Испытание микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств: определение числа микроорганизмов

ИСПЫТАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЧИСТОТЫ
НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ:
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА МИКРООРГАНИЗМОВ

ВВЕДЕНИЕ

Испытания, описанные ниже, позволяют проводить подсчет мезофильных бактерий и грибков, которые могут развиваться в аэробных условиях. Данные испытания предназначены, в первую очередь, для определения соответствия субстанции или препарата требованиям утвержденной спецификации по микробиологической чистоте. В случае использования методик для данных целей следуют приведенным ниже инструкциям, включая количество отбираемых образцов, а также указаниям по интерпретации результатов. Данные методы не применимы к лекарственным средствам, содержащим в качестве действующего вещества жизнеспособные микроорганизмы. Могут использоваться альтернативные микробиологические испытания, в том числе автоматизированные методы, при условии подтверждения их эквивалентности фармакопейным методам анализа.

ОБЩИЕ МЕТОДЫ

Испытания проводятся в условиях, обеспечивающих предотвращение микробной контаминации испытуемого лекарственного средства извне. Меры предосторожности, принимаемые для предотвращения контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, обнаруживаемых в ходе испытания. В том случае, если испытуемое лекарственное средство обладает противомикробной активностью, она должны быть устранена или нейтрализована в максимально возможной степени. Если для этой цели используются инактиваторы, необходимо подтвердить их эффективность и отсутствие токсичности в отношении микроорганизмов. При использовании поверхностно-активных веществ для подготовки образцов, необходимо подтвердить их совместимость с любыми используемыми инактиваторами, а так же отсутствие токсичности в отношении микроорганизмов.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА

В соответствии с указаниями используется метод Мембранной фильтрации или один из Чашечных методов подсчета. Метод наиболее вероятного числа (НВЧ), в большинстве случаев, является наименее точным методом подсчета микроорганизмов; однако он может оказаться наиболее подходящим методом для некоторых лекарственных средств с очень низкой бионагрузкой. Выбор метода основывается на таких факторах как природа лекарственного средства и утвержденный предел содержания микроорганизмов. Выбранный метод должен позволять проводить анализ образца достаточного размера для возможности составления заключения о соответствии спецификации. Пригодность выбранного метода должна быть надлежащим образом подтверждена.

АНАЛИЗ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ СРЕД, ПРИГОДНОСТЬ МЕТОДА ПОДСЧЕТА И ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

Общие положения

Должна быть установлена способность методики испытания выявлять микроорганизмы в присутствии анализируемого лекарственного вещества. Пригодность методики необходимо подтверждать в случае внесения изменений, которые могут повлиять на результаты испытаний, в процесс проведения испытаний или в сам продукт.

Подготовка тест-штаммов

Используются стабильные стандартизированные суспензии тест-штаммов как указано ниже. Методики работы с посевными культурами микроорганизмов (система посевных материалов) применяются таким образом, чтобы живые микроорганизмы, используемые для посева, были удалены от главного посевного материала не более чем на 5 пассажей. Каждый бактериальный или грибковый штамм выращивают отдельно, как описано в Таблице 1.

Таблица 1. Приготовление и использование тест-микроорганизмов

Для приготовления тестовых суспензий используют буферизированный раствор хлорида натрия pH 7,0 или фосфатный буферный раствор pH 7,2. Для суспендирования спор A. Brasiliensis к буферному раствору можно добавить 0,05 % раствор полисорбата 80. Суспензии используют в течение 2 часов, или в течение 24 часов при хранении при температуре от 2° до 8 °C. В качестве альтернативы подготовке и последующему разведению свежей суспензии вегетативных клеток A. Brasiliensis или B. Subtilis, готовят стабильную суспензию спор, а затем высевают подходящий объем данной суспензии. Стабильная суспензия спор может храниться в течение валидированного периода времени при температуре от 2° до 8 °C.

Отрицательный контроль

Для проверки условий испытаний проводится отрицательный контроль с использованием выбранного растворителя вместо испытуемого раствора. Рост микроорганизмов не должен наблюдаться. Отрицательный контроль также проводится при испытании лекарственный средств, в соответствии с разделом Испытание лекарственных средств. При неудовлетворительных результатах отрицательного контроля проводится расследование.

Ростовые свойства сред

Испытывают каждую серию готовой среды, а также каждую серию среды, приготовленной из дегидратированной среды, или из указанных ингредиентов. Высеивают небольшое количество (не более 100 КОЕ) микроорганизмов, указанных в Таблице 1, в части соево-казеинового бульона или на чашки Петри с соево-казеионовым агаром, используя отдельную часть среды/чашу Петри со средой для каждого микроорганизма. Высеивают небольшое количество (не более 100 КОЕ) микроорганизмов, указанных в Таблице 1, на декстрозный агар Сабуро, используя отдельную чашку Петри со средой для каждого вида. Инкубируют в соответствии с условиями, приведенными в Таблице 1. Наблюдаемый на твердых средах рост не должен отличаться от рассчитанного значения для стандартизированного посева более чем в 2 раза. Для свежеприготовленного посева рост микроорганизмов сопоставим с ростом, наблюдаемым ранее на проверенной и одобренной серии питательной среды. Жидкие среды считаются подходящими, если наблюдается отчетливый рост микроорганизмов, сопоставимый с ростом на проверенной и одобренной ранее серией питательной среды.

Пригодность метода подсчета в присутствии препарата

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

Методика подготовки образца зависит от физических характеристик испытуемого препарата. Если ни одна из предложенных ниже методик не является удовлетворительной, должна быть разработана альтернативная методика. Водорастворимые препараты – испытуемый препарат растворяют или разводят (обычно в соотношении 1:10) в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона pH 7,0, фосфатном буферном растворе pH 7,2 или в соево-казеиновом бульоне. При необходимости, доводят pH 6-8. Если требуются дальнейшие разведения, они готовятся с тем же самым растворителем. Нерастворимые в воде препараты, не относящиеся к жирам – испытуемый препарат суспендируют (обычно в соотношении 1:10) в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона pH 7,0, фосфатном буферном растворе pH 7,2 или в соево-казеиновом бульоне. Для облегчения суспендирования плохо смачиваемых веществ может быть добавлено подходящее поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 80 в количестве 1 г/л. При необходимости, доводят значение pH приблизительно до 6-8. Если требуются дальнейшие разведения, они готовятся с тем же самым растворителем. Жиросодержащие препараты – испытуемый препарат растворяют в изопропилмиристате, стерилизованном с помощью фильтрации, либо смешивают его с необходимым количеством стерильного полисорбата 80 или другого не ингибирующего стерильного поверхностно-активного вещества в подходящей концентрации, при необходимости, нагретым до температуры, не превышающей 40 °C, а в исключительных случаях – 45 °C. Осторожно перемешивают и при необходимости поддерживают температуру с помощью водяной бани. Добавляют выбранный, предварительно нагретый, растворитель в количестве, достаточном для получения разведения исходного препарата в соотношении 1:10. Осторожно перемешивают, поддерживая температуру в течение минимального промежутка времени, необходимого для образования эмульсии. Можно провести дальнейшие серийные десятикратные разведения с использованием выбранного растворителя, содержащего стерильный полисорбат 80 или другое не ингибирующее стерильное поверхностно-активное вещество в подходящей концентрации. Жидкости или твердые вещества в форме аэрозолей – препарат асептически переносят на мембрану фильтровальной установки или в стерильную емкость для последующего отбора образцов. Для испытаний используется либо все содержимое каждой испытуемой упаковки, либо определенное количество доз. Трансдермальные пластыри – с трансдермальных пластырей удаляют защитное покрытие (покровную пленку) и помещают в стерильные пластмассовые лотки клейкой стороной вверх. Клейкую поверхность накрывают подходящим стерильным пористым материалом (например, стерильной марлей) для предотвращения слипания пластырей. Переносят пластыри в емкость с подходящим объемом выбранного растворителя, содержащего инактиваторы, например, полисорбат 80 или лецитин. Энергично встряхивают в течение не менее 30 минут.

ПОСЕВ И РАЗВЕДЕНИЕ

К образцу, приготовленному как указано выше, и к контрольной пробе (без испытуемого материала) добавляют достаточный объем микробной суспензии для получения инокулята, содержащего не более 100 КОЕ. Объем суспензии инокулята не должен превышать 1 % объема разведенного препарата. Для подтверждения приемлемого выделения микроорганизмов из продукта в испытании используется наименьший возможный фактор разведения приготовленного образца. Если это невозможно из-за противомикробной активности или плохой растворимости, должны быть разработаны соответствующие протоколы. Если не удается другими способами избежать ингибирования роста образцов, можно добавить аликвоту микробной суспензии после нейтрализации, разведения или фильтрации.

НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ/УСТРАНЕНИЕ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ

Количество микроорганизмов, выделенных из приготовленного образца, разведенного в соответствии с указаниями раздела Посев и разведение, и инкубированного в соответствии с процедурой, описанной в разделе Выделение микроорганизмов в присутствии испытуемого препарата, сравнивают с количеством микроорганизмов, выделенных из контрольной пробы. При подавлении роста (снижение количества более чем в два раза) необходимо модифицировать процедуру подсчета для подтверждения достоверности результатов. Модификация данной процедуры может включать следующее:

Нейтрализующие агенты – нейтрализующие агенты могут использоваться для нейтрализации активности противомикробных агентов (см. Таблицу 2). Они могут быть добавлены к выбранному растворителю или питательной среде, предпочтительно до стерилизации. В случае использования нейтрализующих агентов, необходимо подтвердить их эффективность и отсутствие токсичного действия в отношении микроорганизмов путем проведения контрольного опыта с добавлением нейтрализующего агента без испытуемого препарата.

Таблица 2. Распространенные нейтрализующие агенты/Методы для интерферирующих веществ

Если подходящий метод нейтрализации не найден, можно предположить, что невозможность выделения инокулированного организма объясняется противомикробной активностью испытуемого продукта. Данная информация служит показателем того, что вероятность контаминации испытуемого продукта данным видом микроорганизмов крайне мала. Однако возможно, что данный продукт подавляет рост только некоторых указанных микроорганизмов, но не подавляет рост других, не включенных в тест-штаммы, или тех, для которых данные штаммы не являются показательными. В таких случаях проводят испытание с максимальным разведением, совместимым с ростом микроорганизмов, и специфическим критерием приемлемости.

ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРИСУТСТВИИ ИСПЫТУЕМОГО ПРЕПАРАТА

Для каждого из перечисленных микроорганизмов проводятся отдельные испытания. Подсчитывают только микроорганизмы внесенного тест-штамма. Мембранная фильтрация – используют мембранные фильтры с номинальным размером пор, не превышающим 0,45 мкм. Тип фильтрующего материала выбирают таким образом, чтобы компоненты испытуемого образца не влияли на эффективность удерживания бактерий. Для каждого из перечисленных микроорганизмов используется один мембранный фильтр. Переносят подходящее количество образца, приготовленного в соответствии с указаниями разделов Подготовка образца, Посев и разведение и Нейтрализация/устранение противомикробной активности (предпочтительно, соответствующее 1 г продукта, или меньшему количеству, если ожидается выявление большого числа колониеобразующих единиц), на мембранный фильтр, немедленно фильтруют и промывают фильтр надлежащим количеством растворителя. Для определения общего числа аэробных микроорганизмов (TAMC), мембранный фильтр переносят на поверхность соевого-казеинового агара. Для определения общего числа дрожжевых и плесневых грибов (TYMC), мембранный фильтр переносят на поверхность декстрозного агара Сабуро. Инкубируют чашки Петри как указано в Таблице 1. Выполняют подсчет. Чашечные методы подсчета – чашечный подсчет выполняют не менее чем в двух повторностях для каждой питательной среды и используют среднее значение. Метод глубинного посева – в каждую чашку Петри диаметром 9 см помещают 1 мл образца, подготовленного в соответствии с указаниями разделов Подготовка образца, Посев и разведение и Нейтрализация/устранение противомикробной активности, и 15-20 мл соевого-казеинового агара или декстрозного агара Сабуро с температурой не более 45 °C. Если используются чашки Петри большего диаметра, то количество агаровой среды пропорционально увеличивают. Для каждого из перечисленных в Таблице 1 микроорганизмов готовят не менее двух чашек Петри. Чашки Петри инкубируют как указано в Таблице 1. Вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний в каждой среде и подсчитывают число КОЕ в первоначальном посеве. Метод поверхностного посева – в каждую чашку Петри диаметром 9 см помещают 15-20 мл соевого-казеинового агара или декстрозного агара Сабуро с температурой приблизительно 45 °C и дают затвердеть. Если используются чашки Петри большего диаметра, то количество агаровой среды пропорционально увеличивают. Чашки Петри сушат, например, в ламинарном шкафу или инкубаторе. Для каждого из перечисленных в Таблице 1 микроорганизмов готовят не менее двух чашек Петри. Отмеренный объем образца (не менее 0,1 мл), подготовленного в соответствии с указаниями разделов Подготовка образца, Посев и разведение и Нейтрализация/устранение противомикробной активности, распределяют по поверхности среды. Инкубируют и выполняют подсчет как указано в разделе Метод глубинного посева. Метод наиболее вероятного числа (НВЧ) – метод наиболее вероятного числа уступает по точности и прецизионности методам мембранной фильтрации и чашечному методу подсчета. В частности, недостоверны результаты подсчета плесневых грибов. Поэтому метод НВЧ используют только в случае подсчета общего числа аэробных микроорганизмов в ситуациях, когда другие методы недоступны. Если применение данного метода обосновано, следуют представленным ниже указаниям. Готовят серию не менее чем из трех последовательных десятикратных разведений испытуемого препарата в соответствии с указаниями разделов Подготовка образца, Посев и разведение и Нейтрализация/устранение противомикробной активности. Для каждого уровня разведения используют три аликвоты по 1 г или 1 мл для посева в три пробирки, содержащие от 9 до 10 мл соевого-казеинового бульона. При необходимости, к среде может быть добавлено поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 80 или инактиватор противомикробных компонентов. Таким образом, при использовании приготовления трех уровней разведения, получают девять пробирок с посевами. Пробирки инкубируют при температуре от 30° до 35 °C в течение не более 3 суток. Если в силу природы испытуемого препарата сложно оценить результаты или они получаются неопределенными, пересевают в такой же бульон или соево-казеиновый агар и инкубируют в течение 1-2 суток при той же температуре, а затем используют полученные результаты. В соответствии с Таблицей 3 определяют наиболее вероятное число микроорганизмов в грамме или миллилитре испытуемого продукта.

Таблица 3. Значения наиболее вероятного числа микроорганизмов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

При подтверждении пригодности метода мембранной фильтрации или чашечного метода подсчета, среднее значение любого из наблюдаемых микроорганизмов не должно более чем в два раза отличаться от аналогичного значения в контрольном опыте, определенного в разделе Посев и разведение в отсутствие испытуемого продукта. При подтверждении пригодности метода НВЧ, рассчитанное значение для посева должно укладываться в пределы границ 95 % доверительного интервала результата контрольного опыта. Если указанные выше критерии не могут быть соблюдены для одного или более микроорганизмов, испытываемых одним из приведенных методов, то при анализе препарата используются методика и условия, наиболее приближенные к требуемым.

ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТОВ

Количество, используемое для проведения испытания

Если в частной статье не указано иное, используют 10 г или 10 мл испытуемого препарата, соблюдая все указанные выше меры предосторожности. Для жидкостей или твердых веществ в форме аэрозоля отбирают 10 контейнеров. Для трансдермальных пластырей отбирают 10 штук. Количество отбираемого для испытания препарата может быть уменьшено для действующих веществ, которые в лекарственной форме будут соответствовать следующим условиям: количество в единице дозирования (например, таблетке, капсуле, лекарственной форме для инъекций) ⩽1 мг, либо количество на 1 г или 1 мл (для недозированных лекарственных препаратов) меньше 1 г. В таких случаях количество испытуемого образца не должно быть меньше количества в 10 единицах дозирования, 10 г или 10 мл препарата. Для субстанций, используемых в качестве действующих веществ, количество которых ограничено или размер серии очень мал (например, менее 1000 мл или 1000 г), испытуемое количество должно составлять 1 % от всей серии, если возможность использования меньшего количества не обоснована и не утверждена соответствующим образом. Для препаратов, для которых количество единиц в серии составляет менее 200 (например, образцы, используемые в клинических испытаниях), количество отбираемых образцов можно сократить до двух единиц или до одной, если количество единиц в серии составляет менее 100. Образец (образцы) отбирают случайным образом из нерасфасованного материала или из доступных контейнеров с лекарственным средством. Для обеспечения требуемого качества, смешивают содержимое достаточного числа контейнеров, чтобы получился образец для испытания.

Испытание препарата

МЕМБРАННАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ

Используют фильтровальную установку, позволяющую переносить фильтр на питательную среду. Подготавливают образец, используя подходящий подтвержденный метод, как указано в разделе Анализ ростовых свойств сред, пригодность метода подсчета и отрицательный контроль. Переносят подходящее количество на каждый из двух мембранных фильтров и немедленно фильтруют. Промывают каждый фильтр при помощи подходящей процедуры. Для определения общего числа аэробных микроорганизмов переносят один из мембранных фильтров на поверхность соево-казеинового агара. Для определения общего числа дрожжевых и плесневых грибов, переносят другую мембрану на поверхность декстрозного агара Сабуро. Инкубируют чашку Петри с соево-казеиновым агаром при температуре от 30° до 35 °C в течение 3-5 суток, а чашку Петри с декстрозным агаром Сабуро – при температуре от 20° до 25 °C в течение 5-7 суток. Подсчитывают количество КОЕ на 1 г или 1 мл продукта. Для трансдермальных пластырей отдельно фильтруют 10 % от объема препарата в соответствии с указаниями раздела Подготовка образца через два стерильных мембранных фильтра. Для определения общего числа аэробных микроорганизмов переносят один из мембранных фильтров на поверхность соево-казеинового агара. Для определения общего числа дрожжевых и плесневых грибов переносят другую мембрану на поверхность декстрозного агара Сабуро.

ЧАШЕЧНЫЕ МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА

Метод глубинного посева – подготавливают образец, используя подходящий подтвержденный метод, как указано в разделе Анализ ростовых свойств сред, пригодность метода подсчета и отрицательный контроль. Для каждой питательной среды готовят не менее двух чашек Петри каждого уровня разведения. Инкубируют чашки Петри с соево-казеиновым агаром при температуре от 30° до 35 °C в течение 3-5 суток, а чашку Петри с декстрозным агаром Сабуро – при температуре от 20° до 25 °C в течение 5-7 суток. Отбирают чашки Петри, соответствующие конкретному уровню разведения и с наибольшим количеством колоний, менее 250 для общего числа аэробных микроорганизмов и 50 для общего числа дрожжевых и плесневых грибов. Рассчитывают среднее арифметическое значение числа колоний для каждой питательной среды, а затем определяют количество КОЕ на 1 г или 1 мл препарата. Метод поверхностного посева - подготавливают образец, используя подходящий подтвержденный метод, как указано в разделе Анализ ростовых свойств сред, пригодность метода подсчета и отрицательный контроль. Для каждой питательной среды готовят не менее двух чашек Петри каждого уровня разведения. Инкубируют и подсчитывают число КОЕ в соответствии с разделом Метод глубинного посева.

МЕТОД НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА

Подготавливают и разбавляют образец, используя подходящий подтвержденный метод, как указано в разделе Анализ ростовых свойств сред, пригодность метода подсчета и отрицательный контроль. Инкубируют все пробирки при температуре от 30° до 35 °C в течение 3-5 суток. При необходимости пересевают, используя подходящую подтвержденную методику. Регистрируют для каждого уровня разведения число пробирок, в которых наблюдается рост микроорганизмов. Определяют наиболее вероятное число микроорганизмов в 1 г или 1 мл испытуемого препарата в соответствии с Таблицей 3.

Интерпретация результатов

Общее число аэробных микроорганизмов (TAMC) считается эквивалентным числу КОЕ, определенному с помощью соево-казеинового агара; если при этом на данной среде обнаруживаются колонии грибов, они рассчитываются как часть общего числа аэробных микроорганизмов. Общее число дрожжевых и плесневых грибов (TYMC) считается эквивалентным числу КОЕ, определенному с помощью декстрозного агара Сабуро; если при этом на данной среде обнаруживаются колонии бактерий, они рассчитываются как часть общего числа дрожжевых и плесневых грибов. Если ожидается, что общее число дрожжевых и плесневых грибов превысит предельные значения по причине роста бактерий, можно использовать декстрозный агар Сабуро, содержащий антибиотики. Если подсчет производится с использованием метода НВЧ, то полученное значение рассматривается как общее число аэробных микроорганизмов. Критерии приемлемости микробиологической чистоты интерпретируют следующим образом: - 101 КОЕ: максимально допустимое число = 20; - 102 КОЕ: максимально допустимое число = 200; - 103 КОЕ: максимально допустимое число = 2000; и так далее.

Рекомендуемые растворы и питательные среды описаны в статье Испытания микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств: испытания на отдельные виды микроорганизмов <62>.