Ботулинический токсин типов А и B для инъекций

БОТУЛИНИЧЕСКИЙ ТОКСИН ТИПА А ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ

Toxinum botulinicum A ad iniectabile

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Ботулинический токсин типа А для инъекций представляет собой высушенное вещество, содержащее очищенный ботулинический нейротоксин типа А, который может входить в состав комплекса с гемагглютининами и нетоксичными белками. Ботулинический нейротоксин типа А или его комплекс с гемагглютинином изготавливают путем соответствующего процесса очистки надосадочной жидкости бульонной культуры подходящего штамма Clostridium botulinum типа А.

Очищенные комплексы состоят из нескольких белков и могут различаться по размеру. Самый крупный комплекс (относительная молекулярная масса около 900 000 Да) включает в себя нейротоксин с относительной молекулярной массой 150 000 Да, нетоксичный белок с относительной молекулярной массой 130 000 Да и различные гемагглютинины, относительная молекулярная масса которых варьируется от 14 000 до 43 000 Да. Очищенный токсин состоит только из нейротоксина с относительной молекулярной массой 150 000 Да, аналогичного тому, который входит в состав комплекса с молекулярной массой в 900 000 Да. Изначально в процессе производства комплекса получают одну цепь, а затем ее расщепляют (разрывают) с помощью эндогенных протеаз для получения полностью активной легкой цепи с относительной молекулярной массой 54 000 Да, связанной дисульфидным мостиком с тяжелой цепью с относительной молекулярной массой 97 000 Да.

Перед применением ботулинический токсин восстанавливают в соответствии с инструкциями на этикетке.

ПРОИЗВОДСТВО

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

В производстве токсина используются посевные культуры, на основе которых создают систему посевных материалов, сохраняющую способность продуцировать токсин. Необходимо продемонстрировать, что метод производства позволяет на постоянной основе получать препарат, сопоставимый по активности и характеристикам с теми партиями, которые были признаны в достаточной степени безопасными и эффективными в ходе клинических исследований.

Метод производства валидируют, чтобы показать, что в случае проведения испытаний препарат будет выполнять требования общего испытания на аномальную токсичность (2.6.9) при использовании, как минимум, максимальной терапевтической дозы для человека и достаточного количества соответствующего ботулинического антитоксина типа А для нейтрализации.

Метод производства и стабильность готового препарата и тех промежуточных продуктов, для которых это актуально, оценивают с помощью испытаний, описанных ниже. Они включают вычисление удельной активности на мг белка очищенного токсина в подходящей функциональной модели активности токсина и могут сопровождаться анализами, подтверждающими присутствие ботулинического токсина типа А, а также, в соответствующих случаях, примесных нетоксичных белков.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПОСЕВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Высокотоксигенный штамм C. botulinum, продуцирующий токсин типа А и не имеющий генов, кодирующих выработку других ботулинических токсинов (а именно, токсинов типа B и F), с проверенными данными об источнике и развитии, выращивают на соответствующих средах. Бактериальный штамм, используемый для создания главного посевного материала, следует идентифицировать по сделанным ранее записям, содержащим информацию о происхождении этого штамма и испытаниях, которые были проведены для описания его характеристик, в том числе информацию о морфологических, культуральных, биохимических, генетических и серологических свойствах штамма. Там, где это применимо, следует продемонстрировать идентичность профилей главного и посевного материалов. Допускается использование только тех посевных материалов, которые отвечают нижеприведенным требованиям.

Подлинность. Каждый посевной материал должен представлять собой чистую культуру C. botulinum типа А, не контаминированную другими бактериями или грибами.

Микробиологическая чистота. Каждый посевной материал должен соответствовать требованиям к отсутствию контаминирующих микроорганизмов. Для проверки чистоты бактериальных культур применяют методы, обладающие соответствующей чувствительностью. Они могут предполагать инокуляцию подходящих питательных сред и изучение морфологических свойств колоний.

Фенотипические особенности. Для каждого посевного материала должен быть известен качественный и количественный состав жирных кислот, особенности расщепления сахаров (глюкозы, лактозы, маннозы и т.д.) и протеолитическая активность. Посевные материалы должны иметь надлежащую липазную, лецитиназную и желатиназную активность.

Генетическая чистота. Для каждого посевного материала должна быть известна последовательность гена токсина. Посевные материалы должны соответствовать требованиям к отсутствию посторонних генов, кодирующих продукцию токсинов другого серотипа.

Производство активного токсина. Может использоваться любой бактериальный штамм, который, по результатам испытания на острую токсичность, продуцирует большое количество активного токсина. Посевные материалы должны быть способны обеспечивать, по крайней мере, минимальную токсичность, достаточную для процесса и объемов производства.

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ

В ходе разработки утверждаются стандартные образцы для последующих проверок однородности характеристик серий при производстве и для контроля нерасфасованного очищенного токсина и готового препарата. Эти образцы получают из репрезентативных серий ботулинического токсина типа А, для которых проводят исследования по описанию свойств согласно разделу «Нерасфасованный очищенный токсин».

Стандартные образцы должны быть охарактеризованы соответствующим для их предполагаемого применения образом и храниться в виде аликвот подходящего размера в таких условиях, которые гарантируют их пригодность для применения.

НЕРАСФАСОВАННЫЙ ОЧИЩЕННЫЙ ТОКСИН

Чтобы обеспечить условия для получения максимального количества токсина, штамм C. botulinum типа А выращивают в анаэробных условиях на подходящей питательной среде, отбирают из этого штамма культуры для последующих этапов инкубации в контролируемых соответствующим образом анаэробных условиях, затем переходят к этапам культивирования посевного материала и ферментации нерасфасованной массы. Чтобы удалить нуклеиновые кислоты и компоненты, которые могут приводить к нежелательным реакциям, токсин очищают подходящими методами.

Для подготовки готового нерасфасованного лекарственного средства можно использовать только очищенный токсин, который соответствует всем нижеперечисленным требованиям. Для каждого испытания и каждого препарата устанавливаются допустимые пределы, которым должен соответствовать каждый новый очищенный токсин.

Остаточные реактивы. Удаление остаточных реактивов, которые использовались на этапах очистки, подтверждают с помощью подходящих испытаний на допустимое содержание или посредством валидации процесса.

Нуклеиновые кислоты. Удаление нуклеиновых кислот подтверждается подходящими испытаниями на допустимое содержание или посредством валидации процесса.

Подтверждение подлинности иммунохимическим методом. Присутствие конкретного токсина типа А подтверждают подходящим иммунохимическим методом (2.7.1).

Удельная активность. Удельная активность подтверждается с использованием мышиной модели токсичности или методов in vivo/ex vivo, прошедших валидацию с точки зрения определения средней смертельной дозы (LD50), и выражается в единицах LD50 для мышей на мг белка. Специфическая активность токсина с относительной молекулярной массой 150 000 Да должна быть не ниже 1108 LD50 для мышей на мг белка, а специфическая активность комплекса нейротоксина с относительной молекулярной массой 900 000 Да – 1107 LD50 для мышей на мг белка.

Белок. Суммарная концентрация белка определяется подходящим методом. Каждая серия должна соответствовать допустимым значениям, установленным для данного препарата.

Белковый профиль. Подлинность и белковый состав определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (2.2.31) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях или с помощью других подходящих физико-химических методов анализа, например, эксклюзионной хроматографии (2.2.30), сравнивая испытуемые образцы с подходящими стандартными образцами.

Общее количество жизнеспособных микроорганизмов. Общее количество жизнеспособных микроорганизмов должно соответствовать пределам, установленным для определенного препарата.

ГОТОВОЕ НЕРАСФАСОВАННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

Готовое нерасфасованное лекарственное средство получают путем добавления одобренных вспомогательных веществ к очищенному токсину в нерасфасованном виде. Раствор пропускают через фильтр, задерживающий бактерии. Если добавляется альбумин человека, то должны соблюдаться требования монографии № 0255 «Раствор альбумина человека».

ГОТОВАЯ ПАРТИЯ

Готовое нерасфасованное лекарственное средство в стерильных условиях фасуют в стерильные упаковки с контролем первого вскрытия. Однородность по массе проверяется в ходе заполнения упаковок, проводить испытание на однородность содержания действующего вещества (2.9.6) не требуется. Упаковки укупоривают таким образом, чтобы избежать контаминации.

Разрешается выпуск только тех серий, которые отвечают требованиям, установленным для этого конкретного препарата, и удовлетворяют каждому из требований, перечисленных далее в разделах «Подлинность», «Испытания» и «Количественное определение».

Определение pH (2.2.3). pH восстановленного препарата не должен отличаться от одобренного для конкретного препарата предела больше, чем на ±0,5 единиц.

Определение воды. Содержание воды не должно превышать предел, одобренный для конкретного препарата.

ПОДЛИННОСТЬ

Присутствие ботулинического токсина типа А подтверждают соответствующим иммунохимическим методом (2.7.1).

ИСПЫТАНИЯ

Стерильность (2.6.1). Препарат должен отвечать требованиям испытания на стерильность.

Бактериальные эндотоксины (2.6.14). Содержание бактериальных эндотоксинов в одном флаконе препарата должно быть менее 10 МЕ.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

В соответствии с положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, в испытаниях должно использоваться минимальное количество животных, и необходимо как можно меньше причинять им боль и подвергать страданиям, стрессовым переживаниям или длительному отрицательному воздействию. Определение средней смертельной дозы (LD50) мучительно для животных, поэтому производителям настоятельно рекомендуется разработать и валидировать методы количественного определения, которые позволят сократить количество используемых животных, или же усовершенствовать или заменить процедуру испытания с целью соблюдения принципов гуманного обращения с животными.

Активность восстановленного препарата оценивают посредством определения LD50 для мышей или с помощью метода, который прошел валидацию в сравнении с количественным определением LD50. Активность выражается в виде LD50 для мышей или относительно стандартного образца.

Для определения LD50 группам мышей внутрибрюшинно вводят возрастающие дозы препарата и вычисляют значение LD50 по летальности мышей в каждой группе, используя обычные статистические методы (5.3). Параллельно проводят количественное определение для стандартного образца; активность токсина выражается относительно референтного значения, или же значение, полученное для стандартного образца, должно укладываться в определенные пределы заданной активности.

После валидации количественного определения LD50 (эталонный метод), препарат можно также проанализировать и другими методами, которые более предпочтительны с точки зрения гуманного обращения с животными. Например, могут использоваться биологические методы количественного определения на мышах, где в качестве конечной точки выступает паралич, методы количественного определения ex vivo с использованием диафрагмального нерва/диафрагмы мыши, методы количественного определения in vitro по активности эндопептидазы или методы количественного определения в культуре клеток.

Для альтернативных заменяющих методов активность рассчитывается по отношению к подходящему стандартному образцу, откалиброванному в единицах LD50 для мышей.

Рассчитанное значение активности должно составлять не менее 80 % и не более 125 % от указанного. Пределы доверительного интервала (p=0,95) ‒ не менее 80 % и не более 125 % от рассчитанного значения активности.

Испытание может быть проведено повторно, но при выполнении более одного испытания результаты всех правильно проведенных испытаний объединяют для оценки активности.

МАРКИРОВКА

На этикетке указывается:

- количество единиц токсина во флаконе и комментарий о том, что единицы действительны в отношении определенного препарата, а значит, неприменимы к другим лекарственным средствам, содержащим ботулинический токсин типа А;

- название и объем растворителя, который добавляют к высушенному препарату при восстановлении.

БОТУЛИНИЧЕСКИЙ ТОКСИН ТИПА В ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ

Toxinum botulinicum В ad iniectabile

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Ботулинический токсин типа В для инъекций представляет собой жидкое вещество, содержащее очищенный ботулинический нейротоксин типа В, который может входить в состав комплекса с гемагглютининами и нетоксичными белками. Ботулинический нейротоксин типа В или его комплекс с гемагглютинином изготавливают путем соответствующего процесса очистки надосадочной жидкости бульонной культуры подходящего штамма Clostridium botulinum типа В. В препарат могут быть добавлены подходящие стабилизаторы.

В естественном виде токсин представляет собой комплекс нейротоксина и нетоксичных белков и гемагглютининов и имеет общую относительную молекулярную массу около 700 000 Да. Нейротоксин синтезируется бактерией в виде единой полипептидной цепи с относительной молекулярной массой около 150 000 Да, активация которой происходит во время процесса ферментации за счет протеолитического расщепления (разрыва) с помощью эндогенных протеаз. Отщепленный белок представляет собой полностью активную двойную полипептидную цепь, состоящую из тяжелой цепи (с относительной молекулярной массой 100 000 Да) и легкой цепи (с относительной молекулярной массой 50 000 Да), связанных дисульфидным мостиком.

ПРОИЗВОДСТВО

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

В производстве токсина используются посевные культуры, на основе которых создают систему посевных материалов, сохраняющую способность продуцировать токсин. Необходимо продемонстрировать, что метод производства позволяет на постоянной основе получать препарат, сопоставимый по активности и характеристикам с теми партиями, которые были признаны в достаточной степени безопасными и эффективными в ходе клинических исследований.

Метод производства валидируют, чтобы показать, что в случае проведения испытаний препарат будет выполнять требования общего испытания на аномальную токсичность (2.6.9) при использовании, как минимум, максимальной терапевтической дозы для человека и достаточного количества соответствующего ботулинического антитоксина типа В для нейтрализации.

Метод производства и стабильность готового препарата и тех промежуточных продуктов, для которых это актуально, оценивают с помощью испытаний, описанных ниже. Они включают вычисление удельной активности на мг белка очищенного токсина в подходящей функциональной модели активности токсина и могут сопровождаться анализами, подтверждающими присутствие ботулинического токсина типа В, а также, в соответствующих случаях, примесных нетоксичных белков.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПОСЕВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Высокотоксигенный штамм C. botulinum, продуцирующий токсин типа В и не имеющий генов, кодирующих выработку других ботулинических токсинов (а именно, токсинов типа А и F), с проверенными данными об источнике и развитии, выращивают на соответствующих средах. Бактериальный штамм, используемый для создания главного посевного материала, следует идентифицировать по сделанным ранее записям, содержащим информацию о происхождении этого штамма и испытаниях, которые были проведены для описания его характеристик, в том числе информацию о морфологических, культуральных, биохимических, генетических и серологических свойствах штамма. Там, где это применимо, следует продемонстрировать идентичность профилей главного и посевного материалов. Допускается использование только тех посевных материалов, которые отвечают нижеприведенным требованиям.

Подлинность. Каждый посевной материал должен представлять собой чистую культуру C. botulinum типа В, не контаминированную другими бактериями или грибами.

Микробиологическая чистота. Каждый посевной материал должен соответствовать требованиям к отсутствию контаминирующих микроорганизмов. Для проверки чистоты бактериальных культур применяют методы, обладающие соответствующей чувствительностью. Они могут предполагать инокуляцию подходящих питательных сред и изучение морфологических свойств колоний.

Фенотипические особенности. Для каждого посевного материала должен быть известен качественный и количественный состав жирных кислот, особенности расщепления сахаров (глюкозы, лактозы, маннозы и т.д.) и протеолитическая активность. Посевные материалы должны иметь надлежащую липазную, лецитиназную и желатиназную активность.

Генетическая чистота. Для каждого посевного материала должна быть известна локализация гена токсина в геноме и последовательность гена токсина. Посевные материалы должны соответствовать требованиям к отсутствию посторонних генов, кодирующих продукцию токсинов другого серотипа.

Производство активного токсина. Может использоваться любой бактериальный штамм, который, по результатам испытания на острую токсичность, продуцирует большое количество активного токсина. Посевные материалы должны быть способны обеспечивать, по крайней мере, минимальную токсичность, достаточную для процесса и объемов производства.

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ

В ходе разработки утверждаются стандартные образцы для последующих проверок однородности характеристик серий при производстве и для контроля нерасфасованного очищенного токсина и готового препарата. Эти образцы получают из репрезентативных серий ботулинического токсина типа В, для которых проводят исследования по описанию свойств согласно разделу «Нерасфасованный очищенный токсин».

Стандартные образцы должны быть охарактеризованы соответствующим для их предполагаемого применения образом и храниться в виде аликвот подходящего размера в таких условиях, которые гарантируют их пригодность для применения.

НЕРАСФАСОВАННЫЙ ОЧИЩЕННЫЙ ТОКСИН

Чтобы обеспечить условия для получения максимального количества токсина, штамм C. botulinum типа В выращивают в анаэробных условиях на подходящей питательной среде, отбирают из этого штамма культуры для последующих этапов инкубации в контролируемых соответствующим образом анаэробных условиях, затем переходят к этапам культивирования посевного материала и ферментации нерасфасованной массы. Чтобы удалить нуклеиновые кислоты и компоненты, которые могут приводить к нежелательным реакциям, токсин очищают подходящими методами.

Для подготовки готового нерасфасованного лекарственного средства можно использовать только очищенный токсин, который соответствует всем нижеперечисленным требованиям. Для каждого испытания и каждого препарата устанавливаются допустимые пределы, которым должен соответствовать каждый новый очищенный токсин.

Остаточные реактивы. Удаление остаточных реактивов, которые использовались на этапах очистки, подтверждают с помощью подходящих испытаний на допустимое содержание или посредством валидации процесса.

Нуклеиновые кислоты. Удаление нуклеиновых кислот подтверждается подходящими испытаниями на допустимое содержание или посредством валидации процесса.

Подтверждение подлинности иммунохимическим методом. Присутствие конкретного токсина типа В подтверждают подходящим иммунохимическим методом (2.7.1).

Удельная активность. Удельная активность подтверждается с использованием мышиной модели токсичности или методов in vivo/ex vivo, прошедших валидацию с точки зрения определения средней смертельной дозы (LD50), и выражается в единицах LD50 для мышей на мг белка. Специфическая активность токсина должна быть не ниже 1108 LD50 для мышей на мг белка.

Белок. Суммарная концентрация белка определяется подходящим методом. Каждая серия должна соответствовать допустимым значениям, установленным для конкретного препарата.

Белковый профиль. Подлинность и белковый состав определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (2.2.31) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях или с помощью других подходящих физико-химических методов анализа, например, эксклюзионной хроматографии (2.2.30), сравнивая испытуемые образцы с подходящими стандартными образцами.

Общее количество жизнеспособных микроорганизмов. Общее количество жизнеспособных микроорганизмов должно соответствовать пределам, установленным для определенного препарата.

ГОТОВОЕ НЕРАСФАСОВАННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

Готовое нерасфасованное лекарственное средство получают путем добавления одобренных вспомогательных веществ к очищенному токсину в нерасфасованном виде. Раствор пропускают через фильтр, задерживающий бактерии. Если добавляется альбумин человека, то он должен соответствовать требованиям монографии № 0255 «Раствор альбумина человека».

ГОТОВАЯ ПАРТИЯ

Готовое нерасфасованное лекарственное средство в стерильных условиях фасуют в стерильные упаковки с контролем первого вскрытия. Однородность по массе проверяется в ходе заполнения упаковок, проводить испытание на однородность содержания действующего вещества (2.9.6) не требуется. Упаковки укупоривают таким образом, чтобы избежать контаминации.

Разрешается выпуск только тех серий, которые отвечают требованиям, установленным для этого конкретного препарата, и удовлетворяют каждому из требований, перечисленных далее в разделах «Подлинность», «Испытания» и «Количественное определение».

Определение pH (2.2.3). pH препарата не должен отличаться от одобренного для конкретного препарата значения больше, чем на ±0,5 единиц.

ПОДЛИННОСТЬ

Присутствие ботулинического токсина типа В подтверждают соответствующим иммунохимическим методом (2.7.1).

ИСПЫТАНИЯ

Стерильность (2.6.1). Препарат должен отвечать требованиям испытания на стерильность.

Бактериальные эндотоксины (2.6.14). Содержание бактериальных эндотоксинов в одном флаконе препарата должно быть менее 10 МЕ.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

В соответствии с положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, в испытаниях должно использоваться минимальное количество животных, и необходимо как можно меньше причинять им боль и подвергать страданиям, стрессовым переживаниям или длительному отрицательному воздействию. Определение средней смертельной дозы (LD50) мучительно для животных, поэтому производителям настоятельно рекомендуется разработать и валидировать методы количественного определения, которые позволят сократить количество используемых животных, или же усовершенствовать или заменить процедуру испытания с целью соблюдения принципов гуманного обращения с животными.

Активность препарата оценивают посредством определения LD50 для мышей или с помощью метода, который прошел валидацию в сравнении с количественным определением LD50. Активность выражается в виде LD50 для мышей или относительно стандартного образца.

Для определения LD50 группам мышей внутрибрюшинно вводят возрастающие дозы препарата и вычисляют значение LD50 по летальности мышей в каждой группе, используя обычные статистические методы (5.3). Параллельно проводят количественное определение для стандартного образца; активность токсина выражается относительно референтного значения, или же значение, полученное для стандартного образца, должно укладываться в определенные пределы заданной активности.

После валидации количественного определения LD50 (эталонный метод), препарат можно также проанализировать и другими методами, которые более предпочтительны с точки зрения гуманного обращения с животными. Например, могут использоваться биологические методы количественного определения на мышах, где в качестве конечной точки выступает паралич, методы количественного определения ex vivo с использованием диафрагмального нерва/диафрагмы мыши, методы количественного определения in vitro по активности эндопептидазы или методы количественного определения в культуре клеток.

Для альтернативных заменяющих методов активность рассчитывается по отношению к подходящему стандартному образцу, откалиброванному в единицах LD50 для мышей.

Рассчитанное значение активности должно составлять не менее 80 % и не более 125 % от указанного. Пределы доверительного интервала (p=0,95) ‒ не менее 80 % и не более 125 % от рассчитанного значения активности.

Испытание может быть проведено повторно, но при выполнении более одного испытания результаты всех правильно проведенных испытаний объединяют для оценки активности.

МАРКИРОВКА

На этикетке указывается количество единиц токсина во флаконе и комментарий о том, что единицы действительны в отношении определенного препарата, а значит, неприменимы к другим лекарственным средствам, содержащим ботулинический токсин типа В.