2 
 
Оглавление 
Введение ................................................................................................................................................... 3 
Введение ................................................................................................................................................... 3 
Материалы и методы .............................................................................................................................. 8 
Коллекцияизолятов . , . и. .................................................................................................................. 8 
Скринингизолятов . на устойчивость к фунгицидам  с использованием дискриминационной 
дозы ...................................................................................................................................................... 9 
Полное извлечение РНК ................................................................................................................... 10 
Синтез комплементарной ДНК, ОТ-ПЦР и секвенирование ........................................................ 11 
Влияние мутации 143 начувствительность .  кфунгицидам на борьбу с болезнями нута ....... 11 
Разработка мультиплексного анализа гидролизного зонда для выявления изолятов. ............... 14 
Результаты ............................................................................................................................................. 15 
Влияние мутации 143 начувствительность .  кфунгицидам........................................................ 15 
Обнаружение изолятов . , чувствительных к  и устойчивых к  (143). , с использованием 
мультиплексного гидролизного зонда ............................................................................................ 16 
Обсуждение ........................................................................................................................................... 17 
Ссылки.................................................................................................................................................... 22 
 
   

Введение

Аскохитоз (АБ) зернобобовых культур (нута, полевого гороха и

чечевицы) приводит к снижению урожайности в Монтане, где в 2016 году под

зернобобовые было засеяно 1,2 миллиона акров. Пираклостробин и

азоксистробин, фунгициды с внешним ингибитором хинона (), были выбраны

фермерами для борьбы с аскохитозом в зернобобовых. Однако сообщалось,

что мутация в гене цитохрома в придает устойчивость к фунгицидам . В общей

сложности было выделено и проверено на устойчивость к 990 изолятов

грибов, вызывающих гниль . Из них 10% приходилось на нут, 81% - на сухой

горох и 9% - на чечевицу. Они были получены в результате обследования

полей производителей и партий семян (нут = 17, горох = 131 и чечевица = 21)

из 23 округов Монтаны, отправленных в Региональную лабораторию

диагностики зернобобовых культур, Бозман, штат Монтана, для тестирования.

Устойчивыек фунгицидамизоляты были обнаружены в одной партии семян

нута, отправленных из округов Дэниелс, Маккоун и Вэлли, штат Монтана, из

семян, произведенных в 2015 и 2016 годах. Анализ множественного

выравнивания последовательностей кДНК и белка выявил мутацию, которая

изменила кодон аминокислоты 143 с на , введя аминокислотную замену с

глицина на аланин (143), что часто связано с резистентностью к . В тепличных

условиях устойчивые к изоляты.вызывали значительно большее количество

заболеваний, чем чувствительные изоляты на обработанных

пираклостробином растениях нута (-значение = 0,001). Эти результаты

свидетельствуют о том, что борьба с заболеванием может быть неадекватной

в местах, где присутствуют устойчивые изоляты.Наборы праймеров для

полимеразной цепной реакции, специфичные для . , и зонды были

разработаны для эффективного различения устойчивых к и чувствительных

изолятов

Ключевые слова: Фитофтороз ; пираклостробин; устойчивость к -

фунгицидам; мутация 143; анализ гидролизного зонда

Введение

Производство зерновых культур холодного сезона, включая нут ( .),

горох (.) и чечевицу ( ), на Северных Великих равнинах Соединенных Штатов

быстро растет. Монтана является ведущим производителем гороха и чечевицы

в США, где в 2016 году под зернобобовые было засеяно 1,2 миллиона акров

(Министерство сельского хозяйства США и Национальная служба статистики

сельского хозяйства за 2016 год). Однако увеличение производства

зернобобовых сопровождается потенциально снижающими урожай

болезнями. Главным среди этих заболеваний является аскохитоз (). Это

заболевание, специфичное для хозяина, вызываемое видами грибов, включая

() . ( () ) на нуте, комплексом видов, состоящим из ( ., 2016), и на сухом

горохе и , Ван и Роджерс (анаморф А. чечевица Васильевского) на чечевице

(Барилли идр., 2016). может поражать урожай растений на всех стадиях

развития и вызывать снижение урожая более чем на 40-50% в условиях,

благоприятных для развития болезни (, 2013; .,2011; и .,2005). Потери урожая,

вызванные , составляют порядка 40% у чечевицы ( ., 2016; и Госсен и Дерксен,

2003), но в тяжелых случаях сообщалось о потерях, превышающих 90% у нута

( ., 2016; и .,2005).. Симптомы АБ могут развиться на всех надземных частях

растения, а также вызвать гниль семян. переносится семенами и остатками. В

полевых условиях заболевание обычно начинается после цветения (стадия

роста 1) и заканчивается созреванием растения (стадия роста 8). Зараженные

семена из больных стручков могут быть маленькими, сморщенными или

обесцвеченными ( .,2011; и .,2000). В дополнение к семенам в качестве

источника инокулята,. ,. и .также могут зимовать в половых и / или бесполых

формах (псевдотеции, пикниды и перитеции соответственно), продуцируя

аскоспоры и конидии, которые могут рассеиваться и вызывать вспышки

заболеваний ( .,2011, ., 2008 и и , 2007).

Управление АБ требует комплексного подхода, включающего

использование сертифицированных семян, не подверженных болезням,

глубину посева, севооборот, захоронение растительных остатков

предыдущего сезона посадки для предотвращения перезимовки инокулята,

обработку семян фунгицидами, использование устойчивых сортов и

внекорневых фунгицидов ( .,2011). Использование устойчивых сортов и

культурных практик может снизить , однако устойчивые сорта не получили

широкого распространения на Северных Великих равнинах. Фунгициды

широко используются для достижения приемлемого уровня борьбы с

болезнями ( .,2015; и , 2007). Фунгициды широкого спектра действия

(хлорталонил) обычно применяются перед цветением и могут отсрочить

начало АБ; однако при появлении симптомов для производителя крайне важно

применять фунгициды, которые обеспечивают высокий уровень контроля и

выходят за пределы места применения в тканях растений из-за смыкания

кроны ( ,2015; .,2009; 2007; и ., 2006). Эта проблема усиливается у нута,

который более восприимчив к по сравнению с сухим горохом и чечевицей.

Таким образом, фунгициды часто применяются на полях с нутом и в

умеренных количествах на полях с горохом и чечевицей. Три

зарегистрированных класса фунгицидов, которые обеспечивают

превосходный уровень контроля для управления , включают ингибиторы

хинона вне (; Код 11 Комитета по борьбе с устойчивостью к фунгицидам ),

ингибиторы деметилирования (; код 3 ) и ингибиторы сукцинатдегидрогеназы

(; код 7 ) ( .,2015; и Берроуз, 2013). Считается, что все эти фунгициды имеют

высокий или средний риск развития устойчивости (Комитет действий по

борьбе с устойчивостью к фунгицидам 2016). Эта озабоченность усиливается

из-за специфичного для конкретного участка действия (МОА) фунгицидов,

полициклической природы заболевания, переносимых воздушно-капельным

путем спор возбудителей АБ и возможности полового размножения для

большинства видов, что обеспечивает быструю генетическую эволюцию.

Полициклический характер заболевания предрасполагает производителей к

повторному применению фунгицидов, поскольку тяжесть заболевания может

быстро возрасти при благоприятной погоде, особенно при АБ нута (Комитет

по борьбе с устойчивостью к фунгицидам, 2016; .,2015; и ., 2011).

В настоящее время из трех классов фунгицидов фунгициды выбирают

большинство производителей зернобобовых культур для борьбы с АВ до и

после заражения в Соединенных Штатах и Канаде ( .,2015; , 2016; ., 2013; и

.,2008). До 2007 года это был единственный доступный фунгицидный способ

действия на зернобобовые культуры, и устойчивость к нему быстро

развивалась в Северной Дакоте и Канаде (, 2016; , 2011; и , ., 2004). В 2012 году

были зарегистрированы для использования, и они в основном выпускались в

виде смесей с другим фунгицидом из-за высокого риска развития

резистентности.

Кроме того, предпочтение производителей фунгицидам для борьбы с

болезнями на полях возросло, когда Агентство по охране окружающей среды

США () одобрило использование пираклостробина (®) для улучшения

здоровья растений на этикетках федерального выпуска (, 2009). ., (2002)

сообщили о пользе -фунгицида для здоровья растений, который продлевает

налив зерна в урожае пшеницы. Кроме того, сообщалось, что фунгицид -

снижает скорость транспирации, а также снижает скорость старения растений

пшеницы (, ., 2014; и , ., 2012).

Этот фунгицид ингибирует митохондриальное дыхание путем

связывания с центром сайта хинина () комплекса цитохрома 1 (комплекс ) на

положительной стороне внутренней митохондриальной мембраны. Это

вызывает истощение аденозинтрифосфата (АТФ), что в конечном итоге

останавливает прорастание спор в результате дефицита энергии ( ., 2013;

.,2009; и .,2006). После регистрации пираклостробина в 2003 году он стал

наиболее широко используемым фунгицидом для борьбы с АБ в США и

Канаде как для обработки семян, так и для внекорневой подкормки (, 2013; и

., 2008).

Сообщалось о устойчивости к фунгицидам у патогенов пшеницы, таких

как. . , , и ( .,2012; .,2009; .,2003; и .,2000), и несколько других грибковых

патогенов, включая , , , , , , , и ( ., 2015; ., 2011; .,2009; .,2007; Авила-

Адамеи др.,2003; Маи др.,2003; Кими др.,2003; Гисии др.,2002; и Исиии

др.,2001). Кроме того, сообщалось о резистентности к у. в Северной Дакоте и

Канаде ( ., 2013; .,2009; и .,2004). Механизм устойчивости. был приписан

единичным аминокислотным заменам в белке цитохрома 1в комплекса

цитохрома 1 ( ., 2013). Существует два типа нечувствительности к

фунгицидам: количественная и качественная. Количественная

нечувствительность приводит к тому, что патоген становится менее

чувствительным к фунгициду, хотя более высокие дозы или большее

количество применений фунгицида все еще эффективны. Качественная

нечувствительность приводит к тому, что патоген становится полностью

нечувствительным к активному ингредиенту, и борьба с ним больше

невозможна в полевых условиях. Нечувствительность к стробилуриновым

фунгицидам, как правило, качественная ( ., 2016). В настоящее время в белке

цитохрома в грибковых патогенов растений обнаружены три аминокислотные

замены, которые придают различные уровни устойчивости к фунгицидам (

.,2013; и .,2006). Низкие уровни устойчивости обусловлены заменой

фенилаланина на лейцин в положении 129 (129) и заменой глицина на аргинин

в положении 137 (137), в то время как высокий уровень устойчивости

обусловлен аминокислотной заменой глицина на аланин в положении 143

(143). Изоляты, устойчивые к , имеют трансверсию от к на их, что привело к

точечной мутации с неправильным смыслом, которая заменила аминокислоту

из глицина на аланин в положении 143 (143). Устойчивые. к изоляты . были

идентифицированы в Северной Дакоте и Монтане ( .,2009; и .,2008), где

механизм устойчивости был идентифицирован как мутация 143 ( ., 2013).

Однако в Монтане не проводилось общегосударственное обследование для

мониторинга устойчивости к у зернобобовых культур. Существует

настоятельная необходимость в разработке надежной стратегии скрининга и

мониторинга устойчивости к , чтобы помочь предотвратить распространение

устойчивых к патогенов на быстро растущих посевных площадях в Монтане.

Таким образом, цели этого исследования состояли в том, чтобы 1) провести

обследование по всему штату, чтобы определить частоту и тяжесть АБ в

зернобобовых культурах в Монтане; 2) определить частоту устойчивости к

фунгицидам у патогенов АБ из нута, гороха и чечевицы; 3) определить

механизм устойчивости, связанный с -резистентные изоляты; и 4) разработать

надежный мультиплексный диагностический инструмент ПЦР в реальном

времени для скрининга и мониторинга устойчивости к .

Материалы и методы

Коллекцияизолятов . , . и.

Изоляты. , . и. были получены из четырех основных источников.

Большинство изолятов было получено из партий семян нута, полевого гороха

и чечевицы, представленных производителями из 23 округов Монтаны в

Региональную лабораторию диагностики зерновых культур () в Бозмене, штат

Монтана, для посадки в течение вегетационного периода 2014, 2015 и 2016

годов. Второй набор изолятов был получен с полей выращивания нута и

гороха в Монтане, где применялись фунгициды . Поля, содержащие растения

нута и гороха с симптомами аскохитоза, отбирались по схеме “”, причем

пробы отбирались с интервалом примерно в 15 м. Третья группа изолятов была

собрана с растений нута и гороха с симптомами аскохитоза, отобранных

производителями и отправленных в Диагностическую лабораторию Шуттера,

Бозман, штат Маунтин. Наконец, некоторые изоляты были также получены

благодаря любезности Джули Паше из Университета штата Северная Дакота,

Фарго, Северная Каролина.

Для стандартного теста семян семена (нута =600, сухого гороха =400 и

чечевицы =400) стерилизовали в 1% растворе свободного хлора в течение 10

минут (, 2017). Раствор сливали, а стерилизованные семена высушивали на

воздухе в биологическом шкафу в течение 30 минут. Высушенные семена (=10

на тарелку) высевали на картофельный декстрозный агар () ( ., Балтимор,

Мэриленд). Рост мицелия наблюдали из покрытых оболочкой семян после 11-

14 дней инкубации при 20°+/-1° в суточном цикле холодного белого

флуоресцентного света (12 ч света, затем 12 ч темноты). Наличие патогенов

было подтверждено микроскопическим наблюдением конидий при

увеличении ×40.

Из растений изоляты также получали из единичного поражения на

листьях и стебле с симптомами путем разрезания стеблей или листьев на 3-4-

сантиметровые срезы. Срезы стеблей или листьев помещали в 1% на 30 с и

промывали в течение 30 с в стерильной дистиллированной воде.

Стерилизованные срезы стеблей или листьев высушивали на воздухе в

биологическом шкафу, помещали на КПК и инкубировали в условиях,

описанных выше. Подтверждение наличия возбудителя проводилось, как

описано ранее. Конидии отдельных изолятов из зараженных партий семян (=5-

10) и из листьев или стеблей с симптомами инкубировали на КПК в условиях,

описанных ранее. Для выделения отдельных спор три пикнидии из 10-дневной

культуры помещали в пробирки с завинчивающимися крышками объемом 2

мл ( ), содержащие пять керамических шариков ( ), 300 мкл стерильной воды

и 0,05% (в/в) твин-20. Смесь гомогенизировали с использованием

гомогенизатора (Эталонный гомогенизатор ) в течение 60 секунд при 4000

об/мин. Супернатант удаляли в чистую пробирку эппендорфа объемом 1,5 мл

и разводили в 100 раз в стерильной воде. Из разбавленной суспензии 100 мкл

инокулировали на свежие планшеты и инкубировали при 20°+/-1° в суточном

цикле холодного белого флуоресцентного света (12 ч света, затем 12 ч

темноты). Единичные споры прорастали через 3-5 дней после инокуляции.

Изоляты сохраняли для длительного хранения в виде конидий на стерильной

фильтровальной бумаге, а также в виде мицелия в 15% стерилизованном

глицерине при -80°. (Скоглунди др.,2011)

Скринингизолятов . на устойчивость к фунгицидам с использованием

дискриминационной дозы

В общей сложности 984изолята были подвергнуты скринингу на

устойчивость к . Из них 10% были из нута, 81% из сухого гороха и 9% из

чечевицы из партий семян (нут = 17, горох = 131 и чечевица = 21),

представленных в из 23 округов Монтаны (таблица 1). Скрининг изолятов

проводили с использованием метода на агаровых планшетах в соответствии

с опубликованными методами ( и др., 2008) с некоторыми изменениями.

Исходные растворы технических препаратов пираклостробина (активность

99%; Корпорация , Исследовательский треугольный парк, Северная Каролина)

готовили при концентрации 5 мкг/мл и разводили в ацетоне.

Салицилгидроксаминовую кислоту (; -) растворяли в метаноле и добавляли ко

всем средам с добавлением фунгицидов в концентрации 100 мкг/мл, чтобы

минимизировать эффекты альтернативного окислительного пути, который

некоторые грибы используют для преодоления токсичности фунгицидов в

анализах чувствительности к фунгицидам ( .,2009; .,2008; и .,2002; и ., 1999)..

и другие патогены способны использовать этот альтернативный путь в

присутствии фунгицидов , и было установлено, что не оказывает влияния на

прорастание конидий ( др.,2008). Обработка 0 мкг/мл служила контролем и

была дополнена 100 мкг/мл ШАМА, 1 мл ацетона и 1 мл метанола на литр.

В дополнение к методам с агаровым планшетом, изоляты подвергали

скринингу с использованием ПЦР-анализа на мутацию с амплификацией

несоответствия (-) ( ., 2013). Этот анализ на основе ПЦР был разработан для

выявления изолятов. дикого типа,несущих аллель 143

генацитохрома.Изоляты, у которых рост мицелия составлял 70% от

контрольного планшета (без фунгицида пираклостробина) и которые также

были амплифицированы с помощью -, отбирали для экстракции общей РНК.

Отобранные изоляты культивировали на при 22° в течение 7 дней при 12-

часовом освещении.

Полное извлечение РНК

Общую РНК выделяли с использованием () с модификациями в

начальном процессе. Свежий грибной мицелий из каждого изолята (100 мг) из

7-дневной культуры переносили в пробирки с завинчивающимися крышками

объемом 2 мл ( ), содержащие 450 мкл -буфера. Мицелий разрушали с

помощью настольного гомогенизатора ( ), установленного на скорости 3500

об/мин в течение 60 с, и центрифугировали при 13 000 в течение 1 мин. Затем

около 400 мкл лизата переносили на вращающуюся колонку , помещенную в

пробирку для сбора объемом 1,5 мл. С этого момента протокол продолжался в

соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК определяли

количественно с использованием 2000 при 260 нм ( ) и доводили до конечной

концентрации 100 нг/мкл.

Синтез комплементарной ДНК, ОТ-ПЦР и секвенирование

Комплементарную ДНК с первой цепью (кДНК) синтезировали с

использованием набора -обратной транскриптазы ( ). кДНК использовали в

ПЦР-анализе для амплификации кодирующей последовательности для

аминокислотных кодонов 127-276 генацитохрома в() из. , сообщалось, что в

этой области имеются точечные мутации, которые придают устойчивость к

фунгицидам ( ., 2013; и .,2002).

Стандартную ПЦР проводили в термоциклере 100 (- .) с ПЦР высокой

точности , по 10мкл каждого праймера ( ., 2013) и 50 нг матрицы кДНК в

конечном объеме 50 мкл. Условия реакции были: 94° в течение 5 мин, затем

35 циклов при 94° в течение 30 с, 55° в течение 1 мин и 72° в течение 1 мин.

ПЦР завершали удлинением ДНК при 72° в течение 5 мин. Продукты ПЦР

разделяли на окрашенные бромистым этидием 1,5% (в/в) агарозные гели,

помещенные в 1 трис-ацетат-ЭДТА-буфер, и подвергали воздействию

ультрафиолетового света для визуализации фрагментов ДНК. Изоляты с

ожидаемым продуктом 675 п.н. очищали непосредственно от продуктов ПЦР

с использованием спиртового осаждения. Очищенные продукты ПЦР

секвенировали с помощью праймеров, используемых для амплификации

(таблица 2), в обоих направлениях ( ).

Влияние мутации 143 начувствительность . кфунгицидам на борьбу с

болезнями нута

Были проведены тепличные испытания для определения уровня

контроля заболеваний , достижимого с помощью фунгицидов против

изолятов, классифицированных как чувствительные или устойчивые к

фунгицидам , на основе результатов секвенирования.. В исследование были

включены пять чувствительных к изолятов . (-405, -407, -419, -439 и -430) (,

2008) и пять устойчивых к изолятов (от -001 до -005) (таблица 5). Пять

устойчивых к изолятов были выделены из одной партии семян нута,

представленной в для тестирования семян, пять чувствительных к изолятов

были из исходной популяции ( .,2015).Чувствительность к этих пяти изолятов

определяли с помощью с поправками на пираклостробин, ПЦР и

мутационного анализаихгена .

Эксперименты в теплице были проведены в соответствии с . (2005, 2004)

и ., 2009. Вкратце, семена нута (. ), полученные от Ассоциации по улучшению

урожая штата Вашингтон () и протестированные на отсутствие , высевали по

одному растению на горшок в пластиковые колбочки объемом 80 мл,

наполненные смесью торфа и 1 ( ., Бельвью, Вашингтон) при соотношение

1:1 и выращивают при температуре 22 ±2°. Через 10-14 дней после посадки

растения нута обрабатывали коммерческими препаратами пираклостробина (,

2,09 ; ) в концентрациях 0, 0,1, 1,0, 10 и 100 мкг а.в./мл воды. Фунгициды

наносили на сток2- с помощью гусеничного опрыскивателя поколения,

работающего на 2 ( , США). Примерно через 24 ч после применения

фунгицидов растения инокулировали. конидиальными суспензиями . ,

приготовленными из 14-дневных культур отобранных чувствительных и

устойчивых изолятов. Суспензии доводили до концентрации 3×105конидий/мл

и наносили на растения нута в течение часа после приготовления. Инокулят из

каждого изолята наносили на растения с помощью ручных распылителей.

Растения нута помещали в камеру для запотевания и выдерживали при

относительной влажности >90% в течение 36 ч при 14-часовом фотопериоде

при искусственном освещении, прежде чем поместить на скамейки в теплице.

Через 11 дней степень тяжести заболевания растений оценивали визуально как

процент пораженной площади листьев от всего растения (, 1984). Эксперимент

был разработан как рандомизированный полный блок (). В каждый

эксперимент было включено девять повторов, и тяжесть заболевания была

рассчитана для каждой единицы наблюдения. Процент контроля заболевания

рассчитывали следующим образом: 1 – (% пораженной ткани/% заболевания

на контроль 0 мкг/мл) ×100 ( ., 2009). Однородность отклонений от результатов

двух тепличных экспериментов определялась с помощью теста Левена на

однородность дисперсии. Данные были преобразованы в процент контроля

заболевания, чтобы облегчить прямое сравнение между чувствительными и

устойчивыми изолятами при каждой концентрации фунгицида, и

проанализированы с использованием обобщенной линейной модели

смешанных эффектов в статистическом пакете .

Разработка мультиплексного анализа гидролизного зонда для выявления

изолятов.

Для одновременного выявления и дифференцировки устойчивых к.

изолятов, несущих мутацию 143, от чувствительных изолятов, была

разработана пара праймеров (243 и 244) и два гидролизных зонда (245 и 246)

для мультиплексного ПЦР-анализа в реальном времени для амплификации

фрагмента92гена (таблица 2). 5’-концы зондов 245 и 246 были помечены 6-

карбоксифлуоресцеином () и цианином 5 (5), в то время как их 3’-концы были

помечены гасителем - и - соответственно. Праймеры были разработаны для

фланкирования области мутации 143, в то время как два флуорогенных

красителя обеспечивают мультиплексную дифференцировку между

устойчивыми и чувствительными аллелями. Для повышения эффективности

зондов оба зонда были сконструированы так, чтобызначения были по

меньшей мере на 7° выше (69 и 69°), чем у праймеров (62°), и их содержание

было выше 45%. Мультиплексный анализ оптимизировали в конечном объеме

20 мкл, содержащем 0,05 Ед/мклДНК-полимеразы, реакционный буфер, 4 мМ

2, 0,4 мМ каждого ( , ), 25 мкм каждого праймера (243, -244), 10 мкм каждого

зонда (-245, -246) и 3 мкл экстракта ДНК. Параметры циклирования

составляли 4 минуты при 94°, затем 35 циклов по 15 секунд при 94° и 30 секунд

при 64° и окончательное продление при 72° в течение 5 минут завершали ПЦР.

Праймеры и зонды были синтезированы с помощью (Айова, США). Анализ

был разработан, оценен и проанализирован с помощью системы ПЦР-

детекции 96 в режиме реального времени (- , ., Геркулес, Калифорния).

Способность разработанного анализа была дополнительно исследована

путем скрининга изолятов. ,. и других видов грибов, которые, как сообщалось,

содержат мутацию 143, такую как . Для этого эксперимента использовали 100

нг ДНК каждого из видов, изоляты каждого вида реплицировали один раз в

анализе. -резистентные и чувствительные. изоляты . использовали в качестве

положительного контроля, и в анализе использовали указанные выше

параметры циклирования. Кроме того, оценка эффективности анализа

определялась путем построения графиков пороговых значений цикла для

серии десятикратных разведений 1000 нг ДНК, полученных из

чувствительных и устойчивых изолятов, в зависимости от концентрации ДНК

для получения стандартных кривых. Результат экспериментов в

мультиплексном анализе сравнивали с униплексным анализом с

использованием десятикратных разведений от 1000 нг до 1 мкг экстрактов

ДНК только из изолятов, которые содержали мутацию 143.

Результаты

Анализ множественного выравнивания последовательностей кДНК и

белка генацитохрома визолятов, устойчивых к , выявил мутацию, которая

изменила кодон аминокислоты 143 с на , введя аминокислотную замену с

глицина на аланин (143) (рисунок 1). Другие известные мутации не были

обнаружены в белковых последовательностях наших устойчивых к изолятов,

таких как изменение с фенилаланина на лейцин в положении 129 (129) и

изменение с глицина на аргинин в положении 137 (137).

Влияние мутации 143 начувствительность . кфунгицидам

Независимый анализ экспериментов по борьбе с болезнями в теплицах

определил, что отклонения были однородными, и два эксперимента были

объединены для дальнейшего анализа (-значение =). Тяжесть заболевания

была значительно выше на растениях, инокулированных мутантными

изолятами 143, при всех концентрациях пираклостробина, включая

необработанный контроль (0 мкг/мл); поэтому процент контроля заболевания

от необработанных был рассчитан для прямого сравнения двух групп

изолятов. Были получены убедительные доказательства разницы в

процентном контроле заболевания при взаимодействии мутантов. 143 и

изолятов . дикого типа и фунгицида пираклостробина (-значение < 0,001).

Были также получены данные о различии в процентном контроле заболевания

у растений нута, инокулированных мутантами 143, иизолятов . дикого типас

увеличением концентрации фунгицида пираклостробина (-значение< 0,001).

Контроль над заболеванием мутантных изолятов 143 был значительно

снижен при обработке пираклостробином по сравнению с изолятами дикого

типа при всех концентрациях фунгицида (-значение < 0,001). (Рис. 3). Около

75% контроля над заболеванием наблюдалось при 10 и 100 мкг/мл у изолятов

дикого типа, в то время как <25% контроля над заболеванием наблюдался у

мутантных изолятов 143.

Обнаружение изолятов . , чувствительных к и устойчивых к (143). , с

использованием мультиплексного гидролизного зонда

С помощью анализа удалось обнаружить мутацию 143 и провести

различие между устойчивыми к и чувствительными к изолятами. можно

было бы отличить, используя специфические зонды, в которых нуклеотид,

ближайший к 3’, комплементарен одному аллелю, но образуется как

несоответствие со вторым аллелем. Температура отжига была подтверждена в

анализе температурного градиента, оптимальная температура отжига

составляет 64° как для мультиплекса, так и для униплекса (данные не

показаны). Оптимальная концентрация праймеров и зондов, которые давали

самую высокую репортерную флуоресценцию и самый низкий пороговый

цикл, составляла 20 и 10 мкм соответственно в обоих тестах. Чтобы

подтвердить, что анализ может одновременно обнаруживать два аллеля, ДНК

из изолятов дикого типа (чувствительных к ) и мутантных (устойчивых к )

смешивали в одинаковой пропорции. Удовлетворительная дискриминация

была достигнута между двумя аллелями (рис. 5 и 5). Стандартные кривые

были построены на основе серии десятикратных разведений изолятов дикого

типа и мутантных изолятов (рис. 4). Была подтверждена линейность

амплификации во всех разведениях, и коэффициенты корреляции для

стандартных кривых ДНК чувствительных и резистентных изолятов

составили 0,998 и 0,991 соответственно (таблица 4).

Анализ также был подтвержден с использованием других грибов из того

же рода,что и . , таких как. и. , а также других грибов, о которых сообщалось,

что они имеют мутацию 143, включая . Для всех протестированных

чувствительных видов грибов наблюдалась только амплификация в

чувствительном зонде. Кроме того, надежность анализа была подтверждена с

использованием ДНК, грубо экстрагированных из. , . , . и . , только

контрольный образец имел амплификацию от двух зондов, а другие виды

грибов имели амплификацию только от чувствительного зонда, показывая, что

изоляты были чувствительны к , а изоляты комбинация праймера и зонда

работала на этих видах грибов (таблица 6).

Обсуждение

Основываясь на наших результатах, точечная мутация 143 отвечает за

устойчивость к фунгицидам. у изолятов . с полей нута Монтаны. Генная

структура генацитохрома в. , по-видимому, благоприятна для развития

точечной мутации, связанной с устойчивостью к в кодоне 143 ( ., 2013).

Напротив, мутация 143 не была обнаружена у видов грибов, которые имеют

интрон ниже кодона 143 ( ., 2015; ., 2013; ., 2011; ., 2009; ., 2007; и др., 2006).

Таким образом, эта структура гена цитохрома в не была связана с

возникновением резистентности к . Например, такие виды грибов, как , не

проявляют мутации 143, потому что сайт 5’-сплайсинга смертельно поражен

соседними экзонными фланкирующими последовательностями ( ., 2013; .,

2009; ., 2007; ., 2006; ., 2005; Ламбовиц и Белфорт, 1993). Однако сообщалось,

что мутация 143 ответственна за устойчивость к фунгицидам у , возбудителя

пятнистости листьев лягушачьего глаза сои ( ., 2015) и у ,возбудителя серой

плесени ( ., 2011). Фунгициды не контролируют грибы, несущие мутацию 143,

в то время как те, которые содержат 129 и 137, контролируются в некоторой

степени, но на более низком уровне, чем изоляты дикого типа. Наши

результаты аналогичны исследованию в Северной Дакоте ( ., 2013, и ., 2009),

где механизм устойчивости устойчивых. к изолятов . был связан с мутацией

143 в гене цитохрома .

Устойчивость к фунгицидам наблюдалась у изолятов. , собранных в

Монтане в течение вегетационных сезонов 2012 и 2015 годов (Берроуз, данные

не показаны). До этого в 2009 году были зарегистрированы устойчивые к

изоляты с полей нута в Северной Дакоте ( ., 2009), и они в значительной

степени сохранялись в популяции ( ., 2013). Как по результатам тестирования

семян, так и по текущему полевому обследованию полей Монтаны, частота

устойчивых изолятов пока невелика (. , личное сообщение, март 2016 г.). Это

отличается от сообщения о высокой частоте устойчивых к изолятов в

Северной Дакоте ( ., 2013; ., 2009). Это может быть связано со сравнительно

низкой относительной влажностью и прогрессированием заболеваний в

Монтане по сравнению с Северная Дакота. Уровень относительной влажности

в Северной Дакоте на 12,1% выше, чем в Монтане (, 2015). Хотя это

исследование было нацелено на нута, полевого гороха и чечевицы, было

подтверждено, что только 11 изолятов. из трех партий семян из 88 изолятов из

17 партий семян устойчивы к пираклостробину и содержат мутацию 143,

которая придает устойчивость ко всем фунгицидам . Частота устойчивости к

у. может возрасти, поскольку, судя по наблюдениям в течение 2016 года

урожая и свидетельствам производителей, существует потенциал для

увеличения посевных площадей нута и многократного применения

фунгицидов для предотвращения потенциальных грибковых атак. Многие из

этих применений были продуктами исключительно и в сочетании либо с

хлорталонилом, либо с фунгицидами , такими как (). Продолжение практики

многократного применения фунгицидов, включая продукты высокого риска,

такие как фунгициды и , приведет к развитию устойчивости. Эти активные

ингредиенты доступны в качестве средств для обработки семян и внекорневой

подкормки. Несмотря на то, что обучение ведется, решения о применении

фунгицидов часто определяются ценой и эффективностью продукта в большей

степени, чем способом действия.

В отличие от нута, поля сухого гороха и чечевицы редко обрабатывают

фунгицидами. Это связано с низким уровнем заболеваемости листьями в

Монтане на сегодняшний день. С тех пор как в 2000 году в Монтане было

начато тестирование семян, процент партий семян, в которых по крайней мере

одно семя из 500 было заражено , увеличился с 0% (2000-2002 годы) до <25%

в течение 2009 года. Начиная с урожайного 2010 года, количество партий

семян с содержанием по крайней мере следовых уровней в семенах превысило

60%, а в 2017 году достигло 80%. На сегодняшний день мы не наблюдали

устойчивости к у патогенов , выделенных из партии сухих семян гороха и

чечевицы. Это коррелирует с низкой частотой применения фунгицидов на

горохе. Аналогичным образом, чечевица часто не получает никакой обработки

семян фунгицидами или внекорневой подкормки, особенно на недавно

засеянных площадях.

Различия в контроле над заболеванием наблюдались при применении

пираклостробина к растениям нута, зараженным устойчивыми к и

чувствительными. к изолятами . . Применение пираклостробина в

концентрации 100 мкг/мл обеспечивало менее 25% контроля заболевания на

растениях, зараженных изолятами, устойчивыми к . Такой уровень контроля

коммерчески неприемлем. Наблюдались четкие различия в тяжести

заболевания между изолятами, чувствительными к , вызывающими меньше

заболеваний на обработанных фунгицидами растениях нута по сравнению с

изолятами, устойчивыми к , использованными в исследовании. Хорошо

известно, что устойчивость к у полевых изолятов нескольких патогенов

растений, связанная с заменой 143 в, не влечет за собой затрат на

приспособление ( ., 2014; ., 2011; - ., 2003; и ., 2001). Однако, после

установления устойчивости, вероятно, сохранится в популяции из-за

селективного преимущества, если фунгициды будут продолжать

применяться. Это отсутствие контроля над болезнями у изолятов, устойчивых

к , подтвердило отчет из Северной Дакоты ( ., 2009), где <50% контроля над

болезнями было достигнуто при применении пираклостробина в дозе 100 мкг

/ мл к растениям нута, зараженным изолятами, устойчивыми к . В свете этого

мониторинг устойчивости к у патогенов , заражающих зернобобовые

культуры, важен для предотвращения образования устойчивых популяций.

Из-за широкого распространения патогенов на семенных партиях в Монтане

благоприятные условия окружающей среды, вероятно, приведут к

широкомасштабной эпидемии патогена. Частое применение фунгицидов в

этих условиях приведет к образованию устойчивых изолятов, и тогда

потребуются дополнительные стратегии управления для борьбы с

устойчивыми к фунгицидам патогенами . Хотя имеется множество

ограниченных исследований по профилактике и борьбе с устойчивостью к

фунгицидам. Различные стратегии борьбы с болезнями могут значительно

снизить присущий патогену-мишени риск устойчивости к фунгицидам. Риск

можно снизить, ограничив количество применений фунгицидов на одном

участке с одинаковым действием, чередуя фунгициды с различными

биохимическими способами действия или используя синергические

комбинации фунгицидов. Этот подход был очень эффективен в борьбе с

устойчивыми к фунгицидам штаммами и при болезнях дерновой травы (,

2003 и 2002).

Разработка устойчивых к изолятов в эпицентре производства

зернобобовых в Монтане может вызвать значительные проблемы для отрасли,

которая в 2016 году занимала 1,2 миллиона акров и оценивалась в 176

миллионов долларов. Чтобы сдержать распространение -устойчивости,

мониторинг является ключевым фактором. Инструменты на основе ПЦР,

подобные разработанному в этом исследовании, необходимы для мониторинга

изменения чувствительности к фунгицидам полевой популяции грибковых

патогенов. Кроме того, нехимические методы управления, такие как

севооборот, обработка почвы для захоронения зараженных остатков и

устойчивость хозяина (если таковая имеется), могут помочь снизить риск

устойчивости к фунгицидам ( ., 2015). Кроме того, следует соблюдать

осторожность при применении внекорневых фунгицидов по причинам,

отличным от борьбы с болезнями, ограничьте количество применений

фунгицидов от двух до четырех за сезон, как указано на этикетке. Делайте

профилактические аппликации, чтобы поддерживать давление при

заболевании на низком уровне. Ограничьте количество последовательных

применений фунгицида стробилурина одним или двумя, как указано на

этикетке, перед чередованием с фунгицидом из другой группы действия,

используйте предварительные смеси или баковые смеси фунгицидов

стробилурина с фунгицидами из другой группы действия. Следует

использовать минимальные маркированные нормы каждого фунгицида в

баковой смеси (, 2009). Несоблюдение вышеперечисленных рекомендаций

окажет дополнительное селекционное давление на. и другие потенциальные

грибковые патогены, что, следовательно, потребует продолжения

мониторинга грибковых патогенов на устойчивость к фунгицидам высокого

риска.

Было разработано и использовано несколько молекулярных методов для

выявления устойчивости к на основе наличия мутации 143. Целью

большинства из этих методов является качественная идентификация

полиморфизма, и они включают аллель-специфичную ПЦР, ПЦР- и тесты , в

то время как количественные методы, такие как аллель-специфичная ПЦР в

реальном времени, были разработаны для ограниченного числа патогенов ( .,

2015 и и др., 2011). ПЦР-анализ в режиме реального времени повышает

производительность при скрининге изолятов на чувствительность к по

сравнению с обычным тестом с использованием модифицированных

фунгицидами -пластин. Этот тест занимает от 7 до 10 дней, чтобы получить

результат, в дополнение к логистике, необходимой для скрининга нескольких

изолятов. В настоящем исследовании была разработана и успешно применена

система ПЦР в реальном времени на основе химии для мультиплексного

выявления чувствительных к и устойчивых к изолятов. , . и. к изолятам,

собранным в разных географических точках по всей Монтане. Гидролизные

зонды были сконструированытак, чтобы значения были по меньшей мере на

7° выше (69 и 69°), чем у праймеров (62°), а их содержание было выше 45%,

что повышало специфичность анализа при обнаружении и дифференциации

чувствительных аллелей от устойчивых. Анализ имеет потенциал для

мониторинга устойчивости к у., таким образом, он может служить

инструментом для мониторинга устойчивости к у других грибковых

патогенов, а также для рутинного скрининга грибковых изолятов в

диагностических лабораториях. Кроме того, этот метод подходит для будущих

исследований, направленных на определение изменений частоты аллелей 143

и 143, а также для определения конкурентной способности устойчивых к и

чувствительных к изолятов грибковых патогенов.

В заключение, это исследование было успешным в обнаружении

наличия устойчивых. к изолятов . , охарактеризовало механизм устойчивости

и разработало диагностический инструмент для определения устойчивости к

у. ,который обеспечит высокую пропускную способность и эффективный

скрининг мутантов 143. Другие исследователи добились успеха в разработке

молекулярного метода для выявления мутации 143 (, 2013). Это качественный

анализ, который нельзя использовать для мониторинга частоты аллелей 143 и

143 как в отдельных изолятах, так и в смешанных полевых популяциях.

Анализы, представленные в этом исследовании, упрощают весь процесс

обнаружения, уменьшая необходимость в манипуляциях до и после

амплификации, таких как гель-электрофорез и использование бромистого

этидия или других токсичных соединений, и, следовательно, требуют участия

персонала. Этот процесс может быть связан с крупномасштабными

исследованиями, а также с высокопроизводительной идентификацией

устойчивых изолятов к фунгицидам . Кроме того, этот метод может быть

использован в будущих исследованиях, направленных на определение

изменений частоты аллелей 143 и 143 как в отдельных изолятах, так и в

смешанных полевых популяциях. ,а также конкурентной способности

устойчивых к и чувствительных к изолятов патогена.

Ссылки

(2009). Фунгицид ® от получил одобрение для маркировки здоровья

растений. Онлайн-публикация. ://..// Фунгицид® от получил одобрение для

маркировки здоровья растений 200062/

Аманд, О., Калай, Ф., Кокиллар, Л., Легат, Т., Бодсон, Б., Моро, Дж.-М.

и Марайте, Х. (2003). Первое обнаружение устойчивости к фунгицидам у на

озимой пшенице в Бельгии. . Агрик. Приложение. Биол. науки. 68, 519-531

Авескам, М. М., Грюйтер, Дж. де., Вуденберг, Дж. Х. К., Веркли, Дж.

Дж. М. и Крус, П. В. (2010). Основные моменты: многофазный подход к

характеристикеи родственных плеоспоральных родов. Микол. 65: 33 (2010)

Авила-Адаме, С., Олайя, Г. и Коллер, У. (2003).

Характеристика изолятов , устойчивых к фунгицидам , связанным со

стробилурином. Заводской Дис. 87:1426-1432

Авила-Адаме, К., и Келлер, В. (2003). Характеристика спонтанных

мутантов , выражающих стабильную устойчивость к ингибирующему

фунгициду азоксистробину. Карр. Генет. 42:332-338

Банниза, С., Армстронг-Чо, К. Л., Ган, Ю. и Чонго, Г. (2011) Оценка

эффективности фунгицидов и частоты применения для борьбы с аскохитозом

в нуте. Канадский журнал патологии растений,33:2, 135-149,

Банно, С., Имашита, К., Фукумори, Ф., Окада, К., Уекуса, Х., Такагаки,

М., Кимура, М., Фудзимура, М., (2009). Характеристика устойчивости к у и

идентификация двух типов митохондриального гена цитохрома . Патол.

растений. 58, 120-129.

Барилли, Э.; Кобос, М. Дж.; и Рубиалес, Д. (2016). Уточнение по

спектрухозяев ,возбудителя фитофтороза гороха . Спереди. Наука о

растениях. 7:592.

Боунесс Р., Госсен Б. Д., Чанг К.Ф., Госвани Р., Вилленборг К. Дж.,

Хольц М. и Стрелков С. Е. (2016). Чувствительность к фунгициду

пираклостробину. Заводской дис. 100:192-199.

Берроуз, М. (2013). Комплексная борьба с вредителями высоких равнин:

внекорневые фунгициды для импульсных культур. Онлайн-публикация. ://../

Чен, К., Цзян, Дж.Р., Чжан, Г.З., Цай, Л., Крус, П.В. (2015). Разгадка

загадки Фомы. Исследования в области микологии. 82:137-217

Чилверс, М. И., Роджерс, Дж. Д., Дуган, Ф. М. идр.(2009). . ., телеоморф

. Микологические исследования 113: 391-400

Чин, К. М., Чавайлаз, Д., Кэсборер, М., Штауб, Т. и Фельзенштейн, Ф. Г.

(2001). Характеристика риска резистентности . . к стробилуринам. Прибыль

от урожая. 20:87-96.

Климатические изменения (2015). ://...//-.

Коуч, Х. Б. (2003). Управление полем для гольфа. Май. 71(5): стр. 111-

115

Коуч, Х. Б. (2002). Управление полем для гольфа. Ноябрь. 70(11): с. 89-

93.

Дамиконе, Дж. и Смит, Д. (2009). Управление устойчивостью к

фунгицидам. Кооперативная служба распространения знаний штата

Оклахома. ЭПП-7663

Дэвидсон, Дж.А. и Кимбер, Р. Б. Э. (2007). Комплексное лечение

болезней, вызванных аскохитозом в зернобобовых культурах.. . Патоген

растений. 119:99-110.