Исследование процессов производства лекарственных препаратов, выделенных из плазмы, с учетом риска заражения вариантом болезни Крейтцфельдта-Якоба

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЛАЗМЫ, С УЧЕТОМ РИСКА ЗАРАЖЕНИЯ ВАРИАНТОМ БОЛЕЗНИ КРЕЙТЦФЕЛЬДТА-ЯКОБА

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………………

2. ПРЕДМЕТ…………………………………………………………………………………….

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛИРЕНСА ТГЭ…………………..

3.1. Общие принципы………………………………………………………………………….

3.2. Уменьшение масштабов производственного процесса…………………………………

3.3. Выбор вносимого в образец инфекционного агента……………………………………

3.4. Выбор методов количественного анализа……………………………………………….

3.5. Выбор этапов производства………………………………………………………………

3.6. Интерпретация данных и ограничения их применения.....…………………………….

3.7. Повторная оценка клиренса ТГЭ…………………………………………………………

3.8. Санитарная обработка оборудования…………………………………………………….

4. РЕЗЮМЕ / ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………

1. ВВЕДЕНИЕ

Тема трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ), включая, в частности, вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (вБКЯ), обсуждалась на экспертных совещаниях/семинарах EMEA в январе 1998 г., январе 1999 г., декабре 1999 г., мае 2000 г., декабре 2000 г., июне 2002 г. и январе 2004 г. Последняя редакция Официального заявления Комитета по лекарственным препаратам для медицинского применения (CHMP) касаемо вБКЯ и лекарственных препаратов, выделенных из плазмы, была опубликована в июне 2004 г.1

Вариант БКЯ (вБКЯ) был обнаружен в 1996 г. Согласно официальным данным по вБКЯ, в Великобритании на начало августа 2004 г. было зафиксировано, в общей сложности, 147 точных или вероятных случаев заражения вБКЯ. (Случай, зафиксированный в Гонконге, на самом деле был установлен в Великобритании, поэтому включен в статистику по Великобритании). Помимо этого, по одному случаю болезни было установлено в Ирландии, США и Канаде, но инфицирование, вероятно, произошло на территории Великобритании. Однако никто из 7 инфицированных во Франции и гражданин Италии не находились на территории Великобритании. Вероятность возникновения случаев заражения в других странах не может быть исключена. Генотипирование всех клинических случаев вБКЯ показало гомозиготность (метионин/метионин) по кодону 129 гена прионного белка (PrP). Однако недавно было зафиксировано наличие признаков инфекции у пациента, не страдающего данным заболеванием, гетерозиготного (метионин/валин) по кодону 129.2

Существуют достоверные доказательства того, что вБКЯ вызывает тот же инфекционный агент, что и губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (ГЭКРС). Наиболее вероятной гипотезой возникновения вБКЯ считается употребление в пищу зараженных ТГЭ продуктов.

До сих пор существует неопределенность в отношении прогноза количества случаев заражения вБКЯ. В отличие от спорадической БКЯ, свидетельства обширного вовлечения органов лимфоретикулярной системы привели к возникновению опасений насчет вероятности передачи инфекции от больных в доклинической фазе заболевания через кровь или препараты крови.

Данные, полученные на основании экспериментальных моделей грызунов с ТГЭ, подтверждают инфекционность компонентов крови.3,4,5,6 Также была обнаружена инфекционность лейкоцитарной пленки серого мышиного лемура (Microcebus murinus), экспериментально инфицированного адаптированным к макакам штаммом ТГЭ.7 Эксперименты с переливанием крови у особей одного вида также показали, что экспериментальная ТГЭ или природная инфекция скрепи могут передаваться путем переливания крови у овец.8 С другой стороны, эксперименты для определения инфекционности вБКЯ в крови человека, проведенные на мышах дикого типа9, трансгенных мышах, а также приматах, не показали передачу инфекции, однако, часть исследований еще не завершена.10 Тем не менее, при отслеживании реципиентов крови доноров из Великобритании было установлено два случая возможной вторичной передачи после переливания эритроцитов доноров, у которых впоследствии развились симптомы вБКЯ.2,11 На сегодняшний день по результатам эпидемиологических исследований не удалось установить ни одного случая заражения БКЯ после введения лекарственных препаратов, выделенных из плазмы (исследования проводились в группах реципиентов высокого риска, таких как больные гемофилией).10,12 Накопленные сведения об эпидемиологии слишком ограничены для того, чтобы сделать заключение о возможности передачи вБКЯ через лекарственные препараты, выделенные из плазмы. По данным на февраль 2004 г., не было выявлено ни одного случая вБКЯ, связанного с введением лекарственных препаратов, выделенных из плазмы.11

Плазма доноров из Великобритании в настоящее время не подвергается фракционированию в качестве меры предосторожности, поскольку в Великобритании было зафиксировано наибольшее количество случаев ТГЭ и значительно большее, чем в любой иной стране, количество случаев вБКЯ. Плазма доноров из Франции в настоящее время подвергается фракционированию на основании положительной оценки соотношения «риск-польза». Если в перспективе в каких-либо других странах будет зафиксировано несколько случаев вБКЯ, гарантию безопасности препаратов, произведенных ранее, будет обеспечивать процедура, которая, как показывает опыт, способна снижать инфекционность ТГЭ и может оказаться полезной для подтверждения возможности продолжения фракционирования.

2. ПРЕДМЕТ

Согласно имеющимся данным, процессы производства лекарственных препаратов, выделенных из плазмы, позволяют сократить инфекционность плазмы человека. Официальное заявление 2004 года постановляет1: «Производители должны оценивать потенциал отдельных производственных процессов в отношении снижения инфекционности при использовании поэтапного подхода».

Цель настоящего документа состоит в предоставлении руководящих указаний в отношении исследования производственных процессов на предмет риска инфицирования вБКЯ. В настоящий момент опыта в данной области недостаточно для предоставления исчерпывающего руководства. В связи с этим в настоящем руководстве приводятся рекомендации, основанные на имеющемся опыте, но допустимы и другие подходы. Исключительно важно рассматривать этот документ вместе с последней редакцией Официального заявления, упоминаемого выше, в особенности с его разделом 9.2.3. Процессы производства лекарственных препаратов, выделенных из плазмы. Согласно этому Официальному заявлению, рекомендовано консультироваться с соответствующими компетентными органами. Комитет CHMP и рабочая группа по биотехнологическим препаратам (BWP) готовы обсуждать возникающие вопросы.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛИРЕНСА ТГЭ

3.1. Общие принципы

Принципы, изложенные в Примечании к руководству CPMP/BWP/268/95 для исследований по валидации инактивации и удаления вирусов13, должны максимально распространяться на агенты, вызывающие ТГЭ.

В материал, из которого производится препарат, необходимо ввести объем вещества с содержанием соответствующего инфекционного вещества не более 10 %; исследование инактивации/удаления вируса, вызывающего ТГЭ, должно проводиться на точной маломасштабной лабораторной модели. Испытания должны проводиться персоналом с надлежащей квалификацией строго отдельно от производства и под тщательным контролем с последующим документированием. Как и валидационные исследования на вирусы, валидация маломасштабной модели должна подтверждаться соответствующими параметрами процесса и техническими показателями эффективности маломасштабных моделей.

Исследованию подлежат только те этапы производства, которые могут повлиять на инактивацию/удаление вируса. Агенты, вызывающие ТГЭ, считаются устойчивыми к большинству физико-химических процедур инактивации вирусов, которые обычно применяют в процессе производства лекарственных препаратов, выделяемых из плазмы. В связи с этим, в исследовании может делаться упор на такие этапы удаления/разделения, как фракционирование холодным этанолом, осаждение полиэтиленгликолем, хроматография, глубинная фильтрация или нанофильтрация.

Изучение данных этапов удаления вируса в валидационном исследовании на вирусы включает наглядное подтверждение разделения агентов на побочные фракции, а также исследование параметров, которые влияют на эффективность какого-либо производственного этапа в отношении инактивации/удаления агентов (см. раздел 5.5 Примечания к руководству CPMP/BWP/268/9513). Исследования инфекционных агентов ТГЭ гораздо более трудоемкие и дорогостоящие, чем исследования стандартных агентов, поэтому возможно проведение анализа робастности производственного процесса на теоретической основе в рамках дизайна экспериментального исследования или использование надлежащим образом валидированного количественного анализа in vitro. Необходимо иметь в виду, что процесс удаления вируса может зависеть от изменения производственных параметров. В связи с этим при разработке дизайна экспериментальных исследований для этапов разделения важно установить ограничения внутри процесса. Исследования должны включать оценку разделения прионов на побочные фракции на основании количественного анализа in vitro. Логарифм факторов разделения < 1 не является статистически значимым.

Изначальный титр с известным количеством инфекционного агента (spiking titre) может быть достаточно высок для того, чтобы провести исследование комбинации двух (или более) этапов. Дизайн подобных исследований нескольких этапов одновременно должен позволять определять факторы снижения вирусной нагрузки на каждом этапе, а также на всех исследуемых этапах путем анализа соответствующих промежуточных образцов. Подобные комбинированные исследования нескольких этапов могут оказаться полезными для обоснования аддитивности факторов снижения слабой или средней вирусной нагрузки. Кроме того, исследование нескольких этапов может оказаться полезным в случае, если есть вероятность существенного изменения физико-химических свойств материала ТГЭ, которое может повлиять на эффективность удаления вируса на следующем этапе (например, обработка детергентом перед этапом фильтрации). Идеальным вариантом является проведение экспериментального исследования, которое охватывает весь производственный процесс целиком. Однако при работе с вирусами ограничением для эксперимента служит, в большинстве случаев, слишком низкий первоначальный титр преднамеренно вносимого в образец инфекционного агента, что не позволяет охватить более одного или двух этапов.

Основные аспекты, на которые необходимо обратить внимание:

- процесс уменьшения масштабов исследования;

- выбор вносимого в образец инфекционного агента;

- выбор метода количественного анализа;

- выбор этапов производства;

- интерпретация данных и ограниченность их применения;

- повторная оценка клиренса ТГЭ;

- санитарная обработка оборудования.

3.2. Уменьшение масштабов производственного процесса

Принципы уменьшения масштабов производственного процесса для экспериментальных исследований ТГЭ совпадают с принципами для валидационных исследований на вирусы. Производители должны предоставлять данные по выходу готового продукта, качеству и составу препарата или промежуточных продуктов, произведенных в рамках маломасштабного процесса (версии процесса с уменьшенным масштабом), и эти данные должны быть сопоставимы с данными, полученными для стандартных партий лекарственных препаратов в рамках полномасштабного производства.

3.3. Выбор вносимого в образец инфекционного агента

Согласно данным экспериментов на животных, в ходе которых им вводили инфекционные агенты ТГЭ, инфекционность обнаруживается в крови, при этом примерно у половины – в плазме, а у другой половины – в лейкоцитарной пленке.3 Уровень инфекционности низкий, по меньшей мере в 10 000 раз ниже, чем обнаруживаемый в мозгу, следовательно, мозговая ткань – единственный источник материала инфекционного агента, пригодный для проведения экспериментов.4 Несмотря на необходимость использования максимально высокого титра инфекционного агента, его доля в исследуемом образце не должна превышать 10 % от общего объема во избежание искажения свойств исследуемой фракции.

Основными аспектами, на которые необходимо обратить внимание, являются:

1) штамм инокулята и вид животного, на материале которого он был получен;

2) его физико-химическая природа.

1) Вид и штамм

Факторы, согласно которым отбирают источник материалов для использования в качестве вносимого в образец инфекционного агента, включают: источник, количественное определение и вероятное подобие материала в отношении инфекционности, которая может присутствовать в плазме. Получение непересеваемого материала у больных вБКЯ ограничено по этическим и иным причинам. Несмотря на то, что для количественного анализа биологической активности вБКЯ допустимо использование обычных мышей, и существует как минимум одно опубликованное исследование с применением данного материала из организма человека в исследованиях с добавлением вещества14, использование вБКЯ не является обязательным. В принципе, ткани мозга особей крупного рогатого скота, инфицированных ГЭКРС, доступны в большом объеме, однако, на практике сложно получить материал надлежащего качества. Кроме того, потенциально сложен количественный анализ материала. Это касается и овец, инфицированных ГЭКРС, и в максимальной степени овец, зараженных скрепи. За исключением демонстрационных процессов, например, для подтверждения, что в ходе процесса удаляются не только эталонные агенты, но и агент вБКЯ, считается целесообразным использовать адаптированные к грызунам лабораторные штаммы ТГЭ (например, скрепи, наследственная БКЯ, ГЭКРС или вБКЯ). Поскольку их патология и характеристики штаммов отличаются, было исследовано несколько штаммов. Принципы, на которых основывался их количественный анализ, являются общепринятыми. Согласно опубликованным исследованиям, на данный момент не установлено наглядное влияние видов или штаммов на результат исследований по удалению вируса14, несмотря на то, что штаммы могут отличаться по устойчивости к термоинактивации.15,16 При проведении исследований по удалению вируса нет необходимости делать выбор на основании пригодности штамма, поэтому решение принимают, исходя из практических соображений. Обоснование выбора штамма должно приводиться в любом случае.

2) Физико-химическая форма вносимого в образец инфекционного агента

Несмотря на то, что в ходе экспериментов инфекционность ТГЭ была четко определена в крови животных, на данный момент физико-химическая природа агентов ТГЭ в крови остается неизвестной. Было выдвинуто предположение о том, что речь идет, скорее всего, об инфекционности, обнаруживаемой в селезенке, нежели в мозгу, основанием для чего послужило допущение, что ее источником является любая ткань, кроме мозговой. Однако неясно, что является источником инфекционности в тех опытных системах, которые были продемонстрированы. Существует вероятность, что она является материалом, образующимся в процессе дегенерации мозга, в таком случае мозговая ткань будет подходящим источником материала для добавления в исследуемый препарат. С другой стороны, мозговые ткани, содержащие высокоагрегированные нерастворимые формы белка PrPSc могут как походить на инфекционные прионы в крови, так и нет. Важно тщательно рассмотреть различные возможные физические типы преднамеренно вносимого в исследуемый материал инфекционного агента.

Вэй и соавт.17 описали исследования с четырьмя типами агента, которые были получены из гомогената мозга хомячка.

(a) Неочищенные гомогенаты мозга

В опубликованных исследованиях инфекционности наиболее широко использовались неочищенные гомогенаты мозга. Они содержат наиболее высокую концентрацию инфекционности. Однородность и воспроизводимость подобных субстанций могут быть важным фактором в проводимых исследованиях. Если частицы материала имеют широкий спектр размеров, соответственно, возможно удаление частиц вируса различного размера физическим методом, например, фильтрацией. Воспроизводимость инфекционного материала также может оказаться важным фактором для оценки достоверности полученных результатов.

(b) Микросомальная фракция

Микросомальные фракции получают путем дифференциального центрифугирования гомогенатов мозга, за счет которого происходит удаление крупных скоплений. Микросомальные фракции отражают мембраносвязанную инфекционность. Уровень инфекционности ниже, чем у неочищенных гомогенатов мозга, однако, он всё равно достаточно высок, и данная субстанция считается более однородной, чем неочищенные гомогенаты мозга.

(c) Кавеолоподобные домены мембраны (CLD)

Их получают путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы лизированных детергентом гомогенатов мозга. Уровень инфекционности ниже, чем в микросомах, а также они могут имитировать домены мембраны, «слущивающиеся» с клеток.

(d) Очищенный белок PrPSc

Очищенный белок PrPSc получают путем повторяющихся экстракций детергентом гомогенатов мозга, вслед за которым производят осаждение солей и ультрацентрифугирование. Это формы, не связанные с клетками или мембранами. Неясно, сопоставима ли данная субстанция с материалом, встречающимся в природе.

Согласно результатам исследований осаждения, три мембраносвязанных инфекционных агента, преднамеренно вносимых в исследуемый препарат (гомогенаты, микросомы и CLD) обладают сходным действием, поэтому любой из этих трех типов агентов подходит для проведения подобных исследований. Использование микросомальных фракций может быть предпочтительнее, поскольку в процессе их получения удаляют самые крупные скопления, и сам материал более стабильный при постоянно высоких уровнях активности. Наоборот, очищенный белок PrPSc легче поддавался осаждению (в том числе, до криопреципитата) по сравнению с любой мембранной фракцией. Возможно использование других типов вносимых в образец добавок.

Неясно, характерна ли реакция какого-либо из данных материалов, добавляемых в исследуемое вещество, для формы инфекционности, обнаруживаемой в плазме. В качестве вносимых в образец добавок следует выбирать субстанции, которые могут представлять значительную сложность для исследуемого этапа производства, поскольку это позволит провести анализ в наиболее трудных условиях. Обоснование выбора субстанции должно приводиться в любом случае.

3.4. Выбор методов количественного анализа

Количественный анализ инфекционности считается золотым стандартом определения агентов, вызывающих ТГЭ. Присутствие агента в ткани или жидкости устанавливается путем инфицирования соответствующих животных моделей, и развитие неврологического заболевания после инкубационного периода указывает на присутствие агента. Инфекционность измеряют титрованием до конечной точки у животных. Длительность инкубационного периода также может использоваться в качестве количественной меры инфекционности, присутствующей в исследуемом материале, против валидации с определением инфекционности путем титрования до конечной точки. Существование межвидового барьера передачи и влияние вида и штамма налагают ограничения на материалы, пригодные для количественного анализа. Например, препараты спорадической БКЯ человека редко используют для инфицирования обычных мышей дикого типа, при этом они подходят для трансгенных мышей. Это один из приведенных выше факторов, которые необходимо учитывать при выборе агента, добавляемого в исследуемое вещество. Биологические методы анализа очень непросты для осуществления, что связано с инкубационным периодом, когда для получения результатов наиболее быстрых методов может понадобиться минимум 6-9 месяцев наблюдений и клинического мониторинга инфицированных животных (например, хомячков 263K) и до 15-18 месяцев, если речь идет о нетрансгенных мышиных моделях. Кроме того, физико-химические свойства исследуемого инфекционного агента ограничены комбинацией инфекционного агента/штамма и животного-реципиента. Иными словами, невозможно испытать на одном взятом виде или штамме вируса все типы инфекционного материала, который может использоваться для добавления к исследуемому веществу в ходе валидационного исследования. Это еще одно ограничение для разработки дизайна валидационных исследований производственного процесса с целью демонстрации разделения или инактивации прионов, вызывающих ТГЭ у человека.

Биологические методы количественного анализа необходимо проводить в специальных лабораториях и помещениях для животных, уровни безопасности в которых адаптированы к используемым штаммам (уровень 2 для описанных штаммов скрепи, уровень 3 для штаммов человека и ГЭКРС). Очень ограниченное число лабораторий в Европе имеют возможность работать с большим количеством животных в течение длительного периода клинических наблюдений в помещениях с безопасностью уровней 2 или 3. Наконец, учитывая сложность количественного анализа, длительность инкубационного периода и требуемые меры безопасности, стоимость подобных испытаний очень высока. Тем не менее, большинство опубликованных исследований клиренса процесса включают отдельные элементы испытаний инфекционности. В случае их проведения необходимо использовать подробно охарактеризованную систему штаммов и животного-индикатора.

На сегодняшний день отсутствует общепринятый тест in vitro для определения присутствия инфекционности и количественного расчета уровня инфекционности. Несколько клеточных линий (N2a, GT1) являются неустойчивыми и могут быть инфицированы отдельными штаммами ТГЭ, адаптированными к мышам18, при этом некоторые штаммы, трансфицированные геном PrP, могут дублировать отдельные штаммы скрепи.

Альтернативный метод количественного определения, который также использовался в опубликованных исследованиях, основан на обнаружении белка PrPSc. На данный момент истинные физико-химические свойства агентов ТГЭ до сих пор не установлены, несмотря на то, что результаты многочисленных экспериментов свидетельствуют о вероятности того, что они состоят целиком из белка-хозяина, PrP, накапливающегося с аномальной конформацией. Белок с аномальной структурой (PrPSc) относительно устойчив к протеиназе K (ведет к образованию протеаза-устойчивого белка PrPres) и концентрациям денатурирующих агентов, таких как гуанидина гидрохлорид, которые удаляют белок PrPSc. Обнаружение белков PrPSc или PrPres в тканях животных можно рассматривать как суррогатный маркер инфекционности. Однако корреляция между инфекционностью и содержанием PrPres варьируется в зависимости от штамма и, вероятно, от метода измерения какого-либо из этих параметров. Данные аспекты влияют на достоверность, с которой клиренс, измеряемый удалением PrPSc, может соотноситься с клиренсом инфекционности, несмотря на то, что взаимосвязь была установлена в специфических случаях в ряде опубликованных исследований.19 Если корреляция между биохимическим методом количественного определения PrPSc и биологическим методом анализа установлена, может быть достаточно подтверждения разделения или инактивации инфекционных прионных белков биохимическим методом количественного определения.

Дальнейшие указания по поэтапному подходу к использованию биохимического анализа или биологического анализа приводятся в Официальном заявлении CHMP1, раздел 9.2.3 Процессы производства лекарственных препаратов, выделенных из плазмы.

3.5. Выбор этапов производства

Учитывая установленную устойчивость агентов, вызывающих ТГЭ, к традиционным методам инактивации вирусов, таким как термообработка, для исследования следует выбирать такие производственные этапы, в ходе которых можно ожидать частичное удаление или разделение агента. Исходя из этого, нерационально проводить исследования на этапе обработки растворителем/детергентом и термической обработки; внимание необходимо уделять этапам фракционирования этанолом, осаждения, хроматографии и фильтрации, которые, согласно данным ряда исследований, показали существенную эффективность в удалении агентов, вызывающих ТГЭ.

С другой стороны, необходимо иметь в виду, что действие материала, преднамеренно добавляемого в исследуемое вещество, на определенном этапе может быть изменено под воздействием обработки на предыдущем этапе. Например, обработка растворителем/детергентом может разделить инфекционные агенты таким образом, что они с большей долей вероятности минуют фильтр, а значит, исследования с необработанными материалами покажут завышенный клиренс.

Все производители должны критически оценивать производственные процессы в свете опубликованных данных. Указания по поэтапному подходу к проведению экспериментальных исследований, специфических для препаратов, приводятся в Официальном заявлении CHMP, раздел 9.2.3.1

3.6. Интерпретация данных и ограниченность их применения

Исследования производственных процессов на качественное содержание вирусов предполагают целый ряд оговорок, которые в исключительной степени применимы к оценке процессов в связи с их возможностью удалять инфекционные агенты, вызывающие ТГЭ. В число подобных оговорок входят:

1. Моделирование процесса может быть несовершенным. Этапы, основанные на разделении, сложно достоверно смоделировать в исследованиях на качественное содержание вирусов; особенно это касается этапов фракционирования этанолом, которые могут иметь исключительную важность в удалении агентов, вызывающих ТГЭ.

2. Предполагается, что при оценке двух этапов общий клиренс приблизительно равен их сумме. Это может быть не так, в частности, в случае гетерогенности добавляемого в исследуемое вещество материала, когда одна фракция предпочтительно может быть удалена на одном этапе, а ее субфракция – на другом.

3. Предварительная обработка может влиять на клиренс агента. Например, если материал обработан детергентом, он может пройти следующий этап, такой как фильтрация, гораздо легче, чем необработанный, что связано с его дисперсией.

4. Используемые методы количественного определения несовершенны. Методы количественного определения инфекционности дорогие и очень медленные. Несмотря на общую корреляцию содержания белка PrPSc с инфекционностью, их взаимосвязь может зависеть от метода определения PrPSc и инфекционности. На настоящий момент большинство исследований подтверждается методами количественного определения инфекционности, которые считаются наиболее достоверными.

5. Штамм и вид животного, с использованием которых был получен материал, вносимый в исследуемый образец, могут определять подходящие методы количественного определения. Несмотря на отсутствие доказательств существенного влияния происхождения добавляемого материала на этапы удаления, есть вероятность, что установленный клиренс может зависеть от него.

6. Физико-химические свойства добавляемого в исследуемое вещество материала могут играть существенную роль. На данный момент отсутствуют какие-либо признаки определения физико-химической формы агентов, вызывающих ТГЭ, в крови при их присутствии. В одном из опубликованных исследований проводилось испытание различных мембраносодержащих добавляемых материалов, которые удалялись сходным образом на всех анализируемых этапах осаждения. В отличие от них, немембраносвязанные добавляемые материалы быстрее удалялись на определенных этапах осаждения.17 На определенных этапах, не связанных с осаждением (например, адсорбции), может произойти обратная ситуация. В связи с этим, добавляемый в исследуемое вещество материал, позволяющий провести наиболее точное испытание, может варьироваться в зависимости от этапа производственного процесса.

7. В исследованиях на животных объем агента, присутствующий в крови, низок, при этом вносимое в образец вещество будет иметь наиболее высокий титр, насколько это возможно. Существует вероятность, что удаление добавляемого материала менее эффективно при низких концентрациях, чем при высоких.

8. Анализ процессов инактивации/удаления вирусов включает оценку робастности процесса, например, изучение влияния изменений параметров процесса. Сложности проведения подобных исследований с ТГЭ, в отличие от применения исключительно методов количественного определения in vitro, ведут к тому, что вероятность частых повторных испытаний крайне мала.

В связи с этим, достоверность возможности удаления инфекционного агента, вызывающего ТГЭ, на каком-либо этапе производственного процесса ниже, чем возможности удаления эталонного вируса.

3.7. Повторная оценка клиренса ТГЭ

При проведении валидационных исследований на вирусы может потребоваться повторная оценка данных клиренса ТГЭ в ходе производственного процесса, если были внесены какие-либо существенные изменения. В связи со сложностью проведения исследований и оговорками по поводу получаемых результатов, подобные изменения окажутся, вероятнее всего, существенными. Как вариант, разработки в научной сфере могли бы упростить исследования, например, за счет возможности проведения методов количественного анализа инфекционности in vitro, что могло бы оправдать дальнейшую работу.

3.8. Санитарная обработка оборудования

Инактивация прионов традиционными методами деконтаминации была проанализирована в ходе многочисленных исследований. Инфекционность ТГЭ особенно трудно инактивировать, и было установлено, что некоторые образцы в течение долгих лет остаются патогенными для окружающей среды. Целый ряд методов обработки считается неэффективным в условиях нормального применения (например, алкилирующие агенты, детергенты), в то время как другие признаны довольно эффективными (например, замачивание в ≥ 2% растворе отбеливателя или натрия гидроксиде (NaOH) 1-2 моль/л в течение 60 мин., автоклавирование при 134-138 °С при определенном давлении и в течение установленного времени). Отдельные процедуры признаны в качестве эталонных методов обработки или рекомендаций ВОЗ20 и применяются для медицинских изделий или отходов производства. Однако их применимость довольно ограничена по ряду причин; большинство методов являются довольно жесткими и могут нанести урон биологическим веществам, они вызывают коррозию оборудования, используемого при производстве, или демонстрируют ограниченную эффективность в отношении других инфекционных агентов (например, NaOH считается неэффективным в отношении спор). Ряд экспериментальных методов обработки (например, щелочные очищающие средства, протеазы и т.д.) находятся на этапе оценки пригодности к использованию в процедурах очищения и деконтаминации, но еще не применяются на практике.

В связи с устойчивостью инфекционных агентов, вызывающих ТГЭ, к инактивации и их склонности к прикреплению к нержавеющей стали и прочим материалам, исключительно важно учитывать возможность процедур санитарной обработки и очистки, проводимых для оборудования, в котором производится фракционирование, инактивировать или удалять агенты, вызывающие ТГЭ. Санитарную обработку и повторное использование колонок также следует рассматривать в свете влияния возможных методов обработки на инфекционность ТГЭ. Необходимо иметь в виду, что многие процессы фракционирования заканчиваются на этапе глубинной фильтрации, на котором добавляется фильтрующий материал. Если этот этап подтвердил свою эффективность, он снижает риск контаминации продукта любой инфекционностью, источником которой является оборудование.

Исследование инактивации или удаления инфекционных агентов, вызывающих ТГЭ, которые прикрепляются к металлическим поверхностям, может быть исключительно сложным. Была разработана модель, в которой стальную проволоку окунали в препарат ТГЭ и имплантировали в мозг чувствительного животного, у которого затем развивалось заболевание. Санитарная обработка проволоки может отслеживаться на такой модели путем погружения проволок с различными разведениями агента, их обработки, а затем определения потери инфекционности в результате. Недавно был опубликован пример данного подхода к исследованию новых методов дезинфекции контаминированных прионами медицинских изделий.21 Экстраполяция результатов подобных исследований на оборудование на промышленном уровне может оказаться непростой задачей. Зачастую для очистки производственного оборудования используют растворы NaOH. Было установлено, что обработка раствором 0,1 моль/л NaOH превращает белок PrPSc в протеаза-чувствительную форму, либо в растворе, либо при адсорбции металлической поверхностью.22 Результаты необходимо подтверждать исследованиями инфекционности.

С учетом приведенных выше соображений, в настоящий момент невозможно дать какие-либо специальные рекомендации, пока не будут доступны новые научные сведения в отношении оборудования для обработки плазмы.

4. РЕЗЮМЕ / ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все производители должны критически анализировать производственные процессы в свете опубликованных данных. Указания по поэтапному подходу к проведению экспериментальных исследований, специфических для препаратов, приводятся в Официальном заявлении CHMP, раздел 9.2.3.1 Что касается исследований удаления вируса, нет каких-либо причин делать выбор на основании пригодности штамма агента, вызывающего ТГЭ, поэтому решение может приниматься, исходя из практических соображений. Возможно использование различных препаратов в качестве вносимого в образец агента. В качестве вносимых в образец добавок следует выбирать субстанции, которые могут представлять значительную сложность для исследуемого этапа производства, поскольку это позволит провести анализ в наиболее трудных условиях. Обоснование выбора субстанции должно приводиться в любом случае.

Считается, что ограниченность данных связана характером модели и приближенностью значений, которые связаны с осуществимыми экспериментальными исследованиями. Однако предполагается, что данные экспериментальные исследования позволят получить полезную информацию о возможности удаления агента, вызывающего ТГЭ, в процессе производства лекарственных препаратов, выделенных из плазмы.

Список литературы

1. CHMP Position statement on Creutzfeldt-Jakob Disease and plasma-derived and urine-derived medicinal products, June 2004 (EMEA/CPMP/BWP/2879/02/rev 1)

http://www.emea.eu.int/pdfs/human/press/pos/287902rev1.pdf

2. Peden AH, Head MW, Ritchie DL, Bell JE, Ironside JW. Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet 2004;364:527-529.

3. Brown P, Rohwer RG, Dunstan BC, MacAuley C, Gajdusek DC, Drohan WN. The distribution of infectivity in blood components and plasma derivatives in experimental models of transmissible spongiform encephalopathy. Transfusion 1998;38:810-816

4. Brown P, Cervenáková L, McShane LM, Barber P, Rubenstein R, Drohan WH. Further studies of blood infectivity in an experimental model of transmissible spongiform encephalopathy, with an explanation of why blood components do not transmit Creutzfeldt-Jakob disease in humans. Transfusion 1999;39:1169-1178

5. Taylor DM, Fernie K, Reichl HE, Somerville RA. Infectivity in the blood of mice with a BSEderived agent. Journal of Hospital Infection 2000;46:78.

6. Cervenakova L, Yakovleva O, McKenzie C, Kolchinsky S, McShane L, Drohan WN, Brown P. Similar levels of infectivity in the blood of mice infected with human-derived vCJD and GSS strains of transmissible spongiform encephalopathy. Transfusion 2003;43:1687-1694. CPMP/BWP/5136/03 EMEA 2004 Page 10/10

7. Bons N, Lehmann S, Mestre-Francès N, Dormont D, Brown P. Brain and buffy coat transmission of bovine spongiform encephalopathy to the primate Microcebus murinus. Transfusion 2002;42:513-516

8. Hunter N, Foster J, Chong A, McCutcheon S, Parnham D, Eaton S, MacKenzie C, Houston F. Transmission of prion diseases by blood transfusion. Journal of General Virology 2002;83:2897-2905

9. Bruce ME, McConnell I, Will RG, Ironside JW. Detection of variant Creutzfeldt-Jakob disease infectivity in extraneural tissues. Lancet 2001;358:208-209

10. Cervenáková L, Brown P, Hammond DJ, Lee CA, Saenko EL. Factor VIII and transmissible spongiform encephalopathy: the case for safety. Haemophilia 2002;8:63-75

11. Llewelyn CA, Hewitt PE, Knight RSG, Amar K, Cousens S, Mackenzie J, Will RG. Possible transmission of variant Creutzfeldt–Jakob disease by blood transfusion. Lancet 2004;363:417-421.

12. Ricketts MN, Brown P. Transmissible spongiform encephalopathy update and implications for blood safety. Clin Lab Med 2003;23:129-37.

13. CPMP Note for guidance on virus validation studies: the design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses, February 1996 (CPMP/BWP/268/95) http://www.emea.eu.int/pdfs/human/bwp/026895en.pdf

14. Stenland CJ, Lee DC, Brown P, Petteway SP, Rubenstein R. Partitioning of human and sheep forms of the pathogenic prion protein during the purification of therapeutic proteins from human plasma. Transfusion 2002;42:1497-1500

15. Taylor DM. Inactivation of transmissible degenerative encephalopathy agents: a review. The Veterinary Journal 2000;159:10-17.

16. Somerville RA, Oberthür RC, Havekost U, MacDonald F, Taylor DM, Dickinson AG. Characterization of thermodynamic diversity between transmissible spongiform encephalopathy agent strains and its theoretical implications. Journal of Biological Chemistry 2002;277:11084-11089.

17. Vey M, Baron H, Weimer T, Gröner A. Purity of spiking agent affects partitioning of prions in plasma protein purification. Biologicals 2002;30:187-196.

18. Klöhn P-C, Stoltze L, Flechsig E, Enari M, Weissmann C. A quantitative, highly sensitive cellbased infectivity assay for mouse scrapie prions. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003;100:11666-11671.

19. Lee DC, Stenland CJ, Miller JLC, Cai K, Ford EK, Gilligan KJ, Hartwell RC, Terry JC, Rubenstein R, Fournel M, Petteway SR. A direct relationship between the partitioning of the pathogenic prion protein and transmissible spongiform encephalopathy infectivity during the purification of plasma proteins. Transfusion 2001;41:449-455.

20. WHO Laboratory Biosafety Manual 2003

21. Fichet G, Emmanuel C, Duval C, Antloga K, Dehen C, Charbonnier A, McDonnell G, Brown P, Lasmézas CI, Deslys J-P. Novel methods for disinfection of prion-contaminated medical devices. Lancet 2004;364:521-526.

22. Käsermann F, Kempf C. Sodium hydroxide renders the prion protein PrPSc sensitive to proteinase K. Journal of General Virology 2003,84:3173-3176.