющегося на рынке КЭ на микрочипе, включающего анализ чистоты МАТ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях [32, 33], анализ гликанов с высоким содержанием маннозы с использованием Endo H [34] и анализ общего димера [35]. С оборудованием КЭ на микрочипах (LC90 и GXII, Caliper Lifesciences, г. Хопкинтон, Массачусетс, США) можно проанализировать 96-луночный планшет приблизительно за 75 минут, обеспечивая гораздо более высокую пропускную способность и пригодность в его нынешнем формате для разработки биопроцессов и составов. Успех метода КГЭ с использованием традиционного оборудования КЭ, описанного здесь и другими авторами, обеспечивает стандарт производительности для перехода к методам с более высокой пропускной способностью и надлежащую платформу для применения при исследовании стабильности и выпуске продукции.

[1] Anicetti, V. R., Keytand, B. A., Hancock, W. S., Trends Biochem. Sci. 1989, 7, 342-349.

[2] Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J., J. Pharm. Sci. 2008, 97, 2426-2447.

[3] Jefferis, R., in: Butler, M. (Ed.), Cell Culture and Upstream Processing, Taylor & Francis, Inc. New York 2007, pp. 103-29.

[4] Weber, K., Osborn, M., J. Biol. Chem. 1969, 244, 4406-4412.

[5] Hunt, G., Nashabeh, W., Anal. Chem. 1999, 71, 2390-2397.

6] Han, M., Phan, D., Nightlinger, N., Taylor, L., Jankhah, S., Woodruff, B., Yates, Z., Freeman, S., Chromatographia 2006, 64, 335-342.

[7] Nunnally, B., Park, S. S., Patel, K., Hong, M., Zhang, X., Wang, S.-X., Rener, B., Reed-Bogan, A., Salas-Solano, O., Lau, W., Girard, M., Carnegie, H., Garcia-Canas, V., Cheng, K. C., Feng, M., Ruesch, M., Frazier, R., Jochheim, C., Natarajan, K., Jessop, K., Saeed, M., Moffatt, F., Madren, S., Thiam, S., Altria, K., Chromatographia 2006, 64, 359-368.

[8] Wehr, T., LCGC 2005, 23, 676-681.

[9] Rustandi, R. R., Washabaugh, M. W., Wang, Y., Electrophoresis 2008, 29, 3612-3620.

[10] Ma, S., in: Mire-Sluis, A. R., (Ed.), State of the Art Analytical Methods for the Characterization of Biological Products and Assessment of Comparability, Basel, CH 2005, pp. 49-68.

[11] Ma, S., Nashabeh, W., Chromatographia 2001, 53, S75-S89.

[12] Salas-Solano, O., Tomlinson, B., Du, S., Parker, M., Strahan, A., Ma, S., Anal. Chem. 2006, 78, 6583-6594.

[13] Good, D. L., Cummins-Bitz, S., Fields, R. M., Nunnally, B. K., in: Strege, M. A., Lagu, A. L. (Eds.), Capillary Electrophoresis of Proteins and Peptides, Humana Press, Totowa, NJ 2004, pp. 121-136.

[14] Guo, A., Camblin, G., Han, M., Meert, C., Park, S., in: Ahuja, S., Jimidar, M. I. (Eds.), Capillary Electrophoresis Methods for Pharmaceutical Analysis, Elsevier, Amsterdam 2008, pp. 357-400.

[15] Michels, D. A., Brady, L. J., Guo, A., Balland, A., Anal. Chem. 2007, 79, 5963–5971.

[16] Wehr, T., Rodrı´guez-Dı´az, R., Zhu, M., Capillary Electrophoresis of Proteins, Marcel Dekker, New York 1999, pp. 235-258.

[17] Guttman, A., Shieh, P., Karger, B. L., Hames, B. D. (Ed.), Gel Electrophoresis of Proteins, Oxford University Press, Oxford 1998, pp. 105-126.

[18] Weinberger, R., in: Weinberger, R. (Ed.), Practical Capillary Electrophoresis, Academic Press, New York 2000.

[19] Guo, A., Han, M., Martinez, T., Ketchem, R. R., Novick, S., Jochheim, C., Balland, A., Electrophoresis 2008, 29, 2550-2556.

[20] Hunt, G., Hotaling, T., Chen, A. B., J. Chromatogr. A 1998, 800, 355-367.

[21] Salas-Solano, O., Felten, C., in: Ahuja, S., Jimidar, M. I. (Eds.), Capillary Electrophoresis Methods for Pharmaceutical Analysis, Elsevier, Amsterdam 2008, pp. 401-424.

[22] Lee, H. G., Chang, S., Fritsche, E., J. Chromatogr. A 2002, 947, 143-149.

[23] Lee, H. G., J. Immunol. Methods 2000, 234, 71-81.

[24] Salas-Solano, O., Gennaro, L., Felten, C., LC-GC Europe 2008, 615-622.

[25] Lacher, N. A., Wang, Q., Roberts, R. K., Holovics, H. J., Aykent, S., Schlittler, M. R., Thompson, M. R., Demarest, C. W., Electrophoresis 2009, In press.

[26] ICH, Q2A Text on Validation of Analytical Procedures (Guidance for Industry). International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, March 1995.

[27] ICH, Q2B Text on Validation of Analytical Procedures: Methodology (Guidance for Industry). International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, November 1996

[28] Kojima, S., PDA J. GMP Validation Jpn. 1999, 1, 18-35.

[29] Liu, Y., Reddy, P. M., Ratnayake, C. K., in: Organization, W. I. P. (Ed.), Beckman-Coulter, Inc. 2004.

[30] Zhu, M.-D., Siebert, C. J., US Patent, Bio-Rad Laboratories, Inc. 1996.

[31] Wehr, T., Rodrı´guez-Dı´az, R., Zhu, M., Capillary Electrophoresis of Proteins, Marcel Dekker, New York 1999, pp. 37-49.

[32] Chow, A. W., in: Henry, C. S. (Ed.), Microchip Capillary Electrophoresis – Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey 2006, pp. 145-158.

[33] Vasilyeva, E., Woodard, J., Taylor, F. R., Kretschmer, M., Fajardo, H., Lyubarskaya, Y., Kobayashi, K., Dingley, A., Mhatre, R., Electrophoresis 2004, 25, 3890-3896.

[34] Chen, X., Tang, K., Lee, M., Flynn, G. C., Electrophoresis 2008, 29, 4993-5002.

[35] Chen, X., Flynn, G. C., J. Chromatogr. B 2009, 877, 3012-3018.