Иммунологические методы анализа. Общие положения

Подробнее
Текстовая версия:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Введение

Данная глава содержит общее описание принципов иммунологических методов (ИМ), которые могут быть использованы в специфических испытаниях, описанных в монографии, а так же материалы и подходы к аналитической разработке и валидации ИМ. Цель настоящей главы заключается в предоставлении основной информации, которая распространяется на все ИМ. Рассматриваемая глава служит основой для отдельных глав о различных типах ИМ, например, Иммунологические методы анализа – твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) 1102, Иммунологические методы анализа – иммуноблот-анализ 1104 (предлагаемый) и Иммунологические методы анализа – поверхностный плазмонный резонанс 1105. Эти общие главы относятся к главам на биологические методы анализа. Использование ИМ для контроля производственного процесса, диагностики и анализа клинического ответа, оценки фармакокинетики/фармакодинамики/абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (PK/PD/ADME) и для определения других характеристик препарата (испытания, не зависящие от выпуска) не рассматривается в настоящей главе.

В основе всех ИМ, используемых для определения характеристики качества биологической фармацевтической субстанции или лекарственного средства, лежит высокоспецифичное нековалентное связывающее взаимодействие между антителом и антигеном. Антигеном обычно является аналит (белок, углевод, вирус или клетка), а связующим элементом – антитело (моноклональное антитело или поликлональная антисыворотка). ИМ применимы и к молекулам, которые являются или непосредственно антигенными (иммуногены), или которые могут оказаться опосредованно антигенными (гаптены). Измеряемая величина в ИМ непосредственно связана с характеристикой качества испытуемого препарата.

Иммунологические методы анализа имеют довольно важное значение, так как благодаря своей высокой чувствительности и специфичности позволяют обнаруживать широкий спектр аналитов в образцах со сложной матрицей. Они обычно используются для качественной и количественной оценки как антитела, так и антигена, но так же ИМ применяются и при определении гаптена, комплемента, комплекса антиген-антитело и других белок-белковых взаимодействий (ББВ). Эти свойства ИМ позволяют использовать их для оценки подлинности, активности (эффективности), чистоты, примесей, стабильности и других характеристик качества биологических фармацевтических субстанций и лекарственных средств.

ИМ признаны полезными во многих областях применения, потому как могут измерять молекулы в широком диапазоне размеров и типов связывания. Как правило, антитела остаются стабильны при различных химических модификациях, которые не оказывают существенного неблагоприятного влияния на взаимодействие с антигеном. Молекулы антитела чаще всего выдерживают умеренные кислотные и щелочные изменения рН лучше, чем другие белки. В силу этой особенности существует целый ряд различных ИМ с высокой степенью чувствительности и специфичности. Возможность ускорения контакта между антигеном и антителом предусматривает такие ИМ, которые дают результаты в режиме реального времени.

В большинстве случаев ИМ имеют более высокую прецизионность и меньшую длительность цикла обработки, чем традиционные биологические методы анализа (работа с клеточной культурой, исследования на животных). В некоторых случаях такие преимущества могут способствовать замене биологического метода анализа иммуноанализом, к таким изменениям следует подходить последовательно и с осмотрительностью. Часто довольно сложно доказать равнозначность или сопоставимость результатов биоанализа и иммуноанализа, поскольку взаимодействие между антигеном и антителом может не отражать характерные особенности, наблюдаемые в биоанализе.

Один из основных недостатков ИМ по сравнению с физико-химическими методами (например, жидкостной или газовой хроматографией) заключается в том, что последние, как правило, более прецизионны и могут единовременно определять ряд примесей или непредвиденных веществ. Другой серьезный недостаток заключается в том, что ИМ выполняются с высокомолярными разведениями, при которых они чувствительны к отклонениям, вызванными внешними факторами в матрице образца (матричный эффект). Матричный эффект может зависеть от характера ИМ, и он до сих пор полностью не изучен. Специфичность ИМ порой снижается в результате структурного сходства или сходства последовательностей у аналита и близкородственной молекулярной примеси (перекрёстная реактивность).

Большинство ИМ отображают физическое взаимодействие (связывание) между антигеном и антителом, а не функциональные свойства аналита. Именно поэтому необходимо обратить внимание на выбор ИМ и его выполнение. ИМ на клетках, дающий функциональную информацию об аналите, не рассматривается в данной главе.

Общая характеристика

Иммунологические методы анализа основаны на принципе специфических, нековалентных, обратимых взаимодействий между антигеном и антителом. Как правило, первоначальная реакция антиген-антитело обусловлена комплементарностью, которая создает макромолекулярную специфичность. Это нековалентное взаимодействие определяет степень истинной аффинности. Истинная аффинность способствует функциональной и/или относительной аффинности, которая зависит от таких факторов, как фаза реакции и валентность, что, в свою очередь, определяет степень обратимости взаимодействия. Более глубокое понимание факторов, влияющих на взаимодействие антиген-антитело, дает основание для разработки подходящего ИМ (например, твердая или жидкая фаза, конкурентное или неконкурентное связывание и.т.д.).

Характерной особенностью иммунологических методов анализа является использование антигена (или гаптена) и антитела. Более того, ИМ могут охватывать дополнительные молекулы, например, компоненты комплемента. Компоненты ИМ определяются следующим образом:

В дополнение к перечисленным компонентам ИМ требуют некоторые средства (устройства) для обнаружения и отслеживания реакции связывания антигена с антителом.

Рисунок 1. Структура IgG. Молекула IgG отличается доменной структурой тяжелой (H) и легкой (L) цепей, обе из которых делятся на вариабельную (V) и константную (C) области. Легкие цепи состоят из доменов VL и CL, а тяжелые цепи из вариабельного домена (VH) и трёх константных доменов (CH1, CH2 и CH3). Все домены стабилизированы дисульфидными связями, при этом домены CH2 содержат углеводы. Гибкая шарнирная область между доменами CH1 и CH2 обеспечивает самостоятельность двух участков связывания антигена, образованных вариабельным доменами.

Виды анализа

Определение связывания антигена с антителом может быть выполнено при помощи разных видов и форм анализа: твердая или жидкая фаза, автоматизированная или неавтоматизированная система, конкурентное или неконкурентное связывание, с меченными или немечеными антигенами, качественный или количественный анализ, гомогенный или гетерогенный, или их комбинации. Характерной особенностью всех этих анализов является связывание антитела или антигена с аналитом (который также может являться антигеном или антителом) с последующим выявлением комплекса антиген-антитело. Несмотря на то, что для реакции связывания можно использовать множество различных способов совместно с разными методами определения, количественное определение аналита в испытуемом препарате всегда выполняется путем сравнения результатов измерений со стандартным образцом. Благодаря этому множество иммунологических методов анализа подтверждают при исследованиях качество препарата. Наиболее широко используются такие методы анализа, как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, проточная цитометрия, конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), кинетическая нефелометрия, радиоиммунный анализ (РИА/RIA), радиальная иммунодиффузия, реакции преципитации и агглютинации. Все эти методы описаны ниже.

Твердофазный иммуноферментный анализ

ELISA может быть определен как качественный или количественный твердофазный иммунологический метод, в котором измерение анализируемого вещества происходит после его связывания с иммуносорбентом и последующего обнаружения при помощи ферментативного гидролиза субстрата-репортера – либо напрямую (если анализируемое вещество обладает ферментативными свойствами или мечено ферментом), либо косвенно (посредством меченного ферментом антитела, которое связывается с иммуносорбированным аналитом). Количественный анализ аналита обычно выполняют на основе интерполяции калибровочной кривой стандартного образца. В общей главе Иммунологические методы анализа – твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) 1103 приводится более подробная информация о ELISA, а так же о разработке количественного анализа.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг представляет собой полуколичественный или качественный метод определения белкового вещества, которое было разделено электрофорезом в полиакриламидном геле, а затем перенесено на твердую мембрану (нитроцеллюлоза, нейлон или поливинилидендифторид). Обнаружение может быть достигнуто непосредственно путем взаимодействия с меченым первичным антителом (специфичным для аналита) или опосредованно путем взаимодействия меченого вторичного антитела (антитело к первичному антителу) с первичным антителом, связанным с антигеном, иммобилизованным на мембране. Метка может представлять собой радиоизотоп или фермент, использующий субстрат для выработки цветности, реакции флуоресценции или люминесценции. Данный метод является полуколичественным, в частности из-за низкой концентрации белков в очень сложных смесях. Метод обычно используется на ранней стадии разработки производственного процесса (скрининг антител, экспрессия белка, очистка белка и т.д.). Вестерн-блоттинг является эффективным методом анализа и определения белков в сложных смесях, особенно после разделения с помощью двумерного гельэлектрофореза, который разделяет белки в зависимости от размера и заряда (pI).

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия это метод полуколичественной оценки с использованием лазерного луча, позволяющий измерять зонды, конъюгированные с флуорофором, при взаимодействии со связанными лигандами на поверхности клеток или частиц. С более подробной информацией можно ознакомиться в монографии Проточная цитометрия 1027.

Поверхностный плазмонный резонанс

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) представляет собой метод количественного определения аналита в образце, где образование комплекса антиген-антитело может быть определено в реальном времени на границе жидкой и твердой фаз. Проведенное измерение представляет собой изменение в преломлении поляризованного светового луча в реальном времени, которое происходит при образовании комплекса антиген-антитело, что приводит к изменениям минимума плазменного отражения (т.е. сенсограммы). Количество аналита определяется путем сравнения с измерением кривой стандартного образца, определенной в том же анализе. Дополнительные подробности можно найти в общей главе Иммунологические методы анализа – поверхностный плазмонный резонанс 1105.

Кинетическая нефелометрия

Кинетическая нефелометрия представляет собой метод количественного определения аналита в растворе образца путем измерения интенсивности света, рассеянного небольшими скоплениями частиц, образованными комплексом антиген-антитело. Количество аналита определяется путем сравнения с измерением кривой стандартного образца, определенной в том же анализе.

Радиоиммунный анализ

Чувствительный иммунологический метод РИА, впервые разработанный в 1950-х годах, представляет собой метод количественного определения аналита в образце. РИА, как правило, подразумевает конкурирующую реакцию связывания антиген-антитело, но так же может использоваться в двухсайтовом иммуноанализе, включая иммунопреципитацию. В конкурентном РИА аналит конкурирует за связывание с радиоактивно меченым (например, с использованием 125I или 3H) стандартным антигеном, который идентичен аналиту. Радиомеченый антиген присутствует в избытке. Тот же немеченый антиген в испытуемом образце конкурирует за связывание с тем же участком антитела, который присутствует в установленном количестве. Связывание немеченого антигена с антителом приводит к вытеснению меченого антигена, в результате чего снижается радиоактивность комплекса антиген-антитело. Для отделения комплекса антиген-антитело от лишнего несвязанного антигена, комплекс обычно осаждается или вторичным антителом (или белком G), иммобилизованным на твердой матрице (стеклянных или резиновых гранул), или уже иммобилизованным первичным антителом. Количество аналита, как правило, определяется методом интерполяции по отношению к калибровочной кривой стандартного образца, где установленное количество антитела и радиомеченого антигена смешивается с увеличением количества немеченого антигена. Таким образом, даже небольшое количество немеченого антигена приведет к относительному количественному снижению общей связывающей радиоактивности.

Одномерная радиальная иммунодиффузия

Одномерная радиальная иммунодиффузия (SRID или SRD) представляет собой метод количественного определения аналита в образце путем измерения диаметра кольца преципитации, образованного комплексом антиген-антитело. Антиген вносят в лунки, вырезанные в слое геля, содержащего специфические антитела. Растворы с более высокой концентрацией антигена продолжают диффундировать, связывая все больше антител, пока не произойдет осаждение с образованием кольца. Количество аналита определяется путем сравнения с кривой стандартного образца, определенной в том же анализе.

Преципитация

Главный принцип данного метода заключается в том, что взаимодействие поливалентного антитела и антигена приводит к образованию комплекса. В некоторых случаях образуется видимый осадок. Другие методы иммунопреципитации включают использование микросфер белка A и белка G для захвата комплекса антиген-антитело и облегчения отделения комплексов антиген-антитело от других антигенов в растворе. Преципитация обычно не применяется для определения количественных показателей в силу требуемого времени (несколько дней), отсутствия чувствительности и необходимости в большом количестве антигена и антител.

Агглютинация

Агглютинация и торможение агглютинации обеспечивают качественное определение и количественное измерение антигенов и антител. Торможение агглютинации представляет собой изменение реакции агглютинации, которая обеспечивает более высокую чувствительность к обнаружению небольших количеств белков, химических веществ, вирусов и других определяемых элементов. Принцип агглютинации аналогичен принципу преципитации за исключением того, что взаимодействие происходит между антителом и корпускулярным антигеном, что приводит к видимому скоплению или агглютинации. Данный метод широко используется при определении группы крови (антигены A, B или O).

Выбор иммунологического метода

При выборе иммунологического метода анализа необходимо учитывать его чувствительность и специфичность, а так же сложность образца. В Таблице 1 представлен сравнительный анализ преимуществ и недостатков разных ИМ. Выбор наиболее подходящего формата должен определяться предполагаемым применением ИМ.

Таблица 1. Иммунологические методы анализа, используемые в биофармацевтических лабораториях

Метод

Преимущества

Недостатки

Применение

ELISA

- Высокая чувствительность;

- широкий динамический диапазон;

- высокая пропускная способность;

- низкая стоимость.

- Многоступенчатый процесс, сильно зависящий от правильного выполнения каждой стадии;

- пошаговая промывка увеличивает время выполнения и ведет к образованию биологически опасных отходов;

- требуется маркировка реагента.

- Оценка содержания действующего вещества;

- анализ содержания специфических белков в сложных образцах;

- подтверждение подлинности белка;

- оценка чистоты (отсутствие примесей);

- оценка иммуногенности.

Вестерн-блоттинг

- Позволяет получать информацию о размере и/или заряде антигена;

- позволяет разделять различные антигены (продукты деградации/агрегации), несущие один и тот же эпитоп;

- подходит для сложных смесей.

- Обычно взаимодействует только с линейными эпитопами;

- трудоёмкость;

- низкая пропускная способность, малопроизводительность;

- результаты могут интерпретироваться по-разному;

- иммобилизация может изменять связывание;

- ограничивается белками.

- Оценка чистоты белка;

- оценка стабильности белка;

- испытание белка на подлинность.

Проточная цитометрия

- Высокая пропускная способность;

- высокая степень автоматизации.

- Использование ограничено клетками, частицами и образцами, связанными со сферами;

- чувствительность к скоплениям частиц и матрице образца.

- Оценка содержания действующего вещества;

- идентификация клеток в препаратах клеточной терапии.

SPR

- Прямое обнаружение связывания;

- точное измерение аффинности, включая скорость ассоциации и диссоциации.

- Иммобилизация и регенерация могут изменять связывание;

- низкая пропускная способность, малопроизводительность.

- Оценка иммуногенности;

- оценка содержания действующего вещества;

- анализ содержания специфических белков в сложных образцах.

Кинетическая нефелометрия

- Легко автоматизируемый метод;

- быстрота.

- Узкий диапазон обнаружения;

- высокий фоновый показатель в случае мутных образцов.

- Анализ отдельных компонентов вакцины для проверки их стабильности и чистоты.

РИА

- Связывание происходит в естественной конформации;

- возможность анализа слабоконцентрированных образцов;

- при предельном разведении используется высокочувствительное антитело, которое способствует сохранению реагента;

- для большей пропускной способности могут использоваться микротитровальные планшеты (например, в сцинтилляционном анализе сближения).

- Требуется радиоактивное мечение;

- более короткий период полураспада некоторых радиоизотопов требует регулярного приготовления меченого вещества;

- опасные/вредные отходы.

- Подтверждение подлинности белка;

- анализ содержания специфических белков в сложных образцах.

SRD

- Высокая точность;

- простая настройка.

- Полуколичественный метод;

- низкая прецизионность;

- низкая чувствительность.

- Испытание при выпуске вакцины.

Преципитация

- Низкая стоимость оборудования.

- Результаты могут интерпретироваться по-разному;

- требует времени;

- недостаточная чувствительность (диапазон, мкг).

- Определение подлинности вакцин.

Агглютинация

- Быстрота;

- низкая стоимость оборудования.

- Результаты могут интерпретироваться по-разному;

- требует времени;

- низкая специфичность из-за интерферирующих веществ.

- Определение подлинности вакцин.

Актуальные вопросы при разработке иммунологического метода

Разработка метода позволяет добиться точного анализа, обладающего ответствующей внутрилабораторной и промежуточной прецизионностью, с возможностью применения его на практике. Для сведения к минимуму случайных погрешностей необходимо определить и сократить источники вариабельности.

Выбор реагента

Иммуноанализы подергаются воздействию нескольких источников интерференции: перекрестная реактивность, эндогенные интерферирующие вещества, буферные матрицы, компоненты образца, скрытые антигенные детерминанты вирусных белков, изменения структуры антигена и другие факторы. Таким образом, с целью разработки робастного метода и быстрого выявления ошибок в дальнейшем необходимо определить возможные источники интерференции.

Перекрестная реактивность является основной трудностью при разработке иммунологического метода анализа. Подобная сложность возникает, когда специфичность реакции антиген антитело снижается в результате перекрестной реактивности связывания сходных по структуре молекул со связывающим элементом реакции. Типичными примерами являются изоформы белка, разлагаемые соединения аналита, молекулы одного класса, белки-предшественники, метаболиты и т.д. Перекрестная реактивность может быть сведена к минимуму с помощью строгой характеристики и тщательного отбора образцов.

Реагенты, используемые в ИМ, как правило, делятся на 2 категории: основные и неосновные реагенты. Основные реагенты специфичны для конкретного ИМ, так же к основным могут относиться реагенты, которые неустойчивы даже к незначительным изменениям в составе или в стабильности. В качестве примеров основных реагентов можно привести специфические для метода антитела и калибровочные стандарты. Эквивалентность должна быть установлена перед заменой новой партии. Неосновными являются те реагенты, которые до определенной степени могут изменяться по составу без каких-либо неблагоприятных последствий для ИМ. Зачастую реагенты произвольно причисляются к неосновным (буферные вещества, блокирующий буфер, субстрат), но позже они могут быть признаны основными компонентами, если промежуточная прецизионность дала неудовлетворительные результаты, и начинается выявление и устранение ошибок при выборе реагентов для ИМ. Специфические для иммунологического метода анализа реагенты, в т.ч. организация-поставщик и номер по каталогу, должны быть определены в документации по методике испытаний.

Выбор антитела имеет решающее значение для разработки эффективного иммуноанализа, поскольку он определяет специфичность и чувствительность анализа. Кроме того, во время образования антител следует принять меры к тому, чтобы протоколы иммунизации содействовали целевому назначению антител. В некоторых случаях более специфическое антитело может быть получено путем выбора небольшого и специфического иммуногена и аффинной очистки антитела, что приведет к более определенному покрытию эпитопа. В других случаях может иметь крайне важное значение обеспечение широкого охвата различных эпитопов на исследуемых молекулах, и пул поликлональных антител (pAb) может стать лучшим выбором. В настоящее время в некоторых областях применения для определения отдельных аналитов более предпочтительны моноклональные антитела (mAb) в силу своей высокой специфичности, однородности характеристик от партии к партии и неограниченности запасов. По сравнению с поликлональными антителами для производства mAb имеют более высокую начальную стоимость, но преимущества, как правило, превосходят первоначальные затраты. Другие виды применения могут потребовать более широкий выбор эпитопов для обеспечения того, чтобы незначительные изменения в молекуле не препятствовали распознаванию всего антигена, и поэтому следовало бы отдать предпочтение пулу моноклональных антител или пулу pAb. Последние широко используются для определения сложной смеси аналитов (например, белки клетки-хозяина). Подобным образом иммуноанализы могут использовать два разных эпитопа антигена – один для захвата, а другой для определения, что значительно снижает перекрестную реактивность. Другой способ в снижении перекрестной реактивности заключается в очистке антигена перед иммуноанализом. Изменения температуры и времени инкубации могут влиять на кинетику реакций взаимодействий антител со схожими, но другими антигенами. Таким образом, эта характерная особенность должна быть максимально использована для повышения специфичности взаимодействий антиген-антитело.

Разработка иммуноанализа

Разработка является важным этапом в создании соответствующего иммунологического метода анализа. Во время разработки ИМ специалисты исследуют различные параметры условий анализа и взаимосвязь между ними для установления условий, при которых анализ будет стабильно давать надежные результаты, расходуя минимальное количество реагентов, усилий и времени. В рамках терминологии принципа планируемого качества «возможное рабочее пространство» представляет собой набор параметров, определяющих условия анализа, а «проектное поле» относится к условиям, при которых анализ является успешным. Необходимые параметры ИМ (прецизионность, точность, специфичность) зависят от его предполагаемого использования. При разработке иммунологического метода анализа необходимо рассмотреть:

Настоятельно рекомендуется использовать планирование экспериментов (DOE), так же целесообразным может оказаться использование различных методов DOE на каждой стадии разработки. На начальном этапе разработки особенно полезен план отсеивающего эксперимента (обычно это двухуровневый геометрический план дробного факторного эксперимента – ДФЭ). После отбора (с небольшим количеством факторов для исследования) часто оказывается полезен полнофакторный план или план эксперимента на поверхности отклика. Как только разработка подходит к аттестации (упор делается на робастность) подходящим выбором будет являться план эксперимента на поверхности отклика. Во время аттестации или валидации специалистам может показаться целесообразным одновременное изучение робастности рабочих условий для анализа (применяя геометрическую интерпретацию ДФЭ) и параметров валидации, например, прецизионности (при помощи иерархического или перекрестного плана для случайных факторов, связанных с воспроизводимостью, внутрилабораторной прецизионностью и сходимостью).

Испытания, оценивающие линейность разведения образцов и элементы специфичности, в т.ч. матричные эффекты, обычно включают в себя построение образцов с добавлением известного количества определяемого вещества. Несмотря на то, что такие добавления часто выполняются при разбавлении матрицы, добавление фактических образцов или смешанных образцов является важным аспектом, демонстрирующим робастность линейности разведения образцов и элементов специфичности образца и матричных компонентов.

Требования к реагентам

Порядок выбора поставщика реагентов (в т.ч. проведение аудиторских проверок), оформления заказа, получения и утилизации реактивов и расходных материалов должен быть изложен в стандартной рабочей процедуре (СОП). Приготовление реагентов для внутреннего пользования должно быть задокументировано таким образом, чтобы они подлежали восстановлению. На маркировке серийно выпускаемых и приготовленных для внутреннего пользования реагентов должны быть указаны подлинность, концентрация, номер партии, дата истечения срока годности и условия хранения. Определение стабильности и дат истечения срока годности для реагентов внутреннего пользования во многих случаях основано на имеющихся данных и научном опыте, и, возможно, потребует подтверждения экспериментальным путём. Рекомендуется использовать СОП для продления срока хранения основных реагентов. Кроме того, необходимо внедрить механизм контроля реагентов и связать номера партии с номерами аналитической серии. Неприемлемые свойства реагента определяются путем отслеживания контрольных образцов. Сдвиги в результатах контрольных образцов влекут за собой проверку аналитических серий и изменения номеров партии реактива или анализ возможного ухудшения свойств основных реагентов. Во избежание подобных сдвигов специалисты могут перекрестно валидировать важные изменения партии реактива.

Влияние контейнеров для сбора и хранения на аналитическую эффективность часто недооценивается. При определении стабильности и срока хранения реактивов для внутреннего пользования необходимо регистрировать информацию о поставщике контейнера, каталоге и номере партии. Нельзя переоценить важность надлежащего стандартного образца и его характеристик для иммунологического метода анализа биологических препаратов. В силу присущей им сложности, стандартные и калибровочные образцы макромолекулярных биологических препаратов зачастую хуже описываются, чем традиционные низкомолекулярные стандартные образцы. Если калибровочный образец представляет собой смесь различных антигенов (белки клетки-хозяина), то необходимо продемонстрировать, что она представляет антигенный профиль в исследуемых образцах. Стабильность результатов ИМ зависит от наличия соответствующего стандартного образца.

Валидация

Валидация метода анализа предполагает систематическое выполнение установленного протокола и предварительно указанного анализа, включающего заданные критерии приемлемости. Валидация показывает, что метод анализа пригоден для предполагаемого использования (см. Валидация фармакопейных методик 1225, Валидация биологических методов анализа 1033, и ICH Q2(R1)). Аттестация предполагает аналогичные или похожие испытания, однако она не требует предустановленных протоколов, анализов и критериев приемлемости. В некоторых случаях (например, при использовании коммерческого набора) до аттестации разработка метода анализа может не потребоваться. Общая глава 1225 рассматривает, какие характеристики метода анализа должны быть исследованы во время валидации для четырех основных видов предполагаемого использования. Например, методы анализа, количественно определяющие основное нерасфасованное лекарственное вещество или действующее вещество, могут не требовать при валидации оценки таких характеристик, как предел обнаружения или предел количественного определения, зато могут потребовать оценки точности, прецизионности, специфичности, линейности и диапазона применения.

Пригодность системы или критерии приемлемости

Цель пригодности системы и критериев приемлемости заключается в обеспечении того, чтобы полная система, включающая в себя оборудование, программное обеспечение, реагенты и персонал, соответствовала требованиям для целевого использования. Все процессы должны регулироваться четко прописанными СОП, которые обеспечивают однородность, снижают погрешность и способствуют воспроизводимости лабораторных процессов. Файлы, содержащие набор данных для обучения персонала, должны быть актуальными и современными и должны подтверждать квалификацию работников для выполнения метода анализа.

Квалификация оборудования и программного обеспечения начинается с определения квалификации дизайна, в т.ч. оценки рисков и GAP-анализа, которые определяют возможные угрозы для сбора, целостности и непрерывного накопления данных ИМ. Квалификация так же включает в себя квалификацию монтажа/установки (IQ) и квалификацию функционирования (OQ). Закупленные пакеты необходимой документации для валидации оборудования могут потребовать внесения изменений для соответствия предполагаемому использованию на каждом объекте. Для обеспечения надлежащих функциональных характеристик необходимо осуществлять постоянный контроль за оборудованием и ПО с помощью квалификации эксплуатации (PQ) и тестовых процедур аттестации программных систем. Регулярное техническое обслуживание оборудования осуществляется в соответствии с рекомендациями производителями и может потребовать дополнительного обслуживания в зависимости от специфических требований условий эксплуатации. Следует заносить в архив всю историю планового и внепланового обслуживания каждого оборудования. Обновление ПО (требующее, как правило, дополнительной валидации) следует осуществлять с учетом контроля за внесением изменений. Необходимо придерживаться 21 CFR 11.

С целью обеспечения робастности необходимо установить определенный процесс для внедрения в лабораторию новых ИМ. Для утверждения нового иммунологического метода анализа должны быть предусмотрены документы контроля, в т.ч. план валидации метода, содержащий предварительные критерии приемлемости и отчеты о валидации. Так же необходимы хорошо составленные документы о методе анализа на случай восстановления результатов анализа и минимизации погрешностей лабораторных измерений.

Методы анализа должны предусматривать критерии приемлемости для важных аспектов анализа, включая характеристику калибровочной кривой, контроль качества, соответствие между измерениями образцов, методику проведения повторного анализа образцов и, при необходимости, выявление и обработку статистических выбросов. Кроме того, должна быть принята СОП на случай расследования и урегулирования непредвиденных случаев.

Отчетность

Единицы измерения

Количественные методы предоставляют результаты испытуемых образцов с расчетной концентрацией на основе калибровочной кривой, соответствующей стандартным образцам, с помощью надлежащей модели. При определении количества аналита, единица измерения часто выражается в массе аналита на объем раствора (концентрации) или в массе аналита на массу препарата (млн). В зависимости от свойств измеряемого аналита, степени стандартизации измерений, географического региона, хода разработки метода, концентрацию выражают в весе на единицу объема, в объеме на моль или в массе аналита на массу препарата. В некоторых случаях концентрация может быть преобразована в единицу измерения активности, в которой масса анализируемого вещества считается 100 % активной. При определенных обстоятельствах качественный анализ с предварительно установленным пороговым значением можно считать приемлемой альтернативой количественным методам.

Анализ данных иммуноанализа

Иммунологические методы анализа используют калибровочные кривые на основе стандартных образцов с известной (номинальной) концентрацией, которые включены в каждый биоаналитический метод. Это помогает регулировать отклонения, связанные с повторяемостью и воспроизводимостью результатов измерений и внутрилабораторной прецизионностью, и позволяет оценивать результаты неизвестных испытуемых образцов. Простые статистические анализы предполагают, что (возможно, преобразованные) данные нормально распределены, имеют постоянную дисперсию, независимы, и что используется соответствующая модель. Для многих анализов одно или несколько из этих принятых положений может являться неприемлемым. Специалисты должны оценивать принятые допущения, используя масштабный объем данных (как правило, десятки анализов). Когда допущения не являются обоснованными, анализ становится более сложным.

Калибровочные кривые обычно отличаются нелинейной зависимостью между средним откликом и концентрацией аналита, и строятся линейно-логарифмическим образом с (возможно, преобразованной или взвешенной) переменной отклика (ордината), построенной относительно номинальной концентрации калибратора (абсцисса) на логарифмической шкале. Результирующая кривая, охватывающая валидируемый диапазон анализа, по своей сути является нелинейной и часто имеет сигмоидальную форму с горизонтальными асимптотами при очень низких и высоких концентрациях аналита. Конкурентные ИМ имеют отрицательный наклон, тогда как неконкурентные ИМ характеризуются положительным наклоном. Концентрация аналита в испытуемом образце определяется с помощью обратной регрессии в сравнении с калибровочной кривой. Окончательный результат обычно получают после умножения измеренной концентрации на коэффициент разбавления, который требуется для получения отклика в диапазоне количественного определения ИМ.

Под руководством компетентного специалиста по биостатистике может быть выполнена проверка наличия выбросов в контролируемых документах, позволяющая исключить ложные результаты выборки. Должна быть создана четко определенная процедура установления, повтора и отчета о выбросах. Метод исключения выбросов и интерпретация результатов описаны в монографии Данные анализа – возможности интерпретации 1010. Результаты испытаний, выходящие за пределы установленных спецификаций или критериев приемлемости, должны оцениваться путем исследования не по спецификации для определения первопричины.

Анализ тенденций

Система обеспечения качества включает в себя отслеживание результатов ИМ путем сбора и изучения рабочих характеристик ИМ. Анализ тенденций позволяет обнаруживать тенденции изменений важнейших показателей анализа, связанные с изменением партии реагентов анализа, увеличением количества специалистов, изменениями рабочих условий и другие. Для четкого определения обработки, использования, коррекции, отклонения, принятия и интерпретации данных калибровки и результатов испытаний образцов в рамках ИМ рекомендуется принять СОПы, протоколы исследования, методики испытаний и схемы этапов принятия решения. Нередки случаи, когда имеется несколько обзоров необработанных данных, в т.ч. экспертной оценки, обзора контроля качества. Специалисты должны уметь отличать такие последствия анализа от подлинных изменений в исследуемом веществе, вызванных изменениями или отклонениями в производственном процессе, которые повлияли на препарат. Двумя наиболее важными следствиями надлежащего мониторинга тенденций являются выявление потенциальных проблем до их возникновения и определение направлений, требующих корректирующих/профилактических действий. Общие главы Данные анализа – возможности интерпретации 1010 и Валидация биологических методов анализа 1033, а так же литература по статистике, содержат рекомендации для различных анализов тенденций. Наиболее распространенным преимуществом анализа тенденций является оценка контрольных образцов. Желательно, чтобы один или несколько контрольных образцов в достаточном количестве и с доказанной стабильностью были доступны для анализа долгосрочных тенденций, чтобы аспекты качества были исследованы в каждой серии и в нескольких производственных партиях. По мере исчерпывания контрольных образцов для долгосрочного анализа и истечения срока их хранения, следует провести перекрестное сопоставление данных и разработать новый контрольный образец. Систематический обзор данных контроля качества между анализами помогает в выявлении и устранении погрешностей в ИМ, не выдержавших испытаний, в обеспечении уверенности при оценке неточных результатов, и в управлении введения восполненных компонентов анализа, которые могут проявлять свойства по-другому в отличие от предыдущих реагентов. Другие характеристики ИМ, подлежащие контролю, включают переменные отклика калибровочной кривой, параметры подбора кривой, сравнение исследовательских данных контроля качества с результатами валидации.

Учёт и контроль

Регуляторные органы предъявляют строгие требования к сохранению подлинности и целостности как образцов, так и данных. Для обеспечения надлежащей подлинности и целостности испытуемых или резервных образцов должны осуществляться процедуры контроля качества на основе СОП. Оптимальным вариантом для контроля за ходом выполнения сбора, подлинности, определения местонахождения, цепи поставок, количества циклов замораживания-размораживания образцов, температуры хранения и продолжительности хранения образца является использование системы штрихового кодирования. Эта информация должна отслеживаться с момента сбора и до утилизации образцов. Возможность отслеживания «истории» образца позволяет восстановить события, ведущие к генерации данных. Такая информация используется регуляторными органами для обеспечения соблюдения надлежащих процедур, а внутренними аудиторами - для обеспечения того, чтобы предварительная обработка образцов не нарушала данные исследования. Кроме того, отслеживание образцов позволяет создать механизм, обеспечивающий определение аналита в пределах продемонстрированной стабильности.

Конечным результатом, полученным в биоаналитической лаборатории, является показатель, представляющий собой определение аналита в испытуемом образце. Необходимые меры для сбора данных и занесения их в отчет многочисленны и в значительной мере сопряжены с ошибками. Поэтому для минимизации ошибок в данных должны быть созданы системы контроля качества. Ошибки могут быть вызваны неправильным хранением или определением подлинности образцов, некорректным преобразованием данных, ошибками расчета, ошибками при записи данных, неточностями/упущениями и другими факторами. Для создания, передачи и архивирования данных при возможности используются валидированное программное обеспечение и система управления лабораторными данными. Как правило, контроль на избыточность уже заложен в автоматизированные процессы в результате визуального представления данных не менее 10 % процедур передачи данных. При отсутствии валидированной электронной передачи, все данные должны быть рассмотрены как минимум одним экспертом. Как и в случае отслеживания образцов, создание/преобразование/хранение данных должно быть восстанавливаемо. Более того, все данные должны иметь резервные копии в стабильном формате. Необходимо разработать программы обновления архивных данных, с тем, чтобы по мере изменения технологии архивированные данные все равно были извлекаемы. Регуляторные органы требуют, чтобы необработанные данные были доступны в течение продолжительного времени после завершения исследования или отчёта регулирующему органу. Наконец, данные должны быть защищены от изменения информации и от доступа неуполномоченных лиц.