Иммунологические методы – твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)

Подробнее
В данной работе представлена общая информация о принципах, методиках, способах постановки, разработке анализов и валидации твердофазных ИМ, таких как ELISA. В настоящей работе также описываются стандартные образцы и контроли, используемые в ИМ.
Текстовая версия:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ELISA)


ВВЕДЕНИЕ

Иммунологические методы (ИМ) основаны на связывании антигена и антитела. (Полный список аббревиатур, используемых в данной главе, представлен в Приложении 1). Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)один из самых широко используемых иммунологических методов, применяемых при описании свойств, получении разрешения на выпуск серии и исследовании стабильности биотехнологических препаратов с целью обеспечения качества биологических субстанций и препаратов. Термин ELISA используется в настоящем документе в более широком смысле и включает иммуноферментные анализы (ИФА), а также альтернативные методы обнаружения, например, хемилюминесценцию и флуоресценцию.

В данной главе представлена общая информация о принципах, методиках, способах постановки, разработке анализов и валидации твердофазных ИМ, таких как ELISA, которая может применяться и для других вариантов иммунологических методов, указанных выше. В настоящей главе также описываются стандартные образцы и контроли, используемые в ИМ. Данная информация может быть адаптирована к конкретным методикам, приведенным в монографии. В данной главе не рассматриваются ИМ, предназначенные для измерения иммунных ответов на препарат у животных и людей (например, серологические или клеточные методы исследования), неиммунологические методы (например, связывание лиганда с рецептором), а также другие похожие подходы.

Определение

ELISA может быть определен как качественный или количественный твердофазный иммунологический метод, в котором измерение анализируемого вещества происходит после его связывания с иммуносорбентной фазой и последующего обнаружения при помощи ферментативного гидролиза субстрата-репортера – либо напрямую (если анализируемое вещество обладает ферментативными свойствами или мечено ферментом), либо косвенно (посредством меченного ферментом антитела, которое связывается с иммуносорбированным аналитом). Результаты качественных испытаний исследуемого образца имеют вид простых положительных или отрицательных результатов. Обычной практикой является конвертирование количественных результатов в качественные на основе установленного значения, которое служит границей для разделения положительных результатов и отрицательных. Поскольку параметры эффективности анализа сильно зависят от данного граничного значения, процесс установления этого значения должен быть научно обоснован и подробно отражен в документации. Количественные анализы определяют количество анализируемого вещества на основе интерполяции калибровочного графика для стандарта с известной концентрацией анализируемого вещества, получаемого одновременно в том же самом испытании. В качестве подобного стандарта следует использовать подходящий, желательно гомологичный стандартный или калибровочный материал, репрезентативный по отношению к анализируемому веществу (веществам). Достоинства иммунологических методов анализа подтверждаются различными постоянно совершенствующимися методиками, включая использование альтернативных твердых фаз, например, всевозможных бусин, планшетов с различным полимерным составом и различной конфигурации, а также альтернативных методов обнаружения, таких как хемилюминесценция и флуоресценция. ELISA широко используется в биофармацевтической отрасли для различных целей, таких как определение подлинности, чистоты, активности, обнаружения или количественного определения антител или антигенов, а также для других целей.

Основные принципы

Основные этапы ELISA можно представить следующим образом (см. рисунок 1):

Рисунок 1. Основные этапы ELISA.1


1. Связывание иммобилизованного реагента (как правило, антитела или антигена), который выступает в качестве иммуносорбента для захвата анализируемого вещества, на твердой фазе. 
2. Удаление избыточного несвязавшегося иммобилизованного реагента и последующее блокирование незанятых сайтов связывания с помощью блокирующих белков, таких как альбумин, желатин, казеин, или других подходящих материалов.
3a. Инкубация анализируемого вещества (входящего в состав испытуемого образца или стандартного образца) с иммобилизованным реагентом с целью связывания анализируемого вещества с твердой фазой, после чего следует отмывка несвязавшегося материала в испытуемом образце и детекция анализируемого вещества. Прямая детекция используется, когда анализируемое вещество само обладает ферментативной активностью, либо было помечено молекулой-детектором (например, ферментом). Или: 
3b. Инкубация анализируемого вещества (входящего в состав испытуемого образца или стандартного образца) с иммобилизованным реагентом с целью связывания анализируемого вещества с твердой фазой, после чего следует отмывка несвязавшегося материала в испытуемом образце и детекция анализируемого вещества (рисунок 1, этап 3а). При непрямой детекции анализируемое вещество определяется посредством добавления вторичного меченного ферментом реагента (рисунок 1, этап 3b).  
4. Количественное определение анализируемого вещества осуществляется путем добавления подходящего для используемого детектора субстрата (например, ТМБ, 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин) и сравнения анализируемого вещества со стандартным образцом.

СХЕМЫ АНАЛИЗА

В таблице 1 и в последующих разделах описываются пять основных видов ELISA. Схемы анализа являются достаточно гибкими и могут быть модифицированы в соответствии с необходимыми требованиями. Выбор способа постановки анализа зависит, в первую очередь, от количества и чистоты имеющихся реагентов, а также от имеющегося оборудования. В некоторых случаях в качестве анализируемого вещества выступает антитело (например, препараты на основе моноклональных антител). В этом случае в анализе используются антиидиотипические или другие антитела, специфичные к анализируемому антителу.

Таблица 1. Репрезентативные виды ELISA

Вид ELISA

Требуемые реагенты

Характерные особенности

Недостатки


Прямая детекция


Непрямая детекция


Конкурентный метод


Метод «сэндвича»

a  Данный реагент может быть либо очищенным либо частично очищенным. Термины «анализируемое вещество» и «антиген» в контексте различных видов ELISA являются синонимами.

Прямой метод ELISA

меченое антитело

В данном испытании антиген наносят на твердую фазу, а оставшиеся несвязанными реакционноспособные сайты блокируют (рисунок 2А). Затем добавляют раствор, содержащий специфическое антитело, меченное детектором. После инкубации несвязанное антитело удаляют и добавляют подходящий для используемого детектора субстрат.

Рисунок 2. Схематическое представление прямого, непрямого, конкурентного, «сэндвича» и «мостикового» методов ELISA.2 (Ат = антитело; Аг = антиген (или анализируемое вещество)

меченый антиген

Данный анализ похож на анализ с использованием меченого антитела, только в этом случае антитело наносят на твердую фазу, а меченый антиген используют в качестве детектора.

Непрямой метод ELISA

При выполнении данного анализа антиген наносят на твердую фазу, а затем, после блокировки, добавляют раствор специфических к антигену антител (рисунок 2В). После инкубации несвязавшиеся антитела удаляют в процессе отмывки и добавляют антитело-детектор - анти-иммуноглобулин (анти-Ig). Анти-Ig детекторы коммерчески доступны для конкретных классов и подклассов Ig, полученных от разных биологических видов, что делает этот формат анализа удобным для изотипирования антител. Кроме того, использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом ELISA, тем самым увеличивая чувствительность анализа.

Конкурентные методы ELISA

прямой вариант конкурентного метода elisa с антителом

Данный анализ используется для обнаружения или количественного определения растворимых антигенов (рисунок 2С). Для этого используют антиген-специфическое антитело, конъюгированное с соответствующим детектором, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, рутением или флуоресцеином. Также для выполнения анализа необходим чистый или частично очищенный антиген для сенсибилизации. На твердую фазу наносят антиген с последующей блокировкой. Конъюгированное антитело инкубируют с испытуемым раствором, содержащим растворимый антиген. Затем эту смесь добавляют к иммобилизованному антигену, инкубируют, а потом отмывают от несвязавшегося комплекса антигенантитело. Следующий шаг заключается в добавлении подходящего субстрата и определении степени ингибирования реакции (например, с помощью колориметрии, электрохемилюминесценции, флуоресценции или хемилюминесценции) по сравнению с реакцией без конкурентного растворимого антигена. Степень ингибирования обратно пропорциональна количеству антигена в испытуемом образце. Конкурентные варианты анализа также могут использоваться для количественного определения малых молекул, для этого планшет сенсибилизируют антителом, специфичным к конкретной малой молекуле. Малые молекулы часто биотинилируют с помощью длинного линкера, который не мешает связыванию иммобилизованного антитела и малой молекулы. Содержащийся в образце антиген (малая молекула) затем конкурирует с меченой малой молекулой за связывание с иммобилизованным антителом. После отмывки добавляют выступающий в качестве детектора реагент (например, стрептавидин, меченный пероксидазой хрена), чтобы обнаружить образовавшийся связанный комплекс.

прямой вариант конкурентного метода elisa с антигеном

Данный анализ похож на прямой вариант конкурентного метода ELISA с антителом с тем исключением, что он используется для обнаружения растворимых антител. Антиген конъюгируют с детектором, а на твердой фазе иммобилизуют антитело.

непрямой вариант конкурентного метода elisa с антителом

Данный анализ похож на прямой вариант конкурентного метода ELISA с антителом, только в этом случае при детекции вместо меченого антитела используется меченый анти-Ig реагент.

непрямой вариант конкурентного метода elisa с антигеном

Данный анализ похож на прямой вариант конкурентного метода ELISA с антигеном, только в этом случае при детекции вместо меченого антигена используется меченое вторичное антитело.

ELISA типа «сэндвич»

прямой вариант elisa типа «сэндвич»

При выполнении данного анализа антитело иммобилизуют на твердой фазе с последующей блокировкой. Затем к ним добавляют раствор, содержащий специфический антиген (рисунок 2D). После инкубации удаляют несвязавшийся материал в процессе отмывки и добавляют меченое детекторное антитело. Для выполнения данного вида анализа необходимы два антитела, которые связываются с разными эпитопами на поверхности большой и комплексной молекулы. Два антитела являются специфическими к антигену, и молекула антигена должна быть достаточно большой и комплексной, чтобы обеспечить связывание двух антител.

непрямой вариант elisa типа «сэндвич»

В качестве варианта вместо меченого детекторного антитела может использоваться антитело-детектор – анти-Ig. Непрямые варианты ИФА типа «сэндвич» могут использоваться, только если связывающиеся реагенты получены от разных биологических видов (например, если в анализе методом «сэндвич» используются два мышиных моноклональных антитела (как для захвата, так и для детекции), невозможно провести непрямую детекцию, поскольку получаемый сигнал может не зависеть от концентрации антигена).

«мостиковый» метод elisa

В данной разновидности «сэндвич» метода часто для захвата и детекции используется единственное антитело (рисунок 2Е). Если используется моноклональное антитело, то целевой антиген должен иметь, как минимум, два идентичных эпитопа, расположенных на подходящем расстоянии друг от друга, чтобы избежать стерических препятствий, и чтобы один эпитоп мог связаться с иммобилизованным антителом, а второй с антителом-детектором. В качестве варианта может использоваться поликлональное антитело, но и в этом случае молекула целевого антигена должна быть достаточно большой, чтобы обеспечить связывание с двумя молекулами антител. Что касается специфичности и чувствительности, «мостиковые» методы, как правило, могут использоваться для большинства больших молекул.

выбор анализа

Решение об использовании того или иного метода или формата ELISA часто зависит от индивидуального случая и наличия реагентов, инструментов и другого оборудования. Например, иногда лаборатория на постоянной основе встраивает определенный эпитоп во множество гибридных белков. В таком случае лаборатория может использовать определенные распространенные аттестованные реагенты (например, антитело к глутатион-S-трансферазе множества гибридных белков), что упрощает быструю разработку «сэндвич» метода. Небольшие молекулы антигенов с ограниченным числом эпитопов, позволяющих осуществлять связывание с антителом, ограничивают выбор формата ELISA. При наличии только одного связывающего эпитопа методы ELISA типа «сэндвич»/методы с двумя сайтами связывания или другие «мостиковые» разновидности не могут использоваться, так как для них необходимо, как минимум, два эпитопа для связывания антител. Кроме того, небольшие молекулы, как правило, не используются в качестве иммобилизованного реагента в планшетах, поскольку это может мешать связыванию с реагентом-детектором. Примерами таких небольших молекул являются некоторые пептиды, олигосахариды, нуклеотиды и антибактериальные агенты. Для таких небольших молекул аналитики, как правило, выбирают конкурентные методы анализа.

Различные методы и форматы могут иметь различные свойства и характеристики, например, специфичность, прецизионность, точность, чувствительность, динамический диапазон, соотношение доза-эффект, пропускную способность, чувствительность к интерференции, а также простоту или эффективность автоматизации. Протоколы и форматы испытаний также могут отличаться в отношении простоты валидации. Дизайны испытаний, в которых анализы проводятся параллельно для образцов в соседних лунках, могут быть необъективными при наличии эффектов положения (location effects); поэтому в данном случае образцы для параллельных анализов не следует помещать в соседние лунки. Дизайны испытаний, которые удобно проводить в 96-луночных планшетах с использованием относительно небольшого числа одноканальных пипеток и большего числа многоканальных пипеток, как правило, легче поддаются автоматизации. Анализы, для которых характерны крутые кривые зависимости доза-эффект, обычно позволяют получить более точные расчеты. Однако в некоторых анализах с крутыми кривыми зависимости доза-эффект не удается получить точных результатов для ЕС50 (полумаксимальной эффективной концентрации) и необходимо увеличивать диапазон доз.


методики

Твердая фаза

Твердые фазы могут иметь различную форму (например, мембраны, планшеты или бусины) и химический состав (например, нейлон, нитроцеллюлоза, поливинилиденфторид (ПВДФ), поливинил, полистирол или химически дериватизированное соединение). Выбор твердой фазы обуславливает наиболее вероятный механизм связывания, а именно, гидрофобное, гидрофильное или ковалентное взаимодействие. В целом, в сравнении с планшетами, бусины обладают большей емкостью и чаще используются в клинических анализах, в то время как планшеты чаще используются для тестирования биотехнологических препаратов. Более подробная информация о планшетах представлена ниже.

сенсибилизация твердой фазы – иммобилизация реагента захвата

Реагенты захвата наносят на твердую фазу путем добавления к твердой фазе раствора, содержащего реагент захвата. Чаще всего в качестве твердофазного носителя для иммобилизации реагента захвата используют пластиковые 96-луночные микротитрационные планшеты. Плоскодонные планшеты рекомендуется использовать для спектрофотометрических анализов, а круглодонные планшеты подходят для визуальной оценки изменения цвета красителя. На степень сенсибилизации влияют: концентрация реагента захвата, температура, при которой происходит сенсибилизация, длительность адсорбции реагента захвата, свойства поверхности твердой фазы, а также свойства буфера раствора реагента захвата. Хотя оптимальная концентрация покрытия должна определяться для каждого реагента захвата, чаще всего используется концентрация 1-10 мкг на лунку. Объем реагента захвата, добавляемого в каждую лунку, обычно соответствует объему образца, который будет анализироваться, т.е. 5-100 мкл. Длительность и температура сенсибилизации, а также буферы описываются ниже в отдельных разделах. При выполнении сенсибилизации аналитики должны избегать попадания пузырьков воздуха. Связывающиеся с пластиком белки можно подвергнуть денатурации, поскольку это влияет на их антигенность. В подобных случаях может использоваться антитело захвата или промежуточный белок, например, белок А или белок G. Кроме того, если используется биотинилированный реагент, то может применяться стрептавидин. Значение рН буферного раствора реагента захвата должно быть опитимизировано с учетом изоэлектрической точки реагента и свойств поверхности планшета, выбранного для проведения анализа.

микротитрационные планшеты

Химический состав и коммерческие источники микротитрационного планшета могут оказывать влияние на связывание реагента захвата во время иммобилизации. Следует сравнить несколько микротитрационных планшетов, приобретенных у разных поставщиков, с использованием одной и той же процедуры сенсибилизации, чтобы выбрать те планшеты, которые демонстрируют высокую специфичность в отношении конкретного реагента захвата и низкую вероятность неспецифического связывания с другими веществами. Может также понадобиться сравнение различных категорий планшетов, поставляемых одним поставщиком. Прозрачные планшеты, как правило, используются для колориметрической детекции, а матовые планшеты – для хемилюминесцентной и флуориметрической детекции. Для кислотных иммобилизованных реагентов может понадобиться раствор с более низким значением рН, чтобы нейтрализовать отталкивающие силы между белком и твердой фазой. В процессе разработки анализа для пептидов часто необходимо предусмотреть оптимизацию рН буфера с учетом их заряда для улучшения условий сенсибилизации. Иногда возникают сложности при прямом нанесении полисахаридов, липополисахаридов или гликопротеинов на планшет, и может понадобиться антитело захвата или буфер, содержащий лизин или глутаральдегид. Эффективность нанесения антитела можно увеличить посредством предварительного нанесения на микротитрационный планшет белка А или белка G или их смеси, чтобы обеспечить связывание Fc-области и позволить Fab-области связаться с нужным анализируемым веществом. Однако необходимо принять меры, гарантирующие, что последующие вторичные антитела не вступят в реакцию с белком А или белком G, нанесенными на лунки. В таком случае может использоваться, например, иммуноглобулин IgY курицы или другой подходящий класс антител. Для увеличения производительности анализа и/или экономии реагентов могут использоваться другие форматы планшетов помимо 96-лучночного, например, 96-луночные планшеты с половинным объемом лунок или 384-луночные планшеты.

время сенсибилизации

Время сенсибилизации зависит от кинетики связывания, стабильности, концентрации реагента захвата и температуры инкубации. И хотя различные сочетания разной длительности сенсибилизации и температур часто показывают одинаковую эффективность, на выбор условий влияет стабильность реагента захвата (которую необходимо определять при разработке методики). Аналитики должны оценить влияние разной длительности сенсибилизации, чтобы определить устойчивость методики анализа.

температура сенсибилизации

Температура и время сенсибилизации – тесно связанные между собой параметры методики. Температура сенсибилизации зависит от кинетики связывания и стабильности антигена. Более высокие температуры могут повышать скорость адсорбции и уменьшать время сенсибилизации, но они с определенной долей вероятности влияют на сайты взаимодействия и снижают аффинность связывания антигена и антитела. Типичные сочетания времени и температуры представляют собой 1–4 часа при температуре окружающей среды, 15 минут – 2 часа при 37° или одна ночь при 4°. Аналитики должны определять влияние вариаций температуры для оценки робастности процедуры анализа.

буферы

Буферы, используемые для растворителей, сенсибилизации, блокировки, а также отмывки планшетов, могут влиять на эффективность анализа в целом. Компоненты буферных растворов могут вступать во взаимодействие с исследуемым образцом и препятствовать связыванию. Они также могут вызывать снижение чувствительности к антигену или высокую неспецифическую фоновую активность.

Разведение. Буферы [например, фосфатно-солевой буфер или имидазольно-солевой буфер] с полисорбатом 20 (0,01%–0,1%) распространены для использования в качестве растворителя или отмывочного буфера на разных этапах анализа ELISA.

Сенсибилизация. Сенсибилизирующие буферы должны максимально повышать однородность результатов анализа и способствовать связыванию иммобилизованного реагента с твердой фазой. Наиболее распространенными сенсибилизирующими буферами являются карбонатный буфер 50 ммоль/л, pH 9,6; трис-HCl буфер 20 ммоль/л, pH 8,5 и фосфатно-солевой буфер 10 ммоль/л, pH 7,2. Сенсибилизирующий буфер выбирают опытным путем в зависимости от характеристик отдельных антигенов.

Блокирующие агенты и буферы. Блокирующий агент (например, белок или детергент) представляет собой соединение, которое должно насыщать остающиеся сайты связывания иммуносорбента после связывания иммобилизованного реагента (антитела или антигена). За счет этого сокращается неспецифическое связывание анализируемого вещества и неанализируемых компонентов с матрицей иммуносорбента и/или абсорбированным реагентом. Неспецифическое связывание наблюдается, когда белок в анализируемом образце связывается с пластмассовыми компонентами микротитрационного планшета или абсорбированным реагентом вместо специфического связывания с анализируемым иммобилизованным реагентом. Сократить неспецифическое связывание можно за счет добавления блокирующего реагента в лунки и другого белка, например, альбумина бычьей сыворотки, в буфер для разведения. Блокирующий агент выбирают, исходя из характеристик иммобилизованного реагента, планшета, сенсибилизирующего буфера, растворителя испытуемого образца и прочих связанных факторов. При изменении какой-либо из вышеуказанных характеристик может потребоваться изменение блокирующего агента. К наиболее распространенным блокирующим агентам относятся: альбумин бычьей сыворотки, обезжиренное молоко, желатин, казеин, сыворотка лошадиная нормальная, эмбриональная бычья сыворотка, полисорбат 20 и др. На рынке доступно несколько категорий альбумина бычьей сыворотки; категорию сыворотки следует определять опытным путем для каждого анализа. Кроме того, многие коммерческие реагенты для блокировки и разведения реализуются специально для проведения иммунологических методов анализа.

Добавление образцов и реагентов

В большинстве случаев образцы и реагенты переносят в лунки планшета ELISA с помощью пипетки. Необходимо предпринимать меры во избежание перекрестной контаминации, образования пены или пузырьков. Для повышения точности дозирования, производительности анализа и сокращения вариабельности, связанной со сменой лаборантов, допустимо использовать трудосберегающее оборудование, например, электронные пипетки, устройства для манипуляций с жидкостями, устройства для отмывки планшетов, а также автоматические пипетки.

пипетки

Существуют одноканальные, многоканальные и автоматические пипетки с переменным или фиксированным объемом. Для каждой области применения следует выбирать пипетки соответствующего типа и с требуемой точностью дозирования. Следует осуществлять регулярное обслуживание и официальную калибровку пипеток, что должно быть закреплено документально.

наконечники для пипеток

Существуют разные типы наконечников для пипеток, некоторые из которых пригодны только для определенного типа пипеток. Для каждой области применения следует выбирать наконечники для пипетки соответствующего типа и с требуемой точностью дозирования, особенно с учетом таких параметров анализируемого вещества, как вязкость и неспецифическое связывание материалов.

Отмывка

Этапы отмывки осуществляют на протяжении всей процедуры анализа ELISA для удаления несвязанного сенсибилизирующего антигена, анализируемого образца и реагентов-детекторов. Отмывка – критически важный для эффективности анализа этап, который может стать причиной неуспешного проведения анализа. Очень важно проводить оценку процедуры отмывки на этапе разработки метода. Существует множество подходов к данному процессу. К ручным манипуляциям относят использование мягких пластиковых бутылок, погружение микротитрационного планшета в отмывочный буфер, а также добавление отмывочного буфера с помощью многоканальной пипетки или портативных многоканальных (с восемью или двенадцатью наконечниками) дозаторов. Отмывку следует осуществлять аккуратно во избежание перекрестной контаминации между лунками. Автоматические устройства отмывки планшетов, в целом, позволяют получить более однородные результаты. Существуют отмывочные устройства как для отдельной полосы лунок, так и для всех лунок на планшете. Большинство устройств для отмывки можно запрограммировать для таких параметров, как объем и скорость дозирования, количество отмывок, скорость аспирации буфера и количество остаточного буфера в лунке. Некорректно запрограммированные, ненадлежащим образом обслуживаемые или не полностью очищенные автоматические устройства для отмывки могут стать причиной неоднородности результатов анализа и повышенного фонового сигнала.

Инкубация

Инкубацию в ходе ИФА ELISA осуществляют после добавления образцов и реагентов. В процессе разработки метода должны быть определены оптимальные условия, время и температура каждого этапа инкубации. Время инкубации может варьировать от нескольких минут до одной ночи. Обычно инкубацию проводят при температуре окружающей среды, 4° и 37°. Как правило, планшеты с анализом ELISA герметично запечатывают или помещают во вторичный контейнер, чтобы избежать испарения или контаминации в процессе инкубации. Атмосферные условия, такие как сухая или влажная инкубация, должны быть оценены в процессе разработки метода. Качание, встряхивание или вращение микротитрационных планшетов может быть необходимо или желательно в зависимости от кинетики связывания.

Условия блокировки и неспецифические реакции

После иммобилизации и удаления несвязанного антигена или антитела свободные сайты связывания блокируются для того, чтобы анализируемое вещество в испытуемом образце или реагенты-детекторы не образовали неспецифические связи с твердой фазой или сенсибилизованным антигеном или антителом. Если неспецифическое связывание происходит, любой фиксируемый сигнал может исказить результаты измерения и снизить чувствительность и динамический диапазон анализа. Блокировка является критическим этапом для обеспечения чувствительности и/или специфичности анализа. Существует две основных категории источников неспецифической связи:

Блокирующий агент (примеры приводятся в разделе «Блокирующие агенты и буферы») выбирают опытным путем, и баланс снижения неспецифического связывания и влияния на чувствительность анализа следует оценивать на этапе разработки метода. Следует принимать во внимание перекрестную реактивность с другими реагентами; например, эндогенный биотин присутствует в молоке и сыворотке, и сыворотка может содержать антитела к вирусным или бактериальным белкам. В связи с этим может потребоваться скрининг партий сыворотки. Объем раствора-блокиратора, добавляемого в лунку, должен превышать максимальный объем реакционной смеси, используемой на последующих этапах, чтобы вся поверхность, которая потенциально может повлиять на реакцию связывания, была заблокирована.

Кроме того, иммуноглобулины в исследуемых веществах можно удалить с помощью буферов, ингибирующих конформацию антител или агрегирующих гетерофильные антитела, за счет блокировки неиммунных сывороток или удаления Fc-областей в основных реагентах-антителах, таким образом сокращая или нивелируя нежелательные иммунологические взаимодействия, на которые не действуют блокирующие агенты, приведенные выше. Для мониторинга неспецифических реакций допустимо включение лунок с отрицательным контролем. Состав лунок с отрицательным контролем зависит от типа анализа; они могут включать заблокированные лунки без сенсибилизованного антигена, с удаленными первичными или вторичными антителами или с буфером вместо испытуемого образца. Контрольные лунки также целесообразны в рамках испытания пригодности системы.

Предварительная обработка образцов

Несмотря на то, что метод ELISA призван измерять анализируемое вещество в сложных смесях, присутствие других веществ может вызвать сложности в случае их влияния на обнаружение анализируемого вещества. Для обеспечения специфичности анализа возможно проведение отдельной процедуры обработки образцов с целью удаления неспецифических интерферирующих субстанций (например, уменьшения количества агентов или выпадающих в виде осадка веществ). Данная процедура определяется опытным путем на этапе разработки метода, а затем встраивается в валидированный метод анализа. Любой этап обработки образца необходимо проанализировать на вероятность изменения свойств исследуемого вещества и/или повышения вариабельности, которая ведет к искажению результатов анализа. Подготовку и обработку исследуемых, стандартных и контрольных образцов следует проводить по максимально сходным процедурам. Аналитик должен убедиться, что образцы не были испорчены или повреждены во время предварительной обработки до такой степени, что не могут быть проанализированы (например, в экспериментах по проверке чистоты пика).

Детекторные антитела

В зависимости от вида ELISA детекторные антитела, меченные ферментами или иными метками, могут быть использованы в качестве первичных или вторичных реагентов для обнаружения иммобилизованного анализируемого вещества. В случае анализа ELISA с прямой или конкурентной детекцией (Рис 2A и Рис 2C), после того, как анализируемое вещество связывается с иммуносорбентом, избыточное количество аналита отмывается, и иммобилизованное анализируемое вещество обнаруживают с помощью детекторного антитела, являющегося первичным антителом. В других видах ELISA (Рис 2B, 2D и 2E) аналит-специфическому иммуноглобулину (неконъюгированному первичному антителу) дают связаться с иммобилизованным анализируемым веществом, и избыточные антитела вымываются перед добавлением детекторного антитела, которое считают вторичным антителом.

Во всех видах ELISA, где используются конъюгированные с ферментом антитела, для детекции в систему анализа вводят субстрат, специфичный для конъюгированного фермента. В результате ферментативной реакции субстрат превращается в растворимый продукт, который можно измерить, используя соответствующие длины волн и подходящее устройство для считывания.

Чувствительность метода ELISA зависит от качества реагентов и системы детекции, включая метку и субстрат. Если доступны несколько видов различным образом конъюгированных антител, аналитики должны выбрать наиболее подходящий для данного анализа вид. В процессе такой оценки с помощью соответствующих контролей определяют разведение каждого конъюгата, которое позволяет получить требуемую специфичность и чувствительность.

Наиболее распространенными ферментами для мечения для конъюгации с антителами являются: щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и галактозидаза. Эти ферменты высокоспецифичны, чувствительны и стабильны в хромогенных, люминесцентных или флуоресцентных реакциях катализации. П-нитрофенилфосфат часто используют в качестве субстрата для щелочной фосфатазы. Основными субстратами для пероксидазы хрена являются ТМБ (тетраметилбензидин), ОФД (о-фенилендиамина дигидрохлорид) и АБТС (диаммониевая соль 2,2'-азинобис[3-этилбензтиазолин-6-сульфониевой кислоты]). (см. Таблицу 2). Субстраты для щелочной фосфатазы и пероксидазы хрена хромогенные и позволяют получить колориметрическую субстанцию, которую можно измерить с помощью спектрофотометра. Также существуют хемилюминесцентные и флуоресцентные субстраты для щелочной фосфатазы и пероксидазы хрена, и зачастую их можно приобрести в виде готовых наборов. Распространенным хемилюминесцентным субстратом для щелочной фосфатазы является динатрий 3-(4-метоксиспиро{1,2-диоксетан-3,2′-(5′-хлоро)трицикло[3.3.1.13,7]декан}-4-ил)фенилфосфат (CSPD)(см. Таблицу 2). К распространенным флуоресцентным субстратам для галактозидазы относятся 4-метилумбеллиферил галактозид и нитрофенил галактозид. При использовании хемилюминесцентного субстрата для количественного измерения получившейся субстанции требуется люменометр. Если в анализе ELISA используется флуоресцентный субстрат, потребуется флуориметр.

В Таблице 2 также представлен краткий перечень преимуществ и недостатков различных типов субстратов для метода ELISA. С момента изобретения метода ELISA преимущественно использовались колориметрические субстраты, которые позволяют проводить более достоверные количественные анализы, более выгодные с точки зрения затрат, чем анализы с использованием хемилюминесцентных и флуоресцентных субстратов. Однако хемилюминесцентные и флуоресцентные методы ELISA позволяют получить более быстрые и чувствительные анализы с более широким динамическим диапазоном, чем анализы, в которых используется колориметрия. Окончательный выбор способа считывания результатов делают на основании задачи и требований анализа.

Таблица 2. Конъюгаты и субстраты для ферментов

Способ считывания

Принцип ферментативной реакции

Фермент

Субстрат

Прибор для считывания

Преимущества

Недостатки

Колориметрический

Образуется окрашенная субстанция, коэффициенты поглощения которой прямо пропорциональны концентрации аналита

Щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена

П-нитрофенилфосфат
ТМБ
ОФД
АБТС

Спектрофотометр

Хемилюминесцентный

Происходит испускание света, прямо пропорциональное концентрации аналита

Щелочная фосфатаза

CSPD

Люменометр

Флуоресцентный

Индуцируемое возбуждением испускание света прямо пропорционально концентрации аналита

Галактозидаза

4-метилумбеллиферил галактозид

нитрофенил галактозид

Флуориметр


РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА И ПЛАН ВАЛИДАЦИИ

Разработка основных реагентов

Ключевыми характеристиками основных реагентов являются: источник, чистота, специфичность и стабильность. Для измерения параметров качества в иммунологических методах анализа стандартные образцы используют наряду с основными реагентами для иммобилизации и детекции анализируемого вещества. Любые изменения основных биологических реагентов подлежат оценке (см., например, указания в главе <1032> Дизайн и разработка биологических методов количественного анализа).

источник

Доступность и качество исходных материалов должно контролироваться для того, чтобы можно было постоянно производить (очищенный) реагент одного и того же качества, потенциально в течение нескольких десятков лет. Поскольку основные реагенты представляют собой биологические молекулы, их источником может быть как химический синтез (например, пептиды), так и биологические матрицы (например, антитела, приготовленные из сыворотки, моноклональные антитела из асцитов/клеточных культур, или продукты ферментации/клеточных культур). При необходимости может быть произведена единственная партия основного реагента в достаточном количестве, чтобы обеспечить существенный запас и отсутствие вариабельности между партиями. В других случаях целесообразно включить в валидацию нескольких партий или нескольких поставщиков для подтверждения достаточной для предполагаемого применения достоверности анализа.

чистота

В целом, чистоту основных реагентов оценивают для подтверждения удаления посторонних включений и остаточных продуктов производственного процесса, которые могут влиять на эффективность и/или стабильность реагента.

специфичность

Специфичность основного реагента заключается в его способности иммобилизовать или обнаруживать искомое анализируемое вещество. Реагент должен быть специфичным к анализируемому веществу и не должен демонстрировать неспецифическое или перекрестное связывание с нецелевыми молекулами в комплексных анализируемых материалах.

стабильность

Стабильность основных реагентов следует определять опытным путем для обеспечения эффективности анализа в долгосрочной перспективе (включая такие параметры, как точность, прецизионность, воспроизводимость и дрейф результатов анализа). Долгосрочная (от нескольких месяцев до нескольких лет) стабильность основных реагентов в требуемых условиях хранения (например, при установленных температурах и в соответствующих контейнерах) должна определяться таким образом, чтобы продукции можно было присвоить надлежащие сроки годности. Краткосрочная (от нескольких минут до нескольких дней) стабильность (а также стабильность комнатной температуры и температур замораживания/оттаивания для замороженных основных реагентов) также требуется для обеспечения ежедневной точности, прецизионности и воспроизводимости анализа.

Исследования экономической целесообразности / Поисковые исследования

Этапы разработки, валидации и применения метода ELISA в повседневном анализе образцов следующие:

На этапе разработки анализа проводят оценку критических параметров и основных реагентов и устанавливают для них такие показатели, которые гарантируют требуемую эффективность анализа. Во многих случаях может проводиться оценка нескольких параметров, а четко разработанные эксперименты могут ускорить разработку анализа, особенно в части оценки потенциальных взаимодействий нескольких введений образца.

Многие процедуры анализа ELISA специфичны для конкретного материала, поэтому сторонние стандартные образцы/градуировочные стандарты могут отсутствовать. Вопрос об изготовлении стандартных образцов/градуировочных стандартов должен быть рассмотрен на ранних этапах разработки анализа.

Валидация анализа

Валидацию анализа осуществляют в соответствии с руководствами компетентных регуляторных органов (например, ICH Q2). Цель валидации – подтверждение, что данный конкретный анализ определенного аналита пригоден для предполагаемого применения. Более подробные сведения о валидации методов анализа приведены в общей главе Валидация фармакопейных методик 1225 или в общей главе Валидация биологических методов анализа 1033, если метод ELISA используется для определения содержания действующего вещества. См. Приложение 2 для получения дополнительной информации.


анализ данных

Анализ данных метода ELISA может быть простым (например, по линейной калибровочной кривой с обратной регрессией) или комплексным (например, по нелинейной калибровочной кривой с обратной регрессией). Тип и строгость анализа данных во многом зависят от системы анализа и ее предполагаемого применения. Например, при сведении данных может быть получена оценка концентрации (к примеру, нг/мл) неизвестного образца с использованием градуировочной кривой. К другим подходам относится оценка концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) или полумаксимальной эффективной концентрации (EC50), оценка количества образца, которое дает тот же ответ, что EC50 (или IC50) на градуировочной кривой, и оценка относительной активности исследуемого образца по сравнению со стандартным образцом/градуировочным стандартом.

В общем случае, кривые метода ELISA характеризуются нелинейной зависимостью концентрации аналита и расчетного среднего ответа. Как правило, такая кривая представляет сигмоидальную зависимость ответа от концентрации. К стандартным/ калибровочным кривым применим целый ряд математических моделей, поэтому аналитики должны с особым вниманием выбирать подходящий алгоритм подбора кривой. В прочих случаях количественные анализы ELISA используют для качественной оценки с целью установления, является ли образец положительным или отрицательным относительно порога чувствительности.

Базовый статистический анализ

В настоящей главе не затрагиваются базовые статистические методы. В общей главе Аналитические данные – интерпретация и обработка 1010 приводятся важные базовые положения, включая обращение с данными, вычисление средних значений, стандартных отклонений и среднеквадратических ошибок, обнаружение непостоянных и аномальных дисперсий и методы работы с ними, обнаружение резко отклоняющихся значений и методы работы с ними, а также процедуры интерпретации статистических тестов и доверительных интервалов. Концепции, лежащие в основе валидации задач, планирования, проведения анализа и практических методов валидации, приводятся в общих главах Аналитические данные – интерпретация и обработка 1010, Валидация фармакопейных методик 1225, и Валидация биологических методов количественного анализа 1033. Общая глава Планирование и анализ биологических методов количественного определения 111 содержит руководящие указания по объединению результатов независимых анализов.

Нелинейный статистический анализ

Нелинейная калибровка в иммунологических методах анализа основана на использовании большого числа данных для составления статистического плана и анализа. К ним относятся методы оценки и устранения непостоянной дисперсии, планы и методы анализа экспериментов с комплексными структурами и валидация. Концепции, лежащие в основе дизайна и анализа линейной калибровки, а также обратной регрессии, применимы к нелинейной калибровке, и специалисты по статистике могут помочь применить их надлежащим образом.

Предоставление отчетов

Отчетные оценочные значения концентрации должны пониматься как имеющие связанный доверительный интервал, исходя из результатов валидации. Отчетное точное или оценочное значение, используемое для описания образца, может быть взято из общего результата нескольких анализов.


приложения

Приложение 1: Аббревиатуры


ELISA – твердофазный иммуноферментный анализ

Анти-Ig – анти-иммуноглобулин

ИМ – иммунологический метод

Приложение 2: Дополнительные источники сведений по отдельным темам в рамках валидации и анализа данных

Аналитические данные Интерпретация и обработка
1010

Планирование и анализ биологических методов количественного анализа
111

Валидация фармакопейных методик
1225

Главы по биологическим методам количественного определения
10321033и 1034

Средние значения

X

Стандартные отклонения

X

Среднеквадратические ошибки

X

Аномальные значения

X

X

Непостоянная дисперсия

X

X

Резко отклоняющиеся значения

X

X

Испытания

X

Доверительные интервалы

X

X

Валидация

X

X

Объединение результатов нескольких анализов

X

X


Связывание иммобилизованного реагента, блокирование, связывание аналита, связывание детекторного антитела и анализ – это пять основных этапов ELISA. После этапов связывания иммобилизованного реагента, блокирования и связывания аналита обязателен этап промывания, который позволяет удалить несвязанные реагенты до добавления нового реагента. До выполнения анализа добавляют подходящий субстрат и проводят измерение субстрата при помощи подходящего детектора. Подсчет искомых величин производят путем сравнения данных со стандартной кривой.

Тип формата ELISA зависит от доступности реагентов, предполагаемого назначения анализа, а также физико-химических характеристик исследуемого аналита. В «мостиковом» варианте ELISA иммобилизованное и детекторное антитела распознают один и тот же эпитоп, в связи с чем целевой антиген должен иметь по меньшей мере два эпитопа для связывания.