Разработка официальных стандартов на терапевтические моноклональные антитела
РАЗРАБОТКА ОФИЦИАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА
СОДЕРЖАНИЕ
1. ЕВРОПЕЙСКАЯ ФАРМАКОПЕЯ И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА: ИСТОРИЯ ВОПРОСА
2. ПОИСКОВАЯ ФАЗА ПО РАЗРАБОТКЕ ТЕКСТОВ ЕВР. ФАРМ. НА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА: ВВЕДЕНИЕ И ЗАДАЧИ
2.1 РАССМОТРЕНИЕ ВОПРОСА НА ПРИМЕРЕ ИНФЛИКСИМАБА: ОПИСАНИЕ, ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ НАПИСАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНОГО ТЕКСТА
2.1.1 ОПИСАНИЕ
2.1.2 ОСНОВНЫЕ ШАГИ И ДОСТИЖЕНИЯ
2.1.2.1 Совместное исследование с целью экспериментальной верификации методик анализа, применимых к инфликсимабу
2.1.2.2 Проект монографии: гибкость как способ работы со сложностью и неоднородностью структуры
2.1.2.3 Обсуждение публикации на Pharmeuropa: отклик заинтересованных лиц и последовавшие действия
2.1.2.4 Принятие монографии и публикация в Евр. фарм.
2.1.2.5 Внедрение монографии в практику: актуальная информация о том, что необходимо
2.1.2.6 Перспективы, возникшие по результатам изучения примера инфликсимаба: сведение ожиданий воедино
2.1.3 СЛОЖНОСТИ И СДЕЛАННЫЕ ВЫВОДЫ
2.1.3.1 Комплексность терапевтических моноклональных антител
2.1.3.2 Установление спецификаций в монографии: дополнительная гибкость
Раздел «Производство»: испытания, проводимые для гетерогенности, связанной с процессом
«Подходящая» методика в сравнении с «приведенной в пример»
Критерии приемлемости для показателей качества
2.1.3.3 Монографии в сравнении с требованиями спецификации для выпуска лекарственных средств
2.1.3.4 Верификация методов
Устойчивость методики и пригодность для передачи
2.1.3.5 Стандартные образцы
2.1.4 УЧАСТИЕ ЗАИНТЕРЕСОВАННЫХ СТОРОН
2.2 ГОРИЗОНТАЛЬНЫЕ СТАНДАРТЫ: СОСТОЯНИЕ ДЕЛ НА ДАННЫЙ МОМЕНТ
• Разработка общей статьи Евр. фарм. на основанные на клетках методы количественного определения специфической активности ингибиторов ФНО-а
• Разработка общих физико-химических методологий, применимых к моноклональным антителам
• Разработка общих методов оценки способности IgG и родственных молекул вызывать антителозависимую клеточную цитотоксичность
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАБОТЕ
ЕВРОПЕЙСКАЯ ФАРМАКОПЕЯ И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА: ИСТОРИЯ ВОПРОСА
В 1986 году было одобрено к регистрации первое лекарственное средство на основе моноклонального антитела, Ортоклон ОКТ-3, для ограничения отторжения трансплантатов. С тех пор терапевтических моноклональных антител стало заметно больше. Этот класс препаратов занял доминирующую позицию в биофармацевтике. В конце 1990-х в Европе зарегистрировали еще несколько. Развитие науки и новых технологий привело к появлению в 2000-х следующей волны лекарственных средств на основе антител (мышиных, человеческих и инженерных моноклональных антител), которые в основном разрабатывались как средства против рака и воспаления. Моноклональные антитела — сложные макромолекулы, имеющие уникальные с регуляторной точки зрения аспекты, которые подкрепляют необходимость в официальных стандартах (ранее специализированные регуляторные рекомендации были добавлены в руководство от 1995 года «Производство и контроль качества моноклональных антител» (3AB4a)).
Комиссия Европейской фармакопеи занимается разработкой стандартов качества для терапевтических моноклональных антител уже долгое время. В организации считают, что необходимо иметь общую монографию, в которой будут очерчиваться рамки для требований к качеству моноклональных антител (помимо общей статьи Евр. фарм. «Лекарственные средства, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК» (0784)) и которая, также, послужит фундаментом для создания частных монографий на конкретные лекарственные средства. В 2002 году Рабочая группа Евр. фарм. по моноклональным антителам (MAB WP) начала разработку общих ожиданий от качества моноклональных антител, которая закончилась в 2005 году публикацией в Европейской фармакопее общей монографии «Моноклональные антитела для медицинского применения (2031). В ходе процесса разработки эта монография претерпела несколько модификаций, в результате которых описанные там методологии (например, испытание на чистоту, количественное определение) стали очень общими и, как следствие, менее применимыми на практике. Приняв во внимание большое разнообразие моноклональных антител, Рабочая группа по моноклональным антителам начала задумываться о необходимости добавления в Евр. фарм. и других текстов, которые дополнят общую монографию, и начала обсуждение целесообразности проектирования монографий либо на классы, либо на отдельные ЛС (на тот момент исключительно одноисточниковые).
Несколько лет спустя был проведен серьезный пересмотр монографии №2031 с целью уточнения рекомендаций по видимым частицам, а также приведения текста в соответствие с терминологией проекта EMEA «Руководство по разработке, производству и изучению характеристик моноклональных антител и родственных ЛС и по спецификациям на них» (EMEA/CHMP/BWP/157653/2007)1.
EDQM занялся дальнейшими раздумьями и консультациями с заинтересованными сторонами о роли Евр. фарм. в области биологических лекарственных средств. Этот вопрос обсуждался в 2011 году на рабочем совещании EDQM с европейскими регуляторными органами «Будущее монографий в области биологических лекарственных средств». В этих действиях отразились растущий спрос на дополнительные стандарты Евр. фарм. на биотерапевтические ЛС и необходимость сформировать концепцию монографий на моноклональные антитела, например, путем изучения возможностей разработки специализированных монографий на ЛС или более широких монографий на классы или подклассы ЛС. Необходимость проектирования отдельных монографий на моноклональные антитела (и слитые белки), которые на тот момент были наиболее финансово перспективными направлениями разработки биоподобных ЛС, более подробно обсуждалась и была признана на внеочередной встрече Рабочей группы по моноклональным антителам и Рабочей группы P4Bio (09/2011; см. документ № PA/PH/SG (11) 71). Это привело к расширению охвата поисковой фазы работы Группы P4Bio над созданием монографии, посвященной моноклональным антителам, поскольку в программу добавили монографию на этанерцепт2 (№2895).
За вышеперечисленным последовала встреча EDQM с представителями фармацевтической отрасли в 2014 году, на которой от них были получены комментарии и рекомендации касательно будущей разработки официальных стандартов для моноклональных антител, таких как методологии проведения испытаний для классов ЛС, а также собраны основанные на рабочих характеристиках моноклональных антител стандарты.
По результатам консультации с заинтересованными лицами, обсуждения Рабочей группы по моноклональным антителам продолжились и, с одной стороны, сосредоточились на подходе установления стандартов с целью охватить спектр методологий анализа, применимых в случае (классов) моноклональных антител (например, это методы количественного определения специфической активности ФНО-альфа, методики эксклюзионной хроматографии для выявления агрегатов, техники капиллярного электрофореза и изоэлектрического фокусирования для изучения характеристик и подтверждения подлинности, анализ N-гликанов); с другой стороны, поскольку в 2014 году одобрили к регистрации два первых биоподобных моноклональных антитела3, за которыми выстроилась очередь из перспективных биосимиляров, была намечена стратегия, направленная на помощь в обдумывании разработки монографий, специально предназначенных для конкретных ЛС, с использованием многоисточникового подхода (см. отчет о 7-й встрече Рабочей группы по моноклональным антителам от 09.2013). В результате были предприняты определенные действия, направленные на разработку для моноклональных антител новых, гармонизированных, общемировых стандартов, направленных на повышение качества и единообразия этих лекарственных средств во все более сложных условиях рынка сбыта.
2. ПОИСКОВАЯ ФАЗА ПО РАЗРАБОТКЕ ТЕКСТОВ ЕВР. ФАРМ. НА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА: ВВЕДЕНИЕ И ЗАДАЧИ
Комиссия Евр. фарм. приступила к установлению официальных стандартов на терапевтические моноклональные антитела в марте 2014 года (на 148-й сессии) с поисковой фазы, чтобы разработать:
и в то же время
Чтобы оценить робастность подхода, в качестве конкретного примера был выбран один лекарственный препарат, инфликсимаб. На тот момент это было первое и единственное зарегистрированное антитело (ЕМА одобрила его к регистрации в октябре 2013 года). Поэтому инфликсимаб использовали в качестве примера, чтобы рассмотреть целесообразность создания специализированной монографии на конкретное ЛС, а потом опираться на полученные знания и исследовать возможности для разработки общих фармакопейных текстов, применимых к моноклональным антителам. Таким образом, был выбран подход «снизу вверх» — переход от частных требований к показателям качества к общим (т.е. от специализированных монографий на конкретные лекарственные средства к общим методологиям, монографиям на класс или подкласс ЛС; см. рис. 1). В долгосрочной перспективе результат поисковой фазы, возможно, получится применить для улучшения общей монографии Евр. фарм. «Моноклональные антитела для медицинского применения» (№2031) и уточнения, например, общих требований к методикам испытаний (например, к испытанию на чистоту, к определению специфической активности), путем включения отсылок на новые общие статьи или общие методологии.
Поисковая фаза разработки фармакопейных текстов на моноклональные антитела: подход «снизу вверх»
От частного к общему:
Рисунок 1. Поисковая фаза по моноклональным антителам, подход «снизу вверх»
2.1 РАССМОТРЕНИЕ ВОПРОСА НА ПРИМЕРЕ ИНФЛИКСИМАБА: ОПИСАНИЕ, ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ НАПИСАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНОГО ТЕКСТА
2.1.1 ОПИСАНИЕ
Рассмотрение конкретного примера, инфликсимаба (первый уровень подхода «снизу вверх»), было выстроено на важных базовых элементах: знаниях и опыте, полученных в области биотерапевтических препаратов (см. рис.1). Во-первых, процедура Р1 (многоисточниковый подход) — классический метод разработки монографий Евр. фарм., при котором для получения одной монографии принимаются во внимание спецификации нескольких выпущенных в обращение ЛС. Процедура P1 успешно применялась для разработки нескольких монографий на биотерапевтические ЛС. В основе этой процедуры лежит сравнение разных ЛС. Она дает возможность прийти к компромиссу, что ведет к разработке робастных стандартов. Во-вторых, инфликсимаб4 (химерное моноклональное антитело IgG1 к фактору некроза опухоли-альфа (ФНО-а)) — это зарекомендовавший себя давно ставший лидером продаж препарат. Недавно зарегистрирован биоподобный ему препарат, а еще несколько находятся в разработке. Про Инфликсимаб как таковой знали, но со временем он стал полноценной целью, которая дала основательный базис для рассмотрения вопроса стандартизации комплексного моноклонального антитела. И наконец, параллельно в изучением примера Инфликсимаба, по процедуре Р4 шла разработка монографии «Этанерцепт» (№2895). Как и Инфликсимаб, Этанерцепт (слитый белок из рецептора-2 фактора некроза опухоли-альфа и Fc-фрагмента IgG1) относится к классу ингибиторов ФНО-а, разделяет с инфликсимабом характерные для IgG1 показатели качества и выполняет такие же функции с точки зрения механизма действия и нейтрализации активности ФНО-а. Монография на Этанерцепт предназначалась для того, чтобы послужить образцом для написания проекта монографии на Инфликсимаб, чтобы обеспечить единообразие подходов к ЛС одного класса в Рабочей группе по моноклональным антителам и Рабочей группе P4Bio.
2.1.2 ОСНОВНЫЕ ШАГИ И ДОСТИЖЕНИЯ
2.1.2.1 Совместное исследование с целью экспериментальной верификации методик анализа, применимых к инфликсимабу
После того, как производитель инфликсимаба откликнулся на просьбу поучаствовать, выслал пакеты данных (например, спецификации, методики анализа и валидационные данные; данные о серии и стабильности) и предоставил материалы для испытаний, было проведено совместное исследование, чтобы изучить практическую возможность создания специализированной монографии, посвященной инфликсимабу.
Целью совместного исследования было подтвердить робастность, возможность переноса и пригодность для монографии применимых к инфликсимабу методик анализа для включения в текст; в процессе планировалось собрать информацию, которая позволит выбрать методики испытаний и пути выражения критериев приемлемости для монографии.
Эксперименты включали физико-химические испытания, т.е., пептидное картирование, анализ N-гликанов, изоэлектрическое фокусирование, катионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, капиллярный электрофорез (ДСН), а также основанное на клетках количественное определение нейтрализации ФНО-альфа. Работа велась с опорой на общий протокол исследования, составленный из технической информации, содержавшейся в пакете данных, предоставленном производителем. Исследование охватывало разные образцы инфликсимаба, а именно пробы из шести серий (субстанции и препарата, зарегистрированных в ЕС), а также собственный образец сравнения, предоставленный компанией. В совместном исследовании приняли участие четыре официальных лаборатории по контролю качества лекарственных средств (Австрийское агентство по здравоохранению и по безопасности пищевых продуктов (AGES), Французское агентство по безопасности лекарственных средств и товаров медицинского назначения (ANSM), Шведское агентство по лекарственным средствам (MPA) и Институт Пауля Эрлиха (PEI)), входящие в состав Рабочей группы по моноклональным антителам, а также лаборатория EDQM. Полученные результаты были добавлены к общей оценке. Исследование подразумевало серьезный объем лабораторной работы, в ходе которой не только экспериментально верифицировали методы анализа, описанные в полученном пакете данных, но и провели оценка дополнительных и альтернативных техник анализа, а также получили дополнительные знания.
В целом, по итогам совместного исследования было собрано значительное количество данных в поддержку разработки монографии на инфликсимаб (см. отчет по исследованию PA/PH/Exp. MAB/T (16) 6). Результат исследования показал, что предложенные физико-химические методики испытаний и биологические методики количественного определения можно проводить без особых проблем; было подтверждено, что все методики подходят для переноса между лабораториями, робастны и пригодны для включения в монографию. Кроме того, было сочтено, что предложенные испытания и критерии приемлемости широко применимы к инфликсимабу разных производителей. Дизайн исследования и степень верификации методов позволили выявить критические параметры методик испытаний (например, см. раздел по количественному определению биологическими методами), а также возможные источники вариаций, и, в конечном итоге, облегчили понимание, насколько подробная информация будет даваться в монографии. В силу отсутствия технических препятствий, мешающих разработке частной монографии на моноклональное антитело, исследование подтвердило, что сложные методики анализа и моноклональные антитела возможно стандартизировать.
2.1.2.2 Проект монографии: гибкость как способ работы со сложностью и неоднородностью структуры
Монография «Концентрированный раствор инфликсимаба» (№2928) проектировалась с опорой на принципы, описанные в Руководстве по разработке монографий на синтетические пептиды и рекомбинантные белки (2016 года). При этом особое внимание уделялось:
‒ Сложности процесса производства (живые клетки) и механизму действия моноклонального антитела;
‒ Подходу, который лучше отразит связь между качеством лекарственного средства и процессом производства;
‒ Зависящим от процесса гетерогенности (то есть гликозилированию, профилю вариантов с разными зарядами) и единообразию продукции;
‒ Сложности методик анализа, выбору, какие из них описать в монографии, и установлению критериев приемлемости.
Подход к установке спецификаций для монографии, таким образом, был направлен на обеспечение гибкости. Раздел монографии «Производство» разрабатывался так, чтобы включить туда общие соображения о единообразии продукции (занятость сайтов N-гликозилирования и эффекторные функции, опосредованные Fc-областью), а также специализированные требования касательно зависящей от процесса неоднородности, а именно анализ N-гликанов и определение вариантов с разными зарядами. Важно, что критерии для верификации рабочих характеристик аналитических методик были предоставлены в поддержку робастных методологий, в то время как подходящие методики для комплексных количественных определений были приведены в качестве примеров, таким образом, дана возможность применять разные (валидированные) методики.
Гибкий подход как способ работы со сложностью моноклональных антител подробно обсуждается в разделе «Сложности и сделанные выводы».
2.1.2.3 Обсуждение публикации на Pharmeuropa: отклик заинтересованных лиц и последовавшие действия
В силу того, что эксперты Евр. фарм. собрали большое количество убедительных экспериментальных данных в поддержку разработки частной статьи на инфликсимаб, Комиссия Евр. фарм. на 155-й сессии (в июне 2016 года) согласилась опубликовать проект монографии на портале Pharmeuropa. Было отмечено, что решение об окончательном принятии готового варианта монографии к публикации в Евр. фарм. будет приниматься по результатам открытого обсуждения, которое поможет с продвижением поисковой фазы.
Отклик заинтересованных лиц, полученный в ходе открытого обсуждения выпуска журнала Pharmeuropa №28.4 (октябрь-декабрь 2016 года), составил около 125 комментариев от компаний (в том числе от держателя РУ на оригинальный препарат и от одного из производителей биоподобных препаратов (его лекарственное средство сейчас в процессе разработки)), от ассоциаций производителей и от регуляторных органов. К сожалению от производителя того биоподобного препарата, что зарегистрировали во время разработки монографии, отклика не было.
В целом, у заинтересованных лиц не было никаких серьезных замечаний; большинство комментариев относилось к техническим вопросам, которые подытожены ниже:
‒ содержание действующего вещества: не следует выражать его как численный диапазон (содержание специфично для каждого из препаратов);
‒ специфическая активность: обычно гарантируется путем сопоставления с установленными, собственными образцами сравнения; международные стандартные образцы не применимы ко всем материалам моноклональных антител в силу неоднородности последних;
‒ испытания на технологические примеси (раздел о производстве): эта информация больше подходит для общей статьи №2031;
‒ анализ гликанов: потенциальное неправильное понимание в странах за пределами ЕС (метод в качестве примера/необязательный); использовать более общие формулировки, чтобы отразить потенциально разные карты гликанов;
‒ определение вариантов с разными зарядами: включить более современные методы (например, капиллярный электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование); предоставить в качестве примеров более специализированные методы; критерии приемлемости сформулировать иначе (зависят от метода, значит, суммирование определенных пиков может быть неактуальным);
‒ пептидное картирование: испытания по изучению характеристик (не использовать как испытание на подлинность; пределы: «согласно утвержденным компетентным органом»); следует применять собственный препарат сравнения;
‒ pH: численный диапазон не подходит (pH зависит от состава);
‒ родственные белки (капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия): добавить требование к степени разделения пиков; для анализа препаратов инфликсимаба одобрены разные методологии (разные принципы), спецификации включаются в отчеты по-разному; численные пределы неактуальны (у каждого ЛС они свои);
‒ примеси, молекулярная масса которых отличается от инфликсимаба (эксклюзионная хроматография): критерии приемлемости надо сменить на «предел одобряется компетентным органом» или на «максимум Х %, если не обосновано иное значение» (пределы индивидуальны для каждого ЛС);
‒ специфическая активность: не следует приводить определенный метод; как соотносятся биологический препарат сравнения Инфликсимаб и международный стандартный образец ВОЗ; биологический препарат сравнения следует использовать только для испытаний на пригодность системы; пределы надо заменить на «как одобрено компетентным органом», а не давать определенный диапазон численных значений; предпочтителен более широкий приемлемый диапазон.
В целом, заинтересованные стороны поддержали идею написания монографий на моноклональные антитела [и другие биологические лекарственные средства]. Такие монографии сочли полезными и ценными. Также, с учетом, что монографии не являются демонстрацией биоподобия, признали ценность минимальных стандартных требований, которые дают такие монографии. Было, однако, отмечено, что в мировом масштабе возможно некоторое недопонимание, как применять такие монографии с точки зрения биоподобия, и, следовательно, для ясности рекомендуется включить в текст руководство на этот счет. Кроме того, чтобы избежать потенциального неправильного понимания «гибкости» встроенной в монографию, было рекомендовано представить соответствующие формулировки в разделе фармакопеи «Общие замечания». Компания-производитель оригинального препарата, напротив, усомнилась в достаточности и полезности данной монографии, поскольку у каждого препарата свои собственные стратегия контроля и процесс производства. Также на обсуждение выдвинули вопрос о пояснениях, как соблюдать требования монографии (например, как повлияет монография на компании, изготавливающие оригинальный и воспроизведенные препараты; пределы из монографии и одобренные пределы — разные методы и разные пределы; маловероятно, что предложенные для конкретных испытаний критерии приемлемости охватят всех производителей и обеспечат условия для получения содержательного и полезного стандарта). Все эти вопросы стали темой двустороннего обмена мнениями, который позволил лучше донести до данной компании контекст разработки монографии на инфликсимаб и стимулировать заинтересованность в нем в виде участия в тестировании проекта монографии и установления указанного препарата сравнения. В результате производитель оригинального препарата предоставил дополнительные подтверждающие данные, которые помогли завершить работу по проверке монографии. Эти результаты еще раз подтвердили, что на основании данных, доступных Евр. фарм. на тот момент (09/2017), спецификации, предложенные в монографии, должным образом отражают препараты инфликсимаба, одобренные к регистрации в ЕС.
Кроме того, в результате проведенного ВОЗ и EDQM совместного исследования, целью которого было установление 1-го международного стандартного образца инфликсимаба5 от ВОЗ и 1-й серии биологического препарата сравнения для инфликсимаба от Евр. фарм., были собраны данные в поддержку предложенных для монографии спецификаций на специфическую активность (удельная активность, выраженная в МЕ на мг), а также критериев приемлемости для расчетной специфической активности с использованием количественного определения биологическим методом, как описано в проекте монографии.
Рабочая группа по моноклональным антителам тщательно рассмотрела отклик, полученный в открытом обсуждении, и дополнительную информацию на двух встречах, которые состоялись в апреле и в сентябре 2017 года и позволили рассмотреть все вопросы, которые поднимались за время разработки монографии. Учитывая количество и состоятельность комментариев, полученных от заинтересованных лиц, Рабочая группа по моноклональным антителам заключила, что стандартизация комплексного сложного моноклонального антитела целесообразна, и порекомендовала проект монографии «Концентрированный раствор Инфликсимаба» (№2928) к принятию Комиссии Евр. фарм.
2.1.2.4 Принятие монографии и публикация в Евр. фарм.
Поисковая фаза по моноклональным антителам достигла ключевого этапа работы на 159-й сессии Комиссии Евр. фарм. (21-22 ноября 2017 года) — монография «Концентрированный раствор Инфликсимаба» (№2928) была принята и опубликована в приложении 9.6 к Евр. фарм. (вступила в силу в январе 2019 года).
Исследование на примере инфликсимаба позволило апробировать концепцию и получить понимание, как работать с (другими) подклассами моноклональных антител. Рабочая группа по моноклональным антителам сделала шаг вперед в области установления официальных стандартов на моноклональные антитела путем разработки горизонтальных стандартов. Эта работа нацелена на определение общих требований/методологий, чтобы отразить подходящий набор ожиданий, которые можно применять к различным показателям качества, характерным для (классов или подклассов) моноклональных антител. При этом одним из основных ориентиров была разработка стандартов на основе препаратов против фактора некроза опухоли альфа.
В ходе завершения монографии на Инфликсимаб эксперты из Рабочей группы по моноклональным антителам выразили желание поработать над подготовкой следующих частных статей. Работа с новыми перспективными молекулами могла бы обогатить понимание техник анализа, которые смогут послужить платформенными методологиями для анализа моноклональных антител.
2.1.2.5 Внедрение монографии в практику: актуализация потребностей
Внедрение монографии в практику — неотъемлемая часть поисковой фазы по моноклональным антителам. Тесное сотрудничество с соответствующими сторонами очень важно для надлежащего обеспечения того, чтобы монография охватывала все лекарственные средства, которые находятся в обращении на данный момент.
Существующая монография отражает одобренные спецификации для двух препаратов инфликсимаба (оригинального и воспроизведенного; оба экспрессируются клеточной линией SP2/0), которые присутствовали на рынке на момент начала работы над текстом. За время разработки были выданы регистрационные удостоверения еще на два биоподобных препарата инфликсимаба (оба экспрессируются линией клеток CHO), однако, на этапе завершения монографии этих данных у экспертов еще не было.
После того, как рассматриваемая монография вступила в силу в январе 2019 года, две компании, изготавливающие биоподобные ЛС, запросили пересмотреть указанное в спецификации монографии предельное значение для испытания на родственные белки методом капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях. Сначала, когда с помощью процедуры внесения вариаций для производителей еще только одобрили новую спецификацию на сумму тяжелых и легких цепей (в %) для одного из биоподобных препаратов инфликсимаба, казалось, что может понадобиться пересмотреть монографию, чтобы отразить только что одобренный предел. Кроме того, ждали, что скажет по поводу допустимого предела в спецификации Рабочая группа по биопрепаратам Комитета по лекарственным средствам для медицинского применения (CHMP) в свете новых данных, предоставленных компанией, отвечавшей за один из новых дженериков, и принимая во внимание процедуру EMA для внесения вариаций. Рабочая группа по биопрепаратам решила, что уверенно рекомендовать определенный предел пока рано, и посоветовала собрать больше практических знаний.
Что касается второго упомянутого биоподобного препарата, одобренный подход, используемый компанией-производителем для суммирования пиков, полученных методом капиллярного электрофореза с использованием додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях, отличался от представленного на тот момент в монографии, т.е. от двойного предела в спецификации с дополнительным пределом для «фрагментов» (для всех пиков, которые элюируют до тяжелой цепи (за исключением пиков легкой цепи). Поскольку подходы к выражению критериев приемлемости для родственных белков и примесей, проанализированных методом капиллярного электрофореза с использованием додецилсульфата натрия, для двух биоподобных препаратов неодинаковы, казалось, что будет сложно работать с каждой из заявок на пересмотр критериев отдельно.
Тщательная оценка данных, поданных компаниями в поддержку пересмотра монографии, проводится подгруппой Рабочей группы по моноклональным антителам, в которую входят только представители регуляторных органов, в закрытых условиях, которые необходимы для сохранения конфиденциальной, не подлежащей разглашению коммерческой информации. В связи с появлением новых данных и на основании вклада Рабочей группы CHMP по биопрепаратам на грядущей сессии Комиссии Евр. фарм., которая состоится в ноябре 2019 года, будет представлено предложение по шагам навстречу пересмотру монографии «Концентрированный раствор Инфликсимаба» (№2928).
Кроме того, идет обмен мнениями я одним из производителей касательно потенциального пересмотра диапазона спецификации на специфическую (удельную) активность, поскольку сообщалось об опыте установления связи собственного образца сравнения, используемого в компании, с образцом биологического препарата от Евр. фарм., которому присвоена специфическая активность в МЕ, и определения удельной активности. Чтобы разобраться в вопросе надлежащим образом, от данной компании ожидается дополнительная информация.
2.1.2.6 Перспективы, возникшие после изучения примера инфликсимаба: сведение ожиданий воедино
По завершении монографии на Инфликсимаб и параллельно разработке горизонтального стандарта, Рабочая группа по моноклональным антителам запланировала создание частных монографий на другие моноклональные антитела этого же класса ингибиторов ФНО-альфа. Такой подход может способствовать работе над ингибиторами ФНО-альфа, монографии на которые, посвященные отдельным другим препаратам, уже опубликованы («Этанерцепт» (№2895)) или еще разрабатываются («Концентрированный раствор Голимумаба» (№3103); недавно добавлена в программу работы Группы P4Bio). На сегодняшний день разработка монографии на адалимумаб (полностью человеческое антитело), который нацелен на тот же самый антиген (ФНО-альфа), что и инфликсимаб (химерное антитело), рассматривается как естественное продолжение работы Комиссии Евр. фарм. с антагонистами ФНО-альфа, нацеленной на продолжение анализа, начатого с исследования конкретного примера инфликсимаба, и подтверждение целесообразности подхода путем рассмотрения новых специфических вопросов. В дополнение к этому данная работа поспособствует стандартизации класса антител к ФНО-альфа путем рационализации методологий и общих функциональных вопросов, а тем самым поможет продвижению горизонтального подхода (см. отчеты со встреч Рабочей группы по моноклональным антителам).
Более того, апробация концепции написания подобных монографий на примере Инфликсимаба улучшила понимание, как обращаться с моноклональными антителами других подклассов. Работа с новыми перспективными молекулами может «валидировать» концепцию и обогатить понимание техник анализа, которые могли бы послужить платформенными методологиями для анализа моноклональных антител. При разработке монографий на моноклональные антитела других классов разной сложности (например, на антитела к рецептору фактора эпидермального роста (HER/ErbB), к B-лимфоцитарному антигену CD20, фактору роста эндотелия сосудов (VEGF)), теоретически, будут рассматриваться более сложные с научной точки зрения вопросы, такие как эффекторные функции, опосредованные Fc-областью (например, трастузумаб, ритуксимаб), и откроются новые области. Важно, что существенным условием работы является поддержка со стороны компаний: должно быть заранее гарантировано предоставление данных, образцов для испытаний, а также перспективных материалов для установления стандартных образцов. Также была сделана отсылка к общим дискуссиям о глобальной необходимости иметь стандартные образцы биологической активности моноклональных антител (например, тех, что нацелены на семейство рецепторов ErbB/HER); в данном контексте установление международных стандартных образцов ВОЗ «также может поспособствовать разработке фармакопейных монографий, которые могут помочь контролировать и регулировать обращение этого типа лекарственных средств и, таким образом, поддержать единообразные по всему миру безопасность и эффективность ЛС» [из запросов о начале новых проектов по созданию материалов сравнения ВОЗ для биотерапевтических препаратов (кроме препаратов крови), WHO/BS/2016.2296].
Кроме того, с появлением антител нового поколения, конъюгатов антител с лекарственными средствами, биоспецифичных антител стала очевидна необходимость в робастных, инновационных методах на замену старым; однако считается, что нужен определенный срок, чтобы достичь общего понимания, какие из методологий принимаются научным сообществом. Поэтому Евр. фарм. следует разрабатывать монографии на уже сформировавшиеся темы: если предмет монографии новый или все еще быстро развивается, нужна большая гибкость, а для уже устоявшихся случаев монография может послужить основой оценки качества.
С другой стороны, Рабочая группа по моноклональным антителам прикладывает усилия, чтобы эффективно справиться со следующими уровнями подхода «снизу вверх» путем продвижения разработки общих статей (на методологии физико-химического анализа и биологического количественного определения), что может однажды привести к пересмотру общей монографии «Моноклональные антитела для медицинского применения» (№2031).
2.1.3 СЛОЖНОСТИ И СДЕЛАННЫЕ ВЫВОДЫ
2.1.3.1 Сложность терапевтических моноклональных антител
В деле производства и разработки терапевтических моноклональных антител имеют место различные сложности, которые довольно сильно отличаются от тех, с которыми сталкиваются при работе с традиционными биопрепаратами (такими как малые пептиды и белки, негликозилированные гормоны и факторы роста), особенно в связи с неоднородностью лекарственного средства, которая, как известно, сильно зависит от процесса производства.
Моноклональное антитело — сложная и крупная макромолекула, имеющая несколько вариантов белка разного размера и с разным зарядом, близкородственные молекулы с характерной от природы неодинаковостью гликозилирования и другие формы с посттрансляционными модификациями. Процесс производства комплексный, и изменения процесса могут привести к отличающимся показателям качества, таким как гликозилирование, гетерогенность заряда, химическая модификация (например, деамидирование, изомеризация, окисление, C-концевой лизин). Кроме того, обязательно сохранять сложные вторичные и третичные структуры моноклональных антител. Размер и сложность требуют методов количественного определения, выходящих за рамки традиционных физико-химических техник, и надлежащей методологии анализа для характеризации как физико-химических свойств, так и биологической активности моноклональных антител. Это накладывает определенные требования на техники анализа, требуемые для всестороннего изучения структурных характеристик моноклональных антител, а также для испытаний на подлинность, качество, специфическую активность и чистоту. Моноклональные антитела демонстрируют большое разнообразие показателей качества, которые, в свою очередь, могут анализироваться большим количеством методов. Это осложняет выбор испытаний для включения в монографию и поднимает фундаментальный вопрос о том, как следует определять, какая информация требуется для официального стандарта.
2.1.3.2 Установление спецификаций в монографии: дополнительная гибкость
Официальный стандарт предоставляет набор актуальных показателей, позволяющий подтвердить качество рассматриваемой фармацевтической субстанции. Стандарт — одна из частей стратегии полного контроля, спроектированной для обеспечения качества и единообразия лекарственных средств. Однако цели стандарта не предполагают выхода за рамки к изучению характеристик, которое включает определение физико-химических свойств, биологической активности, чистоты и примесей. Характеристики изучаются в обширной программе испытаний, проводимых ортогональными методами.
Основная сложность в установлении спецификаций в монографии — поиск равновесия между гибкостью ожиданий, позволяющей применять текст к широкому разнообразию продукции, и всесторонним и достаточно предписательным характером требований, чтобы способствовать успешному независимому проведению испытаний. Описание требований в монографии должно включать инструменты для оценки критериев эффективности метода, а также критерии приемлемости для ключевых показателей качества, чтобы облегчить стандартизацию функциональности и сохранить совместимость с разработкой последующих версий.
Концепция гибкости внесена в раздел Евр. фарм. «Общие замечания» и предполагает использование методов, альтернативных официальным из Евр. фарм., при условии, что эти методы дают такие же результаты «испытание пройдено» или «испытание не пройдено» и согласованы с компетентным органом. Также данная концепция предусматривает возможность отказа от определенных испытаний, если соответствие качества лекарственного средства фармакопейным требованиям подтверждается на основании дизайна, стратегии контроля и актуальных данных (например, полученных в ходе валидационных исследований производственного процесса). Кроме того, согласно разделу «Общие замечания» гибкость предоставляется за счет использования процессно-аналитической технологии и/или проведения испытаний для выпуска лекарственного средства во время производства (включая выпуск стерилизованной продукции на основе учёта условий стерилизации) как улучшенного подхода отдельно к тестированию конечной продукции, в условиях, которые сочтет подходящими компетентная организация.
В ходе подготовки проекта монографии на Инфликсимаб стало, однако, очевидно, что нужна еще большая гибкость (помимо включенной в «Общие замечания») в установлении спецификаций для учета структурной сложности и гетерогенности, комплексных методологий анализа, а также потенциального разнообразия соединений, получаемых в результате отличающихся друг от друга процессов производства.
• раздел «ПРОИЗВОДСТВО»: испытания, относящиеся к зависящей от процесса гетерогенности
Чтобы повысить гибкость монографий, раздел монографии «Производство» расширяется определением общих требований к единообразию производства и частных требований к зависящей от процесса гетерогенности (согласно положениям, которые приводятся в разделе фармакопеи «Общие замечания»: «Положения под заголовком «Производство» привлекают внимание к определенным аспектам производственного процесса, но не обязательно являются всеобъемлющими. Изложенные в них требования к производителям обязательны к исполнению, за исключением случаев, когда прямо указано иначе. Эти положения могут относиться, например, к исходным материалам, к самому процессу производства и к его валидации и контролю, ко внутрипроизводственным испытаниям или к испытаниям, которые производителю предстоит выполнять на готовых единицах продукции перед выпуском: либо на избранных сериях, либо на каждой. Эти положения не обязательно можно проверить на образце готовой продукции силами независимого специалиста по анализу. Компетентный орган может постановить, что инструкциям следовали и следуют, например, путем проверки данных, полученных от производителя, путем инспектирования производства или путем испытаний соответствующих образцов»). В результате, испытания, имеющие отношение к гетерогенности, которая зависит от процесса производства (например, гликозилирование, варианты с разными зарядами), вводятся в раздел монографии «Производство».
‒ N-гликозилирование, гетерогенность на микроуровне, связано с одним сайтом (Asn300) N-гликозилирования в Fc-области тяжелых цепей, который дает несколько гликоформ (как и ожидалось для моноклональных антител IgG1, O-связанных гликанов не было). Как таковое, N-гликозилирование играет важнейшую роль в структуре/конформации белка и его опосредованной Fc-областью эффекторной функции, связанной со вторичным механизмом действия инфликсимаба. В первую очередь анализ гликанов применяется для отслеживания единообразия распределения олигосахаридов со спрогнозированными гликановыми структурами, включающими нефукозилированные, фукозилированные и сиалилированные виды, отражая, таким образом, единообразие производства и качество продукции.
Следуя такому же подходу, как применялся для монографий Евр. фарм. на гликопротеины (например, № 2895 «Этанерцепт», №2522 «Концентрированный раствор человеческого (рекомбинантного) фактора свертывания крови IX», №2534 «Концентрированный раствор человеческого (рекомбинантного) фактора свертывания крови VIIa»), анализ гликанов включили в раздел монографии «Производство». Обоснование объясняется следующим образом: во-первых, анализ гликанов, который описывается в монографии, должен отражать тот факт, что гликозилирование зависит от процесса производства. Для этой цели в монографии предписывается использовать два типа стандартных образцов: один для отслеживания рабочих характеристик метода и обеспечения точности результатов (например, это может быть специальный химический стандартный образец (CRS) для проверки пригодности системы), а другой для оценки критериев приемлемости сравнительным методом (например, собственный образец сравнения компании). Во-вторых, гликановый анализ — это многоэтапная процедура, доступная в разных вариантах (в том числе с использованием разных способов подготовки проб, обессоливания, ферментативного расщепления для высвобождения гликанов, флуоресцентного мечения гликанов, анализа методом жидкостной хроматографии с применением разных систем для разделения и детектирования). С другой стороны, общие методы анализа уже описаны в общей статье Евр. фарм. №2.2.59 «Гликановый анализ гликопротеинов» 6. В результате в монографии на Инфликсимаб как обязательное требование указано использование «подходящего метода», разработанного в соответствии с общей статьей №2.2.59, и предписано осуществлять следующие шаги: 1) обессоливание и избирательное высвобождение гликанов; 2) мечение высвобожденных гликанов подходящим флуоресцентным веществом; 3) анализ меченных гликанов методом жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием. Требования к тому, как именно проводить анализ, гибкие, чтобы пользователь мог применить другой метод, основанный на принципах, описанных в общей статье №2.2.59, и адаптировать данные требования к своему оборудованию и подходу.
Кроме того, в монографии приведен пример конкретной методики анализа, чтобы пользователь имел возможность провести испытание, а также даны подробные инструкции (например, подготовка проб, расщепление пептид N-гликозидазой F, метод высокоэффективной анионообменной хроматографии с пульсирующим амперометрическим детектором для анализа меченных гликанов), критерии пригодности системы для подтверждения рабочих характеристик метода с использование специально предназначенного для этого химического стандартного образца.
И наконец, критерии приемлемости для определенных видов гликанов в формате численных пределов могут не подходить для всех зарегистрированных лекарственных средств, и значит, не следует включать их в спецификации монографии; с учетом вариабельности профиля гликанов, связанной с изменениями процесса производства, критерии приемлемости придется устанавливать производителю и согласовывать с компетентным органом.
‒ Изоформы с разными зарядами — несколько молекулярных вариантов, закрепленных за различиями в C-концевом лизине, сайт-специфическом деамидировании и заряженными гликановыми видами; еще один источник неоднородности. Варианты с разными зарядами определяются с помощью комбинации из двух ортогональных техник: изоэлектрического фокусирования (метод А) и ионообменной хроматографии (метод B). Монография позволяет большую гибкость относительно метода А; в данном случае используется тот же подход, что применялся к гликановому анализу. Пользователю монографии нужно применить доходящий метод изоэлектрического фокусирования, соответствующий общей статье Евр. фарм. №2.2.54 «Изоэлектрическое фокусирование»; при этом в качестве примера приводится подробная, конкретная методика. Кроме того, монография позволяет использовать в качестве альтернативы изоэлектрическому фокусированию подходящий метод капиллярного изоэлектрического фокусирования, разработанный в соответствии с общей статьей №2.2.47 «Капиллярный электрофорез», с учетом, что нужна валидация и подтверждение пригодности такой методики удовлетворительным для компетентного органа способом. Как таковая, монография открывает дорогу инновационным методам (как рекомендовалось во время открытого обсуждения проекта). Что касается метода B, в монографии содержатся обязательные требования по поводу того, какой именно метод следует использовать; предписан конкретный метод катионообменной хроматографии. Как и в случае с анализом гликанов, независимый специалист по анализу может выполнить методы A и B и подтвердить пригодность системы (с помощью специально предназначенного для этого химического стандартного образца), но не может оценить соответствие спецификациям монографии, для этого требуется собственный препарат сравнения компании. Более того, пределы для групп изоформ, определенных с помощью ионообменной хроматографии устанавливаются гибко: «как одобрено компетентным органом».
• «Подходящая» методика в сравнении с «приведенной в пример»
Подход, описанный выше, считается необходимым для обеспечения гибкости в случае комплексных, многоэтапных процедур (например, гликанового анализа) и разных форматов одной и той же техники разделения (например, изоэлектрическое фокусирование и капиллярное изоэлектрической фокусирование). Этот подход нельзя рассматривать как универсальный. Точно так же и количественные определения биологическим методом требуют определенной степени гибкости с точки зрения формата анализа, считывания результатов и т.д. (см. раздел ниже). Для всех этих процедур описание подходящего метода испытаний (например, обязательные этапы процедуры или общие методы анализа (на базе общих статей Евр. фарм.)), дано как требование. «Подходящий» — общепринятое понятие, которому дано определение в разделе «Общие замечания». Оно используется для описания реактива, микроорганизма, метода испытаний и т.д.: «если критерии пригодности метода не описаны в монографии, то, что он подходит, доказывается так, чтобы это сочли удовлетворительным компетентные органы».
Или же можно в качестве примера подробно описать процедуры со специализированными инструкциями, в том числе с указанием подготовки проб, количества, концентраций или составов реактивов и буферов, хроматографических условий, дизайна чашек для количественных определений с использованием клеток, считывания результатов и т.д., использования специально предназначенных для этого стандартных образцов Евр. фарм. для калибровки и подтверждения рабочих характеристик метода. Значит, описанная процедура может использоваться «как есть», а может быть заменена на другую, подходящую и валидированную процедуру без необходимости демонстрировать эквивалентность «приведенному в пример» методу, но с обязательным одобрением компетентного органа.
• Препараты сравнения в испытаниях, которые относятся к гетерогенности, зависящей от процесса.
Монография на Инфликсимаб требует применения стандартных образцов, поскольку это неотъемлемая часть стандарта качества. Гибкость привносится путем использования в испытаниях, которые относятся к зависящей от процесса производства гетерогенности, двух типов препаратов сравнения. Стандартный образец химической субстанции (CRS) Инфликсимаб от Евр. фарм., установленный для помощи в гликановом анализе и определении вариантов с разными зарядами, облегчает оценку рабочих характеристик метода на основании определенных критериев пригодности системы. В то время как в соответствующих перечисленным испытаниях с целью сравнения и проверки соблюдения требований (например, по совпадению профилей, полученных методом жидкостной хроматографии) применяется собственный препарат сравнения компании, для которого доказано, что он показателен для серий, протестированных в клинических испытаниях, и для серий, используемых для подтверждения единообразия производства.
• Критерии приемлемости для показателей качества
‒ Физико-химические показатели качества. В монографию заложен баланс между критериями приемлемости в виде численных пределов/диапазонов и в формулировке «как одобрено компетентным органом». Для нескольких из показателей качества в монографии нет критериев приемлемости в численном выражении, поскольку невозможно установить универсальную спецификацию для показателей, зависящих от процесса производства, таких как профили гликозилирования и вариантов с разными зарядами.
То же распространяется и на зависящие от процесса примеси, которые берут свое начало от этапов процесса с подготовки сырья до завершения ферментации, а именно на полученные из клетки-хозяина белки и производную от клетки-хозяина или векторную ДНК, и от этапов выделения и очистки целевой субстанции (остаточный белок А). Критерии приемлемости для содержания белков (указаны в разделе с определением) также выражены формулировкой «как одобрено компетентным органом», чтобы избежать ситуации, в которой возможное лекарственное средство с более низкой концентрацией будет признано несоответствующим.
Спецификации в монографии на составы гликозилирования связаны с конкретными семействами гликанов, а именно нефукозилированными, фукозилированными и сиалилированными гликанами, которые выделены на основании пакета данных, предоставленного производителем. Отсутствие фукозы в ядре гликана — актуальный параметр для обеспечения качества, безопасности и эффективности лекарственного средства, тогда как сиалилирование для большинства антител не обязательно считается критическим показателем качества (CQA). Учитывая, что в монографии дается набор ключевых требований (не обязательно ограничивающихся критическими показателями качества, как они определяются в руководстве ICH Q8(R2) «Руководство по фармацевтической разработке»), упоминание фукозилированных и сиалилированных гликанов было сочтено важным, поскольку они являются частью общего профиля гликанов и показателями единообразия качества лекарственного средства.
Подобные соображения распространяются и на включаемые в монографию спецификации на варианты с разными зарядами. Гетерогенность заряда обычно соотносится с единообразием производства: изменения характера гетерогенности заряда могут указывать на изменения однородности серии. Группирование вариантов с разными зарядами, которые обычно упоминают как кислотные или щелочные, зависит от процесса производства. Типовой профиль инфликсимаба состоит из шести изоформ с разными зарядами (они определяются как родственные ЛС примеси).
Подход суммирования отдельных изоформ основан на группировочных критериях, а именно: кислотные с заряженными гликанами (виды с различиями в деамидировании), основные + щелочные несиалилированные (виды с различным количеством C-концевого лизина), щелочные с заряженными гликанами (виды, несущие 2 C-концевых лизина).
Было доказано, что применяемый в монографии подход с группированием одинаково хорошо подходит для всех препаратов инфликсимаба, которые проходили испытания в совместном исследовании для ее разработки, с замечанием, что могут быть разные способы представления пределов.
С другой стороны, критерии приемлемости для родственных лекарственному средству примесей (а именно вариантов с высоким/низким молекулярным весом, обнаруженных с помощью эксклюзионной хроматографии) и родственных белков (молекул, отличающихся от вариантов с тяжелыми и легкими цепями, которые выявлены с помощью капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях, и отличающихся от IgG в неизменном состоянии, которые выявлены с помощью капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в невосстанавливающих условиях) выражаются в форме численных пределов. Определение в монографии пределов для этих показателей качества было сочтено приемлемым. То же применимо и к специфической активности, выраженной как удельная, для которой численный диапазон дается в разделе монографии, посвященном определениям.
И наконец, для пептидного картирования критерии приемлемости строгие, в результате чего обязательно получить хроматограммы, совпадающие с пептидной картой CRS. Не должно быть гетерогенности в каркасе белка, а последовательность аминокислот нужна такая же, как и у всех препаратов инфликсимаба (ни один из выбранных маркерных пиков на пептидной карте не должен ассоциироваться с вариабельностью C-концевого лизина).
Важно, что роль пептидного картирования в монографии — не обеспечить полное раскрытие первичной структуры белка, что обычно делается с помощью комбинации или диапазона ортогональных техник, а установить подлинность и получить прямые данные о последовательности на основании специфических характерных признаков (избранных маркерных пиков).
‒ Биологическую активность инфликсимаба можно разделить на две составляющих: первичный механизм действия предполагает мишень-специфическое связывание доменом Fab (связывающий антигены фрагмент); вторичный — опосредованные иммунитетом эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), осуществляемые путем взаимодействия домена Fc с рецепторами на разных типах клеток. Инфликсимаб действует как конкурентный ингибитор растворимого ФНО-альфа и с высокой степенью сродства связывается как с растворимыми, так и с трансмембранными формами ФНО-альфа. Инфликсимаб предотвращает активацию рецептора ФНО-альфа, путем связывания с ФНО-альфа, и тем самым нейтрализует биологическую активность ФНО-альфа.
В монографии определены строгие требования к удельной активности (в разделе «Определение»), выражаемой как специфическая активность (по нейтрализации ФНО-альфа) в международных единицах на мг белка.
Удельная активность определяется в соответствии с разделом монографии «Количественное определение» по количеству белка, оцененному с помощью УФ спектроскопии на длине волны 280 нм с использованием удельной оптической плотности и специфической активности, установленных в количественном определении биологическим методом по сравнению с биологическим стандартным образцом Инфликсимаба, калиброванным в международных единицах. Кроме того, в монографии соблюдение требований, расписанных в разделах «Количественное определение»/ «Специфическая активность», вместе с установленными с помощью пептидного картирования характерными признаками белка, служит критерием определения подлинности.
Спецификации на специфическую активность установлены в монографии гибко. Требуется провести подходящее количественное определение на базе клеток, опирающееся на активность инфликсимаба по ингибированию биологической активности ФНО-альфа (с подходящим считыванием результатов, чтобы оценить ингибиторное действие), с калибровкой по биологическому стандартному образцу Инфликсимаба. Это позволяет создать условия для разных версий количественного определения нейтрализации ФНО-альфа, которые обычно применяются в качестве предварительного количественного определения специфической активности инфликсимаба биологическим методом.
В качестве примера приведено специальное количественное определение цитотоксичности на основе клеток WEHI-164 со считыванием результата по тетразолиевому окрашиванию. В данном примере описаны инструменты для подтверждения рабочих характеристик метода и определены критерии пригодности системы на основании биологического стандартного образца Инфликсимаба и специфических контрольных мер. Все это делает представленную методологию робастной. Вместе с вышеуказанными даются отдельные критерии приемлемости (в виде численного диапазона) для оценок относительной специфической активности.
«Все вместе рассмотренные элементы обеспечивают средства для повышения гибкости монографии в четко прописанных условиях. Этот подход принимает во внимание молекулярную сложность и отражает соответствующий набор ожиданий, который, теоретически, применим в качестве универсального и совместим с разработкой биоподобных препаратов7. Проделанная работа потребовала от группы экспертов и от лаборатории EDQM значительных усилий, поэтому для поиска оптимального пути для установления официальных стандартов так важно тесное сотрудничество с представителями фармацевтической отрасли».
2.1.3.3 Монографии в сравнении с требованиями спецификации для выпуска лекарственных средств
• Испытания для изучения характеристик, приспособленные для монографии
Основой для разработки монографии стали одобренные производителем спецификации, которые состоят из набора специально предназначенных для лекарственного средства методик испытаний и критериев приемлемости, тщательно подобранных на основании имеющейся определенной стратегии контроля. Однако эти спецификации могут не охватывать всех ключевых показателей качества антитела, и поэтому для официального стандарта их может быть недостаточно.
Пример этому — пептидное картирование, которое для выпуска серий терапевтических моноклональных антител обычно не рассматривается. Однако пептидное картирование (в комбинации с (тандемной) масс-спектрометрией) — очень важная техника для изучения характеристик первичной структуры; в комбинации с ортогональными техниками это часть обширного изучения характеристик фармацевтической субстанции и готового препарата физико-химическими методами, а также исследований стабильности. Рабочая группа по моноклональным антителам сочла, что пептидное картирование — ключевой метод анализа для подтверждения первичной структуры, и поэтому его нужно включить в список испытаний на подлинность в монографии.
В монографии использование карты триптических пептидов в формате качественного инструмента анализа не требует полной характеризации отдельных пептидных пиков и полного выяснения первичной структуры с целью 100% охвата последовательности белка. Но там есть требование идентифицировать специфические характерные признаки путем сравнения «отличительных пептидов» с теми, что получены с использованием специально предназначенного CRS, следовательно, предполагается получение совпадающих профилей на хроматограммах (с точки зрения количества пиков, относительного удерживания, площади пиков и соотношения площадей пиков). Требования к пригодности системы по маркерным пикам («отличительных пептидов») обычно касаются качественного подобия хроматограмм (т. е. с точки зрения характера элюирования в целом, количества пиков, показателей относительного удерживания, отсутствия дополнительных пиков), полученных в испытании со стандартным образцом и поставляемых с CRS.
Кроме того, для понимания структуры белка и определения в монографии подходящего набора требований к качеству требуются данные, собранные при изучении характеристик первичной структуры (часть пакета документов для подачи в регуляторные органы), в том числе степень охвата последовательности, структурная подлинность и сопоставление пиков с их источниками для значимых фрагментов пептидов с помощью масс-спектрометрии. Эти данные используются только в поддержку верификации метода, в свете установления надлежащих критериев для рабочих характеристик метода и для принятия результатов, без адаптации для применения в разработке монографии.
• Знание лекарственного средства
Понимание, какие характеристики ЛС затрагивают качество, эффективность и безопасность и какие методы нужны, чтобы их отслеживать, сильно зависит от наличия достаточного количества знаний, в том числе и от изучения характеристик ЛС. В монографии это может быть отражено в разделе «Производство» в виде общих положений, ссылающихся на важные показатели качества, которые нужно отслеживать по мере того, как идет разработка и процесс производства лекарственного средства. Например, анализ гликозилирования инфликсимаба обычно предполагает применение ряда новейших методов, в том числе анализ сайт-специфического гликозилирования для определения диапазона гликановых структур, наблюдаемого в сайте Asn300, в сочетании с анализом моносахаридов и оценкой типа или количества сиаловых кислот, находящихся на концах этих гликановых структур. Все это обычно входит в состав тщательных исследований характеристик. Кроме специализированных требований к анализу N-гликанов / профилированию олигосахаридов, было сочтено очень важным включить в монографию общее требование по единообразию ожидаемой степени заполнения сайтов N-гликозилирования, которые определяются с использованием подходящих, прошедших квалификацию методов количественного определения.
Включить количественное определение специально для эффекторных функций, опосредованных Fc-областью, которые, вместе со связыванием ФНО-альфа и нейтрализацией ФНО, являются составляющими биологической активности инфликсимаба (обычно проводится в ходе исследований по определению биологических характеристик), было невозможно по техническим причинам. Поэтому в раздел «Производство» вставили общее требование: «В ходе разработки лекарственного средства обязательно с помощью прошедших соответствующую квалификацию методов количественного определения доказать, что процесс производства неизменно дает продукт с ожидаемой степенью заполнения сайтов N-гликозилирования и опосредованными Fc-областью эффекторными функциями (антителозависимой и комплементзависимой клеточной цитотоксичностью)».
2.1.3.4 Верификация метода анализа
Несмотря на то, что методики анализа, предложенные для включения в монографию, прошли валидацию и признаны робастными в соответствии с руководством ICH Q2(R1) «Валидация методик анализа: текст и методология» (производитель предоставил данные по валидации для разработки монографии), нужно подтвердить их робастность и пригодность к переносу и к использованию в качестве фармакопейного стандарта. Кроме того, предоставленная производителем информация по верификации робастности метода позволяет определить набор ключевых параметров и предположить, какие будут технические проблемы.
Разнообразие и сложность методик анализа для включения в монографию на Инфликсимаб были объектом тщательного аналитического тестирования, которое потребовало большой работы в лаборатории для верификации метода. Это совместное исследование дало устойчивую научную базу для оценки данных, основанную на робастном межлабораторном сравнении, а также важные знания для улучшения понимания, какую информацию надо включить в официальный стандарт (см. ответ об исследовании №PA/PH/Exp. MAB/T (16) 6).
• Робастность и пригодность метода для передачи
Робастность методики анализа — это «то, насколько методика может оставаться неизменной при небольших, но намеренных вариациях параметров метода; робастность указывает на надежность методики при нормальном использовании». Кроме того, в руководстве ICH Q2(R1) уточняется, что хотя робастность и не входит в таблицу стандартных характеристик методики для валидации, которые следует рассматривать, ее следует «принимать во внимание на соответствующей стадии разработки методики анализа».
Робастность метода жидкостной хроматографии, при котором применяются обычные колонки, зависит от ряда переменных, таких как подготовка пробы, состав подвижной фазы, параметры колонки (например, производитель, тип, партия, скорость потока, pH, температура, колонка, длина волны детектирования, состав подвижной фазы, градиент и т.д.). При этом с точки зрения требуемых методологии и ресурсов оценка робастности достаточно прямолинейна. Если же такой хроматографический метод применяется в сочетании с восстановлением, этапами алкилирования и последующим протеолитическим расщеплением (пептидное картирование), или с ферментативным высвобождением и химическим мечением гликанов (гликановый анализ), или с этапами алкилирования +/- восстановление (капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях), то тестирование на робастность становится более сложным и трудоемким. В этом случае, возможно, придется учитывать специфические параметры, связанные с особенностями используемых реактивов для восстановления или алкилирования, со временем и температурой инкубации, количествами и концентрациями, критичностью фермента (источник, активность).
Робастность не обязательно проверяется в специально разработанном для этого эксперименте. Этот параметр, скорее, оценивают непрерывно в ходе разработки метода, учитывая модификации и улучшения, которые вносятся за это время, и опыт, накопившийся при применении метода до итоговой валидации.
Более того, робастность предназначается для учета параметров, для которых «небольшие вариации» вероятны «при нормальном использовании», следовательно, нельзя ожидать от производителя, что он проверит свой метод на робастность на другом оборудовании, с ключевыми реактивами и расходниками из разных источников. Например, в участвующих в совместном исследовании лабораториях во время верификации метода для инфликсимаба использовали разное оборудование компании «Бекмен Культер» для капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (модели PA800+ и P/ACE MDQ 2).
Даже если производитель валидировал методики анализа и если проверена их робастность, опыт Рабочей группы по моноклональным антителам показывает, что перенос метода из лаборатории по контролю качества производителя в одну из OMCL требует сложной работы. Она подразумевает подстройку первоначальных условий для нескольких параметров до того, как удастся получить валидные результаты (например, это модификация первого этапа разбавления в подготовке пробы для пептидного картирования). На данный момент важнейшую роль в обеспечении полноты информации, необходимой для разработки монографии, своевременного рассмотрения технических вопросов и практических решений для соответствующего улаживания технических деталей являются тесное сотрудничество и регулярный обмен информацией с производителем.
• Содержание белка
Согласно данным от производителя, предпочтительным методом для оценки содержания белка является «Метод №1» (определение при длине УФ волны 280 нм), описанный в общей статье Евр. фарм. №2.5.33 «Общее содержание белка». Содержание белка вычисляется с использованием теоретического (прогностического) молекулярного коэффициента поглощения; это новый подход, он отличается от обычного, описанного в монографии, который предполагает определение содержания белка с использованием специально предназначенного для лекарственного средства CRS с указанным содержанием.
• Количественное определение биологическими методами
Методы биологического анализа, основанные на клетках, считаются одними из самых сложных аналитических процедур, в том числе сложен перенос метода. Экспериментальная верификация биологического метода количественного определения инфликсимаба была сложным, ресурсозатратным и напряженным делом. Верификация, как таковая, может считаться полноценным проектом сама по себе. Она требует тщательного оценивания критических параметров и источников вариации (например, это серии разведений, специфические реактивы (например, ФНО-альфа, клетки из определенных серий), наборы для колориметрии из различных коммерческих источников). Все это помогло установить подходящий набор критериев качества работы метода в монографии и обеспечило условия, чтобы все элементы, которые вносят свой вклад в рабочие характеристики метода были стабильными и контролировались.
2.1.3.5 Стандартные образцы
В монографии на Инфликсимаб упоминаются CRS (стандартная химическая субстанция) и BRP (стандартный биологический препарат) Инфликсимаба. CRS Инфликсимаба не предполагается применять для определения содержания действующего вещества, она создавалась для качественных испытаний, а именно для определения пригодности системы и для идентификации пиков. CRS требуется для следующих описанных в монографии испытаний: гликановый анализ (раздел «Производство»), варианты с разным зарядом методом изоэлектрического фокусирования (раздел «Производство»), варианты с разным зарядом методом жидкостной хроматографии (раздел «Производство»), пептидное картирование («Подлинность B), родственные белки методом капиллярного электрофореза как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях (раздел «Испытания»), примеси с молекулярными массами не как у инфликсимаба методом эксклюзионной хроматографии (раздел «Испытания»). CRS Инфликсимаба выпускается по 89 мг на флакон и предназначается в помощь практическому осуществлению физико-химических методик, описанных в монографии.
В одно время с разработкой монографии на Инфликсимаб ВОЗ приняла предложение установить первый международный стандартный образец Инфликсимаба. Это дало основание для совместной работы EDQM и ВОЗ в лице Государственного института биологических стандартов и контроля Великобритании с целью обеспечения совместимости стратегий двух организаций. В результате было организовано совместное исследование ВОЗ и EDQM для одновременного установления первого международного стандартного образца Инфликсимаба от ВОЗ и первого стандартного биологического препарата Инфликсимаба от Евр. фарм. Важно, что участие производителей в совместном исследовании дало возможность подтвердить соответствие ЛС перспективному BRP и облегчить подведение итогов данного исследования.
BRP Инфликсимаба предназначается для использования в количественном определении специфической активности в соответствии с монографией (в качестве показателя рабочих характеристик количественного определения (пригодности системы)), а также для оценивания относительной специфической активности. BRP состоит из лиофилизированного инфликсимаба и имеет приписанную специфическую активность в 500 МЕ активности по нейтрализации ФНО-альфа на ампулу, как и у соответствующего международного стандартного образца.
В качестве общего замечания: установление CRS/BRP опирается исключительно на предоставление перспективных материалов производителями. Поэтому важным условием для дальнейшей разработки монографий является обеспечение заинтересованности компаний на ранних этапах данного процесса (предпочтительно в самом начале разработки). Кроме того, стратегию по CRS/BRP необходимо первоначально рассмотреть на достаточно раннем этапе и адаптировать на более позднем, то есть на основе результатов верификации метода. Следует учитывать, какое количество материала нужно от производителя (это может быть значительная часть производственной серии), а также возможность поддерживать запас на протяжении срока службы монографии.
2.1.4. УЧАСТИЕ ЗАИНТЕРЕСОВАННЫХ СТОРОН
Достижения, сделанные на этапе поисковой фазы разработки монографий на моноклональные антитела, представляют собой результат совместно реализуемого, динамического и прозрачного процесса, основанного на комплексном взаимодействии всех заинтересованных сторон. Прежде всего, Рабочая группа по моноклональным антителам осуществляет функцию платформы для многостороннего взаимодействия и обсуждений. В Рабочей группе участвует равное количество представителей от производителей инновационных и биоподобных лекарственных препаратов, лабораторий OMCL и NCL, а также от регуляторных органов, что отражает возможности для позитивного взаимодействия заинтересованных сторон и, благодаря партнерству и взаимопониманию, уравнивает ожидания регуляторных органов и производителей. В ходе поисковой фазы по разработке монографий на моноклональные антитела, Рабочая группа по моноклональным антителам претерпевала интенсивные изменения за счет возросшего и разностороннего взаимодействия, отражающего внимание и готовность заинтересованных сторон к активному участию в этом важном направлении работы Европейской Фармакопеи.
Сотрудничество, которое поддерживалось между EDQM и производителями инфликсимаба на всех этапах разработки и написания монографии, было необходимым для получения положительных результатов в исследовании данного препарата. Огромное значение имеет как можно более раннее вовлечение заинтересованных сторон в работу Европейской фармакопеи – как показывает опыт, ключевые участники вникали в процесс разработки монографии, положительно реагировали на предложения к участию в данном процессе и предоставляли техническую поддержку по установления официального стандарта. После признания инфликсимаба быстро развивающейся целью, появилась необходимость в обновлении монографии с учетом недавно одобренных препаратов. Производители инфликсимаба поделились знаниями и опытом, необходимыми, чтобы заполнить пробел (вызванный неспособностью обеспечить обратную связь на этапе публикации в «Pharmeuropa») между монографией ЕФ и спецификациями, одобренными ЕФ, на два биоподобных препарата, которые были зарегистрированы во время разработки монографии.
Коммуникация – это ключ к успеху в продвижении поисковой фазы разработки монографии на моноклональное антитело. Оценка предварительных результатов этой фазы осуществляется с помощью различного рода обсуждений с заинтересованными сторонами, которые проводятся на протяжении всего процесса. Для получения мнения заинтересованных сторон относительно пригодности и полезности монографии на «Инфликсимаб» («Pharmeuropa», выпуск 28.4, октябрь-декабрь 2016 года), в рамках мероприятий EDQM, посвященных выпуску новых изданий Европейской фармакопеи (в сентябре 2016 в Таллине и в июне 2019 года в Страсбурге) был организован открытый опрос и были проведены специальные семинары по установлению фармакопейных стандартов для биотерапевтических препаратов. Данные мероприятия помогли дать критическую оценку поисковой фазе разработки и послужили основой для дальнейшего рассмотрения и одобрения Комиссией Европейской фармакопеи.
В рамках своей постоянной приверженности обеспечению процесса эффективной коммуникации и доступности для пользователей, EDQM опубликовал новостные материалы, сопровождающие выход проекта монографии на «Инфликсимаб» на сайте «Pharmeuropa», а также утверждение и публикацию монографии в Европейской фармакопее. Принимая регулярное участие в международных конференциях, EDQM предложил дорожную карту и основные этапы поисковой фазы по разработке монографий на моноклональные антитела, а также наладил контакт с соответствующими заинтересованными сторонами. Помимо этого, EDQM подготовился сделать дальнейший вклад с учетом меняющихся потребностей и ожиданий, которые также необходимо учитывать (например, на семинаре DIA CMC в Женеве в июне 2018 года, на Фармакопейной конференции PDA в Вене в мае 2018 года и на Фармакопейной конференции PDA в Женеве в мае 2019 года). Работа и достижения Комиссии Европейской фармакопеи, связанные с разработкой монографии на инфликсимаб, были весьма высоко оценены пользователями.
2.1.5. «ГОРИЗОНТАЛЬНЫЕ» СТАНДАРТЫ – ТЕКУЩИЙ СТАТУС РАБОТЫ
Одобрение и публикация монографии Европейской фармакопеи «Инфликсимаб, концентрированный раствор» (2928) – первой монографии на терапевтическое моноклональное антитело – положили основу использованию подхода «снизу-вверх» относительно выработки общих требований/методологий и требований к классам и (под-)классам лекарственных средств. Текущая работа посвящена заполнению следующего уровня подхода «снизу-вверх» путем разработки горизонтальных стандартов, которые будут применяться к большому разнообразию лекарственных средств.
Лекарственные препараты «Этанерцепт» – слитый белок, состоящий из рецептора-2 фактора некроза опухоли (ФНО) и фрагмента Fc иммуноглобулина человека IgG1 – «Цертолизумаба пегол» – пегилированный Fab’-фрагмент – и «Голимумаб», «Инфликсимаб» и «Адалимумаб» – лекарственные препараты на основе человеческого иммуноглобулина IgG1 – принадлежат к классу ингибиторов ФНО-а; механизм их действия заключается в связывании с цитокином ФНО и подавлении его связи с рецепторами ФНО. Помимо некоторых специфических для IgG1параметров качества, данные лекарственные препараты обладают общими функциональными характеристиками с точки зрения механизма их действия и нейтрализующей активности в отношении ФНО-а, которую можно исследовать с помощью разных клеточных анализов.
Помимо исследования на примере инфликсимаба, получению фундаментальных знаний и лучшему пониманию потребностей стандартизации в области анализов нейтрализации ФНО-а способствовала разработка Рабочей группой P4Bio надежного метода биоанализа для «Этанерцепта». Эти достижения использовались в дальнейшем при разработке стратегии создания клеточных анализов для определения активности антагонистов ФНО-а, которая в настоящее время разрабатывается Рабочей группой по моноклональным антителам.
Для экспериментального подтверждения различных моделей количественного анализа – основанных на использовании разных клеточных линий – наиболее часто применяемых для оценки ингибирующего действия на ФНО-а, было проведено совместное исследование. Исследование, нацеленное на оценку пригодности методов анализа, которые рассматриваются как кандидаты для использования в качестве универсальных методов стандартного определения активности антагонистов ФНО-а:
Исследование проводилось девятью участвующими лабораториями (включая лаборатории OMCL, NCL, а также лаборатории EDQM) с использованием общего лабораторного регламента, разработанного на основе валидированных методик и технической информации, которые предоставляются производителями при подаче комплекта данных. Оценка различных моделей анализа проходила с использованием разных моноклональных антител, представителей семейства ингибиторов ФНО-а и соответствующих референтных препаратов (т.е. биологических стандартных препаратов (BRP), также как и внутренних стандартных образцов). Исследование потребовало комплексной исследовательской работы и привлечения значительных ресурсов (один анализ подразумевает использование 24-луночных планшетов и занимает приблизительно 7-8 недель, в течение которых производится достаточное количество повторов испытания); в результате был собран внушительный объем данных, которые в настоящее время проходят статистическую оценку, что поможет сделать заключение о результатах исследования и обеспечит необходимыми элементами для составления главы.
Также проводится работа по выработке общих требований и методологий для проведения физико-химических испытаний для различных моноклональных антител с целью разработки широко применяемых методик и обобщенных критериев эффективности методов, поддерживаемых использованием специальных стандартных образцов. Рационализация таких методов сможет обеспечить улучшения в области стандартизации различных препаратов, как находящихся в обращении, так и разрабатываемых.
Универсальные методы капиллярного электрофореза для проверки однородности моноклональных антител по заряду
Достигнут прогресс в организации совместного исследования в рамках 1 фазы испытаний на основе общего лабораторного протокола. Исследование нацелено на оценку эффективности и пригодности предлагаемой процедуры капиллярного изоэлектрического фокусирования для отобранного набора образцов.
Универсальные методы эксклюзионной хроматографии для определения высокомолекулярных соединений в моноклональных антителах
Изначально обсуждения проходили внутри Рабочей группы по моноклональным антителам с целью определения стратегии испытаний. Текущая работа ориентирована на определение подходящих в качестве претендентов процедур, основанных на общедоступных знаниях о технологиях эксклюзионной хроматографии, и на установление исследования целесообразности.
В настоящее время данный пункт находится в стадии обсуждения: методологическая подгруппа работает над получением опыта, определением нужд и путей дальнейшего продвижения, которые будут одобрены Рабочей группой по моноклональным антителам.
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПРЕДЛАГАЕМЫЕ ПУТИ ПРОДВИЖЕНИЯ
Помимо исследования на примере «Инфлексимаба», в ходе которого были получены важные данные о целесообразности и первое подтверждение концепции, поисковая фаза разработки монографий на моноклональные антитела также предоставила возможность продвинуться вперед в понимании проблем, связанных со стандартизацией. С этой связи, стала очевидной необходимость в реализации поэтапного подхода за счет накопления опыта с помощью исследования конкретных лекарственных препаратов для решения общих, пересекающихся вопросов. Ввиду разнообразия и высокой сложности получения моноклональных антител, сложно представить, что поисковая фаза закончится написанием одной общей статьи. Помимо развития горизонтального стандарта, необходимой мерой для продвижения вверх по кривой обучения является продолжение поисковой фазы и дальнейшая разработка монографий, что, как следствие, способствует выработке стратегий для разработки официальных стандартов в сфере моноклональных антител.
Заменено недавним Руководством EMA по разработке, производству и изучению характеристик моноклональных антител и родственных ЛС и по спецификациям на них (EMA/CHMP/BWP/532517/2008), действующим с 2016 года.
Слитый белок.
Обе заявки на регистрацию были поданы на биоподобный препарат инфликсимаба; одна — компанией «Хоспира» (Инфлектра), а другая — компанией «Селтрион» (Ремсима).
Инфликсимаб — химерное мышино-человеческое IgG1 моноклональное антитело к фактору некроза опухоли-альфа (ФНО-а) с гомодимерной структурой, двумя легкими цепями, каждая из которых включает 14 аминокислот с 5 остатками цистеина, и 2 тяжелыми цепями, каждая из которых состоит из 450 аминокислот с 11 остатками цистеина; все остатки цистеина в тяжелых и легких цепях вовлечены интра- или интер-дисульфидное связывание. Как и другие подклассы IgG, инфликсимаб — гликопротеин с одним N-связанным сайтом гликозилирования (аспарагин 300) в домене CH2 каждой из тяжелых цепей и с несколькими гликоформами. Инфликсимаб действует как конкурентный ингибитор растворимого ФНО-а, с высокой аффинностью связывается как с растворимой, так и с трансмембранной формой ФНО-а. Путем связывания с ФНО-а Инфликсимаб не дает активировать рецептор ФНО-а, нейтрализуя тем самым биологическую активность фактора некроза опухоли.
Исследование одобрено Комитетом экспертов ВОЗ по биологической стандартизации (ECBS) в октябре 2016 года.
В общей статье Евр. фарм. №2.2.59 «Гликановый анализ гликопротеинов» даются рекомендации по методикам гликанового анализа. Это анализ целого гликопротеина, гликопептидов, высвобожденных гликанов; анализ моносахаридов; использование стандартных образцов для проверки пригодности системы и подтверждения, что испытуемый образец соответствует указанным требованиям.
Выводы, сделанные в ходе разработки монографии на Инфликсимаб, были включены в пересмотренную версию Технического руководства по разработке монографий на синтетические пептиды и белки, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК (2018 г.), которое теперь содержит новый раздел «Гибкость», где приведены мысли, касательно подхода к работе с комплексными молекулами.