Важность наличия грибов для саженцев орхидей

  Содержание Введение 3 Материал и методы 5 Статистический анализ 8 Результаты 12 Обнаружение Tulasnella и описание грибкового сообщества 15 Грибок 18 Структура грибкового сообщества 20 Обсуждение 22 Выводы 24 Ссылки 25   Введение Ожидается, что совместное появление и обилие подходящих микоризных грибов будут важными факторами для создания и развития сеянцев орхидей, а также распространения зрелых растений. Однако имеется ограниченная информация о распространении и пространственном характере микоризных грибов орхидей в почве независимо от хозяина орхидеи. В этом исследовании мы исследовалиin situраспределение in situTulasnella Tulasnella spp., связанного с находящейся под угрозой исчезновения австралийской орхидеейDiuris fragrantissima. Мы внедрили метод мета-штрих-кодирования (грибковая область ITS1), ориентированный на три источника почвы: ризосферу орхидеи, насыпную почву, связанную с орхидеей, и насыпную почву с места произрастания орхидеи. Качественно отфильтрованный набор данных показал, что встречаемостьTulasnellaspp.in situограничена ризосферой орхидей, что позволяет предположить, что в естественной среде обитания Diuris fragrantissima существует ограниченное количество потенциальных мест рекрутирования с подходящими таксонами микоризы.Diuris fragrantissima. Метод мета-штрих-кодирования также выявил отличительное грибковое сообщество, связанное с ризосферой орхидеи. В целом, технология NGS оказалась подходящим методом для крупномасштабного скрининга изолятов грибов в почве, ассоциированной с орхидеями. Прорастание семян, переход к рассаде и раннее развитие наземных орхидей в естественных условиях зависят от колонизации микоризными грибковыми симбионтами. Отсутствие разветвленной корневой системы делает приобретение питательных веществ грибковыми симбионтами критически важным на протяжении всей жизни орхидеи. Несмотря на разнообразие грибов, связанных с наземными орхидеями, различающееся в разных местах обитания или даже между сеянцами и взрослыми растениями , было обнаружено, что многие такие орхидеи образуют микоризные ассоциации с относительно узким разнообразием грибов в альянсе rhizoctonia. Грибы Rhizoctonia представляют собой полифилетический комплекс, который включает патогены, эндофиты, сапротрофы и микоризные грибы, включая важные роды микориз орхидей, такие какCeratobasidium,Tulasnella,ThanatephorusиSebacina(Weiss et al. 2004; Дирнели 2007). Ожидается, что совместное появление и обилие подходящих микоризных грибов будут важным фактором не только для создания и развития сеянцев орхидей, но и для появления зрелых растений, и важность связей распространения / распространения между орхидеями и грибами была задокументирована в нескольких исследованиях (обзор Маккормик и Жакмин 2014). Хотя ограниченное присутствие грибов может представлять собой серьезное ограничение, особенно для тех орхидей, которые проявляют узкую грибковую специфичность (Брандретт. 2003; Боннардо. 2007; Дирнели 2007; Огура-Цудзита. 2009), динамика и экология грибов, независимых от орхидей, с которыми они ассоциируются, еще не были четко рассмотрены, хотя большинство микориз орхидей являются свободноживущими грибами, которые могут расти без растения-хозяина (Дирнели. 2012, Маккормик и Жакмин 2014, Rasmussen. 2015). Несколько экспериментов по прорастанию семян продемонстрировали, что присутствие симбионтов обычно ограничено участками, где также встречается орхидея. Действительно, всхожесть часто снижается с увеличением расстояния от взрослых растений, что позволяет предположить, что обилие подходящих микоризных грибов также уменьшается. Однако было показано, что некоторые микоризы орхидей встречаются независимо от орхидей (т.е.> 5 м от ближайшей конспецифичной орхидеи; например, что указывает на то, что подходящие грибы могут присутствовать вне участков орхидей. Учитывая важность грибов как факторов распространения орхидей, способность решить проблему распределения микоризных грибов как в занятых, так и в незанятых местах обитания орхидей, вероятно, будет важнейшим требованием для определения подходящих микросайтов для мероприятий по реинтродукции. Методы ‘травли’ с использованием пакетов с семенами орхидей обычно применяются для изучения распространения микоризных грибов орхидей. Однако этот метод может обнаруживать только те места, где и грибы, и условия окружающей среды подходят для прорастания семян, в то время как фактическое появление грибков может быть более распространенным. Недавно метабаркодирование ДНК с использованием секвенирования следующего поколения (NGS) стало эффективным инструментом мониторинга биоразнообразия грибов и встречаемости микоризных грибов орхидей. Высокопроизводительный метод секвенирования ДНК позволяет извлекать и идентифицировать микробный генетический материал непосредственно из образцов окружающей среды и может представлять собой эффективный, неинвазивный и простой в стандартизации подход к отбору проб для почвенных грибов. Diuris fragrantissimaявляется находящейся под угрозой исчезновения австралийской местной орхидеей (EPBC Act, 1998), которая растет в ассоциации с узким таксономическим диапазоном микоризных грибов в космополитическом семействе Tulasnellaceae. Ограниченная выживаемость культурных растенийD. fragrantissimaпосле реинтродукции коррелирует с потерей ассоциированных грибов во время перехода отex situкin situ(Smith 2006). Предполагается, что наличие микросайтов, содержащих подходящие микоризные грибы, способные помочь реинтродуцированным орхидеям, является необходимой предпосылкой для их долгосрочного выживания в дикой природе. Тем не менее, мониторинг наличия грибка с использованием традиционных методов "травли" оказался ненадежным в этой ситуации (Smith 2006). В этом исследовании мы использовали метабаркодирование для изучения распределения микоризных грибов орхидеи в ризосфере орхидеи и прилегающей почве, а также для характеристики грибкового разнообразия в естественной среде обитанияD. fragrantissima. Материал и методы Описание участка и отбор проб почвы Diruis fragrantissima, SunshineDiuris, многолетняя наземная орхидея, эндемичная для базальтовых равнин непосредственно к западу от Мельбурна (Австралия) в биорегионе Викторианской вулканической равнины ИБРА. После деградации среды обитания, нашествия сорняков, хищничества со стороны интродуцированных травоядных животных, изменения режимов сжигания и незаконного сбора, катастрофическое сокращение ареала и численности повлияло на этот местный вид. На сегодняшний день только одна дикая популяция, включающая около 30 растений, сохранилась в луговом заповеднике на огороженной территории площадью около 1200м2, расположенном в Саншайн (Мельбурн, Виктория, Австралия). На этом участке доминируют несколько австралийских аборигенных видов, в том числе Themeda triandra,Austrodanthoniasp.,Dianella longifolia,D. revoluta,Tricoryne elatior,Pimelea humilisиDichanthium sericeumsubsp. sericeum. Орхидеи расположены на северо-восточной стороне огороженной территории, на участке размером примерно 15 × 10 м. Почва представляет собой мелкую тяжелую глину, с несколькими обнаженными базальтовыми валунами. Мы собрали образцы почвы из трех различных источников: ризосферной почвы орхидеи (в непосредственном контакте с корнем орхидеи), насыпной почвы орхидеи (рядом с растениями орхидеи) и насыпной почвы участка. Во-первых, для изучения состава грибкового сообщества, на которое непосредственно влияют корни орхидеи, были собраны два образца из ризосферной почвы (на расстоянии ~ 1 мм от поверхности корня и 3 см от кончика корня) с четырех местных растенийin situ("ризосферная почва орхидеи"), в общей сложности восемь образцов. Во—вторых, чтобы исследовать "зону влияния" орхидеи, то есть на каком расстоянии от растения мы все еще можем найти следы его микоризного симбионта, пять растений на внешних границах участка орхидеи были дополнительно исследованы путем сбора рядом с растением (0 см, но не в контакте с корнем) вдоль с тремя точками на постепенном расстоянии от каждого растения (10, 20, 40 см). Образцы были взяты вдоль одного и четырех разрезов в направлениях север, юг, восток и запад, в зависимости от местоположения орхидеи (некоторые разрезы были невозможны из-за наличия камней), в общей сложности 35 дополнительных образцов (‘насыпной грунт орхидеи’). Отбор проб проводили с помощью почвенного керна (диаметром 2 см) на глубину 10 см в соответствии. В-третьих, для изучения распространения Tulasnellaspp. и выявления возможных микроплощадок, подходящих для перемещения орхидей, были взяты образцы почвы с участка, на котором присутствовала орхидея (‘насыпная почва участка’). Пул образцов включал почвы из районов, где были и не были представлены орхидеи. Для обеспечения систематического отбора2 проб на огороженной территории была обозначена сетка площадью 5 м2. Для каждого участка была определена средняя точка, и четыре почвенных керна (диаметром 2 см х длиной 10 см) были собраны в пределах небольшого радиуса (25 см) от центра сетки. Образцы почвы были объединены в один образец для анализа. Учитывая неоднородное распределение Tulasnellaspp.в Diurisестественной среде обитания, объединение нескольких кернов увеличивает вероятность обнаружения интересующего гриба. В общей сложности в заповеднике орхидей было собрано 44 образца, включая шесть образцов (A1, A2, A3, B1, B2 и B3) с территории, занятой орхидеями. Кроме того, было собрано десять образцов почвы за пределами заповедника, чтобы проверить наличие Tulasnellaspp. в прилегающих зонах, которые потенциально могут быть реинтродуцированы. Ризосферная почва была собрана в июне 2015 года, в то время как насыпная почва для участка и орхидеи была собрана в июле 2015 года. Все образцы хранили в стерильных пробирках falcon при температуре -20°C перед извлечением ДНК. Набор данных включал свежевыделенные чистые культуры Tulasnella sp. с трех исследованных растений, у всех из которых успешно проросли саженцы (Нил Андертон). Экспериментальный рабочий процесс кратко представлен на рисунке 1. Выделение ДНК, ПЦР-амплификация и подготовка библиотеки Образцы почвы гомогенизировали и выделяли ДНК из 0,25 г почвы с использованием набора для выделения почвенной ДНК PowerSoil™ ДНК из трех Tulasnellasp. культуры (диаметром~1 см на агаре) использовали в качестве положительного контроля. Чтобы повысить эффективность протокола экстракции ДНК, мы использовали более длительный этап лизиса клеток (15 мин) с образцами, нагретыми до 65 °C, следуя Жанг ДНК определяли количественно с помощью спектрофотометра ND1000 и стандартизировали до 5,0 нг/мкл. Поскольку область 5,8S рДНК является гипервариабельной у Tulasnella видов Tulasnella, и все известные праймеры имеют множественные несоответствия многим видам, идентификация грибов была основана на области ITS1, полученной из полностью внутренней транскрибируемой области спейсера (ITS). Грибковая область ITS была амплифицирована с использованием праймеров ITS1F/ ITS4 (Gardes and Bruns 1993; White et al. 1990), чья способность амплифицировать областьITS, ассоциированную с Diuris Tulasnellaceae, была ранее продемонстрирована. Однако, чтобы дополнительно подтвердить пригодность грунтовок ITS1F-ITS4 для определения присутствия Tulasnellaceae в почве, мы провели пилотный запуск MiSeq, в котором эффективность этих грунтовок сравнивалась соTulasnellaспецифичными для Tulasnella грунтовками ITS1F-ITS4Tul. Пилотный запуск включал ризосферную почву иTulasnellaчистые культуры Tulasnella spp. Две пары праймеров выполняли аналогичную работу при извлечении Tulasnellaspp. из почвы (см. Дополнительный материал 1) и, следовательно, грунтовки ITS1F / ITS4 были выбраны вместо ITS1F-ITS4Tul, потому что они универсальны, что позволяет исследовать какраспространение Tulasnellaspp., так и состав всего почвенного грибкового сообщества. Подготовка библиотеки требовала первой амплификации, проведенной в общем объеме 20 мкл с использованием 10 нг ДНК, 12,5 мкл готовой смеси KAPA Taq и по 10 мкм каждого прямого и обратного праймеров (ITS1F и ITS4 соответственно). Условия ПЦР составляли 6 мин при 95°C, за которыми следовали 35 циклов по 30 с при 95°C, 30 с при 55°C и 30 с при 72°C. Окончательное удлинение производили при 72°C в течение 5 минут. Вторую ПЦР проводили для добавления индивидуальных индексов Illumina к каждому образцу, используя 25 мкл ампликона, полученного в результате первой ПЦР, при следующих условиях: 6 мин при 95°C, затем 8 циклов по 30 с при 95°C, 30 с при 55°C, 30 с при 72 °C и завершают при 72 °C в течение 5 мин. Каждый продукт ПЦР очищали с помощью магнитных шариков Agencourt AMPure XP SPRI. Индексированные продукты ПЦР нормализовали и объединяли после количественного определения с помощью флуорометра Qubit 2.0 и набора для анализа dsDNA HS Qubit. Секвенирование на парных концах проводилось собственными силами на секвенаторе Illumina MiSeq. Молекулярная идентификация и биоинформатика Каждое чтение с одного конца анализировалось отдельно в соответствии со стратегией, реализованной, и исследовались только прямые чтения, которые включают области ITS1. Сначала считывания были усечены до 280 п.н., а затем отфильтрованы с помощью USEARCH. v8.1.1831. После анализа с контролем качества последовательности были дереплицированы и сгруппированы в оперативные таксономические единицы (OTU) с использованием USEARCH. Кластеризация OTU была выполнена при пороге идентификации 97%, а таксономия была присвоена с помощью классификатора RDP по эталонному набору данных ITS от UNITE fungal с порогом достоверности 85%. Была зарегистрирована гипотеза ОБЪЕДИНЕНИЯ видов для совпадений OTU 97% или выше. Приложение FunGuild использовалось для назначения грибковых OTU из разреженных данных функциональным гильдиям. Для этого исследования мы включили только те результаты, в которых был достигнут доверительный рейтинг ‘высокой вероятности’.   Статистический анализ Мы проверили, были ли усилия по отбору проб достаточными для определения богатства грибкового сообщества, путем создания кривых разрежения видов и графиков накопления видов с использованием функций ‘rarecurve’ и ‘specaccum’ в библиотеке R vegan с использованием R 3.2.0. Перед всеми последующими анализами набор данных был разрежен до равномерной глубины 500 последовательностей на выборку и удалены синглтоны. Данные о сообществе грибов были упорядочены в программном обеспечении Primer-E (версия 6, PRIMER-E Ltd. Плимут, Великобритания) с использованием неметрического многомерного масштабирования (nMDS) для нетрансформированных данных и данных, подлежащих преобразованию второго корня, с использованием метрики Брэя-Кертиса в качестве меры различия. Поскольку результаты анализа, основанного на упорядочении, были качественно одинаковыми независимо от используемого преобразования, мы сообщаем только о преобразовании второго корня в результатах. Сходство между образцами, отображенными с использованием 2D-многомерного масштабирования (nMDS), было проверено с использованием непараметрического теста на основе перестановок ANOSIM (Анализ сходства) для изучения потенциальных различий между сообществами грибов в трех разных почвенных источниках ("ризосфера", "насыпная почва орхидеи" и "насыпная почва участка"), и закономерности в составе грибов были исследованы путем генерации дендрограммы с помощью алгоритма UPGMA. SIMPROF (Анализ профиля сходства) использовался для определения того, существовала ли какая-либо структура в среднем по группе с 95% доверительным интервалом.   Результаты Грибы из почвы и корней демонстрировали различные закономерности в содержании OTU на уровне типа. В образцах почвы аскомикота (48,0%) была наиболее богатым OTU типом, за которым следовала базидиомикота (38,1%), тогда как в образцах корней эта картина была обратной (Basidiomycota 53,3% и Ascomycota 38,5%). Другие типы, взятые вместе, составляли около 5% OTU для обоих типов образцов. В образцах почвы и корней 8,5 и 3,0% OTU, соответственно, оставались неидентифицированными на уровне типа. Грибы из почвы и корней демонстрировали различные закономерности в содержании OTU на уровне типа. В образцах почвы аскомикота (48,0%) была наиболее богатым OTU типом, за которым следовала базидиомикота (38,1%), тогда как в образцах корней эта картина была обратной (Basidiomycota 53,3% и Ascomycota 38,5%). Другие типы, взятые вместе, составляли около 5% OTU для обоих типов образцов. В образцах почвы и корней 8,5 и 3,0% OTU, соответственно, оставались неидентифицированными на уровне типа   Обнаружение Tulasnella и описание грибкового сообщества Отфильтрованный по качеству набор данных включал в общей сложности 892 288 последовательностей, которые были отнесены к 2707 OTU на заключительном этапе кластеризации с порогом сходства 97%. Кривые разрежения общего количества грибов OTU для образца ризосферы чаще достигали плато по сравнению с насыпной почвой участка и насыпной почвой орхидеи (дополнительный рисунок 1A), в то время как кривые на участках накопления видов были насыщенными для всех трех источников почвы (дополнительный рисунок 1B). До удаления одиночных элементов и разрежения в ризосферной почве было идентифицировано в общей сложности 1661 грибковый OTU, 1306 - в почве орхидеи и 1710 - в почве участка. В общей сложности 642 OTU были зарегистрированы исключительно в ризосфере, в то время как 459 были уникальными для насыпной почвы орхидеи и 117 для насыпной почвы участка. ОТУ, уникальные для ризосферы, представлены в Дополнительной таблице 1. Один OTU (обнаруженный из 38 последовательностей), идентифицированный какTulasnellasp. (SH234355.06FU), был извлечен из ризосферной почвы, собранной с двух из четырех проанализированных растений (35 и 3 последовательности соответственно, Дополнительная таблица 1). Тот же OTU был также получен из свежих культур, использованных в качестве положительного контроля (2415 последовательностей), в то время какTulasnellasp. не было. OTU были извлечены из других источников почвы (насыпной грунт орхидеи и насыпной грунт участка). После разрежения и удаления синглетонов было сохранено в общей сложности 1562 OTU и 64 образца. В целом, грибы из ризосферной почвы орхидеи, насыпной почвы участка и насыпной почвы орхидеи демонстрировали сходные закономерности в богатстве OTU на уровне типа. В образцах насыпной почвы и почвы для орхидей Ascomycota (60% и 59% соответственно) была наиболее богатым OTU типом, за которым следуют Basidiomycota (20% и 21% соответственно) (рисунок 2A). Другие типы, взятые вместе, составляли примерно 20% OTU для обоих типов образцов. Аналогичное распределение наблюдалось и в образцах ризосферы. Ascomycota (59%) представляли наиболее богатый и распространенный OTU тип, за которым следовали Basidiomycota (21%). Из других групп грибов хитридиомикоты и гломеромикоты были наиболее богаты OTU. Менее 3% OTU принадлежали Zygomycota, а оставшиеся 5% OTU были не идентифицированы на уровне типа.   Грибок Для нашего набора данных 51% OTU (786 из 1562) смогли быть отнесены к функциональной группе, соответствующей базе данных FUNGuild на уровне рода. Из них 89,6% был присвоен уровень достоверности "весьма вероятный", а 10,4% был присвоен уровень достоверности ‘вероятный’ или ‘возможный’. OTU были сгруппированы и усреднены в соответствии с источником почвы, а функциональный анализ включал только трофические режимы и гильдии с "высоковероятным" уровнем достоверности (705 OTU) (рис. 2B и C). Тем не менее, поскольку функциональные группы грибов недостаточно четко определены для австралийских луговых почв, приведенные здесь назначения следует интерпретировать с осторожностью. Что касается трофических групп, то симбиотрофные грибы были самыми обильными (502 OTU), за ними следовали сапротрофы (114 OTU). В целом, группы, содержащие симбиотропы (патотрофно-симбиотропные и симбиотропные группы), были относительно более распространены в ризосфере (65% от общего сообщества) по сравнению с другими почвенными источниками (<55% от общего почвенного сообщества орхидей на каждом расстоянии от растения-хозяина и 56% в общей почве участка). Что касается грибных гильдий, арбускулярные микоризные грибы (AM) были наиболее часто обнаруживаемыми таксонами (447 OTU), за которыми следовали эктомикоризные грибы (ECM) (44 OTU) и неопределенные навозные сапротрофы (38 OTU). Грибы ECM были единственной группой, которая продемонстрировала четкую картину относительного обилия по отношению к источнику почвы (рисунок 2C), будучи более распространенными в ризосфере орхидеи (6% от общего сообщества) по сравнению с основной почвой орхидеи (<3% от общего сообщества на каждом расстоянии от растения-хозяина) и насыпной грунт участка (4% от общей площади сообщества).   Структура грибкового сообщества График на дополнительном рисунке 2 показывает порядок расположения проб nMDS из трех источников почвы (ризосфера, грунт для орхидей и грунт для участка); расстояние между любыми двумя точками отбора проб отражает их относительное сходство. АНОСИМ показал, что изменение состава сообщества почвенных грибов положительно коррелировало с источником почвы. Самая сильная группировка произошла между ризосферной почвой орхидеи и насыпной почвой орхидеи (R = 0,85,p= 0,001), а также между ризосферной почвой орхидеи и насыпной почвой участка (R = 0,82,p= 0,001), в то время как группировка между насыпной почвой орхидеи и насыпной почвой участка была слабее (R = 0,35,p=0,001). В пространстве упорядочения образцы ризосферы были четко отделены от других образцов (хотя и относительно широко разбросаны в пространстве упорядочения), при этом образцы из почвы орхидеи попадали между образцами ризосферы и образцами почвы участка. В кластерном анализе (рис. 3) было четыре основных кластера, один кластер состоял исключительно из образцов из ризосферы, которые группировались вместе с относительно низким общим сходством (20%), в то время как образцы из орхидеи и насыпной почвы были распределены по трем другим кластерам. В двух из этих трех других кластеров были взяты только образцы из насыпного грунта участка (три образца и восемь образцов соответственно), в то время как третий крупный кластер включал все образцы из насыпного грунта орхидеи вместе с другими 23 образцами из насыпного грунта участка. В рамках этого третьего крупного кластера все образцы почвы для орхидей находились в пределах одного крупного подкластера (наряду с тремя образцами почвы для орхидей, взятыми из районов, заселенных орхидеями). Последовательно, различия в составе, визуализированные с помощью кластера и упорядочения, показали, что образцы почвы ризосферы представляют собой отдельный кластер. Что касается "основного" сообщества (OTU, присутствующие по меньшей мере в 75% образцов и составляющие более 5% сообщества, дополнительная таблица 2), то ризосфера орхидеи состояла из 90 OTU, в которых доминировали Ascomycota (65 OTU), за которыми следовали Chytridiomycota (6 OTU), Basidiomycota (4 OTU), Zygomycota (3 OTU) и Glomeromycota (1 OTU), в то время как 10 OTU были не идентифицированы на уровне типа (Дополнительная таблица 3a). Среди сообщества ядра ризосферы десять OTU были с высокой вероятностью отнесены к трофическому режиму ‘симбиотрофов", в основном AM (5 OTU) и ECM (3 OTU), в то время как 13 OTU считались "сапротрофами", в основном ‘Навозно-сапротрофами’ (11 OTU). В основных сообществах для насыпной почвы орхидей и насыпной почвы участка было меньше таксонов (51 и 9 OTU соответственно, Дополнительная таблица 2 B и C). Подобно сообществу ядра ризосферы, Ascomycota были в значительной степени представлены в основном сообществе как в насыпной почве орхидей (38 OTU), так и в насыпной почве участка (7 OTU). Пять и один OTU, идентифицированные как симбиотропные, присутствовали как в насыпной почве орхидеи, так и в насыпной почве участка соответственно, при этом в насыпной почве орхидеи преобладали "сапротрофные" (21 OTU) и "Патотрофы" (10 OTU).   Обсуждение Обнаружение Tulasnella spp. Один OTU идентифицирован как микоризный гриб Tulasnellasp. (SH199347.06FU) была успешно извлечена из ризосферы трех из четырех проанализированных диких орхидей. Однако ниизсыпучих почв, собранных наDiurisродном участке Diuris, ни из сыпучих почв орхидей не было получено ни одного Tulasnella OTU, независимо от расстояния от растения-хозяина. Несмотря на решающую роль в прорастании и сохраненииD. fragrantissima, Tulasnellaceae представляют собой "редких" представителей сообщества почвенных грибов, на долю которых приходится менее 1% от общего числа ризосферных грибов. Это говорит о том, что интересующий гриб узко распространен и ограничен исключительно почвой, непосредственно связанной сD.fragrantissima. Ограниченное распространениеTulasnella spp. может быть следствием небольших объемов почвы, которые могут быть отобраны молекулярными методами, недостаточной глубины секвенирования или высокой неоднородности распределения грибов в мелких масштабах. Тем не менее, мы смогли культивировать микоризный симбионт из корней всех орхидей, что дало положительные результаты на присутствиеTulasnellaspp. в образце метабаркодирования, что указывает на то, что извлеченный Все TulasnellaOTUs были связаны с присутствием живого, активного гриба. В соответствии с нашими результатами, в предыдущих молекулярных исследованиях сообщалось о редком появлении микоризных грибов орхидейin situ, которые показали, что микоризы вне корней орхидей представляют небольшую часть почвенного сообщества и обычно ограничены на участки, где также встречается растение-хозяин. Спорадическое появление Tulasnellaspp., ассоциированной с орхидеями, в местах произрастания орхидей может быть связано с ограниченной способностью микоризных грибов к разведке почвы в районах с высокой плотностью корней, таких как участки орхидей, где разведка на короткие расстояния будет представлять собой эффективную стратегию с точки зрения затрат на углерод. Однако имеется ограниченная информация о механизмах распространения микоризных грибов орхидей в почве. С другой стороны,Diurisчисленность микоризы Diuris может быть ограничена специфическими условиями окружающей среды. Многочисленные эдафические особенности могут коррелировать с ограниченным запасом микоризы орхидей в пределах участков обитания, включая такие свойства почвы, как влажность, содержание органических веществ, рН и уровни питательных веществ. Количество и качество органического материала почвы являются определяющими для появления в почве сапротрофных грибов, таких как Tulasnellaspp., и совместное появление определенных видов растений, обеспечивающих подходящий органический материал, может представлять важный аспект в определении распространения грибов (Rasmussen et al. 2015).D. fragrantissima Родной участок D. fragrantissima подвергся деградации среды обитания, изменению режима пожаров и нашествию сорняков в течение последних 30 лет, что, вероятно, привело к изменению первоначальной среды обитания орхидей. Следовательно, изменения в составе растительности на родном участке орхидеи, возможно, сделали среду обитания неспособной поддерживать устойчивость Tulasnellaspp. независимо от растения-хозяина. Разнообразие грибов в ризосфере орхидей и на родном участке В дополнение к in situ распределению Tulasnellaspp. in situ, целью нашего исследования было охарактеризовать общее грибковое сообщество в ризосфере орхидей, а также место произрастания орхидей, как на занятых, так и на незанятых территориях. Был выявлен явный сдвиг в составе грибных сообществ из ризосферы по сравнению с основной почвой, независимо от расстояния от растения-хозяина. Это изменение в составе было в основном связано с присутствием нескольких таксонов, обогащенных или уникальных для ризосферы. В дополнение к Tulasnellasp., два OTU, отнесенных к отряду Sebacinales, образующему ризоктонию, были извлечены исключительно из ризосферы орхидей, вместе с гетерогенной группой немикоризообразующих таксонов, в основном принадлежащих к отрядам Agaricales (3 OTU), Chaetotyriales (9 OTU), Helotiales (5 OTU)., Hypocreales (13 OTU), Pezizales (2 OTU) и Pleosporales (3 OTU). Грибы из этих отрядов ранее были выделены из корней орхидей в умеренных и тропических регионах, и их часто рассматривают как корневые патогены или сапробы в мертвых клетках. Хотя их роль не может быть полностью рассмотрена в этом исследовании, ассоциация с сапротрофными грибами в ризосфере может представлять собой выгодную стратегию для растения, позволяющую получить доступ к ресурсам, ограничивающим рост, в естественных условиях. Действительно, присутствие сапротрофов связано с повышенной доступностью органического вещества из стареющих корневых структур и экссудатов, что повышает вероятность выживания орхидей в условиях с низким содержанием питательных веществ. Некоторые из таксонов, уникальных для ризосферы, такие какPurpureocillium lavendulumиCordyceps bassiana, обычно встречаются в почве ризосферы растений, и их присутствие подразумевает как защиту хозяина от насекомых, так и функции, способствующие росту растений. Обогащение этих грибов в сообществе ризосферы орхидей предполагает, что корни орхидей и их ближайшее окружение могут стимулировать рост и размножение отдельных полезных грибов. В свою очередь, ризосфера орхидей может поддерживать грибковое сообщество, предлагая защищенную среду для выживания и сохранения. В ризосфере орхидей были обнаружены молекулярные следы грибов из семейства Geoglossaceae (например, Trichoglossum hirsutum) (Дополнительная таблица 1). Эти таксоны обычно ассоциируются с бедными питательными веществами лугами Северного полушария и обычно встречаются на неоплодотворенных или неулучшенных лугах, газонах и пастбищах. Хотя была выдвинута гипотеза о связи между Geoglossaceae и корнями травянистых растений, механизмы и динамика этого альянса еще предстоит определить, что не позволяет нам оценить роль этих грибов вDiuris ризосфере Diuris. В нашем исследовании были обнаружены молекулярные доказательства встречаемости грибов AM и ECM всообществе D. fragrantissima‘core’ rhizosphere. Грибы ECM ранее были выделены как из микогетеротрофных, так и из фотосинтезирующих корней орхидей, и их присутствие в ризосфере предполагает благоприятную роль в приобретении высвобождаемых питательных веществ, таких как N и P. Напротив, арбускулярные микоризы лишь изредка встречаются в семействе Орхидных (Shefferson et al., 2005). Учитывая способность AM переносить соединения между несколькими видами растений через общие сети гиф, мы предполагаем активную роль этой группы грибов в обеспечении подземной коммуникации между D. fragrantissimaи окружающими растениями. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить эту гипотезу о роли арбускулярной микоризы в ризосфере орхидей. В то время Diuris как сообщество ризосферных грибов Diuris продемонстрировало резкое различие в составе, изменения в составе между насыпной почвой орхидеи и насыпной почвой участка были менее выраженными. В соответствии с предыдущими исследованиями, большинство грибов, характеризующих пастбища, принадлежали к типам Ascomycota, Glomeromycota и Basidiomycota, являясь в основном симбиотрофными (например, Glomussp.), патогенами растений (например, Ilionectria mors-panacis,Drechslerasp.), сапротрофы навоза (например, Podospora glutinans) и сапротрофы подстилки (например, Mortierellaspp.,Penicilliumspp.,Clavariaspp.). О некоторых из этих таксонов ранее сообщалось из луговых почв, также в связи с биологическими почвенными корками.   PenicilliumиMortierella, в частности, широко известны как колонизаторы поздней стадии разложения мусора, и их присутствие предполагает увеличение скорости разложения и рециркуляции органических материалов, что, возможно, способствует сохранению питательного статуса почвы (Baath 1981). Однако извлечение Clavariaspp. свидетельствует о бедной питательными веществами экосистеме. Действительно, вместе с Geoglossaceae представители семейства Clavariaceae традиционно считаются индикаторными видами для неуправляемых лугов. Разнообразие, таксономия и экология грибковых сообществ в травянистых экосистемах Австралии все еще в значительной степени не изучены по сравнению с их аналогами в Северном полушарии, что затрудняет нашу способность делать выводы о ценности этих таксонов в качестве показателей состояния питательных веществ или качества пастбищ в этой ситуации. Низкая доля извлеченных последовательностей, сопоставленных на уровне вида, подчеркивает важность заполнения баз данных последовательностей большим количеством последовательностей из материала, идентифицированного для вида. Отсутствие идентификации на уровне видов препятствует глубокому анализу роли конкретных OTU, который может быть возможен для отдельных известных видов, опираясь на знание их конкретной истории жизни и распространения. Однако даже без идентификации на уровне видов сообщество молекулярных OTU, выявленных в этом исследовании, доступно для будущих мета-анализов растущего набора данных метабаркода, доступных для австралийской среды   Выводы Хотя симбионт находящегося под угрозойисчезновения вида Diurisfragrantissimaбыл обнаружен наin situрастениях in situ, он не был обнаружен где-либо еще, среди или вблизи существующей популяции орхидей. Это говорит о том, что существует очень ограниченное число потенциальных мест рекрутирования с подходящимивидами Tulasnellaspp. дляD. fragrantissima. Отсутствие подходящих грибов за пределами участка с орхидеями говорит о том, что соответствующие микроплощадки по существу насыщены орхидеями. Многие факторы или комбинации факторов могут влиять на распространение орхидных грибов, что, в свою очередь, может повлиять на потенциал прорастания и распределение растений орхидей в полевых условиях. Учитывая зависимость развития и выживания наземных орхидей от микоризы, корреляция факторов окружающей среды с распространением грибов имеет решающее значение для создания самосохраняющейся популяции орхидей, что в конечном итоге является целью любой деятельности по реинтродукции. Однако отсутствие обнаружения Tulasnella вдали от корней орхидей означает, что невозможно провести сравнение с другими переменными. Дальнейшее изучение присутствия Tulasnella симбионтов Tulasnella обычных видов Diuris, где пополнение растений происходит вдали от существующих растений, будет поучительным. Беспрецедентное разнообразие грибов было извлечено из D. Fragrantissim aризосферной почвы, что предполагает взаимодействие с несколькими грибковыми партнерами в естественной популяции Diuris. Необходимы более детальные исследования для характеристики грибов и грибных экотипов, связанных с этой находящейся под угрозой исчезновения орхидеей, а также их роли в развитии растений. В целом, технология секвенирования следующего поколения оказалась мощным методом для обнаружения симбионта редкой орхидеи и для крупномасштабного скрининга ассоциированного грибкового сообщества. Ссылки Австралийское содружество (1999). Закон 1999 года об охране окружающей среды и сохранении биоразнообразия. Бот, Э. (1981). Грибки в почве соснового леса в центральной Швеции. Канадский журнал ботаники, 59 (7), 1331-1337. Бабикова З., Джонсон Д., Брюс Т., Пикетт Дж. и Гилберт Л. (2014). Подземные союзники: Как и почему мицелиальные сети помогают растениям защищаться? Биоанализы,36(1), 21-26. Бахрам М., Пей К. Г. и Тедерсу Л. (2015). Локальная биогеография и пространственно‐временная изменчивость сообществ микоризных грибов. Новый фитолог,205(4), 1454-1463. Балинт, М., Шмидт, П. А., Шарма, Р., Тинс, М., и Шмитт, И. (2014). Конвейер метабаркодирования Illumina для грибов. Экология и эволюция, 4 (13), 2642-2653. Батти, А. Л., Диксон, К. В., Бранд, М. и Сиваситхампарам, К. (2001). Ограничения на симбиотическое прорастание семян наземных орхидей в средиземноморском кустарнике. Новый фитолог,152(3), 511-520. Батти, А. Л., Диксон, К. В., Бранд, М. К. и Сиваситхампарам, К. (2002). Сохранение орхидей и микоризных ассоциаций. Вкниге "Микроорганизмы в сохранении растений и биоразнообразии" (стр. 195-226). Спрингер, Нидерланды. Байман П. и Отеро Дж. Т. (2006). Микробные эндофиты корней орхидей. Вмикробных эндофитах корней(стр. 153-177). Springer Berlin Heidelberg. Бидартондо, М. И., Бургхардт, Б., Гебауэр, Г., Брунс, Т. Д. и Рид, Д. Дж. (2004). Смена партнеров в темноте: изотопные и молекулярные доказательства эктомикоризных связей между лесными орхидеями и деревьями. Труды Лондонского королевского общества B: Биологические науки,271(1550), 1799-1806. Брундретт, М. К. (2006). Понимание роли многофункциональных микоризных и эндофитных грибов. Вмикробных эндофитах корней(стр. 281-298). Боннардо, Ю., Брундретт, М., Батти, А., Диксон, К., Кох, Дж. и Сиваситхампарам, К. (2007). Разнообразие микоризных грибов наземных орхидей: сети совместимости, краткие встречи, длительные отношения и инопланетные вторжения. Микологические исследования,111(1), 51-61. Карра, Р. С., Зелмер, К. Д., Хэмблтон, С. и Ричардсон, К. А. (1997). Грибы из микоризы орхидей. ВБиологии орхидей(стр. 117-170). Спрингер, Нидерланды. Карра, Р. С., Зелмер, К. Д., Хэмблтон, С. и Ричардсон, К. А. (1997). Грибы из микоризы орхидей. ВБиологии орхидей(стр. 117-170). Спрингер, Нидерланды. Дирнали, Джей Ди (2007). Дальнейшие достижения в исследовании микоризы орхидей. Микориза,17(6), 475-486. Дирнели, J. D. W., Martos, F. и Selosse, M. A. (2012). 12 Микоризы орхидей: молекулярная экология, физиология, эволюция и аспекты сохранения. Вгрибковых ассоциациях(стр. 207-230). Springer Berlin Heidelberg. ДЕХ 2000. Пересмотр Временного биогеографического районирования Австралии (IBRA) и разработка версии 5.1. – Краткий отчет. Департамент окружающей среды и наследия, Канберра.