Определение содержания невидимых механических включений в инъекционных лекарственных препаратах на основе терапевтических белков

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕВИДИМЫХ МЕХАНИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ В ИНЪЕКЦИОННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ НА ОСНОВЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ

Введение

Основная тенденция разработки и производства лекарственных препаратов для парентерального введения заключается в сведении к минимуму количества присутствующих в них механических включений, которые подразделяются на две обширные группы: видимые и невидимые. Абсолютный порог видимости, или обнаружения, зависит от условий проведения испытания и от свойств механических включений. Общая информация, изложенная в настоящей статье, применима к невидимым механическим включениям, диаметр которых находится в пределах диапазона 2-100 мкм. Механические включения, размер которых превышает 100 мкм, считаются видимыми частицами (см. общую статью «Видимые механические включения в инъекционных лекарственных препаратах», <790>).

Присутствие посторонних и механических включений в готовом лекарственном препарате является нежелательным. Однако такие нежелательные частицы могут попадать в лекарственный препарат из двух источников: внешнего (extrinsic) – это посторонние включения, и внутреннего (intrinsic) – это специфические для препарата включения. Включения, связанные с внешними источниками, не имеют отношения ни к самому препарату, ни к процессу его производства. Включения, связанные с внутренними источниками, могут являться либо побочным продуктом упаковки и маркировки, либо появляться в препарате в результате изменений, происходящих со временем. Существует и третья категория частиц – собственные (inherent) включения, которые связаны с физическим состоянием или естественными свойствами препарата. Данная общая статья разработана как дополнение к общей статье «Невидимые механические включения в инъекционных лекарственных препаратах на основе терапевтических белков», <787>, в которой определены пределы по содержанию механических включений диаметром 10 мкм и 25 мкм. Поскольку контроль совокупности невидимых включений размером менее 10 мкм может являться важным параметром качества лекарственного препарата, рекомендуется осуществлять сбор данных о содержании механических включений диаметром 2-10 мкм (например, 2-5 мкм и 5-10 мкм). В данной статье основное внимание сконцентрировано на вопросах, связанных с подсчетом, описанием свойств и, когда возможно, идентификацией собственных механических включений. А также речь идет об отличиях собственных от внешних и внутренних механических включений. Требования настоящей общей статьи не распространяются на такие лекарственные формы, как суспензии или эмульсии, а также лекарственные препараты, содержащие адъюванты или другие частицы, имеющие аналогичные функции. Тем не менее, количество посторонних и механических включений в готовом лекарственном средстве должно быть ограничено, а стратегия и методология, служащие для достижения данной цели, должны определяться непосредственно производителем.

Частицы, связанные с внешними источниками

Это материалы, не имеющие отношения к лекарственной форме, упаковке или маркировке, а являющиеся посторонними и непрогнозируемыми. Примерами частиц, попадающих в препарат из внешних источников, могут служить: материалы биологического происхождения (например, волокна, части насекомых, пыльца и растительный материал), производственные и строительные материалы (например, целлюлоза, ворс, минералы, стекло, пластик, резина, метал и краска), материалы, попадающие в препарат в процессе его обработки персоналом (например, эпителиальные клетки, фрагменты одежды, волосы).

Частицы, связанные с внутренними источниками

Материалы, появление которых в готовом лекарственном препарате связано с ингредиентами, входящими в состав лекарственного средства, особенностями маркировки и упаковки. Если их появление обусловлено производственным процессом и/или имеет отношение к упаковке, это может являться признаком комплексной проблемы. Например, силиконовое масло является важным компонентом производственного процесса и лекарственных средств, и его присутствие влияет на число механических включений. В избыточном количестве частицы силиконового масла считаются включениями, связанными с внутренними источниками. Частота попадания в лекарственное средство частиц, имеющих отношение к силиконовому маслу, может коррелировать с последовательностью производственных циклов или с источниками компонентов лекарственного препарата. Вопросы, связанные с выявлением, идентификацией и определением содержания частиц, имеющих отношение к силиконовому маслу, будут более подробно рассмотрены в другом разделе данной главы. Частицы внутреннего происхождения могут быть в некотором смысле схожими с частицами внешнего происхождения, такими как резина, металл, пластик и стекло, но они попадают в лекарственный препарат в результате ненадлежащей очистки производственного оборудования. Также частицы внутреннего происхождения могут появляться в лекарственном препарате с течением времени, как результат происходящих в нем изменений. Данные изменения могут быть обусловлены особенностями ионных или органических экстрактов, нестабильностью активных фармацевтических ингредиентов, разложением лекарственной формы или взаимодействием лекарственного препарата и упаковки. Частицы внутреннего происхождения могут способствовать росту содержания белка, чего следует опасаться.

Собственные частицы

Материалы, появление которых ожидается в связи с использованием определенных лекарственных субстанций и других компонентов лекарственной формы и является, таким образом, потенциально допустимой характеристикой препарата. Что касается инъекционных лекарственных препаратов на основе терапевтических белков, то в данном случае основным источником собственных включений являются белковые агрегаты, которые формируются либо исключительно за счет взаимодействия белка с самим собой, либо в комбинации с другими ингредиентами, входящими в состав лекарственной формы. Наличие белковых частиц говорит о необходимости оценки с точки зрения однородности технологического процесса и качества продукции. Для того чтобы отличить собственные частицы от частиц внешнего и внутреннего происхождения, критически важно провести идентификацию и дать описание свойств агрегатов. Средства и методологии, описанные в настоящей общей статье, применимы ко всем механическим включениям, но особенно хорошо подходят для описания свойств белковых агрегатов.

В состав гетерогенных частиц, как правило, входит не одно химическое соединение. К частицам внешнего или внутреннего происхождения гетерогенные частицы относят по небелковому компоненту, который представляет собой наибольший риск.

Изначально методы испытаний, представленные в общей статье <788> «Механические включения в инъекционных лекарственных препаратах», были предназначены для выявления и контроля содержания частиц внешнего и внутреннего происхождения и основывались на методах светоблокировки (LO) и/или микроскопического определения частиц, диаметры которых находятся в пределах диапазона 10-25 мкм. Данный диапазон значений был выбран для обеспечения достоверного подсчета невидимых механических включений и определения приемлемости лекарственного препарата с точки зрения безопасности для человека и постоянства технологического процесса. Сначала был разработан мембранно-микроскопический метод, который использовался только для исследования препаратов, представленных в большом объеме (100 мл). Позже, благодаря изменениям, которые были внесены в методы, и изобретению метода автоматического затухания света (светоблокировки), появились эффективные и надежные способы отслеживания содержания механических включений во многих лекарственных препаратах различного объема. Для процессов установления фармакопейных стандартов характерна эволюция аналитических систем: методы постоянно претерпевают изменения, чтобы соответствовать научно-техническим достижениям, соображениям о безопасности пациентов и регуляторным требованиям.

С тех пор, как вступила в действие общая статья <788>, на рынке фармацевтических препаратов значительно увеличилось количество разновидностей лекарственных форм и лекарственных средств на основе терапевтических белков. Метод светоблокировки, описанный в общей статье <788>, имеет некоторые технические ограничения, связанные с его использованием в отношении определенных типов механических включений (например, таких, которые обладают слабой контрастностью в лекарственной среде и/или могут изменять форму/размер в ходе выполнения анализа, что свойственно для собственных частиц, входящих в состав инъекционных лекарственных препаратов на основе терапевтических белков). Другие ограничения описанного в статье <788> метода, связанные с лекарственными препаратами на основе терапевтических белков, относятся к обработке образцов и небольшим объемам препаратов. Все перечисленные аспекты послужили причиной для разработки общей статьи <787> «Невидимые механические включения в инъекционных лекарственных препаратах на основе терапевтических белков».

ЦЕЛЬ

Целью данной общей статьи является описание стратегий идентификации и описания свойств совокупностей частиц внешнего и внутреннего происхождения в сравнении с совокупностью (совокупностями) собственных белковых частиц в составе инъекционных лекарственных препаратов на основе терапевтических белков. Информация об особых методах, которые могут применяться с этой целью, а также их преимущества и ограничения в настоящее время обсуждаются; информация применяется в отношении лекарственных препаратов на основе терапевтических белков, а также разведений и инфузионных растворов на их основе. Основная цель настоящей общей статьи заключается в предоставлении подробного руководства по использованию широкого спектра аналитических методик, одна или несколько из которых могут применяться помимо методов, описанных в общих статьях <787> и <788>. Ожидается, что данная мера поможет улучшить процесс описания свойств лекарственных препаратов на основе терапевтических белков и сделает его более независимым на этапах разработки, исследования стабильности и анализа причин несоответствий, проводимого при их обнаружении в рамках соответствующего расследования. Это подразумевает наличие методов, обеспечивающих возможность оценки широкого спектра характеристик собственных белковых агрегатов, включая их морфологию, конформацию, особенности восстановления/распада и ковалентную модификацию. Руководство по обработке и подготовке проб обсуждается в общих чертах.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Содержание частиц внешнего и внутреннего происхождения в лекарственных препаратах для парентерального применения должно быть сведено к минимуму. Тем не менее, присутствие некоторого количества белковых частиц является естественным для лекарственных средств на основе терапевтических белков. Механизм попадания таких собственных частиц в лекарственный препарат должен быть изученным и контролируемым. Данные собственные частицы известны, а их наличие в препарате ожидаемо – они появляются из комплексов молекул белка и могут быть представлены большим разнообразием размеров: от нанометров (димеры) до сотен микрометров (мультимеры и видимые частицы). На распределение частиц по размерам влияют аминокислотные последовательности, условия раствора, история обработки образца и другие факторы. Специфический феномен ассоциации белков, в результате которой выпадают белковые частицы, называется агрегацией. В контексте настоящей общей статьи термины «белковые частицы» и «агрегаты» являются взаимозаменяемыми.

Поскольку частицы могут попадать в лекарственный препарат из нескольких возможных источников, важно суметь выявить частицы и определить их тип: это частицы внешнего происхождения, внутреннего или собственного. После того, как однажды это удалось сделать, можно разработать и применять соответствующие стратегии контроля. Если будут обнаружены отклонения, полученные индивидуальные характеристики частиц будут определять особенности анализа причин, по которым возникли данные отклонения, а также особенности оценки рисков, корректирующих действий и стратегии контроля.

Белковые агрегаты, присутствие которых характерно для препаратов на основе терапевтических белков, могут представлять собой гетерогенную совокупность, поэтому размер частиц сам по себе не является достаточным параметром для надлежащего описания. Когда происходит сопоставление данных о совокупностях агрегатов между разными препаратами, лабораториями и т. п., важно учитывать и другие характеристики, такие как морфология, способность к диссоциации, конформации белка (или структуры высоких порядков) внутри агрегатов и присутствующие химические модификации (1). Данные параметры обобщенно представлены в таблице 1 [по материалам (1)]. Важно понимать, что полученные результаты зависят от используемых техник и методик, и данная информация должна включаться в любое описание свойств белковых агрегатов. Инструменты, доступные для описания свойств агрегатов, будут представлены далее в данной статье. Выбирать инструменты и характеристики, подлежащие анализу, нужно очень внимательно, исходя из особенностей конкретного анализируемого белка. Более подробное описание параметров, которые предстоит рассмотреть в ходе описания свойств агрегатов, будет представлено ниже.

Размер – это такое свойство частицы, которое измеряется с давних пор и остается ее главной характеристикой. Результаты измерения сообщаются с указанием диапазона, в котором оно проводилось, и методологии, которая использовалась. Таким образом, невидимые механические включения также могут считаться агрегатами/частицами, размер которых находится в диапазоне 1-100 мкм, на основании следующих признаков: присутствия эквивалентных по окружности частиц – согласно методу светоблокировки (LO); наличия самой длинной хорды в окружности – согласно методу световой микроскопии; обнаружения частиц с эквивалентным объемом сфер – методом электрочувствительных зон; или других соответствующих объемов, определенных с помощью других доступных методик. Следует учесть, что способы подготовки образцов, методы определения и применяемые алгоритмы – это все важные факторы, которые стоит включить в отчет о результатах исследования.

Способность любого вида агрегатов к диссоциации (т.е. к возвращению к форме мономера) и условия, которые для этого требуются, также заслуживают рассмотрения. В случае диссоциирующих агрегатов способ подготовки проб может влиять на полученные результаты; таким образом, понимание данного вопроса, связанного с агрегатами, принимает критическое значение при выборе методик подсчета количества, измерения размеров и описания свойств агрегатов. Способность белковых агрегатов к диссоциации может оцениваться путем разведения агрегатов в буфере для конкретного лекарственного средства или в других растворах, после чего проводится их повторный анализ тем же методом. Также может включаться возвращение пробы в исходное состояние для оценки количества диссоциированных агрегатов. Таким образом, способность к диссоциации является характерной особенностью белковых агрегатов, которая может обуславливать условия обработки и подготовки (например, условия разведения) перед подсчетом частиц. Также способность к диссоциации может распространяться на частицы внутреннего и, в меньшей степени, внешнего происхождения.

Структуры и конформации молекул белка, формирующих агрегаты, можно исследовать с помощью нескольких биофизических методов. Находки, полученные в результате таких исследований, могут помочь в поиске и устранении несоответствий. Также полезно знать и о присутствии в агрегатах химических модификаций, таких как продукты окисления, дезамидирования, межмолекулярные связи или фрагменты. Конформация молекул белка в его агрегатах, а также их состояние ковалентной модификации могут помочь с объяснением потенциального биологического воздействия собственных частиц.

Морфология частиц может служить еще одним показателем и, также, помочь в установлении их источника. Если говорить еще более конкретно, то описание морфологических особенностей помогает отличить собственные частицы, присутствие которых характерно для лекарственного препарата на основе белка, от частиц внешнего и внутреннего происхождения. Чаще всего, белковые частицы, так же как и многие внутренние и внешние частицы, отличаются неправильной формой, тогда как пузырьки силиконового масла и воздуха обычно сферичны. Морфология белковых агрегатов также дает важные данные, которые могут использоваться для сравнения в разных исследованиях и в долгосрочной перспективе.

В таблице 1 приведен обзор признаков, которые могут использоваться для классификации белковых агрегатов.

Таблица 1. Описание категорий белковых агрегатов (1)

Силиконовое масло

Силиконовое масло широко используется в производстве фармацевтических средств и в упаковке в качестве скользящего вещества. В избытке оно может быть одной из причин повышенного содержания частиц в лекарственном средстве. В рамках общей стратегии контроля за содержанием механических включений очень важно оценивать, где применимо, влияние силиконового масла на содержание частиц в инъекционных лекарственных препаратах на основе терапевтических белков. В производстве лекарственных форм для парентерального применения силиконовое масло, в первую очередь, используется, чтобы упростить обработку компонентов тары, уменьшить прилипание резиновых деталей упаковки друг к другу, обеспечить легкое движение пробок в резервуар / по подающему устройству и на ожидающую заполненную лекарственным средством емкость. Силиконовое масло также используется в изготовлении лекарственных форм для парентерального применения, представленных в виде предварительно заполненных шприцев, в качестве смазки для снижения силы трения между ограничителем на поршне шприца и стеклом, обеспечивая, таким образом, легкое движение поршня. Подготовка упаковок парентеральных препаратов предусматривает выполнение определенной процедуры, которая включает мытье, очистку, нанесение силиконового масла и стерилизацию. Пропитывание укупорочных элементов (например, пробок флаконов) измеренным количеством силикона является стандартной процедурой, выполняемой для создания однородного покрытия поверхностей перед использованием. Общепринятой процедурой является применение известного количества разрешенного смазочного вещества, нанесенного стерильным методом.

Даже при осторожном нанесении силиконового масла на внутреннюю поверхность тары, контактирующую с лекарственным препаратом, во время транспортировки, хранения и использования оно может попадать в препарат. Капли силиконового масла могут значительно увеличить содержание невидимых механических включений в лекарственном препарате, в особенности, частиц в диапазоне 10 мкм, если речь идет об инъекционных лекарственных средствах на основе терапевтических белков. Содержание частиц зависит от количества силиконового масла, и в некоторых случаях даже небольшое количество силиконового масла может значительное повысить степень загрязнения лекарственного средства механическими частицами (2).

После попадания в лекарственное средство на основе терапевтического белка капельки силикона могут адсорбировать молекулы белка. Масляная среда ресуспендируется и перестраивается по мере перемешивания, и образуются частицы разной формы и размеров. Размер капелек силикона в белковых лекарственных формах может соответствовать размеру собственных частиц лекарственного средства, однако морфология и оптические свойства двух субстанций будут различаться. При попадании в водные растворы капли силиконового масла, как правило, принимают сферическую форму с более высоким коэффициентом преломления, чем у белковых агрегатов, и плавным снижением контраста по направлению снаружи к центру частицы. Перечисленные особенности не характерны для белковых агрегатов, которые, как правило, аморфны и прозрачны и имеют коэффициент преломления, очень близкий к показателям белковых мономеров лекарственной формы. Данные отличия могут использоваться для разработки алгоритмов для дифференцирования частиц силиконового масла и белковых частиц. Также возможно отслеживать изменения в одной совокупности и сравнивать их с изменениями в другой.

Поскольку силиконовое масло имеет свою функцию в лекарственном препарате, оно считается внутренним источником частиц, а количество таких частиц будет изменяться с течением времени. Однако если процесс применения силиконового масла контролируется плохо, тогда возможно попадание в препарат его чрезмерного количества. Надлежащая функциональность силиконового масла в минимальном достаточном для срока хранения препарата объеме достигается путем разработки тщательно продуманного производственного процесса, стратегий контроля и применения масла.

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ МЕХАНИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ

Результаты анализа распределения частиц по размеру зависят от используемого инструмента, а также от метода, с помощью которого данный инструмент был откалиброван. Доступные стандартные образцы для механических включений (касающиеся размера и количества) – это шарики полистирольного латекса, монодисперсионного силикагеля или полиметилметакрилата (РММА) и полидисперсного стекла. Каждый из перечисленных стандартных образцов содержит сферы с коэффициентом преломления и плотностью, существенно отличающимися от характерных для лекарственных препаратов на основе терапевтических белков. Поскольку типичные белковые частицы обладают нестандартной морфологией и низким оптическим контрастом, в настоящее время нет доступных стандартных образцов для устойчивого воспроизведения морфологии и параметров белковых частиц.

Коэффициент преломления у белковых частиц весьма близок по значению с данным показателем у раствора среды. Данная разница показателей преломления служит важнейшим параметром при определении белковых частиц с помощью методов, основанных на взаимодействии света для измерения распределения частиц по размерам. По этой причине необходимой мерой является установление стандартных образцов, способных отражать качества белковых частиц (3). Таким образом, разработка стандартных образцов, демонстрирующих свойства белковых частиц, в настоящее время является областью активных научных исследований. Данные стандартные образцы должны послужить суррогатами фактически существующих белковых частиц благодаря своей способности имитировать их свойства в рамках выбранного метода определения. Данный подход требует обязательной реализации из-за ограниченного числа стандартных образцов использующих белки, что обусловлено следующими факторами: (а) для достижения соответствующей требованиям стабильности хранение и транспортировка образцов должны осуществляться при температуре -80 °С, (б) любые методики, применяемые в условиях, отличных от условий окружающей среды (non-ambient technique), могут подвергать стандартный образец изменениям; и (в) белковые частицы сами по себе довольно вариабельны, что затрудняет выбор универсального белка.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕВИДИМЫХ МЕХАНИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ И МЕТОДИКИ ОПИСАНИЯ СВОЙСТВ

В представленных ниже разделах описаны преимущества, недостатки и надлежащее применение методологий (см. таблицу 2), которые позволяют производить оценку разнообразных характеристик всех частиц, а, в особенности, собственных белковых агрегатов, по таким параметрам, как размер и распределение, размер и морфология, и описание свойств. Выбранная методология повлияет на регистрируемый размер частиц из-за используемых принципов инструментального измерения, режима, в котором проводятся измерения, характерных особенностей частиц, способов подготовки и обработки. Также полученные результаты могут зависеть от алгоритмов, которые применяются для определения размера, объема и содержания частиц. Таким образом, любое измерение, связанное с определением размера белковых частиц, должно производиться с указанием используемого для этого метода. Помимо этого, необходимо четко указывать единицы измерения, поскольку размер может приводиться с помощью разных параметров, особенно это касается гидродинамического размера, эквивалентного кругового диаметра (ECD, equivalent circular diameter), наибольшей хорды в окружности, эквивалентного сферического диаметра (ESC, equivalent spherical diameter), диаметра Фере или молекулярной массы. Перечень, представленный в таблице 2, может не быть исчерпывающим.

Таблица 2. Методологии, используемые в измерении свойств невидимых механических включений

Точность оборудования, которое используется для определения особенностей распределения частиц по размеру, должна подтверждаться с помощью калибровки с использованием стандартных образцов частиц с известными концентрациями и размерами, имеющими прослеживаемость к единицам измерений Международной системы единиц.

Концепция, связанная с трехмерным размером частиц является особенно важной для понимания механизма взаимодействия стандартных образцов частиц с различными видами измерительного оборудования и способов сопоставления результатов, полученных с помощью разных методологий. В разных подходах используются разные способы измерения и разные алгоритмы определения размеров (например, объемный эквивалентный диаметр (volume equivalent diameter), поверхностный эквивалентный диаметр (surface equivalent diameter) или Стоксов диаметр).

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТИЦ ПО РАЗМЕРУ И ЧИСЛУ

Метод светоблокировки (рабочий диапазон: 1-300 мкм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Исследуемый образец пропускают между источником света и детектором. Подсчет производится, когда между ними проходят одиночные частицы, блокируя свет, в результате чего происходит резкое повышение напряжения. Высота каждого пика напряжения зависит от размера частицы, которая его вызвала. Размер частиц, который фиксируется, генерируют по калибровочной кривой «размер – ответ напряжения», выстраиваемой с использованием содержащих моносферы сертифицированных стандартных образцов для определения размера (как правило, шариков полистирола). При использовании метода светоблокировки размер частиц отображается в виде диаметра окружности, имеющей эквивалентное поперечное сечение. В целях проведения анализа может использоваться образец, взятый из одной упаковки, объединенный из нескольких упаковок или подготовленный в виде разведения (см. общие статьи «Распределение глобул по размерам в жидких эмульсиях для инъекций», <729>, <788> , «Механические включения в офтальмологических растворах», <789> и «Методы определения механических включений в инъекционных лекарственных средствах и офтальмологических растворах», <1788>).

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Метод электрочувствительных зон (метод Култера)

(рабочий диапазон: 0,4-1 600 мкм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Образец растворяют в растворе электролита и пропускают через узкую апертуру между двумя активными электродами, в результате чего, при прохождении через апертуру, механические включения заслоняют электрическое поле. Отклик зависит от объема жидкости, вытесненного электролитом, и, таким образом, регистрируется как эквивалентный сферический диаметр (диаметр сферы стандартного образца одинакового размера с частицей). Отклик не зависит от типа частицы (например, от колебаний в цвете, твердости, прозрачности, индексе преломления).

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Лазерная дифракция (рабочий диапазон: 0,1-3 500 мкм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Метод лазерной дифракции основан на обнаружении частиц образца при их прохождении через лазерный луч и на измерении полученного в результате этого углового распределения интенсивности рассеянного света. Следовательно, распределение частиц по размерам можно рассчитать, если измерять интенсивность света, рассеянного в результате контакта с образцом, как функцию угла. Для расчета распределения частиц по размеру, полученные данные об угловых размерах должны сравниваться с моделью рассеяния (теория Ми).

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

РАЗМЕР И МОРФОЛОГИЯ

Световая микроскопия (LM) (рабочий диапазон: 0,3 мкм – 1 мкм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

В основе оптической или световой микроскопии лежит принцип пропускания света через серию линз после его прохождения через подготовленный образец или после отражения от такого образца. Свет детектируется непосредственно глазом, отображается на фотографической пластинке или фиксируется в цифровом виде. Анализ образцов может проводиться как непосредственно в момент захвата фильтром, так и после. Световую микроскопию можно комбинировать со статистическим анализом изображений, что позволяет захватывать цифровые изображения для последующего их развертывания с помощью систем программного обеспечения, предназначенных для анализа изображений. При использовании анализа изображений можно выбрать определенные параметры, использование которых поможет избежать вывода на экран нежелательных артефактов или совокупностей частиц (круглая форма, аспектное соотношение и другие), после чего можно приступать к изучению выбранных совокупностей (см. статьи <776> «Оптическая микроскопия», <788>, <789> и <1788>).

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Анализ методом визуализации потока [рабочий диапазон: 0,7 – 100 мкм (для размера) и 4 – 100 мкм (для морфологии)]

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Данный метод основан на получении цифровых изображений материалов, находящихся в движущемся потоке образца, с последующим анализом полученных изображений. Так же, как и в оптической микроскопии, которая по своей сути является системой анализа статических изображений, в анализе динамических изображений, или в поточной микроскопии, в ходе анализа производится несколько отдельных снимков, только в данном случае объектом становится динамичная, подвижная система. Элементами анализа динамических изображений являются компоненты света, линза объектива и фокусирующая линза микроскопа, а также замкнутый путь жидкости в пределах проточной ячейки определенных размеров, камера и процессор для сбора и анализа информации. Таким образом, с помощью данного метода воссоздаются условия in situ с реальными изображениями частиц. Визуализация частиц газа, жидких, полутвердых или твердых частиц с помощью данной методики облегчает интерпретацию других измерений взвешенных частиц, в которых визуализация исследуемых частиц невозможна. Движение частиц имеет тенденцию к беспорядочному, что необходимо учитывать при создании дизайна системы и рассмотрении данных. Повышение увеличительной силы и разрешающей способности системы и уменьшение глубины ячейки потока повышают качество получаемых изображений. Дополнительным преимуществом динамической поточной микроскопии является возможность применить анализ размера и особенностей строения к полученному изображению частицы. Помимо этого, в целях изучения полученных изображений может применяться любое количество дополнительных алгоритмов, если есть такая необходимость. Четкость, контрастность и форма частицы на полученных изображениях могут рассказать о ее возможном происхождении и типе, а при наличии достаточного количества сравнительной информации, для анализа и подсчета различных совокупностей частиц в образце могут применяться математические фильтры. Данный подход использовался с целью дифференциации силиконового масла и белковых агрегатов.

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Электронная микроскопия (EM) (рабочий диапазон ангстремы – мм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

В основе электронной микроскопии (ЕМ) лежит использование пучка электронов для освещения образцов и получения увеличенного изображения. Практический предел пространственного разрешения для биологических образцов составляет у ЕМ приблизительно 1 нм, что значительно превышает требования к разрешению для обычно присутствующих в белковых растворах частиц, размер которых составляет 0,1мкм. В целях анализа методом ЕМ невидимые частицы могут либо изолироваться в индивидуальном порядке, либо помещаться на подходящий фильтр и затем крепиться на специальную сеточку или палочку для наблюдений в микроскоп. Как правило, анализ с помощью ЕМ проводят в полном вакууме (приблизительно 10-6 торр). Обязательным этапом подготовки образца является его высушивание и нанесение специального покрытия. Новейшие технологии позволяют проводить анализ образца без покрытия (в естественных условиях, в непросушенном виде). Методики обнаружения разделены на следующие категории: (а) сканирующая электронная микроскопия (SEM), в которой могут использоваться вторичные электроны или сигналы обратного рассеяния; (b) трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ), с помощью которой доступна визуализация электронов, попавших в образец; и (с) сканирующая тоннельная электронная микроскопия (STEM), в которой комбинируются методы SEM и ТЕМ (также см. статью Фармакопеи США №1181 «Сканирующая электронная микроскопия»).

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

ОПИСАНИЕ СВОЙСТВ

Описание свойств активного ингредиента белка подразумевает не только оценку распределения по размеру, но и определение химических свойств первичного белка, так же как и конформаций, агрегаций и самоассоциированных частиц (см. таблицу 1) . Размер фундаментальной частицы-агрегата важен; однако не менее важным аспектом является происхождение твердых частиц и связь с другими частицами.

Инфракрасная микроспектроскопия с Фурье-преобразованием (FTIR) (рабочий диапазон 10 мкм – 1 мм и больше)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

При взаимодействии субстанции и света последний может отражаться, абсорбироваться или рассеиваться. Инфракрасная спектроскопия определяет вибрационные свойства частицы, как правило, в диапазоне 200-4 000см-1, путем анализа взаимодействия со светом при определении абсорбции фотонов. Помимо этого, использование инструментов, основанных на микроскопии, таким образом, микроспектроскопии, позволяет выбрать отдельные интересующие частицы или домены, пользуясь преимуществом в виде наличия фильтров и поляризаторов для микроскопов и возможности захвата изображения вместе с вибрационными или другими данными. Применение методик вибрационной спектроскопии весьма оправдано для анализа частиц в белковых растворах.

Частицы могут быть изолированы по отдельности или захвачены мембранным фильтром, а затем проанализированы методом FTIR-микроскопии. Поскольку инфракрасный сигнал, поступающий от воды, оказывает ощутимое влияние на области локализации белка, данные образцы необходимо тщательно просушивать перед анализом. Как правило, FTIR-микроскопы работают либо в режиме вывода изображений, либо в режиме точечной развертки. В режиме вывода изображения (image mode) инфракрасные сигналы собираются из отдельных пикселей в одной заранее определенной зоне. Однако режим точечной развертки (spot mode), как правило, дает более высокий коэффициент сигнал/шум, поскольку комбинированный инфракрасный сигнал собирается с области, площадь которой определяется размером апертуры. Многие органические компоненты обладают уникальными инфракрасными сигнатурами. Спектры, собранные для отельной частицы, могут быть проанализированы путем поиска сигнатур в библиотеке инфракрасных спектров или путем сопоставления спектра частицы с данными предполагаемых материалов.

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Дисперсионно-рамановская микроспектроскопия (рабочий диапазон от 0,5 мкм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Как и инфракрасная спектроскопия, Рамановская спектроскопия представляет собой изучение взаимодействия света с субстанцией. Определенный источник монохроматического света (лазер) фокусируют на образце, чем вызывают отражение, поглощение или рассеяние света с целью исследования тех же колебательных состояний, которые исследуются с помощью инфракрасной спектроскопии. В частности, Рамановская спектроскопия – это исследование неупругого рассеяния фотонов (Рамановское рассеяние). Фотоны также могут рассеиваться упруго (Релеевское рассеяние) без изменения длин волн, однако целесообразность использования данного метода наблюдается только при его использовании для обозначения силы лазерного возбуждения. После фактического достижения лазерного возбуждения, которое затем спадает до базового колебательного или вращательного состояния и сопровождается излучением энергии, характерной для функциональной группы, например, для атомов молекулы или родственных структур. Более низкие (Стокс) и более высокие (анти-Стокс) сдвиги регистрируются благодаря контакту с электронным облаком, которое образуется в результате взаимодействия функциональных групп. Применение лазеров в данной ситуации оправдано тем, что лишь небольшая часть фотонов (лишь один из 106 - 108) демонстрирует наличие спектрального сдвига после Рамановского рассеяния. В Рамановской микроспектроскопии световой микроскоп используется в комбинации с длиной лазерной и белой световых волн. Микроскоп, благодаря наличию в нем фильтров и поляризаторов, помогает осуществить выбор отдельных частиц или областей, представляющих интерес, для получения изображения, наряду с колебательными спектрами.

Рамановская спектроскопия с Фурье-преобразованием, как правило, является дополнительной методикой после Рамановской дисперсии, и при использовании более длинноволнового возбуждения дает небольшую флуоресценцию образца. Одно существенное преимущество Рамановской спектроскопии над инфракрасной спектроскопией – это возможность анализировать непосредственно водные образцы, часто в стеклянных держателях образца. Отдельные частицы могут проходить анализ в условиях in situ, а в некоторых случаях непосредственно в таре, если это не мешает сигналу Рамановкого рассеяния. Здесь, как в случае инфракрасной спектроскопии, анализ неизвестных спектров производится либо с помощью библиотеки спектров, либо путем сопоставления спектров отдельных стандартных соединений.

Теория и практика Рамановской спектроскопии описаны более подробно в статье «Рамановская спектроскопия», <1120>.

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Электронная микроскопия (EM) с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (EDS или EDX) (рабочий диапазон для количественного анализа: 0,1 – 3 мкм; для полуколичественного анализа:  3 мкм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDS или EDX)основана на характеристическом рентгеновском излучении фотонов, генерируемом образцом за счет взаимодействия с мощным источником излучения, таким как пучок электронов. Как правило, интенсивность свечения элементов находится в непосредственной связи с объемом выброшенного рентгеновского излучения, что коррелирует с содержанием энергий перехода атомной валентной оболочки. Современная тенденция в сфере технологий контрольно-измерительных приборов заключается в использовании тонкооконных и безоконных детекторов и их размещении вблизи образца в системах ЕМ, что улучшает детектирование и соотношение сигнал/шум у всех элементов, а особенно, у более легких, например, с Z 11 (натрий). Тут же проводится определение количественного элементного состава для твердых веществ (см. также монографию <1181> для общей информации по ЕМ и соответствующей справочной информации по EDS).

ПРЕИМУЩЕСТВА

- быстрый качественный анализ для маленьких частиц (rapid qualitative collection for small particles);

- в контролируемых экспериментах возможен полуколичественный анализ (1% LDL и ±20% RSD);

ОГРАНИЧЕНИЯ

Электронная микроскопия (EM) со спектроскопией характеристических потерь энергии электронами (EELS) (рабочий диапазон: 0,5 мкм – 1 мм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

С помощью спектроскопии характеристических потерь энергии электронами (EELS) измеряются колебательные движения атомов и молекул на поверхности и вблизи поверхности путем анализа отражающегося от низкоэнергетических электронов энергетического спектра.

ПРЕИМУЩЕСТВА

ОГРАНИЧЕНИЯ

Времяпролётная вторично-ионная масс-спектрометрия (TOF-SIMS)

(рабочий диапазон от мкм до чуть менее мм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

Времяпролётная вторично-ионная масс-спектрометрия (TOF-SIMS) является поверхностно-чувствительным аналитическим методом, в основе работы которого используется пульсирующий пучок ионов [микрофокусированный цезий (Cs) или галлий (Ga)] для удаления молекул с самого наружного слоя поверхности образца. Частицы удаляются с атомных монослоев поверхности (вторичные ионы). Затем данные частицы ускоряются в «пролетной трубке», и их масса определяется путем измерения точного времени, за которое они достигают детектора (т.е. времени пролета).

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

Анализ окрашивания

(рабочий диапазон: 0,3 мкм - 1 мм)

ПРИНЦИП РАБОТЫ

В методиках окрашивания используются реактивы, обеспечивающие конкретные реакции, такие как видимое окрашивание или флуоресценция, которые позволяют получить качественное подтверждение категории неизвестных материалов или идентифицировать их. Обычно анализ окрашивания проводят с помощью микроскопических методов, поэтому данный метод обладает преимуществами и недостатками микроскопии.

ПРЕИМУЩЕСТВА

НЕДОСТАТКИ

СТРАТЕГИЯ

Частицы, попадающие в состав лекарственных препаратов на основе терапевтических белков, обычно отличаются постоянным показателем распределения по размеру с экспоненциально бо́льшим числом мелких частиц (10 мкм). Информация, полученная при анализе собственных включений белка, может использоваться в разработке, а также для облегчения понимания и донесения до других людей данного важного аспекта качества лекарственных препаратов на основе терапевтических белков. Следует разработать рациональную стратегию по описанию свойств белковых агрегатов или механических включений. Категории, приведенные в таблице 1, представляют собой рекомендации, связанные с различиями, наблюдаемыми у разных типов белковых агрегатов. При этом признается, что анализ распределения частиц по размеру очень важен, однако не является единственной информативной характеристикой. Описание свойств белковых агрегатов в соответствии с тактикой, продемонстрированной в таблице 1, поможет в определении совокупности частиц в лекарственном средстве и/или их свойств, которые могут являться наиболее важными для оценки воздействия частиц на качество лекарственного препарата.

Чтобы получить всестороннюю характеристику, касающуюся распределения частиц в лекарственном препарате, требуется применить большое количество разнообразных методик. Для измерений и описаний свойств частиц используется множество различных методов, однако каждый из них имеет как преимущества, так и недостатки. Такая потребность в применении разных методов обусловлена тем, что с их помощью можно анализировать отдельные характеристики частицы. При использовании ортогональных методов можно лучше понять происхождение частицы (внешнее, внутреннее или собственное), распределение частиц по размеру и другие характеристики, с помощью которых производится дифференциация частиц. Данные, полученные после описания характеристик частиц, могут использоваться для оценки риска, связанного с присутствием агрегатов в лекарственном препарате, а также при изучении механизма их формирования. Такая информация о свойствах частиц может пригодиться также на стадии разработки состава и планирования производства лекарственного препарата, поскольку позволит осознано изменять компоненты состава и этапы производства, чтобы сократить общее содержание частиц.

Всесторонняя стратегия оценки содержания невидимых механических включений подразумевает несколько этапов, начиная с разработки до промышленного выпуска и пострегистрационного периода. Измерение размеров / описание свойств частиц может начинаться уже на этапе отбора материала для получения лекарственного препарата. При этом могут применяться высокопроизводительные технологии в целях прогнозирования тенденций к образованию частиц в молекулах рассматриваемого вещества. В данном случае предполагается использование небольшого количества материала и предоставление относительного ранжирования по склонности к агрегации.

Ранние этапы разработки

На данном этапе основное внимание уделяется изучению типичного профиля частиц, которые могут входить в состав лекарственного средства, включая такие характеристики, как распределение по размеру и наиболее распространенные свойства агрегатов, когда-либо наблюдавшихся в лекарственном средстве. Размер частиц и их количество в диапазоне от 1 до 100 мкм – это те показатели, которые должны контролироваться в ходе производства и во время проверки стабильности лекарственного средства.

Поздние этапы разработки

Данный этап посвящен изучению лекарственного препарата и сопоставимости разных партий, а также связи между результатами анализа размерности частиц с процессом разработки состава, производством и применением препарата. Размер частиц и их количество в диапазоне от 1 до 100 мкм должны контролироваться в сериях лекарственных препаратов, выпущенных для использования в клинических исследованиях. Должно производиться еще более подробное описание свойств агрегатов и частиц – это касается, в основном, серий лекарственных препаратов, которые предназначены для использования в ходе опорных клинических исследований. Необходимо собрать данные о качественном и количественном содержании невидимых механических включений, которые образуются в процессе хранения, применения и в условиях стрессового воздействия, также необходимо разработать стратегии по снижению рисков. После того, как выбран окончательный метод контроля размера и содержания частиц, следует утвердить стратегии контроля механических включений, попавших в лекарственное средство из внешних и внутренних источников. Разработанная стратегия контроля может предписывать пределы регулирования, за рамками которых должно проводиться расследование.

Пострегистрационный период

На данном этапе подразумевается сбор данных о выпущенных на рынок сериях лекарственного средства в рамках общей стратегии контроля, согласно которой допускается присутствие невидимых частиц, не превышающих в диаметре 10 мкм (1-10 мкм). При внесении изменений в процесс управления в пострегистрацонном периоде рекомендуется использовать как количественные, так и качественные методы анализа. Для разработки стратегий по снижению рисков, в ходе расследований, возможно использование данных, полученных на этапе разработки. Исследования стабильности также являются частью управления жизненным циклом лекарственного средства, и рассмотрены ниже в разделе «Применение».

Общая стратегия

Углубленное изучение свойств агрегатов на этапе разработки в сочетании с корреляцией результатов испытаний, проведенных на данном этапе, с результатами испытаний, проведенных при выпуске готовой продукции (например, методом LO), могут составлять основу для рациональной общей стратегии контроля. Часто агрегаты представлены широким разнообразием размеров – от олигомеров, до частиц, размеры которых составляют сотни микрометров. Если при подсчете частиц в диапазоне от олигомеров до 25 мкм в рамках фармакопейного метода может быть показана корреляция (или математическая зависимость), тогда для выявления влияния изменений и тенденций в производстве на частицы диаметром 1-10 мкм может использоваться определение содержания частиц диаметром 10 мкм и 25 мкм с помощью LO. В данной ситуации общую стратегию контроля можно использовать для установления предела принятия мер, равного 10 мкм, при превышении которого должно быть запущено расследование, предметом которого являются также методы описания свойств, которые обсуждались в данной главе.

ВОПРОСЫ, СВЯЗАННЫЕ С ОБРАЗЦАМИ

Определенные аспекты, связанные с обработкой образцов и их объемом, требуют особого внимания. Для того, чтобы избежать появления артефактов, например, ложноположительных результатов из-за присутствия пузырьков или агрегатов, которые образуются на этапе подготовки образца, необходимо разработать и применять процедуры обработки и дегазации. При определенных обстоятельствах для получения надежных результатов может потребоваться разбавление образцов. Вопросы, связанные с обработкой образцов, описаны в статье <787>.

ПРИМЕНЕНИЕ

Ключевым направлением в разработке лекарственного препарата на основе белков является получение информации о свойствах, происхождении и количестве собственных частиц/агрегатов в лекарственной формуле, так же, как и об их стабильности и общем воздействии на качество, безопасность и эффективность лекарственного средства.

Существует риск, что белковые агрегаты в диапазоне размеров от 1 до 10 мкм могут усиливать риск формирования иммуногенности на фоне терапевтического действия лекарственного препарата (4, 5). С точки зрения концепции разработки препарата, изменение концентраций невидимых белковых механических включений, в частности диаметром в диапазоне 1-10 мкм, может быть ранним и чувствительным индикатором возможных проблем со стабильностью препарата (6,7). Помимо изучения стабильности, частицы указанного размера должны рассматриваться и в рамках оценки рисков с целью изучения влияния на лекарственный препарат различных стрессовых условий. Такие условия могут включать термическое воздействие, замораживание/оттаивание, свет, транспортировку, разбавление/прибавление компонентов и характеристики использования. Количество частиц в диапазоне от 1 до 10 мкм, как правило, значительно (в несколько раз) превышает количество частиц в диапазоне ≥10 мкм. Это делает диапазон от 1 до 10 мкм полезным для целей, описанных выше, поскольку так наблюдение за изменениями становится проще. Однако результаты данных подсчетов весьма не постоянны, и, следовательно, для распознавания тенденций требуется наличие надлежащего подхода к контролю, соответствующего подхода к выборке и хорошего оснащения.

Подробное описание свойств невидимых механических включений, особенно собственных частиц, снабжает информацией, которая может использоваться в программе разработки и производства лекарственного препарата, обеспечивая формирование надежной стратегии контроля, как на этапе его производства, так и в постмаркетинговый период. С другой стороны, несмотря на то, что описание свойств само по себе не выявляет возможных корреляций между иммунным ответом и агрегатами/частицами, использование нескольких методов в отношении нескольких партий лекарственного препарата помогает определить качество продукции, которое может быть связано с данными по безопасности и эффективности, полученными в ходе клинических исследований. Эти данные также могут использоваться в управлении жизненным циклом лекарственного препарата, например, при перемещении с одной производственной площадки на другую, изменении формы выпуска (с жидкой на лиофилизированную; из флакона в предварительно заполненный шприц).

Чтобы проиллюстрировать данные моменты, ниже представлены примеры; они показывают способы, с помощью которых могут использоваться взаимодополняющие методики, чтобы получить как можно больше информации о лекарственном средстве.

Пример 1: Сравнение конфигураций лекарственных средств

Не все лекарственные препараты выпускаются в жидкой форме. В одном случае для лиофилизированного лекарственного средства, которое выпускается в стеклянных флаконах, была разработана новая конфигурация, призванная облегчить введение препарата пациентам, а именно – предварительно заполненный шприц. Ожидалось, что сравнительный подсчет частиц методом LO покажет большее количество частиц в восстановленном лиофилизированном препарате, чем в жидкой лекарственной форме, однако получены были противоположные результаты, согласно которым, жидкая конфигурация отличалась значительно более высоким содержанием частиц диаметром 2мкм [130 000 частиц на контейнер против 30 000 частиц на контейнер]. Затем данные образцы прошли оценку методом ММ, и тогда результаты в большей мере соответствовали ожидаемым: для частиц диаметром 5мкм лиофилизированный раствор содержал 70 частиц на контейнер по сравнению с 14 частицами на контейнер у жидкой конфигурации. Затем, чтобы понять причины разногласий между методами ММ и LO, был проведен еще один анализ – методом проточной микроскопии. Проточная микроскопия подтвердила результаты, полученные с помощью LO, согласно которым, жидкая конфигурация препарата показала большее содержание частиц размером 2 мкм (600 000 частиц на контейнер), чем у лиофилизированного раствора (150 000 частиц на контейнер). В ходе изучения структуры частиц было выявлено, что частицы в жидком лекарственном препарате имеют другую морфологию, для которой характерно присутствие преимущественно субстанций, имеющих сферическую форму, причиной чему – присутствие силиконового масла, которым покрыты с внутренней стороны стенки шприца. Полученные результаты подтверждались исследованием образца жидкой лекарственной формы, который не помещали в шприц (источник силиконового масла), которое показало 20 000 частиц на контейнер. Таким образом, за вычетом капель силиконового масла, количество оставшихся частиц в жидкой конфигурации лекарственного средства, выпущенной в форме предварительно заполненного шприца, стало ниже, чем в лиофилизированном препарате, что согласуется с данными, полученными с помощью ММ.

Пример 2: Выбор технологии заполнения упаковок

Процессы заполнения упаковок могут влиять на качество препарата, поскольку в ходе их выполнения оказываются стрессовые воздействия, такие как абсорбция, механическое раздражение, трение и кавитация, которые могут привести к агрегации белков. Некоторые заливные насосы могут являться источниками посторонних включений, которые могут приводить к гетерогенной связанной с нуклеацией агрегации (heterogeneous nucleation-induced aggregation).

Влияние использования поршневого насоса из нержавеющей стали на количество невидимых частиц в растворах исследовалось с помощью нескольких методик анализа механических включений в растворах (8). Анализ методом Култера, при котором буферный раствор пропускали через насос, показал, что, после прохождения через насос, 1 мл раствора содержал 13 000 частиц диаметром от 1,5 до 6 мкм. С помощью элементного анализа было показано, что попавшими с буферным раствором частицами были частицы нержавеющей стали. Анализ распределения частиц в этом растворе по размеру, выполненный с помощью лазерного дифракционного анализатора размера частиц, показал, что большинство частиц имели диаметр от 0,25 до 0,95 мкм. Инкубирование наночастиц из нержавеющей стали в растворе MAb-Y со временем привело как к увеличению количества частиц, так и к изменению картины распределения частиц по размеру. Описание свойств частиц с помощью FTIR-спектроскопии показало, что белок, адсорбированный на частицах металла, содержал слегка возмущенную вторичную структуру по сравнению с белком в растворе. Было решено, что частицы металла служили местами нуклеации для агрегации белка. В таком случае, с целью уменьшения агрегации белка может быть оправдан выбор заполнителя другого вида.

Было проведено сопоставление влияния различных типов насосов на образование невидимых частиц в растворе MAb-Z (9). Потоковая микроскопия показала, что поршневые насосы, изготовленные либо из нержавеющей стали, либо из керамики, являются источником частиц диаметром 1-100 мкм в количествах, превышающих примерно в 100 раз количество механических включений в контрольных образцах. Изучение микроскопических изображений этих частиц показало, что они были полупрозрачными, что свидетельствует в пользу их белковой природы. Инкубация белкового раствора с растворимыми частицами из поршневых насосов не привела ни к значительному изменению распределения частиц по размерам, ни к увеличению количества частиц в данных растворах, что указывает на то, что внешние частицы не служат местами нуклеации для белков. В этом случае образование частиц в растворе было сочтено результатом механического раздражения, вызванного в ходе накачки. Эти результаты были подтверждены исследованием других типов насосов (перистальтического, пневматического или сильфонного), с помощью которых получали растворы, содержащие значительно меньше частиц.

РЕЗЮМЕ

В настоящей общей статье представлены стратегии по описанию характеристик и определению содержания механических включений в инъекционных лекарственных препаратах на основе терапевтических белков, в том числе совокупностей внешних и внутренних частиц. Также настоящая статья содержит информацию о конкретных методах, которые могут применяться в данных целях, а также их преимуществах и недостатках. Рациональная, подробная стратегия контроля может быть разработана на основе глубокого описания свойств агрегатов во время разработки в сочетании с соотношением результатов этих испытаний и тех, которые были проведены для выпуска препарата. Агрегаты обычно присутствуют в большом разнообразии размеров – от олигомеров до частиц, составляющих сотни микрометров. Если в рамках фармакопейного метода при подсчете частиц в диапазоне размера от олигомеров до 25 мкм может быть показана корреляция, тогда для выявления влияния изменений и тенденций в производстве может использоваться определение содержания частиц с помощью LO. В данной ситуации общую стратегию контроля можно использовать для установления предела принятия мер 10 мкм, при превышении которого должно быть запущено расследование, предметом которого могут стать также и методы описания свойств, которые обсуждались в данной главе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Narhi LO, Schmit J, Bechtold-Peters K, Sharma D. Classification of protein aggregates. J Pharm Sci. 2012; 101(2):493–498.

2. Felsovalyi F, Janvier S, Jouffray S, Soukiassian H, Mangiagalli P. Silicone-oil-based subvisible particles: their detection, interactions, and regulation in prefilled container closure systems for biopharmaceuticals. J Pharm Sci. 2012; 101(12): 4569–4583.

3. Ripple DC, Wayment JR, Carrier MJ. Standards for the optical detection of protein particles. Am Pharm Rev. 2011; July Issue. http://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured Articles/36988-Standards-for-the-Optical-Detection-of-Protein-Particles/. Accessed 10 January 2013.

4. Carpenter JF, Randolph TW, Jiskoot W, Crommelin DJ, Middaugh CR, Winter G, et al. Overlooking subvisible particles in therapeutic protein products: gaps that may compromise product quality. J Pharm Sci. 2009; 98(4):1201–1205.

5. Singh SK, Afonina N, Awwad M, Bechtold-Peters K, Blue JT, Chou D, et al. An industry perspective on the monitoring of subvisible particles as a quality attribute for protein therapeutics. J Pharm Sci. 2010; 99(8):3302–3321.

6. Barnard JG, Singh S, Randolph TW, Carpenter JF. Subvisible particle counting provides a sensitive method of detecting and quantifying aggregation of monoclonal antibody caused by freeze-thawing: insights into the roles of particles in the protein aggregation pathway. J Pharm Sci. 2011; 100(2):492–503.

7. Cao S, Jiang Y, Narhi L. A light obscuration method specific for quantifying subvisible particles in protein therapeutics. Pharmacopeial Forum. 2010; 36(3):824–834.

8. Tyagi AK, Randolph TW, Dong A, Maloney KM, Hitscherich C, Jr, Carpenter JF. IgG particle formation during filling pump operation: a case study of heterogeneous nucleation on stainless steel nanoparticles. J Pharm Sci. 2009; 98(1):94–104.

9. Nayak A, Colandene J, Bradford V, Perkins M. Characterization of subvisible particle formation during the filling pump operation of a monoclonal antibody formation solution. J Pharm Sci. 2011; 100(10):4198–4204.