Испытания на активацию моноцитов

ИСПЫТАНИЯ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ

Испытание на активацию моноцитов (ИАМ) используется для обнаружения или количественного определения веществ, активирующих моноциты человека или моноцитоподобные клетки, и как результат высвобождение эндогенных медиаторов, таких как провоспалительные цитокины, например фактор некроза опухолей α (TNFα), интерлейкина-1β (IL-1 β) и интерлейкина-6 (IL-6). Данные цитокины принимают участие в патогенезе лихорадки. Поэтому ИАМ будет выявлять наличие пирогенов в испытуемом образце. ИАМ может пригоден в качестве замены испытания на пирогенность на кроликах, после валидации методики для конкретного продукта.

У фармацевтических продуктов, содержащих пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, или провоспалительные вещества, часто получают очень крутые кривые зависимости доза-эффект по сравнению с эндотоксиновыми кривыми зависимости доза-эффект. Часто наибольшую реакцию при испытании таких продуктов получают от неразведенных растворов испытуемых препаратов или небольших разведений испытуемых препаратов. Поэтому препараты, содержащие или которые могут содержать пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, должны испытываться при диапазоне концентраций, которые включают минимальное разведение:

В данном разделе описаны три метода.

Метод А. Количественное испытание.

Метод В. Полуколичественное испытание.

Метод С. Сравнительное испытание со стандартной партией.

Испытание проводится таким образом, чтобы избежать контаминации пирогенными веществами.

Максимальное допустимое разведение (МДР) - это максимальное разведение образца, при котором может быть определено предельно допустимое пирогенное вещество. МДР определяют по формуле:

CLC = предельная концентрация пирогенного вещества;

С = концентрация испытуемого раствора;

LOD = предел обнаружения.

Критерием приемлемости для принятия положительного или отрицательного решения является предельная концентрация пирогенного вещества (CLC), которая выражается в эквивалентах эндотоксина на миллиграмм или миллилитр или в единицах биологической активности испытуемого препарата.

CLC определяют по формуле:

В случае введения продукта через частые интервалы или постоянно инфузионно, M - это максимальная общая доза, введенная в течение одного часового периода. В случае, когда для продукта установлена предельная концентрация эндотоксина (ELC), CLC будет такой же, что и ELC, если не указано иначе.

В этом случае концентрация испытуемого раствора выражается в мг/мл, если предельное содержание эндотоксина установлено в массовых единицах (МЕ/мг); в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксина выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед); в мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в объемных единицах (МЕ/мл).

Эквиваленты эндотоксина - это значения концентрации пирогенного вещества, вычисленные по кривой доза-эффект стандарта эндотоксина (метод А) или оцененные путем сравнения реакций со стандартными растворами эндотоксина (метод В). Исходный стандартный раствор эндотоксина готовят из стандартного образца эндотоксина, калиброванного относительно международного стандарта, например, стандартного образца эндотоксина BRP.

Пороговое значение вычисляется по формуле:

x̅ = среднее 4-х повторностей для реакций на отрицательный контроль (холостой раствор) (R0);

s = стандартное отклонение 4-х повторностей для реакций на отрицательный контроль (холостой раствор) (R0).

Пороговое значение выражается в соответствующих единицах полученных данных.

Предел обнаружения (ПО) определяется с использованием кривой стандарта эндотоксина. ПО - это концентрация эндотоксина, соответствующая пороговому значению. Для целей данного испытания ПО выражается как эквиваленты эндотоксина на миллилитр.

Испытуемый раствор инкубируют с источником моноцитов человека или с клетками моноцитов человека, например, с гепаринизированной периферической кровью человека, отобранной, предпочтительно, не более, чем за 4 ч до испытания, или моноцитсодержащей фракцией данной крови, например, мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные, например, путем центрифугирования в градиенте плотности, или с линией моноцитоподобных клеток (моноцитов) человека. Гепаринизированная периферическая кровь человека обычно разводится питательной средой или физиологическим раствором, например до концентрации от 2 до 50% (об/об) (конечная концентрация). Обычно в испытании используют РВМС или линии моноцитоподобных клеток в питательной среде с добавлением или плазмы донора, или АВ сыворотки с окончательной плотностью клеток 0,1-1,0 х 106 клеток/ячейка, пробирка или другой контейнер. При использовании линий моноцитоподобных клеток АВ сыворотку можно заменить на бычью эмбриональную сыворотку, инактивированную нагреванием. Культура клеток готовится при температуре 37 ± 1°С в подходящей атмосфере, например увлажненном воздухе с 5% С02. Устойчивость культуры должна быть достаточной для накопления выбранных маркеров присутствия пирогенного вещества. Реакцию выбранного маркера, например, провоспалительный или пирогенный цитокин, сравнивают с реакциями на стандартный эндотоксин или на стандартную партию испытуемого препарата. Выбранная реакция калибруется с использованием соответствующего стандарта.

5-1. ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ

Цельную кровь получают от доноров или от пулов цельной крови, которые квалифицируется в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5-3 и 5-4 соответственно.

5-2. МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ (РВМС)

РВМС выделяют из крови, полученной от доноров или пулов цельной крови, которые квалифицируются в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5-3 и 5-4 соответственно.

5-3. КВАЛИФИКАЦИЯ ДОНОРОВ

Доноры, у которых берут кровь, должны соответствовать ниже приведенным квалификационным критериям наряду с другими действующими требованиями в отношении согласия на процедуру, здоровья, безопасности и этическими принципами. Доноры должны описывать себя как «здоровые», «не страдающие любыми бактериальными или вирусными инфекциями» и «не имеющие симптомов любой инфекции в течение периода не менее 1 недели перед сдачей крови». Доноры не должны принимать нестероидные противовоспалительные лекарственные средства в течение 48 ч перед сдачей крови и стероидные противовоспалительные лекарственные средства - в течение 7 дней перед сдачей крови. Физические лица не могут быть донорами, если им были назначены иммунодепрессанты или другие лекарственные средства, которые влияют на продукцию выбранных показателей. Донорская кровь должна быть обследованы на инфекционные маркеры в соответствии с национальными требованиями к трансфузионной медицине.

5-4. КВАЛИФИКАЦИЯ КЛЕТОК, ОБЪЕДИНЕННЫХ ОТРЯДА ДОНОРОВ

Пулы (цельной крови или компонентов крови, например РВМС) должны состоять из порций крови минимум от 4 индивидуальных доноров, но предпочтительно от 8 или более доноров; пулы формируются путем отбора от каждого пакета донорской крови приблизительно одинаковых объемов крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови. Для квалификации объединенных в пул клеток действуют следующим образом: в течение 4 ч с момента сбора крови строят кривые доза-ответ для пула с использованием стандартных растворов эндотоксина в не менее чем 4-х разведениях, например, в диапазоне от 0,01 МЕ/мл до 4 МЕ/мл. Кривые доза-ответ должны отвечать 2 критериям для стандартной кривой, описанным в разделе 6-1.

5-5. КВАЛИФИКАЦИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК

Источник клеток, предназначенных для использования в ИАМ, например, цельная кровь человека, компоненты крови, такие как РВМС или линии моноцитоподобных клетках, может быть криоконсервированным. Пулы криоконсервированных клеток получают объединением перед замораживанием, или объединением единичных криоконсервированных донорских порций сразу же после оттаивания. Пулы должны состоять из порций крови минимум от 4 индивидуальных доноров, но предпочтительно от 8 или более доноров; пулы формируются путем отбора приблизительно одинаковых объемов крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови. Квалификация криоконсервированной крови или клеток выполняется сразу же после оттаивания (и объединения, в случае необходимости): кривые доза-ответ для криоконсервированных крови или клеток должны отвечать 2 критериям для стандартной кривой, описанным в разделе 6-1.

5-6. НЕПРЕРЫВНАЯ ЛИНИЯ МОНОЦИТОПОДОБНЫХ КЛЕТОК

Непрерывная клеточная линия моноцитов (моноцитоподобных клеток) человека постоянно культивируется для того, чтобы гарантировать наличие соответствующего субстрата для НАМ. Для оптимизации метода могут использоваться клоны, полученные от клеточной линии. Клетки должны храниться в асептических условиях и регулярно испытываться на заражение микоплазмой. Дополнительно клетки должны регулярно проверяться на подлинность (например, время удвоения, морфологию и функцию) и стабильность.

Функциональная стабильность клеточной линии оценивается путем наблюдения за ее состоянием с учетом количества пассажей в процессе повседневных испытаний. Критерии функциональной стабильности должны быть установлены и могут включать критерии роста, максимальную реакцию, полученную в испытании, фоновый шум и экспрессию рецептора. Экспрессия рецептора может проверяться с помощью специфических лигандов, например, липополисахарид (ЛПС) для Толл-подобного рецептора 4 (TLR4), липотейхоевая кислота (LTA) Толл-подобного рецептора 2 (TLR2), синтетический бактериальный липопротеин для TLR2-TLR1 или синтетический бактериальный липопротеин для TLR2-TLR6.

Для обеспечения прецизионности и достоверности испытания проводят предварительные испытания, в которых проверяют выполнение критериев для стандартной кривой, отсутствие взаимодействия растворов в ходе испытания, способность методики обнаруживать эндотоксины и пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, отсутствие влияния растворов на детектирующую систему.

6-1. КРИТЕРИИ ДОСТОВЕРНОСТИ ДЛЯ СТАНДАРТНОЙ КРИВОЙ

Из стандартного раствора эндотоксина готовят не мене 4 концентраций эндотоксина для построения стандартной кривой. Проводят испытание, используя не менее 4 повторностей каждой концентрации стандартного раствора эндотоксина.

Базовое высвобождение выбранного маркера (контрольный уровень) в отсутствие добавленного стандартного раствора эндотоксина должен быть оптимизировано до наиболее низкого возможного уровня.

Для стандартной кривой должны выполняться 2 критерия приемлемости:

- регрессионная зависимость ответов (соответственно преобразованных при необходимости) от логарифма дозы должна быть статистически значима (р < 0,01);

- регрессионная зависимость ответов от логарифма дозы не должна существенно отличаться от линейности (р > 0,05). При анализе 4-факторной логистической кривой наблюдаемая кривая не должна существенно отличаться от теоретической кривой, рассчитанной с помощью стандартных статистических методов (см. раздел 5.3. Статистический анализ).

6-2. ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Для обеспечения достоверности испытания проводятся предварительные испытания, подтверждающие отсутствие влияния испытуемого раствора на результаты испытания. Валидация аналитической методики требуется при внесении любых изменений в экспериментальные условия, которые способны повлиять на результаты испытания. Используя подходящий растворитель, готовится разведения испытуемого препарата с коэффициентом геометрической прогрессии, не превышающий MVD. Готовятся такие же разведения испытуемого препарата, и прибавляется эндотоксин в концентрации равной или близкой к середине стандартной кривой (Метод А) или равной удвоенному значению ПО (Метод В), или используется растворитель, содержащий добавленный эндотоксин в концентрации равной или близкой к середине стандартной кривой (Метод А) или равной удвоенному значению ПО (Метод В). Проводят испытания полученных рядов разведений параллельно в одном эксперименте. Для вычисления концентрации эквивалентов эндотоксина в каждом растворе используют стандартную кривую. Вычисляют среднее значение полученной концентрации раствора эндотоксина, содержащего добавленный эндотоксин, вычитанием средней концентрации эквивалентов эндотоксина в растворе (при его наличии) из средней концентрации раствора эндотоксина, содержащего добавленный эндотоксин.

Считают, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если в условиях испытания вычисленная концентрация эквивалентов эндотоксина, добавленного к испытуемому раствору, находится в пределах 50-200 % от известной концентрации добавленного эндотоксина, после вычитания концентрации эндотоксина, обнаруженной в растворе, не содержащем добавленного стандарта эндотоксина. Если испытание не отвечает этому критерию, следует провести испытание Методом С.

При методе С испытания проводят на 3 разведениях раствора испытуемого препарата: наибольшая концентрация (наименьший фактор разведения), при котором наблюдается наибольший выброс выбранного маркера, и двухкратные разведения непосредственно больше и меньше выбранной концентрации. Так как концентрация испытуемого препарата, при которой наблюдается наибольший выброс выбранного маркера, может зависеть от особенностей донора клеток/крови, а также серии клеток, должна быть проведена валидация методики в отношении используемого субстрата на трех независимых испытаниях с использованием в каждом из них клеток от различных доноров. Набольшая концентрация (наименьший фактор разведения), при котором регистрируется высвобождение наибольшего количества выбранного маркера у большинства доноров и 2-кратные разведения непосредственно ниже и выше выбранного разведения, считаются валидированными для дальнейшего выполнения испытания. Если наибольшее высвобождение выбранного маркера происходит при испытании исходного испытуемого раствора, последующее испытание должно выполняться с использованием неразведенного испытуемого раствора, а также испытуемого раствора, разведенного в отношениях 1:2 и 1:4 перед его добавлением к РВМС. 3 разведения, используемые в последующем исследовании, не должны превышать MVD; коэффициенты разведения для этих 3 растворов обозначаются как f1, f2 и f3. После валидации в отношении субстрата выполняется обычное испытание с клетками от 4 индивидуальных доноров или с единичным пулом или с клетками от 1 пассажа линии моноцитоподобных клеток человека.

6-3. ВАЛИДАЦИИ МЕТОДИКИ В ОТНОШЕНИИ ВЕЩЕСТВ-АКТИВАТОРОВ МОНОЦИТОВ, ОТЛИЧНЫХ ОТ ЭНДОТОКСИНОВ

В предварительных испытаниях также подтверждают способность выбранной аналитической системы обнаруживать помимо бактериальных эндотоксинов провоспалительные или пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов. Для этого можно использовать ранее исследованные архивные серии, наличие в которых пирогенных веществ, отличных от эндотоксинов, было определено на основании положительных реакций в испытании «Пирогенность» на кроликах или развития побочных эффектов у человека. При отсутствии таких серий препарата, в предварительные испытания должна быть включена валидация используемой аналитической системы при помощи специфических лигандов для толл-подобных рецепторов, например, пептидогликанов, липотейхоевых кислот или синтетических бактериальных липопротеинов.

6-4. ВЛИЯНИЕ НА СИСТЕМУ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ

После подбора оптимального разведения раствора испытуемого препарата для дальнейшего исследования, данное разведение испытывается на наличие влияния на систему детектирования (например, ELISA) для выбранного маркера. Различие в определяемых концентрациях серий разведений стандарта выбранного маркера в присутствии и отсутствии испытуемого препарата должно находиться в диапазоне ± 20%.

7-1. МЕТОД А: КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ

При методе А проводится сравнение реакции испытуемого препарата с кривой доза-ответ стандартного раствора эндотоксина. Концентрация пирогенных веществ в испытуемом препарата не должна превышать CLC.

7-1-1. Процедура испытания

Используя валидированную методику испытания, готовят растворы, приведенные в Таблице 2.6.30.-1, и культивируют 4 повторности каждого раствора с клетками от каждого из 4 индивидуальных доноров или с единичным пулом или с клетками от 1 пассажа линии моноцитоподобных клеток человека.

Таблица 2.6.30.-1

Раствор А = раствор испытуемого препарата в разведении, обозначенном в таблице как/ при котором было проведено испытание на метающие факторы, то есть наибольшая концентрация (наименьшее разведение), для которой определяемая концентрация эндотоксина находится в пределах от 50 до 200%.

Раствор В = 2-кратное разведение раствора А, не превышающее MVD. Раствор С = 2-кратное разведение раствора В, не превышающее MVD.

Раствор D = раствор А, содержащий стандарт эндотоксина в концентрации около середины стандартной кривой (R3).

Раствор R0 = отрицательный контроль.

Раствор R1-R4 = растворы стандарта эндотоксина в концентрациях, использованных в испытании на мешающие факторы.

7-1-2. Вычисления и оценка результатов

Все результаты, включаемые в данные анализа, должны быть связаны с клетками, для которых выполнены 2 критерия стандартной кривой. Определяемая концентрация эквивалентов эндотоксина, рассчитанная путем вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина в растворе А из концентраций в растворе D находится в пределах 50-200%. Для каждого различного источника клеток, например, индивидуального донора, пула доноров, клеточной линии, для вычисления концентрации эквивалентов эндотоксина в каждой из повторностей растворов А, В и С используется кривая стандарта эндотоксина R1-R4. Испытуемый препарат отвечает требованиям испытания для определен

ого источника клеток, если среднее концентраций эквивалентов эндотоксина, измеренное в повторностях растворов А, В и С, с учетом разведений и концентрации, меньше CLC, установленного для испытуемого препарата.

7-1-3. Критерии соответствия/несоответствия препарата

При использовании клеток от индивидуальных доноров, испытуемый препарат должен выдерживать испытание, проведенное с клетками от каждого из 4 различных доноров. Если испытуемый препарат выдерживает испытание с клетками от 3 из 4 доноров (клетки 1 донора исключены, поскольку не отвечают критериям проведения испытания или имеют положительную реакцию), испытание продолжают с клетками от других 4 доноров, клетки от которых не использовались в первом испытании; испытуемый препарат должен выдерживать испытание с клетками от 7 из 8 различных доноров (то есть, допускается только 1 положительная реакция при использовании клеток от 8 доноров). Если источник моноцитов представляет клетки, объединенных от ряда индивидуальных доноров, испытуемый препарат должен выдерживать испытание с 1 пулом клеток. При использовании линии моноцитоподобных клеток человека, испытуемый препарат должен выдерживать испытание с 1 пассажем линии клеток.

7-2 МЕТОД В. ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ

При методе В проводится сравнение испытуемого препарата со стандартом эндотоксина. Концентрация пирогенного вещества в испытуемом препарате должна быть менее CLC. Раствор А должен быть выбран для принятия решения о соответствии, если не обоснованно и разрешено другое.

7-2-1. Процедура испытания

Используя валидированный метод испытания, готовят растворы, приведенные в Таблице 2.6.30.-2, и культивируют 4 повторности каждого раствора с клетками от каждого из 4 индивидуальных доноров или с единичным пулом или с клетками от 1 пассажа линии моноцитоподобных клеток человека.

Таблица 2.6.30.-2

Раствор А = раствор испытуемого препарата в разведении, обозначенном в таблице как f при котором было проведено испытание на мешающие факторы.

Раствор В = раствор испытуемого препарата в разведении, обозначенном в таблице как f1 не превышающем MVD, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении субстрата, например 1:2 × MVD (то есть 2-кратное разведение выше MVD).

Раствор С = раствор испытуемого препарата в разведении, обозначенном как f2 не превышающем MVD, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении субстрата, то есть MVD

Раствор D = раствор А, в который добавлен стандарт эндотоксина в концентрации 2 × ПО используемой системы (как определено в предварительном испытании).

Раствор Е = раствор В, в который добавлен стандарт эндотоксина в концентрации 2 × ПО используемой системы.

Раствор F = раствор С, в который добавлен стандарт эндотоксина в концентрации 2 × ПО используемой системы.

Раствор R0 = отрицательный контроль.

Раствор R1 = стандарт эндотоксина в количестве 0,5 × ПО для используемой системы.

Раствор R2 = стандарт эндотоксина в количестве 1 × ПО для используемой системы.

Раствор R3 = стандарт эндотоксина в количестве 2 × ПО для используемой системы.

Раствор R4 = стандарт эндотоксина в количестве 4 × ПО для используемой системы.

7-2-2. Вычисления и оценка результатов

Все результаты, которые должны быть включены в анализ данных, должны быть связаны с клетками, для которых средние реакций на растворы R0-R4 увеличиваются в прогрессии. Среднее реакции на R0 может быть равным среднему реакции на R1. Для каждого различного источника клеток, например, индивидуального донора, пула доноров, клеточной линии, среднее ответа на раствор R2 должно быть больше положительного порогового значения. Результаты ниже этого положительного порогового значения рассматриваются как отрицательная реакция. Если среднее ответа на R1 или R2 превышает пороговое значение, реакция на раствор, выбранный для оценки соответствия/несоответствия препарата требованиям, должна быть отрицательной (= выдерживает испытание).

Для каждого отрицательного раствора испытуемого препарата (А, В и С), среднее ответа на соответствующий раствор с добавленным стандартом эндотоксина (D, Е или F соответственно) сравнивается со средним ответа на R3 для определения определяемой концентрации в % от ожидаемой. Концентрация пирогенного вещества в испытуемом препарате менее CLC для данного источника клеток, если раствор испытуемого препарата, выбранный для выбранный для оценки соответствия/несоответствия и разведения ниже его дают отрицательные результаты и определяемая концентрация добавленного в растворы стандарта эндотоксина находится в диапазоне от 50 до 200%.

7-2-3. Критерии соответствия/несоответствия препарата

Критерии те же, что и для Метода А (см. п. 7-1-3).

7-3. МЕТОД С: СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ СО СТАНДАРТНОЙ ПАРТИЕЙ

При Методе С проводится сравнение испытуемого препарата с валидированной стандартной партией этого препарата. Стандартная партия выбирается в соответствии с обоснованными и утвержденными критериями. Данное испытание предназначено для случаев, когда испытуемый препарат оказывает заметное мешающее действие, но не может быть разведен в диапазоне MVD для устранения мешающего действия, поскольку данный препарат содержит (или предполагается, что содержит) пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов. Реакции на пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, могут быть более быстрыми и выраженными, чем ответы на эндотоксин, что делает необходимым выполнение испытания в диапазоне разведений, который включает минимальное разведение. Процедура испытания описана ниже и включает пример сравнения испытуемой партии со стандартной партией.

7-3-1. Процедура испытания

Используя валидированную методику испытания, готовятся растворы, указанные в Таблице 2.6.30.-3 и культивируются 4 повторности каждого раствора с клетками от каждого из 4 индивидуальных доноров или единичного пула или с клетками от 1 пассажа линии моноцитарных лейкоцитов человека.

Таблица 2.6.30.-3

Растворы А, В и С - это разведения стандартной партии в степенях разведения f1, f2, f3, определенных в испытании на мешающие факторы.

Растворы D, Е и F - это разведения испытуемого препарата в степенях разведения f1, f2, f3, определенных для стандартной партии в испытании на мешающие факторы.

Раствор G - это положительный испытуемый контроль жизнеспособности клеток и содержит концентрацию стандарта эндотоксин, при которой наблюдается четкий положительный ответ.

Раствор R0 - это растворитель, используемый для разведения испытуемого препарата, и представляет собой отрицательный контроль.

7-3-2. Вычисления и оценка результатов

Все результаты, включаемые в анализ данных, должны быть связаны с клетками, у которых раствор G и хотя бы один из растворов А, В и С вызывают ответ, превышающий базовый уровень высвобождения выбранного маркера (Раствор R0). Для каждого различного источника клеток, например, индивидуального донора, пула доноров, клеточной линии, используют стандартную кривую для маркера (калибровочная кривая в двух повторностях с отрицательным контролем и не менее 4 разведений стандарта маркера в геометрической прогрессии) и вычисляют среднюю величину ответов на растворы A-F. Суммируют среднее ответов на растворы А, В и С и среднее ответов на растворы D, Е и F. Делят сумму средних ответов на растворы D, Е и F на сумму средних ответов на растворы А, В и С. Испытуемый препарат отвечает требованиям испытания для данного источника клеток, если результирующее значение соответствует определенному критерию приемлемости, не превышающему 2,5.

7-3-3. Критерии соответствия/несоответствия препарата

Критерии те же, что и для Метода А (см. 7-1-3).

Для более точного количественного определения уровня содержания пирогенного вещества Методы А, В и С могут выполняться с использованием других разведений раствора испытуемого препарата, не превышающих MVD.

Рекомендации по применению

Испытание на активацию моноцитов (ИАМ) в первую очередь предназначено для использования в качестве альтернативного метода испытанию на пирогенность на кроликах. ИАМ позволяет обнаруживать пирогенные и провоспалительные вещества, включая эндотоксины грамотрицательных бактерий и пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, включая патогенно-ассоциированные характерные молекулярные паттерны грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусов и грибов, пирогенные биологические или химические вещества, характерные для продукта и или образующиеся в процессе производства.

Так как пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, представляют собой молекулы с разнообразными физико-химическими характеристиками, и обычно природа пирогенного вещества, присутствующего в испытуемом препарате, неизвестна, уровень содержания этих веществ выражается или в единицах эндотоксин-эквивалента, полученных путем сравнения с реакциями на стандарт эндотоксина, или путем сравнения со стандартной партией испытуемого препарата.

В ИАМ концентрации маркеров, образующихся в результате реакции на стандарт эндотоксина, обычно разводят приблизительно в 10 раз (на 1 логарифм) и при испытании продуктов, содержащих пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, (одних или в комбинации с эндотоксинами), на их способность стимулировать моноциты часто получают очень крутые кривые доза-ответ, обычно только в диапазоне 1 или 2 степеней разведений. Часто наибольший ответ на такие продукты получают при использовании неразведенных растворов испытуемых препаратов или небольших разведений испытуемых препаратов. По этой причине испытуемые растворы препаратов, которые содержат или могут содержать пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, должны испытываться в диапазоне разведений, который включает минимальное разведение.

2-1. ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО ВЫБОРА МЕТОДОВ

Методы А, В и С обычно не применяются в случае, когда сам испытуемый препарат может активировать высвобождение из клеток выбранного маркера, или когда одной из примесей в испытуемом препарате является выбранный маркер. В обоих случаях эти обстоятельства должны привести к модификации и валидации выбранного метода. Предполагается, что при валидации выбранного метода в отношении субстрата (маркера) будет определена частота отсутствия реакции на соответствующую комбинацию продукт /пирогенные примеси и обеспечит выбор мер по обеспечению достоверности результатов испытаний, например, скрининг доноров, увеличение числа доноров, у которых получают клетки для каждого испытания, установление достаточно строгих критериев соответствия/несоответствия для максимального увеличения вероятности обнаружения серий продукта, содержащих существенного количество пирогенных веществ. Методы А и В могут использоваться, когда ответы на разведения испытуемого препарата приблизительно параллельны ответам на разведения стандарта эндотоксина. Метод В является полуколичественным испытанием, который может также применяться, когда ответы на разведения испытуемого препарата не параллельны ответам на разведения стандарта эндотоксина. Метод С, сравнительное испытание со стандартной партией испытуемого препарата, был разработан для случаев значительной индивидуальной вариабельности реакции донорских клеток на определенные комбинации продукт/пирогенные примеси. Следует отметить, что в то время как реакция моноцитов большинства доноров на бактериальный эндотоксин приблизительно одинакова, ответы моноцитов отдельных доноров на пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, могут существенно различаться, поэтому возможно идентифицировать клетки, у которых ответ на определенные комбинации продукт/пирогенные примеси отсутствует.

2-2. ВЫЧИСЛЕНИЕ ПРЕДЕЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ПИРОГЕННОГО ВЕЩЕСТВА

Критерием приемлемости для принятия решения о соответствии/несоответствии является предельная концентрация пирогенного вещества (CLC), которая выражается в эквивалентах эндотоксина на миллиграмм или миллилитр или в единицах биологической активности испытуемого препарата. Если предельная концентрации эндотоксина (ELC) для продукта установлена, то CLC будет равен ELC, если не указано иное. CLC выражается в эквивалентах эндотоксина. CLC вычисляется по формуле:

К = пороговая пирогенная доза эндотоксина на килограмм массы тела;

М = максимальная рекомендованная разовая доза препарата на килограмм массы тела.

В случае введения продукта через частые интервалы или постоянно инфузионно, М - это максимальная общая доза, введенная в течение одного часового периода. Предельные концентрации эндотоксина зависит от продукта и его пути введения и устанавливается в фармацевтических статьях.

Значения для К представлены в Таблице 2.6.30.-4.

Таблица 2.6.30.-4

Для продуктов с другими путями введения предельная концентрация бактериальных эндотоксинов обычно определяется на основе результатов, полученных в процессе разработки препарата.

2-3. ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО КРИОКОНСЕРВАНТОВ

Влияние криоконсервантов, например, диметилсуль-фоксида (DMSO), и их остаточных количеств в размороженных клетках должны быть оценены: DMSO оказывает токсичное действие на клеточные культуры и, даже если клетки были тщательно промыты, криоконсервирование может изменять свойства клеток, например, проницаемость клеточных мембран.

2-4. ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Если требуется, проводится испытание на мешающий факторы по крайней мере 3 различных партий испытуемого препарата. Испытуемые препараты, у которых отмечается значительная вариабельность реакций от серии к серии, обусловленная их вариабельностью, должны подвергаться испытанию на мешающие факторы в рамках каждого индивидуального испытания, то есть сопутствующей валидации.

Испытание на мешающие факторы в большинстве случае выполняется на сериях испытуемого препарата, которые не содержат эндотоксинов и других пирогенных/провоспалительных веществ, а, если это невозможно, на сериях с минимальным содержанием пирогенных веществ. Если имеется только 1 серия испытуемого препарата, валидация должна выполняться на этой серии в трех независимых испытаниях. Должны выполняться параметры прецизионности для воспроизводимости, например, ± 50%.

Как отмечалось ранее, испытание на активацию моноцитов (ИАМ) прежде всего предназначено для использования в качестве альтернативы испытанию на пирогенность на кроликах. В фармакопейных статьях на лекарственные средства, предназначенные для парентерального введения, которые могут содержать пирогенные вещества, содержат требования проведения испытания на бактериальные эндотоксины или испытания на активацию моноцитов.

Общие принципы:

- в любой фармакопейной статье, при наличии требований к содержанию пирогенных веществ, указывается только 1 испытание, или испытание на бактериальные эндотоксины, или ИАМ. Перед включением ИАМ в фармакопейную статью требуются подтверждения пригодности одного из трех методов, описанных в общем разделе «Испытание на активацию моноцитов» для оценки продукта, являющего предметом данной фармакопейной статьи.

- необходимая информация предоставляется производителями. Заинтересованным производителям предлагается предоставить любые данные по валидации, относящиеся к применимости ИАМ для контроля субстанций и лекарственных форм. Такие данные включают подробное описание приготовления образцов,

а также любые процедуры по удалению мешающих факторов. В дополнение требуются любые доступные данные по параллельному испытанию продукта на пирогенность на кроликах, способствующие доказательству того, что замена испытания на пирогенность на кроликах на ИАМ применима.

Замена испытания на пирогенность на кроликах на ИАМ или замена метода определения провоспалительных/пирогенных веществ на другой метод должны рассматриваться согласно положений раздела «Общие сведения» о замене фармакопейных методик на альтернативные «Все испытания, в том числе методики количественного определения, приведенные в Фармакопее, являются официальными, на них базируются стандарты качества Фармакопеи. По согласованию с компетентным уполномоченным органом при контроле качества продукта могут использоваться альтернативные методики, обеспечивающие возможность принятия такого же однозначного решения о соответствии продукта требованиям фармакопейной статьи, как и в случае использования методов, в ней описанных. В случае сомнений или разногласий основной является фармакопейная методика.»

Для валидации метода для ИАМ, отличного от описанного в фармакопейной статье, предполагается выполнение следующих работ:

- процедура, материалы и реактивы, используемые в испытании, должны быть валидированы в соответствии с рекомендациями для данного испытания;

- присутствие мешающих факторов (и, если необходимо, процедура по их устранению) должна испытываться на образцах не менее 3 производственных серий.

ИАМ должен применяться ко всем новым продуктам, предназначенным для парентерального введения, которые должны испытываться на присутствие веществ, активирующих моноциты, в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи.