Выращивание и химическое продуцирование цианобактерий

Целью данного исследования является изучение влияния интенсивности света и концентрации диоксида углерода на рост и выработку этанола модельных цианобактерий 6803 и 7002 (далее именуемых 6803 и 7002 соответственно). Цианобактерии представляют собой идеального хозяина для химического производства посредством метаболической инженерии благодаря их способности преобразовывать 2 в полезные соединения, используя энергию света. Модели фотосинтеза 3 и анализ метаболического контроля идентифицировали седогептулозо-1,7-бисфосфатазу () в цикле в качестве потенциальной мишени сверхэкспрессии для увеличения потока углерода. Это было доказано многочисленными исследованиями трансгенных растений в различных условиях окружающей среды, а также на цианобактериях, которые содержат бифункциональную форму фермента фруктозо-1,6-/седогептулозо-1,7-бисфосфатазы ().

Таким образом, избыточная экспрессия у цианобактерий теоретически может привести к усиленному росту и выработке химических веществ. Однако предыдущая работа нашей лаборатории показала, что сверхэкспрессия у штаммов 6803, продуцирующих этанол, не приводит к увеличению роста или производства этанола. В этой работе изучается влияние условий окружающей среды на скорость роста и выработку этанола сконструированных штаммов 6803 и 7002. был сверхэкспрессирован у штаммов 6803 и 7002, а также штаммов, продуцирующих 6803 этанол, и выращивался при интенсивном насыщающем освещении. Рост анализировали путем измерения оптической плотности () штаммов с использованием мультикультиватора 1000 (1000), а выработку этанола определяли количественно с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ). Количество определяли количественно с помощью масс-спектрометрии с контролем селективных реакций ( ). Ни один из штаммов, сверхэкспрессирующих , не показал увеличения роста по сравнению с диким типом, и сверхэкспрессия не привела к увеличению выработки этанола по сравнению с диким типом.

Щелкните, чтобы развернуть Содержимое и сокращения

Введение

1.1 Метаболическая инженерия

Метаболическая инженерия направлена на изменение метаболизма организма-хозяина с целью получения желаемых химических продуктов, которые обычно не производятся хозяином, путем введения метаболических сетей. С этой целью цианобактерии являются привлекательным организмом-хозяином благодаря своей способности непосредственно фиксировать неорганический углерод из углекислого газа в сложные органические соединения, используя энергию света посредством фотосинтеза 1,2. Однако внедрение неродных метаболических сетей неизбежно приводит к нарушениям метаболического потока хозяина из-за взаимодействия с нативным метаболизмом. Чтобы максимизировать эффективность внедренных метаболических сетей в организме хозяина, настройка нативного метаболизма может обеспечить способ, с помощью которого баланс метаболического потока может быть смещен в пользу искусственной сети. Производство этанола представляет собой хорошую модель метаболической сети из-за ее простоты, при которой в организм хозяина вводятся только 2 фермента: пируватдекарбоксилаза (), которая превращает пируват в ацетальдегид, и алкогольдегидрогеназа (), которая превращает ацетальдегид в этанол. Этанол также является простым и нетоксичным продуктом, и его можно легко обнаружить и определить количественно с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ). Следовательно, производство этанола может быть использовано в качестве модели для изучения влияния изменения нативного метаболизма хозяина на выход интродуцированной метаболической сети.

1.2 БиБП

Фруктозо-1,6-/седогептулозо-1,7-бисфосфатаза (далее именуемая ), является членом семейства , которое существует исключительно у цианобактерий. Это бифункциональный фермент, катализирующий одновременно две реакции – удаление фосфатной группы из фруктозо-1,6-бисфофата и седогептулозы-1,7-бисфосфата с образованием фруктозо-6-фосфата и седогептулозы-7-фосфата соответственно 4,5,6. В растениях эти две реакции катализируются отдельно ферментами фруктозо-1,6-бисфосфатазой () и Седогептулозо-1,7-бисфосфатазой ().

В растениях существует два типа в зависимости от местоположения фермента: цитозольная участвует в пути глюконеогенеза и синтезе сахарозы, в то время как хлоропластическая участвует в регенерации в цикле и синтезе крахмала 4. Оба типа требуют ионов двухвалентных металлов в качестве кофакторов, но цитозольная регулируется , в то время как хлоропластовая регулируется светозависимой ферродоксин-тиоредоксиновой системой 4. также требует ионов 2 + в качестве кофакторов, но он отличается от обоих типов тем, что он регулируется как ферродоксин-тиоредоксиновой системой, так и 4.

1.3 Фотосинтез и цикл

Фотосинтез можно разделить на две основные части: светозависимые реакции и светозависимые реакции, также известные как цикл Кэлвина-Бенсона-Бассема (цикл ). В светозависимых реакциях энергия фотонов используется для расщепления воды, высвобождая возбужденные электроны, которые проходят через цепь переноса электронов для выработки восстановительной энергии в виде , а также АТФ. Затем НАДФН и АТФ подаются в цикл , где они используются в серии реакций, в которых неорганический углерод в форме диоксида углерода связывается с органическими соединениями углерода. Эти органические соединения углерода затем поступают в различные другие метаболические пути и служат предшественниками для синтеза других метаболитов.

Сам цикл можно представить в виде трех основных частей: фиксация углерода, восстановление углерода и регенерация . Диоксид углерода фиксируется на акцепторной молекуле, рибулозобисфосфате (), реакция, катализируемая ферментом рибулозобисфосфаткарбоксилазой оксигеназой (), с образованием 2 молекул 3-фосфоглицерата, одна из которых поступает в другие метаболические пути, в то время как другая фосфорилируется АТФ, а затем восстанавливается до получают Глицеральдегид-3-фосфат (3). 3 подвергается серии реакций, потребляя в процессе одну АТФ, для регенерации акцепторной молекулы , завершая один оборот цикла.

Среди серии реакций в фазе регенерации - дефосфорилирование и , реакции, катализируемые одновременно у цианобактерий и отдельно и соответственно у растений. Реакция является первой реакцией, которая связывает углеродное соединение с регенерацией , и поэтому является уникальной для цикла , в то время как продукт реакции , фруктозо-6-фосфат (6), может быть либо дополнительно переработан в направлении регенерации , либо преобразован в глюкозо-6-фосфат (6) и вводятся в пути биосинтеза сахарозы и крахмала 8, 11, 12, 20. находится в точке разделения углерода между регенерацией и синтезом углеводов и, следовательно, является ключевым ферментом в цикле , стимулируя регенерацию 7.

1.4 Важность / в регулировании потока углерода в цикле

Многочисленные теоретические модели фотосинтеза 3, а также анализ метаболического контроля выявили в качестве потенциальной мишени для улучшения потока углерода через цикл 7-12. Было обнаружено, что при атмосферных условиях поток углерода через цикл ограничен двумя фазами цикла: карбоксилированием с помощью и регенерацией , и при атмосферных условиях поддерживается баланс, так что ни один из процессов не оказывает полного контроля на скорость фотосинтеза 8, 9, 14, 19. В то время как в регенерации участвуют многочисленные ферменты, многие из которых катализируют необратимые реакции, было показано, что оказывает наибольшее влияние на максимальную способность регенерации (), и что скорость ассимиляции углерода () наиболее чувствительна к , а также 7. Также теоретически было показано, что относительные количества различных ферментов в цикле не являются оптимальными для достижения максимальной скорости фотосинтеза, как при атмосферном, так и при повышенном 2 7. В частности, было показано, что количества и альдолазы, обе из которых действуют в фазе регенерации цикла , и , ниже, чем необходимо для достижения более высокой скорости фотосинтеза, в то время как ферменты в фотореспираторном пути находятся в изобилии 7.

Важность реакции в скорости регенерации и скорости ассимиляции углерода, отмеченная в теоретических исследованиях, была подтверждена экспериментальными данными. Антисмысловые растения табака, демонстрирующие ряд сниженных активностей по сравнению с диким типом, показали, что очень чувствителен к уровню активности , и что скорость регенерации линейно уменьшается с небольшим снижением активности 19. Эта чувствительность скорости регенерации к активности показывает, что уровень активности дикого типа ограничивает скорость регенерации , и что нормальных уровней в растениях дикого типа может быть достаточно только для поддержания скорости регенерации дикого типа 19.

Это влияние на фазу регенерации цикла отражается в сниженных скоростях усвоения углерода и темпах роста по сравнению с диким типом, а также в резком снижении уровня крахмала в антисмысловых растениях табака, при этом уровень крахмала дикого типа снижается до 5%. у трансгенных штаммов содержание крахмала составляет менее 15%. активности дикого типа 8. Это измененное распределение углерода соответствует роли как контролирующей баланс между экспортом углерода в биосинтез крахмала или сахарозы и регенерацией .  В соответствии с этими наблюдениями было показано, что увеличение реакции за счет сверхэкспрессии либо , либо в трансгенных растениях увеличивает скорость фотосинтеза и рост. Сверхэкспрессия из цианобактерии 7942 (далее именуемой 7942) в табаке, выращенном в атмосферных условиях, привела к увеличению конечного сухого вещества в 1,5 раза и увеличению скорости ассимиляции углерода в 1,24 раза 20.

Затем та же группа попыталась прояснить относительный вклад и в это увеличение скорости фотосинтеза путем избыточной экспрессии каждого фермента независимо в трансгенных растениях, показав, что, хотя избыточная экспрессия только приводила к увеличению скорости фотосинтеза, для достижения фенотипа требовалось гораздо большее увеличение ее активности по сравнению с ., выделяя как наиболее важную контрольную точку в регенерации , а является вторичной контрольной точкой 21. Это подтверждается антисмысловыми исследованиями и , которые показали, что вредный фенотип наблюдался только тогда, когда активность снижалась менее чем до 14% от дикого типа, в то время как снижение активности до 71% от дикого типа приводило к заметному снижению фотосинтетической активности 21.

Сверхэкспрессия в табаке, выращенном в окружающей среде 2 по . также были отмечены повышенные скорости фотосинтеза, а также повышенное накопление сахарозы и крахмала в течение дня по сравнению с контролем дикого типа 15. Также наблюдалось увеличение биомассы и площади листьев по сравнению с диким типом 15. Этот результат был воспроизведен Розенталем и др. при тех же условиях окружающей среды 2 17.

Исследования с другими трансгенными растениями показали аналогичные результаты. Сверхэкспрессия в пшенице также показала повышенную скорость усвоения углерода в условиях насыщения светом, что привело к увеличению биомассы растений, массы семян и количества колосьев на растение по сравнению с диким типом 14. Было показано, что транспластомный салат-латук, сверхэкспрессирующий из 7942, обладает 1,3-кратным увеличением фотосинтетической способности по сравнению с диким типом, а также 1,6-кратным увеличением веса в свежем виде, увеличением размеров листьев и увеличением количества листьев по сравнению с диким типом 24.

Томаты, сверхэкспрессирующие , показали не только повышенную скорость фотосинтеза, уровни сахарозы и крахмала, площадь листьев и накопление биомассы, но и повышенную устойчивость к холодовому стрессу 13. Аналогичным образом, у риса, сверхэкспрессирующего , наблюдалась толерантность к солевому и тепловому стрессу; однако увеличения роста по сравнению с диким типом не наблюдалось 25. Интересно, что другое исследование, в котором сверхэкспрессия , а не в рисе, смогла показать увеличение сухой массы листьев на площадь, высоты растения, а также содержания растворимых углеводов по сравнению с диким типом 26. Вполне возможно, что повышенная активность как , так и требуется для увеличения фотосинтетической способности и скорости роста, и точная величина повышенной активности может варьироваться от вида к виду.

Сверхэкспрессия в цианобактериях показала аналогичные результаты с точки зрения роста. Лян и др. показали, что сверхэкспрессия , помещенного под сильный, управляемый светом промотор 2 в 6803, приводила к увеличению скорости роста и накоплению биомассы, а также к увеличению содержания хлорофилла по сравнению с диким типом 27. Неопубликованные данные и соавт. с использованием морской цианобактерии 7002 показали, что помимо увеличения скорости роста с точки зрения времени удвоения, размеры клеток трансгенных линий также были намного больше при измерении. Скорость фотосинтетического переноса электронов, представленная эволюцией 2, также была увеличена.

Это исследование также подтвердило результаты антисмысловых экспериментов на растениях, в которых сообщалось об увеличении содержания растворимых углеводов, а также подчеркивало тот факт, что запасы углеводов в форме гликогена уменьшились, что указывает на измененное распределение конечных продуктов углерода в цикле . Это представляет интерес в контексте метаболической инженерии для химического производства, поскольку сверхэкспрессия может привести к увеличению потока углерода в направлении выделяемых химических веществ, таких как этанол.

Это потенциальное влияние сверхэкспрессии на химическое производство было оценено в исследовании . с использованием , фотосинтетического одноклеточного эукариота. . производит парамилон при выращивании в аэробных условиях, а при переходе на анаэробные условия превращает парамилон в сложные эфиры воска, ценное химическое вещество. У трансгенных линий было не только значительно увеличено производство биомассы, но и накопление парамилона и последующее производство восковых эфиров также были резко повышены по сравнению с диким типом 23. Это доказало, что сверхэкспрессия не только приводит к увеличению роста и накоплению биомассы, но также может увеличить химическую продукцию в модельных организмах за счет повышенного потока углерода в цикле .

Учитывая эти наблюдения, в предыдущей работе нашей лаборатории была предпринята попытка исследовать влияние сверхэкспрессии на скорость роста и выработку этанола модифицированного 6803. Кассету для производства этанола с генами(пируватдекарбоксилазы) и(алкогольдегидрогеназы), за которой следует, интегрировали в нейтральный сайт 0168 и помещали под контроль -индуцируемого промотора 11. Однако сверхэкспрессия не приводила к каким-либо изменениям скорости роста или выработки этанола по сравнению с контрольными штаммами.

Возможной причиной такого неожиданного результата являются условия, в которых культивировались штаммы. Культуры выращивали при интенсивности света 60 мкэ с 1% 2 при 30 ° ; в то время как было показано, что является важным регулятором потока углерода в цикле у высших растений и цианобактерий, сверхэкспрессия или может оказывать положительное влияние на скорость фотосинтеза и рост только тогда, когда регенерация ограничена, что имеет место не при всех условиях окружающей среды 11.

1.5 Влияние интенсивности света на углеродный поток штаммов, сверхэкспрессирующих

Поскольку цикл использует продукты фотосинтетической цепи переноса электронов для восстановления углерода, естественно, следует, что светонезависимые реакции ограничены светозависимыми реакциями, которые, в свою очередь, ограничены плотностью потока фотосинтетических фотонов (). Теоретические модели, постулирующие ограничивающие эффекты активности , предполагают, что цикл не ограничен количеством и ; следовательно, любая выгода от увеличения активности будет наблюдаться только в условиях насыщения светом, когда и не ограничивают сокращение углерода в цикле 7, 9, 10. Это подтверждается экспериментальными данными как на высших растениях, так и на цианобактериях.

Лефевр и соавт. продемонстрировали, что трансгенный табак, сверхэкспрессирующий , не показал какого-либо увеличения роста или скорости фотосинтеза при выращивании зимой с более короткими днями и меньшей интенсивностью освещения, в отличие от фенотипа, проявляющегося при выращивании при высокой интенсивности света 15. Это дополнительно определено количественно ., Которые показали, что значительное увеличение фотосинтетической активности в табаке, сверхэкспрессирующем , наблюдалось только выше порога интенсивности света, при этом наибольшее увеличение фотосинтетической активности по сравнению с диким типом, достигалось, когда трансгенные растения выращивали в условиях полного насыщения светом; те же авторы обнаружили, что тот же порог при сверхэкспрессии только или в табаке 20, 21.

Суточные измерения трансгенного табака также показали, что усвоение углерода было наиболее повышенным по сравнению с диким типом в полдень, в то время как в начале или в конце дня увеличения не было 17. Неопубликованные данные и др. показали, что у 7002, сверхэкспрессирующих , в то время как увеличение скорости фотосинтеза и роста наблюдалось как при высоком освещении, так и при нормальном освещении, фенотипы были более выражены у штаммов, культивируемых при насыщенном свете. Лян и др. в работе 6803 было показано, что положительный фенотип, связанный со сверхэкспрессией , наблюдался только у штаммов, культивируемых при интенсивности света 100 мкЕ, в то время как штаммы, культивируемые при интенсивности света 15 мкЕ, не демонстрировали тот же фенотип 27.

Интересно, что штаммы, сверхэкспрессирующие , на самом деле демонстрировали более медленные темпы роста, чем дикий тип, и более медленное увеличение содержания хлорофилла а 27. Это доказывает, что в то время как при высокой интенсивности света сверхэкспрессия приводит к более быстрому росту, при низкой интенсивности света сверхэкспрессия фактически ингибирует рост клеток 6803. Примечательно, что эта тенденция присутствует не только в сверхэкспрессии , но и в сверхэкспрессии , и 27.

Очевидно, что когда свет ограничен, попытки ускорить цикл контрпродуктивны; поскольку светозависимые реакции на самом деле являются этапами, ограничивающими скорость, а не циклом . В частности, поскольку для регенерации требуются и , следовательно, она обусловлена фотосинтетическим переносом электронов и, следовательно, зависит от интенсивности света; регенерация может быть ограниченной только при насыщении светом.

1.6 Влияние 2 на углеродный поток штаммов, сверхэкспрессирующих

Другим условием роста, которое может повлиять на эффективность сверхэкспрессии , является концентрация 2. Поскольку цикл совместно ограничен регенеративной фазой и реакцией фиксации углерода в атмосферных условиях, изменение баланса между этими двумя процессами зависит от относительной активности двух основных ферментов, управляющих каждым процессом, а именно и , соответственно 8, 9. является основным ограничивающим фактором при атмосферных условиях из-за его низкой специфичности, что приводит к низкой скорости оборота.

Помимо карбоксилирования , также катализирует окисление из-за его неспособности различать2 и 2, что приводит к бесполезной побочной реакции, продукт которой токсичен и создает метаболическую нагрузку на организм при превращении его в нетоксичное соединение для повторного использования в цикле . При атмосферном 2 равновесие между реакциями карбоксилирования и оксигенации таково, что карбоксилирование является основным ограничивающим фактором в потоке углерода 8, 9, 10, 14, 17.

Однако при повышенных концентрациях 2 равновесие смещается в пользу реакции карбоксилирования, снижая скорость реакции оксигенации до незначительной 11. больше не ограничивает при повышенном 2, и ограничение цикла смещается на регенерацию 14, 17. Теоретически, увеличение способности к регенерации за счет усиления реакции , следовательно, может быть наиболее полезным при насыщении 2.

Гипотеза о том, что сверхэкспрессия или при повышенном 2 приведет к наиболее продуктивному воздействию на фотосинтез, подтверждается экспериментальными данными. Трансгенный табак, сверхэкспрессирующий , демонстрировал наибольшее увеличение фотосинтетической активности по сравнению с диким типом в условиях насыщения 2 17.

В то время как трансгенный табак также демонстрировал увеличение биомассы по сравнению с диким типом в условиях окружающей среды 2, это увеличение было более выраженным при выращивании в условиях повышенного содержания 2, а также при более высоком накоплении растворимых углеводов 20. Эти результаты были также подтверждены на пшенице, выращенной в условиях насыщения 2 14. , выращенная как при высокой интенсивности света, так и 2, демонстрировала как увеличенный объем клеток, так и скорость роста, в то время как штаммы, выращенные при сильном освещении, показали только увеличенный объем клеток, а выращенные в условиях окружающей среды не показали увеличения скорости роста выше дикого типа 23.

Фактически, рост дикого типа ингибировался в условиях окружающей среды 2 при сильном освещении из-за того, что избыток восстановителя, вырабатываемого цепью переноса электронов, не мог быть израсходован циклом ; это было подтверждено восстановлением скорости роста дикого типа за счет увеличения 2 23.

С другой стороны, не всегда было показано, что высокий 2 необходим для увеличения роста и скорости фотосинтеза у штаммов, сверхэкспрессирующих или . Соя, сверхэкспрессирующая , показала повышенную ассимиляцию углерода и скорость фотосинтеза как в условиях окружающей среды, так и при повышенном 2 уровне по сравнению с диким типом, в то время как трансгенные штаммы были способны поддерживать урожай семян при повышенном 2 и температуре, а дикий тип - нет 22.

Было показано, что трансгенный табак и пшеница обладают повышенным фотосинтезом как при окружающей среде, так и при повышенном 2, хотя увеличение было более выраженным при повышенном 2, и было показано, что штаммы 6803, сверхэкспрессирующие , имеют более высокие скорости роста при окружающей среде 2 при высокой интенсивности света 14, 20, 21, 27. Следовательно, хотя повышенный 2 теоретически максимизирует преимущества сверхэкспрессии или за счет увеличения реакции карбоксилирования и смещения стадии ограничения скорости на регенерацию , экспериментальные данные показывают, что это не обязательно является требованием для увеличения потока углерода в цикле , даже если это может усилить положительный эффект влияние на фотосинтез.

1.7 Цели проекта

Чтобы проверить гипотезу о том, что предыдущая работа в нашей лаборатории, показывающая, что сверхэкспрессия не приводила к увеличению скорости роста или выработки этанола у штаммов, продуцирующих этанол, 6803, из-за неоптимальной интенсивности света и 2, из 6803 был сверхэкспрессирован у дикого типа 6803 и 7002 и культивировался при высокой интенсивности света в течение 7 дней, с целью воспроизведения результатов, показанных . и де Порчеллинис и др. с точки зрения усиления роста. 6803 штамма, продуцирующие этанол, сверхэкспрессирующие , были повторно оценены при более высокой интенсивности света, и через 7 дней измерили скорость роста и выработку этанола.

Материалы и методы

2.1 Условия культивирования

6803 штамма были культивированы в среде -11. Культуры выращивали в колбах, содержащих 25 мл среды -11 при 30°, вращательном встряхивании 130, при окружающей среде 2 и интенсивности света, и добавляли спектиномицин в конечной концентрации 50 мкг/мл или гентамицин в конечной концентрации либо 50 мкг/мл на агаровых чашках, либо 0,5 мкг/мл.мЛ в жидкой среде. Рост контролировали при 730 нм с использованием спектрофотометра 200 ( . Швейцария).

7002 штамма культивировали в среде А+ с добавлением витамина В12 при конечной концентрации 4 мкг/мл. Культуры выращивали в колбах, содержащих 25 мл среды + при 30°, вращательном встряхивании 130, при окружающей среде 2 и интенсивности света, и добавляли спектиномицин в конечной концентрации 50 мкг/мл или гентамицин в конечной концентрации 50 мкг/мл.  Рост контролировали при 730 нм с использованием спектрофотометра 200 ( . Швейцария).

Штаммы . выращивали при 37°С в среде бульона Лурии с добавлением соответствующего антибиотика в следующих конечных концентрациях: спектиномицин в дозе 50 мкг/мл, гентамицин в дозе 10 мкг/мл, хлорамфеникол в дозе 50 мкг/мл и карбенициллин в дозе 50 мкг/мл.

2.2 Конструкции

В экспериментах по анализу роста использовались две конструкции, сделанные предыдущими сотрудниками лаборатории, полученные из самореплицирующегося вектора 1010,содержащегоген из 6803, - и -143. Плазмиду, полученную из 1010, содержащую ген , использовали в качестве контроля для конструкций. Конструкции экстрагировали из запасов глицерина . 5 с использованием набора -, концентрацию ДНК определяли количественно с использованием 200 от , и образцы отправляли в для диагностического секвенирования, чтобы подтвердить наличиегена .

2.3 Флуоресценция

-, плазмида, полученная из 1010, содержащая ген , использовалась в качестве контроля для экспрессии конструкций . Через 7 дней после индукции 100 мкл культуры добавляли в 96-луночный планшет и снимали показания поглощения и флуоресценции с помощью спектрофотометра 200 (поглощение: 730 нм; возбуждение 503 нм; излучение 540 нм). Флуоресценцию нормировали по оптической плотности при 730 нм.

2.4 Конъюгация трех родителей

Штамм . 134, содержащий 623, инокулировали в 5 мл с добавлением 50 мкг/мл хлорамфеникола и инкубировали в течение ночи при 37°. Плазмиды - или -143 трансформировали в компетентные клетки 134 с помощью теплового шока, и трансформированные клетки штамма инокулировали в 5 мл с добавлением 50 мкг/мл хлорамфеникол и инкубировали в течение ночи при 37°. Затем 1 мл ночных культур отжимали, 3 раза промывали средой для удаления антибиотиков и ресуспендировали в 500 мкл .

Конъюгированный штамм . 135, содержащий 443, инокулировали в 5 мл среды с добавлением 50 мкг/мл карбенициллина в течение ночи при 37°. Затем 1 мл культур отжимали, промывали средой 3 раза для удаления антибиотиков и ресуспендировали в 500 мкл .

Штаммы 6803 или 7002 культивировали при 730 0,8-1,0. Затем 1 мл культур отжимали и дважды промывали средой -11 или + и ресуспендировали в 500 мкл среды -11 или +.

По 100 мкл каждого грузового штамма, конъюгированного штамма и цианобактерий смешивали и инкубировали в течение 2 часов при 60 мкЕ при 1% 2 с вращательным встряхиванием 130. Затем смеси переносили на агаровые чашки без антибиотиков и инкубировали в течение 2 дней, после чего использовали 500 мкл среды -11 или + для переноса клеток на агаровую чашку, дополненную соответствующим антибиотиком. Затем планшеты инкубировали в течение 10-14 дней.

2.5 Анализ роста

Анализ роста проводили на мультикультиваторе 1000 (1000). Стартовые культуры выращивали при температуре 30° при окружающем освещении и 2 до тех пор, пока они не достигли значений 730, по меньшей мере, 0,4. Затем культуры инокулировали в 50 мл -11 или + с добавлением соответствующего антибиотика и витамина 12 в случае + до начального 730 0,2-0,3. Добавляли до конечной концентрации 1 мм. Все штаммы культивировали в 1000 в течение 7 дней с 6803 штаммами при интенсивности света 250 мкЕ и 7002 штаммами при интенсивности света 1000 мкЕ. Измерения 720 производились автоматически каждые 30 минут.

2.6 Производство этанола

Существующие штаммы 6803, продуцирующие этанол, содержали продуцирующую этанол кассету и, а такжепод промотором 11, интегрированным в нейтральный сайт 0168. Через 7 дней после индукции 1 мл каждой культуры отжимали при 4000 в течение 10 минут. Затем супернатант анализировали. Количественное определение этанола проводили с использованием системы ВЭЖХ серии 1200 фирмы . Элюентом была 5 мМ серная кислота в воде класса ВЭЖХ со скоростью потока 0,6 мл/мин. Для обнаружения сигнала использовался детектор показателя преломления.

2.7 Подготовка образца для масс-спектрометрического анализа

Через 7 дней после индукции 25 мл каждой культуры отжимали при 5000 об/мин в течение 10 минут при 4°. Гранулы ресуспендировали в 1,5 мл среды -11 или + и снова отжимали. Затем гранулы ресуспендировали в 500 мкл экстракционного буфера (1 м Трис- 8,0, 0,25 м , 1 М ) и отжимали при 18000 при 4 в течение 10 минут. Гранулы ресуспендировали в 1000 мкл экстракционного буфера и добавляли 500 мкл промытых кислотой 0,1 мм гранул кремнезема/циркония (. ). Клетки разрушали путем завихрения в течение 7,5 минут при частоте 30 Гц. Затем надосадочную жидкость отжимали при 21000 в течение 10 минут при 4° для удаления неповрежденных клеток и остатков.

2.8 Количественное определение белка с помощью

Идентификация и количественная оценка проводились с использованием установленного протокола, разработанного предыдущим членом группы. 3 пептида использовали для и 2 пептида для , с 2-4 переходами на пептид. Для 6803 относительную количественную оценку проводили с использованием относительных пиковых интенсивностей, нормализованных к относительным пиковым интенсивностям нативного стандарта . Из-за нехватки времени внутренний стандарт для 7002 с сигнатурными пептидами и оптимальными переходами для обнаружения был недоступен. Следовательно, количественное определение 6803 в 7002 штаммах проводилось без нормализации.

был сконфигурирован с источником , с газом 1 и 2, установленным на 40 и 60 соответственно, температурой источника, установленной на 500, и напряжением ионного распыления, установленным на 5500 В. , сконфигурированный с включенной высокой массой, использовался в режиме ‘Тройной четверной’ для многократного мониторинга реакции. Данные были собраны и проанализированы с использованием 1.6.1 и 3.0.

Результаты

Существующие продуцирующие этанол штаммы 6803, сверхэкспрессирующие , были повторно оценены при более высокой интенсивности света. Предыдущая работа включала культивирование при интенсивности света 60 мкЕ, в то время как в этой работе интенсивность света была увеличена до 250 мкЕ. Штаммы 6803, трансформированные с помощью конструкции -, использовались в качестве контроля роста, а не дикого типа из-за технической ошибки. Скорость роста продуцентов этанола, независимо от сверхэкспрессии , была медленнее, чем в контроле, что показано более поздним приближением к стационарной фазе (фиг. 5), и не было никакой статистической разницы в конечном 720 через 7 дней между продуцентом этанола, сверхэкспрессирующим , и контрольным штаммом этанола и контрольным штаммом (фиг.5).

Выработку этанола сравнивали с контролем, вырабатывающим этанол, , после 7 дней в 1000 при 250 МКЭ. В то время как среднее количество этанола, продуцируемого штаммом, сверхэкспрессирующим , было значительно ниже, чем у контрольного, при учете выброса в одной из контрольных повторов, не было существенной разницы в количестве продуцируемого этанола между контрольным и сверхэкспрессирующим штаммом (рис.5). Однако количество было значительно выше в по сравнению с .

4 Обсуждение

Теоретически и экспериментально было продемонстрировано, что является важной контрольной точкой для потока углерода в цикле . Предыдущая работа нашей лаборатории показала, что сверхэкспрессия -в производящем этанол 6803 не приводила ни к увеличению роста, ни к производству этанола. Чтобы понять, почему сверхэкспрессия не приводила к увеличению фотосинтетической ассимиляции углерода, подтвержденной экспериментальными данными других групп, было исследовано влияние интенсивности света на эффект сверхэкспрессии . Лян и др. показали, что 6803 сверхэкспрессирующих демонстрируют повышенную скорость роста по сравнению с диким типом только при интенсивности света 100 мкЕ, в то время как при интенсивности света 15 мкЕ трансгенные штаммы фактически росли медленнее, чем дикий тип 27.

Неопубликованные результаты и соавт. показали, что для 7002 высокая интенсивность света 1500 мкЕ приводит к более выраженному увеличению скорости роста относительно дикого типа, а также к увеличению размера клеток по сравнению с интенсивностью света 250 мкЕ. Чтобы попытаться воспроизвести эти результаты, штаммы 6803 и 7002 дикого типа трансформировали самореплицирующейся плазмидой, содержащей ген , и контролировали рост в течение 7 дней при интенсивности света 250 мкЕ для штаммов 6803 и интенсивности света 1000 мкЕ для штаммов 7002. Существующий продуцирующий этанол штамм 6803, сверхэкспрессирующий из нашей лаборатории, выращивали при 250 МКЭ в течение 7 дней, и контролировали рост, а выработку этанола определяли количественно через 7 дней.

Ни один из штаммов цианобактерий, сверхэкспрессирующих , не показал увеличения роста при высокой интенсивности света по сравнению с контрольными штаммами, а также у продуцентов этанола, сверхэкспрессирующих , не наблюдалось увеличения выработки этанола, что согласуется с результатами предыдущей работы нашей лаборатории, несмотря на результаты , показывающие, чтоуровниэкспрессии были выше у 6803 штаммов, чем контрольные штаммы. Результаты для 7002 были недоступны, поскольку внутренний стандарт с оптимальными пептидами и переходами еще не был определен.

Теоретические и экспериментальные данные доказали, что сверхэкспрессия оказывает положительное влияние на усвоение углерода только в условиях, когда регенерация не ограничивается АТФ и 9, 15, 20, 21. Так почему же культивирование штаммов при насыщении светом, когда АТФ и НАДФН не должны быть лимитирующими, не привело к какому-либо увеличению роста при избыточной экспрессии ? Первая причина может заключаться в том, что культуры не были насыщены 2. является наиболее важным ферментом, определяющим скорость регенерации . Следовательно, обеспечивает наибольший контроль за усвоением углерода, когда регенерация является ограничивающим скорость этапом в цикле .

При атмосферном 2 регенерация и карбоксилирование совместно ограничивают скорость фотосинтеза 8, 9, 12; поскольку карбоксилирование ограничено реакцией оксигенации при атмосферном 2, увеличение регенерации в этих условиях все еще оставляет цикл ограниченным скоростью карбоксилирования . При повышении 2 равновесие между реакциями карбоксилирования и оксигенации сдвигается таким образом, что скорость окисления становится незначительной, улучшая скорость карбоксилирования и смещая ограничение потока углерода в сторону регенерации 12.

Поскольку эксперименты проводились при атмосферном 2, отсутствие увеличения усвоения углерода у штаммов, сверхэкспрессирующих , может быть связано с тем, что регенерация не ограничивает цикл ; следовательно, сверхэкспрессия приводит к избытку , который не может потребляться с той же скоростью.

С другой стороны, Лян и др. показали увеличение скорости роста 6803 сверхэкспрессирующих при интенсивности света 100 мкЕ при ‘окружающем’ 2 27. Как это возможно в условиях, когда ограничение потока углерода по-прежнему равномерно распределяется между регенерацией и карбоксилированием? Ответом может быть влияние различных промоторов, контролирующихген . В этой работе были использованы две конструкции для сверхэкспрессии , обе на основе самовоспроизводящегося вектора 1010 и содержащие -индуцируемые промоторы 11 и 143. Лян и др. использовали плазмиду 1, также полученную из самореплицирующегося вектора 1010, и поместилипод промотор 2, сильный, индуцируемый светом промотор, нативный для 6803, который управляет транскрипцией генов фотосистемы 27.

Хотя количество белка, экспрессируемого в трансгенных линиях, не упоминалось в работе ., возможно, что увеличение скорости роста трансгенных штаммов при высокой интенсивности света в отличие от низкой интенсивности света было обусловлено различными уровнями индукции и скоростями транскрипции.

В многочисленных исследованиях были сделаны наблюдения о плейотропном эффекте или на . Было показано, что соя, сверхэкспрессирующая , увеличивает максимальную скорость карбоксилирования (, ) 22. У табака, сверхэкспрессирующего , , также был увеличен по сравнению с диким типом при выращивании в тепличных условиях, но не в условиях открытого грунта 15, 17.

В атмосферных условиях, в то время как общая активность оставалась неизменной, было показано, что трансгенный табак обладает повышенной начальной активностью по сравнению с диким типом, что соответствует увеличению активации 20, 21. Неопубликованные данные и др. также было показано, что в условиях 3% 2 не только общая активность повышалась по сравнению с диким типом, наблюдались изменения в активности других ферментов. В частности, альдолаза, участвующая в регенерации выше по течению от , также была повышена в активности, в то время как ферменты, участвующие в путях катаболизма углерода, таких как окислительный пентозофосфатный путь и гликолиз, имели либо уменьшение количества, либо изменение посттрансляционных модификаций, так что катаболизм углерода подавлялся.

Поскольку активность , наряду с регенерацией , является ограниченной в цикле в условиях атмосферного 2, тот факт, что сверхэкспрессия может привести к сопутствующему увеличению активности , может объяснить, почему одна только сверхэкспрессия может привести к увеличению скорости фотосинтеза и последующей скорости роста. . также сообщается, что избыточная экспрессия сама по себе не приводит ни к одному из этих изменений.

Учитывая, что увеличение общей активности наблюдается не во всех исследованиях и при разных условиях, существует ли порог либо в интенсивности света, либо в 2, либо в количестве , который приводит к увеличению активности у штаммов со сверхэкспрессией ? Вполне вероятно, что достаточное количество или может увеличить активность до такого уровня, что даже при атмосферном 2 скорость реакции карбоксилирования увеличивается достаточно, чтобы привести к заметному увеличению ассимиляции углерода. Хотя было высказано предположение, что повышенное содержание , вызванное сверхэкспрессией , приводит к увеличению активации , точный механизм, с помощью которого влияет на состояние активации и активность , остается неизвестным.

Следующие шаги

Поскольку 1000 допускает только восемь культур одновременно, культивирование трех повторов для каждого штамма, сверхэкспрессирующего , привело к использованию только одной репликации для каждого контрольного штамма роста; таким образом, статистическая значимость не может быть определена для данных анализа роста. Таким образом, наблюдения, сделанные в этой работе, являются лишь предварительными, и какие-либо конкретные интерпретации могут быть сделаны только после проведения дополнительных экспериментов для многократных повторений контрольных штаммов.

 был сверхэкспрессирован у 6803 производителей этанола, использованных в этом исследовании, посредством хромосомной интеграционной кассеты с вкачестве третьего гена оперона, послеи. В то времякак был успешно сверхэкспрессирован, количество было намного выше в штаммах, содержащих конструкции -. Дальнейшие исследования с производителями этанола должны быть проведены путем преобразования с помощью конструкций - для увеличенияуровнейэкспрессии .

Первоначальная идея этого проекта состояла в том, чтобы изучить влияние как интенсивности света, так и 2 на рост и выработку этанола у штаммов, сверхэкспрессирующих . Однако, как из-за нехватки времени, так и из-за поломки двух инкубаторов , культивирование можно было проводить только при высокой интенсивности света при атмосферном 2. Будущие эксперименты будут включать в себя завершение первоначальной цели этого исследования и проведение анализа роста при высокой 2 наряду с высокой интенсивностью освещения, а также сравнение роста и выработки этанола со штаммами, культивируемыми при низкой интенсивности света и атмосферном 2. Если результаты этого текущего исследования связаны с тем, что регенерация не является основным ограничивающим этапом из-за атмосферного 2, повторение экспериментов при высоком 2 должно дать положительные результаты.

Размер клеток относительно штамма дикого типа также должен быть измерен для штаммов в этой работе и любой последующей работе. Было показано, что у , сверхэкспрессирующей , увеличен объем клеток, но не скорость роста при атмосферном 2; как объем клеток, так и скорость роста были увеличены по сравнению с диким типом при повышенном 2 23. Об увеличении объема клеток в штаммах 7002 со сверхэкспрессией также сообщили . Поскольку культуры могут демонстрировать увеличенный размер клеток без увеличения оптической плотности, возможно, что клетки в этой работе действительно испытали увеличение роста в виде увеличения размера клеток, но не удвоения времени. Сухая масса культур также может быть измерена как еще один показатель увеличения роста, отличный от оптической плотности.

7002 штамма, выращенные при интенсивности света 1000 мкЕ при начальном 0,2-0,4, показали признаки фотообесцвечивания после 3 дней культивирования. Это было неожиданно, поскольку известно, что 7002 устойчив к высокой интенсивности света, и в работе . Не сообщалось о фотообесцвечивании штаммов, культивируемых при интенсивности света 1500 мкэ. Фотообесцвечивание также не было зарегистрировано Декстером и Фу в их работе, гдепродуцирующие этанол штаммы 6803 культивировали в биореакторной системе 110 при 1000 мкЕ 1. Это несоответствие может быть связано с задействованными объемами культивирования, поскольку штаммы в работе и культивировались при 3,1 л. Однако, поскольку 1000 допускает максимальный объем только 80 мл на культуру, штаммы следует выращивать до более высокого начального перед культивированием при высокой интенсивности света в будущем работать.

Следует также исследовать несколько других фенотипов, о которых сообщили другие лаборатории. Регуляторное действие на другие ферменты углеродного метаболизма, особенно , следует изучить с помощью . Интересным вопросом было бы, существует ли линейная зависимость между увеличением экспрессии и состоянием активации, количеством и активностью ; это имело бы большое значение для выяснения взаимодействия между и . . также сообщалось о подавлении ферментов, участвующих в катаболизме углерода, результаты, которые не были подтверждены другими исследованиями. Было бы целесообразно подтвердить эти утверждения с помощью для количественной оценки количества этих ферментов по сравнению с контролем.

Ссылки

Декстер, Дж. и Фу, П. (2009). Метаболическая инженерия цианобактерий для производства этанола. Наука об энергетике и окружающейсреде, 2 (8), стр.857.

Гао, З., Чжао, Х., Ли, З., Тан, Х. и Лу, Х. (2012). Фотосинтетическое производство этанола из диоксида углерода у генетически модифицированных цианобактерий. Энергетическая экология. Наука, 5 (12), с.9857-9865.

Декстер, Дж., Армшоу, П., Шихан, К. и Пембрук, Дж. (2015). Состояние автотрофной выработки этанола у цианобактерий. Журнал прикладной микробиологии, 119 (1), стр. 11-24.

Фенг Л., Сун Ю., Дэн Х., Ли Д., Ван Дж., Ван Х., Ван У., Ляо Х., Рен Ю. и Ху Х. (2013). Структурная и биохимическая характеристика фруктозо-1,6/седогептулозо-1,7-бисфосфатазы из штамма 6803. Журнал , 281 (3), стр.916-926.

Тамои, М., Мураками, А., Такеда, Т. и Сигеока, С. (1998). Приобретение нового типа фруктозо-1,6-бисфосфатазы с устойчивостью к перекиси водорода у цианобактерий: молекулярная характеристика фермента из 6803.  () – Структура белка и молекулярная энзимология, 1383 (2), стр.232-244.

Цзян, Ю., Ван, Д. и Вэнь, Дж. (2012). Независимое прокариотическое происхождение эукариотической фруктозо-1,6-бисфосфатазы и седогептулозы-1,7-бисфосфатазы и значение их происхождения для эволюции цикла у эукариот.  Эволюционная биология, 12 (1), стр.208.

Чжу, Х., де Стурлер, Э. и Лонг, С. (2007). Оптимизация распределения ресурсов между ферментами углеродного метаболизма может значительно увеличить скорость фотосинтеза: численное моделирование с использованием эволюционного алгоритма. ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 145(2), с.513-526.