Содержание

Введение ................................................................................................................... 3

Методы ..................................................................................................................... 5

Дифференциальное покрытие (DP) ..................................................................... 12

Количественная оценка количества клеток и колоний ..................................... 16

Проточная цитометрия ......................................................................................... 19

Иммуноцитохимия (ICC) ...................................................................................... 20

Заключение ............................................................................................................ 22

Ссылки .................................................................................................................... 23

Список сокращений

SSC – сперматогониальные стволовые клетки.

DP – Дифференциальное покрытие.

NOA – Необструктивная азооспермия.

MACS – сортировка клеток с магнитной активацией.

FACS - сортировка клеток, активируемых флуоресценцией.

Введение

Экспансия сперматогониальных стволовых клеток (SSC)in vitroостается

серьезной проблемой в усилиях по сохранению фертильности среди

мальчиков в период полового созревания. Текущее исследование было

сосредоточено на инновационных подходах к оптимизации расширения SSC.

Образцы тестикул мышей CD-1 шести-восьминедельной давности собирали

путем механического и ферментативного расщепления. Клеточные суспензии

инкубировали для дифференциального посева (DP). После DP мы провели два

эксперимента по сравнению одиночного и повторяющегося DP (S-DP и R-DP

соответственно) до прохождения 2 (P2).

Каждый эксперимент включал набор культур, состоящий из 5

соотношений плавающих и прикрепленных клеток (5, 10, 15, 20 и 25), и

контрольных культур, содержащих только плавающие клетки. Мы

обнаружили сходное падение количества клеток и колоний во время P0 как в

S-, так и в R-DP. Во время P2 показатели S-DP увеличивались в средних

соотношениях (10, 15 и особенно 20) по сравнению с низкими и высокими

соотношениями (5 и 25 соответственно). Количество сильно упало в R-DP

после прохождения 2. Превосходство промежуточных соотношений было

продемонстрировано путем обогащения GFRα1 qPCR. Оптимальное

соотношение 20 в S-DP содержало значительно увеличенную долю GFRα1-

позитивных клеток (25,8±5,8%), измеренную методом проточной цитометрии,

по сравнению с после DP (1,9±0,7%, p<0,0001), а также положительное

иммуноокрашивание на GFRα1 и UTF1 с редкими Sox9-позитивными

клетками. Это первое сообщение о влиянии начального соотношения

плавающих и прикрепленных клеток на пролиферацию SSC в культуре.

Сперматогониальные стволовые клетки (SSC) представляют собой

унипотентные клетки, локализованные в семенной базальной мембране,

которые отвечают за выработку сперматозоидов в процессе сперматогенеза.

Эти клетки были в центре внимания многих исследований по всему миру из-

за их способности восстанавливать фертильность среди стерильных

пациентов, получавших гонадотоксические схемы в детстве, или мужчин с

необструктивной азооспермией (NOA), у которых сперматозоиды

отсутствуют или редки в яичках.

Несмотря на интенсивные исследования, SSC остаются загадочными из-

за их уникальных особенностей. Во-первых, они существуют на очень низких

частотах, оцениваемых в 1 на 3000-4000 клеток у мыши.

Для клинического применения, вероятно, потребуется экспансия ССК

человека ex vivo. Во-вторых, SSC трудно идентифицировать и очистить из-за

отсутствия маркеров, специфичных для SSC, и, возможно, из-за

существования субпопуляций SSC у различных видов. В-третьих, текущие

стратегии, направленные на экспансию SSC ex-vivo, сложны, требуют много

времени и ресурсов и часто приводят к низкой чистоте и жизнеспособности

клеток.

Традиционный подход к расширению SSCex-vivoвключает сортировку с

последующим расширениемin vitro.

Основным методом сортировки является дифференциальный посев

(DP), который включает инкубацию суспензии клеток яичек над желатином в

течение ночи.

Во время ДП соматические клетки, как правило, прикрепляются к

желатину, в то время как зародышевые клетки остаются плавающими, что

делает их разделение легким и простым. Однако DP сам по себе не может

отделять зародышевые клетки на различных стадиях дифференцировки, и

полное отделение от соматических клеток не является эффективным на 100%.

С этой целью были оценены более продвинутые методологии, такие как

сортировка клеток, активируемых магнитной активацией и флуоресценцией

(MACS и FACS соответственно), с использованием специфичных для SSC

маркеров.

Однако эти сложные манипуляции часто приводят к значительной

гибели клеток и отсутствию доступных SSC для дальнейшего

культивирования и основаны на маркерах, которые не полностью выяснены в

отношении их специфичности для SSC. Кроме того, было показано, что

различные условия культивирования способствуют распространению SSC,

включая кормовые и непитательные культуры и использование нескольких

сред среди прочих.

Хотя сообщалось о длительномex-vivoрасширении SSC ex-vivo в

образцах ткани яичек как в допубертатный период, так и у взрослого человека,

эти сообщения были подвергнуты сомнению из-за сохранения экспрессии

маркеров соматических клеток в культивируемых клетках, что повышает

неопределенность в отношении чистоты этих культур SSC. Следовательно,

для создания надежныхin vitroсистем расширения SSC in vitro требуется

адаптация. Некоторые недавние исследования были сосредоточены на

краткосрочных культурах, пытаясь улучшить условия культивирования на

ранней стадии для успешной долгосрочной пролиферации. Однако основным

препятствием является чрезмерный рост соматических клеток яичек, который,

по-видимому, подавляет пролиферацию SSC. Как было продемонстрировано

Smith et al., 2014, экспрессия маркеров SSC человека UTF1, FGFR3 и DAZL

прогрессивно снижалась на протяжении всей культуры, в то время как

маркеры соматических клеток VIM, ACTA2 и GATA4 увеличивались.

Наши знания о биологии SSC получены в основном из исследований на

грызунах. В то время как долгосрочная пролиферация SSC среди образцов

человека является спорной, многочисленные исследователи сообщали о

распространении SSC у мышей в течение нескольких месяцевin vitro, и

мышиные модели широко использовались для культивирования SSC

исследования, в которых основное внимание уделялось новым подходам и

методамin vitroразмножения SSC in vitro и дифференцировке. Следует

отметить, что большинство экспериментов по культивированию SSC на

мышах включали ювенильных мышей, семенники которых имели

относительно высокую концентрацию SSC и были собраны до инициации

сперматогенеза. Поэтому актуальность этой модели для взрослых патологий,

таких как НОА, является неопределенной. Целью настоящего исследования

было провести предварительную оценку инновационных подходов к

оптимизации пролиферации SSCin vitroс использованием модели взрослой

мыши. Первый подход был сосредоточен на установлении оптимального

соотношения плавающих клеток яичек (предположительно обогащенных

зародышевыми клетками) к прикрепленным клеткам (предположительно

обогащенным соматическими клетками) после DP. Мы предположили, что

эффективная пролиферация SSC будет достигнута путем добавления

соматических клеток в оптимальном соотношении, которое обеспечивает

жизненно важную поддержку при минимизации чрезмерного роста

соматических клеток. Второй подход включал использование повторного DP

при каждом проходе, чтобы поддерживать низкое количество соматических

клеток. Мы предположили, что повторный ДП может увеличить

пролиферацию SSC, предотвращая чрезмерный рост соматических клеток.

Методы

Сбор тканей, механическое и ферментативное расщепление

Вся работа была выполнена в соответствии с руководящими

принципами CACC и с одобрения Комитета по уходу за животными Центра

феногеномики в Торонто. Образцы тестикул мышей CD-1 6-8-недельного

возраста собирали, как описано ранее. После эвтаназии путем вдыхания CO2

у мышей проводили забор ткани путем разреза по средней линии с

последующим извлечением семенника и удалением оболочки. Механическое

переваривание проводили путем разрезания семенников на мелкие кусочки

(по 1-2 мм каждый) с последующим измельчением в HBSS с использованием

тонких игл. Кусочки ткани переносили в пробирки объемом 15 мл и

промывали три раза при 5-минутном вращении при 1200 оборотах в минуту.

Ферментативное расщепление осуществляли в два этапа. Сначала добавляли 2

мл раствора коллагеназы в течение 15 минут при37oCс повторным

встряхиванием с последующим двойным промыванием HBSS. Во-вторых, 1,6

мл 0,25% трипсина добавляли в течение 10 минут при37oCпри постоянном

встряхивании. После этого к суспензиям отдельных клеток добавляли 5 мл

Stempro34 с 2% добавками Stempro34. Образцы центрифугировали при 1200

об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли и подсчитывали

клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток.

Дифференциальное покрытие (DP)

Клеточные суспензии инкубировали в течение ночи в базальной среде

SSC, как описано ранее, включая 2% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин и

1л/мл гентамицина в 10-сантиметровых чашках, покрытый 0,2% желатином

в 5%CO2при37oCс плотностью 150 000 клеток насм2. На следующее утро

плавающие клетки собирали и переносили для второго DP в идентичных

условиях. Прикрепленные клетки в первой чашке DP гидратировали PBS.

Плавающие клетки собирали через 4-5 часов. Прикрепленные клетки

объединяли как из первой (на ночь), так и из второй (4-5 часов) чашки DP

путем удаления PBS и добавления TrypleE во все первые и вторые DP в

течение 3-5 минут. Все прикрепленные ячейки были отделены от плавающих

ячеек и объединены. Все пробирки центрифугировали при 1200 об/мин в

течение 5 минут и надосадочную жидкость отсасывали. Как плавающие, так и

прикрепленные популяции клеток подсчитывали с использованием

автоматизированного счетчика клеток перед созданием культур.

Эксперимент 1: культивирование в различных соотношениях

плавающих / зародышевых / прикрепленных / соматических клеток

Плавающие клетки совместно культивировали с прикрепленными

клетками после DP в покрытых 0,2% раствором ламинина 12-луночных

планшетах с добавлением среды StemPro34.

Было создано шесть культур (P0) следующим образом: 5 исследуемых

культур со специфическими 5 соотношениями плавающих и прикрепленных

клеток: 5, 10, 15, 20 и 25. Каждая культура содержала 10 000 прикрепленных

клеток и соответствующее количество плавающих клеток – 50 000, 100 000,

150 000, 200 000 и 250 000 соответственно. Дополнительное контрольное

условие культивирования состояло из 100 000 плавающих клеток только для

имитации предыдущих сообщений о расширении SSC в мышиной модели без

добавления прикрепленных/соматических клеток после DP.

Клетки пассировали от P0 к P1 и от P1 к P2 каждые 14-18 дней в

соответствии со слиянием клеток. После P0 40 000 клеток во всех

соотношениях (за исключением культур, которые содержали меньшее

количество клеток) пассировали в P1, чтобы предотвратить смещение,

связанное с количеством. Все клетки пассировали от Р1 к Р2. В отличие от

установления P0, при котором количество клеток рассчитывали отдельно для

плавающих/зародышевых и прикрепленных/соматических клеток,

объединенные популяции клеток пассировали в P1 и P2. Эксперимент

заканчивали при потере большинства клеток в соотношениях 5 и 25 после Р2

(после 45-50 дней культивирования) и повторяли 6 раз.

Эксперимент 2: Использование повторяющегося DP при каждом

проходе

Условия культивирования P0 включали идентичные соотношения, как

описано в эксперименте 1. Однако в этих экспериментах мы повторяли DP при

каждом пассаже, чтобы поддерживать низкую плотность прикрепленных

клеток (<10 000 на культуру). DP проводили путем ночной инкубации на 12-

луночных планшетах, покрытых 0,2% желатином, с использованием

базальной среды SSC с 2% FBS – 1% Pen Strep + 1 мкл/мл гентамицина, как

описано выше. На следующее утро фракции плавающих и прикрепленных

клеток разделяли и подсчитывали. Было пассировано до 10 000

прикрепленных клеток. Что касается плавающих ячеек, постоянное число (40

000) между соотношениями было передано от P0 к P1, и все ячейки были

переданы от P1 и к P2. Следовательно, аналогично эксперименту 1, переход к

P1 включал постоянное количество клеток, чтобы сосредоточиться на

соотношении между фракциями клеток. В отличие от эксперимента 1,

эксперимент 2 включал отдельные количества плавающих и прикрепленных

клеток, основанные на вычислении при каждом проходе. Этот эксперимент

был повторен 3 раза.

Количественная оценка количества клеток и колоний

В ходе обоих экспериментов мы оценивали количество клеток,

используя два метода. Сначала мы подсчитывали клетки при каждом проходе,

используя автоматический счетчик клеток.

В то время как в эксперименте 1 мы подсчитывали и пассировали

объединенные фракции зародышевых и соматических клеток, в эксперименте

2 мы разделяли фракции плавающих и прикрепленных клеток и каждую из них

подсчитывали отдельно. Колонии, определенные как скопления из более чем

10 маленьких круглых клеток, были подсчитаны двумя независимыми

исследователями, не обращавшими внимания на соотношение клеток в каждой

чашке для культивирования.

Q-ПЦР

Клетки ресуспендировали в 350л буфера RL+0,1%β-меркаптоэтанола

и лизировали. Геномную ДНК разрезали, пропустив лизат через иглу весом 25

г. РНК очищали в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце,

перед загрузкой колонки к лизату добавляли 100% этанол для осаждения РНК..

Колонку, связанную с РНК, промывали, колонку высушивали для удаления

остаточного этанола, и РНК элюировали в 25л буфера для элюирования.

Концентрацию РНК оценивали с помощью NanoVue.

100 нг общей РНК использовали для предварительного усиления и

синтеза кДНК2с использованием набора для синтеза кДНК с предусилителем

RT 2 в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, геномная ДНК

была удалена и была синтезирована первая цепочка кДНК. Затем кДНК

амплифицировали с использованием праймеров RT2q-PCR для анализа SSC и

маркеров соматических клеток GFRa1 и GATA4 соответственно.

Q-ПЦР проводили с использованием 1л предварительно

амплифицированной кДНК, 2,5мкм праймеров и 12,5 мкл 2X RT2SYBR Green

FAST Mastermix. Условия циклирования составляли 95°C в течение 10 минут

для активации полимеразы, и 40 циклов при 95°C в течение 15 секунд и 60°C

в течение 1 минуты. Отрицательный контроль (без шаблона) использовали для

каждой пары праймеров, и все образцы анализировали в трех экземплярах.

Кривые плавления были получены для каждой реакции, чтобы обеспечить

специфичность праймера. Относительное изменение сгиба рассчитывали с

использованием метода 2–ΔΔCt с использованием GAPDH в качестве эталона.

Проточная цитометрия

Обогащение SSC оценивали с помощью проточной цитометрии для

GFRa1, хорошо известного маркера SSC мыши. Мы сравнили процент GFRα1-

позитивных клеток после дифференциального посева (до P0) и в оптимальном

соотношении 20 после P2. Клетки собирали в пробирки для проточной

цитометрии с добавлением 3% FBS–PBS (FACS-буфер). Добавляли первичное

кроличье антитело против GFR1a (1:100, Abcam, AB80126) с последующей 30-

минутной инкубацией при 4°C. После однократной промывки клетки

ресуспендировали в FACS-буфере, содержащем AlexaFluor-конъюгированный

козий анти-кроличий Alexa Fluor 488, инкубировали в течение 30 минут. После

одной промывки клеточные суспензии окрашивали йодидом пропидия (PI;

Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Неокрашенные клетки и клетки,

окрашенные только вторичным антителом, действовали как отрицательный

контроль. Анализ проводили на FACS Aria II-SC BRV в центре проточной

цитометрии Sickids-UHN.

Иммуноцитохимия (ICC):

Клетки переносили на предметные стекла и оставляли сушиться в

ламинарном потоке, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 минут

с последующей однократной промывкой PBS и хранили при 4°C до 2 недель.

Предметные стекла промывали 3 раза PBS, а затем пермеабилизировали в

течение 15 минут в 0,1% растворе Triton X и 1% бычьем сывороточном

альбумине, разведенном в PBS. Блокировку проводили в 5% нормальной

козьей сыворотке в 1% BSA –PBS в течение 1 часа при комнатной

температуре. Далее, добавляли первичные антитела, включающие кроличьи

анти-GFRa1 (1:200, Abcam, Ab8026), мышиные анти-UTF1 и кроличьи анти-

sox9, разведенные в 5% NGS-1% BSA –PBS, и инкубировали при 4 °C за ночь.

Контроль проводили в идентичных условиях, за исключением того, что

первичные антитела заменяли на 1% BSA –PBS. После трехкратной промывки

1% BSA –PBS клетки инкубировали со вторичными конъюгированными Alexa

Fluor555 козьими анти-кроличьими антителами и Alexa Fluor488-

конъюгированными анти-мышиными антителами, разведенными 1:500 в 5%

NGS – 1% BSA – ПБС. Были проведены три дополнительные промывки 1%

BSA – PBS с последующим добавлением Hoechst, разведенного 1:2000 в 1%

BSA – PBS в течение 3-5 минут. После трех промывок 1%–ным раствором BSA

- PBS смонтировали предметные стекла с использованием Permafluor и

покровного стекла. Слайды оценивали с помощью флуоресцентного

микроскопа. Микроскопический вид клеточной культуры был зафиксирован с

помощью камеры color SPOT RT.

Статистический анализ

Количество клеток и колоний, представленное в виде среднего ±

стандартных ошибок, сравнивали между соотношениями в каждом

эксперименте, а также между аналогичными соотношениями в экспериментах

1 и 2. Проводили ANOVA, и там, где наблюдались значительные различия,

выполняли post hoc анализ. Изменения в экспрессии генов и белков

анализировали с помощью t-критерия Стьюдента или односторонних тестов

ANOVA и множественного сравнения Бонферрони. Значения P <0,05

считались значимыми на протяжении всего анализа.

Результаты

Подсчет клеток и колоний во время культивирования

Эксперимент 1: Одиночный DP (S-DP):

Шесть культур со специфическим соотношением плавающих

/прикрепленных клеток были получены после DP (P0). Во время P0 количество

клеток уменьшилось на 40-60% по сравнению с количеством клеток с

покрытием. Количество клеток и колоний в конце P0 коррелировало с

начальным количеством клеток в каждом соотношении, поскольку

соотношения 5 и 25 содержали наименьшее и наибольшее среднее количество

клеток и колоний соответственно (рисунки 1A, 1B). Чтобы сосредоточиться на

влиянии соотношения клеток и избежать искажений, связанных с количеством

клеток, из каждой культуры пассировали постоянное количество клеток (40

000) от P0 до P1 во всех соотношениях, кроме соотношения 5, которое

содержало немного уменьшенное количество клеток. При P1 мы отметили

самую высокую пролиферацию в соотношении 20.

При P2 соотношения 15 и 20 демонстрировали самые высокие скорости

пролиферации, что отражается как в количестве клеток (338,000±165 000 и 336

700±31 800 соответственно), так и в количестве колоний (418,3±165,2 и

581,7±133,8 соответственно). Количество клеток и колоний в соотношении 20

было значительно выше по сравнению с соотношениями 5, 10, 25 и контролем

(р<0,05). Аналогичные достоверные различия наблюдались в соотношении 15

по сравнению с соотношениями 5, 10, 25 и контролем (р<0,05), за

исключением того, что увеличение количества колоний не достигло

статистической значимости по сравнению с соотношением 10. Колонии

наблюдались не только в большом количестве, но и имели однородный

внешний вид (рис. 1Е). Потеря клеток в экстремальных соотношениях 5, 25 и

контрольных культурах привела к тому, что мы прекратили эксперимент после

P2.

Эксперимент 2: Повторный DP во время каждого прохода (R-DP):

Количество клеток после P0 уменьшалось в зависимости от исходного

количества культивируемых клеток (30 700 ± 2600 плавающих клеток в

соотношении 5, 36 000 ± 15 800 в соотношении 10, 74 700 ± 1500 в

соотношении 15, 75 700 ± 18 700 в соотношении 20, 99 000 ± 23 000 в

соотношении 25 и 104 700 ± 37 900 в контрольных культурах). Количество

колоний коррелировало с количеством клеток и непрерывно увеличивалось с

соотношения 5 до 25. Одинаковое количество клеток переносили после

выполнения R-DP в P1 во всех соотношениях, чтобы предотвратить смещение,

связанное с количеством, включая до 10 000 прикрепленных клеток и 40 000

плавающих клеток. В конце P1 соотношение 15 включало наибольшее

количество клеток и колоний (97 000±800 и 41±7,5 соответственно), за

которым следовало соотношение 20 (72 700±6 800 и 35,3±10,7 соответственно)

по сравнению с более низкими и более высокими соотношениями, без

достижения статистической значимости. При P2 общее количество клеток и

колоний уменьшилось во всех соотношениях, сохраняя при этом тенденцию к

увеличению количества в среднем по сравнению с крайними соотношениями

(рисунок 1C, 1D).

Сравнение между S- и R-DP

Оба эксперимента привели к сходным выводам. Во-первых, поскольку

равные условия культивирования были установлены в P0, неудивительно, что

были обнаружены сопоставимые снижения количества клеток и количества

колоний в корреляции с начальным количеством культивируемых клеток в

конце P0. Во-вторых, первоначальная закономерность увеличения количества

средних коэффициентов 15 и 20 по сравнению с экстремальными

коэффициентами развивалась во время P1 и стала более заметной в P2. В то

время как показатели в P0 и P1 были одинаковыми, основные различия между

S- и R-DP возникли во время P2. В культурах S-DP количество клеток и

колоний резко увеличилось в средних соотношениях (особенно в соотношении

20, но также 15 и 10), в то время как низкое и высокое соотношение (5 и 25

соответственно) оставалось относительно постоянным, как и в P1. Напротив,

количество клеток и колоний в культурах R-DP снизилось во время P2, что

привело к значительным разрывам между экспериментами (рис. 1A-D).

Следовательно, более высокая пролиферация промежуточных соотношений

по сравнению с экстремальными соотношениями во время P2 наблюдалась в

обоих экспериментах, но достигла статистически значимого значения только

в культурах S-DP.

Характеристика ячейки

Чтобы исследовать обогащение SSC в культуре, мы провели q-ПЦР и

проточную цитометрию для GFRα1, одного из наиболее часто используемых

мышиных SSC-маркеров. Мы сосредоточились на условиях культивирования

S-DP, поскольку они дали нам наибольшее количество колоний. Как и

ожидалось, экспрессия GFRα1 после DP была значительно выше во фракции

плавающих клеток по сравнению с прикрепленными клетками (рис.2А). Более

того, экспрессия GFRα1 после P2 была значительно увеличена в соотношениях

15 и 20 (p<0,01) и 10 (p<0,05), но не было никакой разницы между крайними

соотношениями 5 и 25 по сравнению с контролем (рис.2B). Экспрессия

связанного с соматическими клетками маркера GATA4 была сходной после

DP в популяциях плавающих и прикрепленных клеток (рисунок 2C), в то

время как после P2 все соотношения показали значительно повышенную

экспрессию GATA4 (p<0,05) по сравнению с контролем, который не включал

прикрепленные клетки.

После этого мы сравнили долю GFRα1-позитивных клеток при P2 в

условии соотношения 20 эксперимента S-DP (который показал оптимальные

результаты) с популяцией плавающих клеток после DP в начале P0. Процент

GFRα1-позитивных клеток в соотношении 20 составил 25,8±5,8% по

сравнению с 1,9±0,7% во фракции плавающих клеток после DP (p<0,0001), что

представляет собой обогащение в 13,6 раза. В абсолютных цифрах, в то время

как исходная культура ratio 20 после DP включала в среднем 3771 GFRa1-

позитивных клеток, после P2 она содержала в среднем 87 204 GFRa1-

позитивных клеток, что в 23,1 раза больше. Это несмотря на намеренное

исключение большинства ячеек между P0 и P1, чтобы соответствовать

количеству переданных ячеек между соотношениями.

GFRa1 и UTF1 использовали в качестве маркеров SSC в дополнение к

маркеру, ассоциированному с клетками Сертоли, Sox9 использовали для

дальнейшей характеристики клеток с помощью иммуноцитохимии. При P2

кластеры клеток из соотношения 20 были положительными для обоих

маркеров SSC. Несколько клеток, окрашенных положительно на Sox9,

подтвердили существование поддерживающих клеток в пределах разрастания

клеток и колоний (рис. 4 и дополнительный рисунок 1).

Заключение

Сперматогенез зависит от межклеточных взаимодействий между

популяциями соматических и половых клеток. Сложное взаимодействие

внутри тестикулярной ниши включает факторы роста, обеспечиваемые

клетками Сертоли и интерстициальными клетками, в дополнение к

стимуляторам сосудистой сети, нацеленным на SSC. Уникальные

соединительные комплексы между SSC и клетками Сертоли образуются над

базальной мембраной благодаря активному цитоскелету, обеспечивая

метаболическую и иммунологическую поддержку половых клеток.

Расширение SSCin vitroимеет решающее значение, прежде чем дальнейшие

клинические применения для сохранения фертильности, такие как

аутотрансплантация илиin vitroсперматогенез in vitro с последующим ЭКО-

ИКСИ, могут стать реальностью. Хотя SSC можно значительно увеличить в

культуре и даже восстановить фертильность при трансплантации у грызунов

и крупных животных, долгосрочная пролиферация SSC с использованием

клеток человека остается сложной задачей.

Предыдущие исследования предложили различные системы

культивирования для длительного культивирования SSC у мышей, в основном

с помощью DP с последующим культивированием только плавающей фракции

(обогащенной для зародышевых клеток). Поскольку мышиные модели

являются общепринятыми инструментами для изучения новых концепций и

методологий, в текущем исследовании рассматривались инновационные

вмешательства для предотвращения чрезмерного роста соматических клеток,

что является основным препятствием для размножения SSC ex vivo. Мы

обнаружили, что тонкий численный баланс между соматическими и

зародышевыми клетками обеспечивает решающую поддержку соматических

клеток для зародышевых клеток, избегая при этом их чрезмерного роста.

Важность поддержки соматических клеток подчеркивается при сравнении

оптимальных соотношений 15 и 20 с контрольной культурой, которая

включала только плавающие клетки, как описано ранее. Используя DP,

простую методику обогащения клеток, обе клеточные фракции могут быть

легко разделены (хотя и недостаточно оптимально очищены) с последующим

посевом клеток в соотношениях, специфичных для культуры. Оптимальное

расширение клеток и колоний было достигнуто при промежуточных

соотношениях плавающих и прикрепленных клеток (10, 15 и 20) после DP. С

другой стороны, слишком низкие (5) или слишком высокие (25) соотношения

приводили к потере клеток после культивирования в течение 45-50 дней как в

S-, так и в R-DP экспериментах.

Превосходство промежуточных по сравнению с экстремальными

соотношениями было продемонстрировано не только количественно, но и

повышенной экспрессией GFRα1 и GRF1a-позитивных клеток. В частности,

соотношение 20 в эксперименте S-DP продемонстрировало оптимальную

пролиферацию клеток и количество колоний после P2, что привело к

значительному увеличению скорости пролиферации по сравнению с

контрольными условиями культивирования, которые содержали только

плавающие клетки. Более того, в то время как в предыдущих исследованиях

использовались препубертатные образцы, мы использовали взрослых мышей,

семенники которых содержат более низкую концентрацию SSC, подчеркивая

важность продемонстрированной пролиферации и очистки SSC.

Второй подход включал повторное ДП при каждом проходе, чтобы

контролировать и поддерживать низкое количество соматических клеток. В то

время как P0 и P1 приводили к сходному количеству клеток и колоний по

сравнению с набором культур S-DP, P2 характеризовался противоположными

тенденциями снижения и увеличения количества клеток и колоний в

культурах rec- и non-DP, соответственно. Такая разница может быть объяснена

чрезмерными манипуляциями с клетками, выполняемыми во время методики

R-DP. Интересно, что эксперимент с R-DP показал преимущество в

выживаемости в промежуточных соотношениях (в меньшей степени, чем в

культурах S-DP), несмотря на нарушение выживаемости клеток.

Сперматогенез млекопитающих демонстрирует несколько общих черт

между видами: а) важность самообновления SSC для сохранения пула SSC; б)

сперматогенез подразделяется на митотическую фазу, мейотическую стадию

и спермиогенез и; в) сложные межклеточные взаимодействия в тестикулярной

нише. Однако следует отметить фундаментальные различия между

сперматогенезом мышей и приматов, такие как продолжительность

сперматогенеза, количество митотических делений до начала мейоза и

маркеры. Используя человеческие образцы, наши первоначальные результаты

очень похожи и многообещающи. Мы обнаружили значительно более высокие

SSC-подобные агрегаты через 12 дней в конкретных совместных культурах с

соотношением плавающих / прикрепленных клеток по сравнению с одними

плавающими клетками.

Эти результаты подчеркивают важность соматической поддержки для

выживания половых клетокin vitro.

Однако, в отличие от мышиной модели, ДП с последующим

культивированием только плавающих половых клеток с клетками человека в

конечном итоге приводило к чрезмерному росту соматических клеток.

Это говорит о том, что добавление небольшого количества

прикрепленных клеток к плавающим клеткам при P0 может улучшить

первоначальную выживаемость зародышевых клеток, но, вероятно, в

конечном итоге приведет к чрезмерному росту соматических клеток. Поэтому

необходимо разработать дополнительные методы, чтобы ограничить пагубное

воздействие чрезмерного роста соматических клеток. По нашему мнению,

неудовлетворительный результат R-DP по сравнению с S-DP на мышиной

модели не должен препятствовать попытке изучить это на человеческих

образцах. Однако чрезмерные манипуляции и время, затрачиваемые на R-DP,

являются потенциальным недостатком этого вмешательства.

Текущее исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых,

поскольку мы прекратили культивирование после Р2 из-за потери клеток в

соотношениях 5 и 25, мы не смогли оценить влияние соотношения клеток при

более длительном культивировании. Во-вторых, текущее исследование не

включало анализ трансплантации зародышевых клеток для демонстрации

истинного фенотипа SSC в расширенных колониях.

Однако увеличение экспрессии РНК и белка GFRα1 (общепринятого

маркера SSC у мышей после P2 позволяет предположить, что мы добились

успешного обогащения, включая относительно высокую долю SSC в наших

колониях. Хотя текущее исследование дает многообещающие результаты, мы

намерены провести анализы трансплантации в будущих экспериментах, а

также более длительные культивирования клеток при оптимальных

соотношениях клеток 15 и 20, как было продемонстрировано в этих

экспериментах. В-третьих, поскольку мы выполнили ICC для колоний после

P2, чтобы продемонстрировать их обогащение SSC, клетки переполнены друг

другом, поэтому оптимальное различие между ядерной и мембранной

локализацией чрезвычайно сложно. Тем не менее, мы считаем, что текущие

результаты ICC, сопровождаемые QPCR и проточной цитометрией, дают

исчерпывающую картину обогащения SSC в наших специфических условиях

культивирования.

Насколько нам известно, это первое исследование влияния соотношения

плавающих и прикрепленных клеток после DP на пролиферацию SSC и

образование колоний. R-DP, по-видимому, менее эффективен по сравнению с

S-DP в этой модели взрослой мыши CD-1. Хотя соотношение 20 для S-DP, по-

видимому, является оптимальными условиями для in vitro генерации SSC-

подобных клеток in vitro, необходимы дальнейшие исследования, чтобы

оценить точное соотношение при более длительном культивировании, а также

при выполнении ксенотрансплантации. Перенос этих методик на человеческие

образцы может помочь оптимизировать in vitro экспансию SSC in vitro и, таким

образом, привести к новым стратегиям сохранения фертильности у мальчиков

до лечения рака и к потенциальным терапевтическим вмешательствам для

некоторых мужчин с серьезными нарушениями сперматогенеза.

Ссылки

Альберт, С., Вистуба, Дж., Эйлдерманн, К., Эмке, Дж., Шлатт, С.,

Громолл, Дж., & Коссак, Н. (2012). Сравнительный анализ маркеров после

выделения и культивирования тестикулярных клеток от незрелой

мартышки. Клетки Ткани Органы, 196(6), 543-554. doi: 10.1159/000339010

Шалмель, Ф., Ком, Э., Лавин, Р., Эрнио, Н., Тейшейра-Гомес, А. П.,

Даше, Дж. Л., и Пино, С. (2014). Интегративная стратегия omics для оценки

секретома зародышевых клеток и расшифровки перекрестных помех между

сертоли и зародышевыми клетками в семенниках млекопитающих. PLoS One,

9(8), e104418. doi: 10.1371/journal.pone.0104418

Конрад С., Азизи Х., Хатами М., Кубиста М., Бонин М., Хенненлоттер

Дж., ... Скутелла Т. (2014). Дифференциальное профилирование экспрессии

генов обогащенных сперматогоний человека после кратковременного и

длительного культивирования. Biomed Res Int, 2014, 138350. doi:

10.1155/2014/138350

Конрад С., Реннингер М., Хенненлоттер Дж., Визнер Т., Джаст Л., Бонин

М., ... Скутелла Т. (2008). Получение плюрипотентных стволовых клеток из

яичек взрослого человека, 456(7220), 344-349. doi: 10.1038/nature07404

Франка, Л. Р., Хесс, Р. А., Дюфур, Дж. М., Хофманн, М. К., и Грисволд,

М. Д. (2016). Клетка Сертоли: сто пятьдесят лет красоты и

пластичности. Андрология, 4(2), 189-212.: 10.1111/andr.12165

Гассей, К., Валли, Х., и Орвиг, К. Э. (2014). Комплексная

иммуногистохимия для изучения сперматогониальных стволовых клеток и

развития сперматогенной линии у мышей, обезьян и людей. Методы Mol Biol,

1210, 193-202. doi: 10.1007/978-1-4939-1435-7_15

Гонсалес, Р., и Добрински, И. (2015). За пределами мышиной

монополии: изучение мужской зародышевой линии на моделях домашних

животных. ИЛАР Дж., 56(1), 83-98. doi: 10.1093/ilar/ilv004

Хулейхель, М., Нурашрафеддин, С., и Плант, Т. М. (2015). Применение

трехмерных систем культивирования для изучения сперматогенеза

млекопитающих с акцентом на макаку-резус. Азиат Джей Андрол, 17(6), 972-

980. doi: 10.4103/1008-682X.154994

Изадьяр Ф., Вонг Дж., Маки К., Паччиаротти Дж., Рамос Т., Хауэртон

К., ... Копперман А. (2011). Идентификация и характеристика

репопулирующих сперматогониальных стволовых клеток из семенника

взрослого человека, 26(6), 1296-1306.