Руководство по терапии соматическими клетками человека и генной терапии

Руководство по терапии соматическими клетками человека и генной терапии

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОР (1998)

Руководство по терапии соматическими клетками человека и генной терапии

ОБЗОР (1998)

С момента издания «Вопросов, связанных с терапией соматическими клетками человека и генной терапией» (РТС) в 1991 г. тематика разработок по генной терапии расширилась и теперь включает новые классы векторов и виды применения векторов in vivo посредством прямого введения векторов пациентам. Данное руководство заменяет собой РТС 1991 г. и содержит новую информацию, которая знакомит производителей с текущими регуляторными представлениями о производстве, контроле качества и применения рекомбинантных геннотерапевтических векторов, а также о доклинических испытаниях как для препаратов клеточной терапии, так и для векторов. Данные руководящие указания не являются нормативными требованиями, а скорее рассматривают те аспекты, которые сотрудники Центра экспертизы и исследования биопрепаратов (CBER) считают нужным исследовать в настоящее время.

В данном документе не рассматриваются вирусные препараты и препараты ДНК, используемые в качестве профилактических вакцин, хотя связанные с ними вопросы частично пересекаются с темами, рассматриваемыми в данном руководстве. Отдельные руководства по применению плазмидных препаратов для профилактики инфекционных заболеваний разработаны Подразделением по исследованию и экспертизе вакцин CBER (301) 594-2090. Одним из основных документов являются «Вопросы, связанные с вакцинами на основе плазмидных ДНК, используемыми для профилактики инфекционных заболеваний (декабрь 1996)», (61 FR 68269). На терапию соматическими клетками оказывают влияние меняющиеся критерии диагностики инфекционных заболеваний. Информация по этой теме представлена в следующих документах:

Вопросы, связанные с производством и испытаниями терапевтических препаратов для применения у человека, полученных от трансгенных животных, (8/22/95), (60 FR 44036);

Руководство Службы общественного здравоохранения (PHS) по вопросам передачи инфекционных заболеваний при ксенотрансплантации, август 1996 г. (61 FR 49920) и январь 1997 г. (62 FR 3563);

Руководство по применению препаратов, состоящих из живых аутологичных клеток, прошедших обработку ex vivo, и предназначенных для заживления или восстановления структурных повреждений» (май, 1996), 28 мая 1996 г., (61 FR 26523).

Предлагаемый подход к регулированию препаратов на основе клеток и тканей, 28 февраля 1997 г., (62 FR 9721).

I. ВВЕДЕНИЕ

A. Определение терапии соматическими клетками и генной терапии

В последнее время стали использоваться и разрабатываться различные инновационные виды терапии, связанные с обработкой соматических клеток ex vivo и их последующим введением в человеческий организм. Терапия соматическими клетками – это введение в человеческий организм аутологичных, аллогенных или ксеногенных живых клеток, измененных или обработанных ex vivo. Производство препаратов, предназначенных для терапии соматическими клетками, включает выращивание, размножение и селекцию клеток ex vivo (см. «Предлагаемый подход к регулированию препаратов на основе клеток и тканей, 28 февраля 1997 г., (62 FR 9721), или фармакологическую обработку клеток, или же другие изменения их биологических характеристик. Подобные клеточные препараты могут также использоваться в диагностических или профилактических целях. Производителям следует изучить существующие подходы и руководства, чтобы узнать, как происходит регулирование определенного препарата для терапии соматическими клетками или генной терапии.

Недавно также начали использоваться и разрабатываться различные инновационные виды терапии, связанные с введением в человеческий организм соматических клеток. В контексте данного руководства термин «терапия соматическими клетками» означает введение в человеческий организм аутологичных, аллогенных или ксеногенных живых незародышевых клеток (не являющихся трансфузионными препаратами крови) в терапевтических, диагностических или профилактических целях.

Генная терапия представляет собой медицинское вмешательство, основанное на модификации генетического материала живых клеток. Клетки могут модифицироваться ex vivo для последующего введения в организм человека или могут подвергаться изменениям in vivo посредством прямого воздействия генной терапии на субъекта. Если генетические манипуляции осуществляются ex vivo с клетками, которые впоследствии вводятся пациенту, то это также одна из форм терапии соматическими клетками. Генетические манипуляции могут предназначаться для оказания терапевтического или профилактического действия, или же могут использоваться для маркировки клеток с целью их дальнейшей идентификации. Материалы рекомбинантной ДНК, используемые для переноса генетического материала, считаются компонентами генной терапии и поэтому подлежат регуляторному контролю.

В данном документе не рассматриваются генетические манипуляции, используемые для модификации половых клеток.

B. Виды терапий

Примерами терапии соматическими клетками могут служить: имплантация клеток, служащих физиологическим источником молекул, например, ферментов, цитокинов или факторов коагуляции; введение активированных лимфоцитов, например, лимфокин-активированных клеток киллеров и проникающих в опухолевые ткани лимфоцитов (этот вопрос рассматривается в отдельном документе, на который дается ссылка ниже); и имплантация обработанных клеточных популяций, например, гепатоцитов, миобластов или клеток панкреатических островков, предназначенных для выполнения комплексной биологической функции.

Изначально генная терапия подразумевала под собой изменение и введение пациентам соматических клеток. Однако используются и другие подходы к генной терапии, например, прямое введение пациентам ретровирусных векторов или других форм генетического материала. Рассмотренные ниже вопросы относятся ко всем используемым методам, хотя набор испытаний может варьироваться.

Доставка клеток в терапевтических целях может осуществляться различными способами. Например, они могут вводиться посредством внутривенных вливаний, инъекций в различные сайты или имплантироваться хирургическим путем в агрегированной форме или вместе с твердой основой или инкапсулирующими материалами. Любые матрицы, волокна, гранулы и другие материалы, используемые в качестве дополнения к клеткам, могут быть отнесены к вспомогательным веществам, дополнительным активным компонентам или медицинским изделиям.

Ввиду сложностей, связанных с возможным взаимодействием дополнительных компонентов с клетками и другими компонентами, их следует рассматривать как часть готового биологического препарата при проведении доклинической оценки.

C. Регуляторные вопросы

Все препараты генной терапии и большинство препаратов для терапии соматическими клетками регулируются FDA. См. «Предлагаемый подход к регулированию препаратов на основе клеток и тканей, 28 февраля 1997 г., (62 FR 9721), а также последующие нормативные документы, опубликованные по этой теме.

Заявки IND (прим. IND – заявка на допуск нового экспериментального препарата к клиническим исследованиям) на препараты терапии соматическими клетками и препараты генной терапии должны составляться в соответствии с тем же форматом и содержать те же разделы, что и заявки IND на любые экспериментальные биологические препараты, согласно требованиям, описанным в Статье 21 Кодекса федеральных постановлений (21 CFR) 312.23. Формы и руководства можно запросить в CBER по телефону, факсу или электронной почте, указанным в конце документа. Набор необходимых для предоставления данных будет зависеть от системы испытаний и фазы исследования. Для тех видов терапии, которые подразумевают включение результатов генетического тестирования в критерии отбора пациентов, следует указывать в IND данные о методике тестирования и ее валидации.

Биологические препараты часто представляют собой сложные соединения, которые бывает невозможно полностью охарактеризовать. Поэтому необходимо контролировать процесс производства и качество готового продукта. Недостаточный контроль производственного процесса может привести к контаминации биологического препарата занесенными агентами или другими загрязняющими веществами, или к неумышленному изменению его свойств или стабильности, что бывает сложно распознать при испытании готового препарата. Поэтому следует указывать все методики и реактивы, используемые в процессе производства. А также следует контролировать банки клеток и основные промежуточные продукты. Следует изучить посерийную воспроизводимость как готового препарата, так и основных материалов, например, супернатантов, содержащих вектор. Рекомендуется ознакомиться с действующими общими постановлениями (21 CFR 210, 211, 312, и 600) для получения дополнительной информации.

Поисковые исследования фазы I для препаратов терапии соматическими клетками и препаратов генной терапии должны основываться на данных, обеспечивающих достаточную безопасность и целесообразность. На ранних этапах поисковых исследований может предоставляться меньший объем данных, чем на более поздних стадиях разработки препарата, особенно если речь идет о серьезных или опасных для жизни заболеваниях. При рассмотрении данных, обосновывающих начало исследований фазы I, основное внимание уделяется безопасности, однако следует также предоставить краткое обоснование целесообразности.

Данные о дальнейших испытаниях препарата должны предоставляться на более поздних стадиях разработки препарата. Следует разработать количественный анализ активности, отражающий биоактивность препарата in vivo, а также изучить стабильность препарата, для того чтобы гарантировать его целостность. Для лицензирования препарата, помимо данных о безопасности, необходимы также данные о клинической эффективности.

Если в процессе разработки препарата его состав подвергается изменениям, следует провести сравнение разных вариантов состава при помощи количественного анализа биологической активности и, при необходимости, провести оценку доклинической безопасности. Если препарат, используемый в более поздних фазах исследования, существенно отличается от препарата, применяемого в ранних фазах, и если результаты ранних исследований играют важную роль для оценки готового препарата, следует продемонстрировать сопоставимость препаратов или следует рассмотреть необходимость повторения проведенных ранее исследований (см. «Руководство FDA по демонстрации сопоставимости биологических препаратов для применения у человека, в том числе терапевтических биотехнологических препаратов» 4/26/96, (61 FR 10426)).

Если информацию о векторе планируется включить в несколько разных заявок IND, можно предоставить производственную информацию в мастер-файле, чтобы упростить процесс представления данных. Ни сам мастер-файл, ни описываемый в нем препарат не могут быть «одобрены» или «не одобрены». Мастер-файл просто содержит информацию и данные, дополняющие IND. Использование одного и того же препарата для разных популяций пациентов может требовать рассмотрения разных вопросов или может быть связано с различными уровнями приемлемости риска, но использование мастер-файла поможет определить общие вопросы и упростить их эффективное решение. Спонсоры нескольких заявок IND смогут ссылаться на мастер-файл, что позволит сократить число ненужных документов, не нарушая при этом конфиденциальности информации.

D. Общие вопросы

Некоторые вопросы, касающиеся препаратов клеточной и генной терапии, пересекаются с вопросами, рассмотренными в других регуляторных документах. Поэтому рекомендуется, при необходимости, консультироваться с последними версиями регуляторных документов, например:

Применение действующих правовых норм к препаратам терапии соматическими клетками человека и препаратам генной терапии, 14 октября 1993 г., (58 FR 53248).

Вопросы, связанные с производством и испытанием новых лекарственных средств и биологических препаратов, полученных при помощи технологии рекомбинантной ДНК (1985) и Дополнение: Характеризация и генетическая стабильность нуклеиновой кислоты (1992), 27 июля 1992 г., (57 FR 33201).

Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов (1993), 12 августа 1993 г., (58 FR 42974).

Вопросы, связанные с производством и испытанием препаратов на основе моноклональных антител для применения у человека (1997), 28 февраля 1997 г., (62 FR 9196).

Вопросы, связанные со сбором, обработкой и тестированием мононуклеарных лейкоцитов, активированных ex vivo, предназначенных для применения у человека (1989), 2 ноября 1989 г., (54 FR 46303).

В дальнейших разделах настоящего документа представлены проблемные области и вопросы, которые должны быть рассмотрены производителями подобных препаратов при составлении заявки. Перед началом клинических исследований следует предоставить данные, достаточные для подтверждения необходимой степени безопасности. В заявку следует включить описание используемых методик, результаты проведенных испытаний и подтверждение валидации анализов.

Рассмотрение всех вопросов, представленных ниже, может оказаться нецелесообразным или невозможным для некоторых программ исследования. В некоторых случаях описываемые испытания могут быть невыполнимыми или неуместными, или же альтернативные методики могут оказаться более подходящими для целей исследования. Описываемые в настоящем документе методы и методики являются одними из возможных вариантов спонсоры могут предложить альтернативные методики, которые будут считаться приемлемыми при наличии соответствующих подтверждающих данных и обоснования. Кроме того, не всегда получение всей перечисленной ниже информации необходимо до начала клинических исследований. Спонсорам рекомендуется консультироваться по данному вопросу со специалистами CBER.

Руководящие указания, содержащиеся в данном документе, частично основываются на опыте рассмотрения препаратов клеточной и генной терапии и методов их производства. Со временем процедуры будут подвергнуты изменениям, и потребуются альтернативные методы контроля. Принципы, описанные в настоящем документе, могут служить руководством для разработки подобных новых методов.

II. РАЗРАБОТКА И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТУ

A. Сбор клеток

Следует предоставить следующую информацию:

1. Типы клеток: Должен быть описан тип (типы) используемых клеток, в зависимости от их происхождения: аутологичные, аллогенные или ксеногенные. Следует предоставить данные об источнике ткани и другую релевантную идентифицирующую информацию.

2. Критерии отбора доноров: Следует указать любые важные характеристики донора (доноров), в том числе возраст и пол. Как указано в документе «Вопросы, связанные со сбором, обработкой и тестированием мононуклеарных лейкоцитов, активированных ex vivo, предназначенных для применения у человека», аллогенные доноры должны, как минимум, отвечать критериям для доноров крови (21 CFR 640.3). Следует описать методы тестирования и принципы отбора доноров и обосновать любые отступления от них. При необходимости, следует выполнять дополнительные рекомендации Службы общественного здравоохранения, касающиеся доноров органов и тканей. Критерии невключения должны учитывать вероятность заражения ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирусами гепатита В и С, Т-лимфотропным вирусом человека (HTLV-1) и другими инфекционными агентами. Следует указать данные серологических и диагностических исследований и данные анамнеза донора. В некоторых случаях целесообразным является последующее наблюдение за донором. Кроме того, следует подробно описать методы получения данных о доноре и регистрации этих данных.

Если используются аутологичные клетки, следует консультироваться с документом «Предлагаемый подход к регулированию препаратов на основе клеток и тканей», 28 февраля 1997 г. (62 FR 9721) для получения дополнительной информации о проведении испытания на занесенные агенты и о маркировке. Если используются животные виды, следует предоставить описание происхождения, важных генетических особенностей, условий содержания и состояния здоровья стада или колонии (см. также «Руководство PHS по вопросам передачи инфекционных заболеваний при ксенотрансплантации, август 1996 г. (61 FR 49920) и январь 1997 г. (62 FR 3563).

3. Типирование тканей: Если будет использоваться материал, полученный от аллогенных доноров, при необходимости, следует проводить типирование для обнаружения полиморфизмов, например, определение группы крови. Следует изучить важность сходства между донором и реципиентом по антигенам гистосовместимости (HLA-антигенам класса I и/или II, и возможно, в некоторых случаях, минорным антигенам) и предоставить данные о процедурах типирования и критериях приемлемости.

Если необходимо использовать смесь клеток, полученных от разных доноров, особое внимание следует уделить возможному взаимодействию между клетками, которое может привести к возникновению иммунного ответа или изменить действие клеток. Характеризация смесей клеток, полученных от разных доноров, может быть непростой задачей. Препараты на основе смеси клеток, полученных от разных доноров, не отвечают критериям для препаратов на основе клеток или тканей для применения у человека, описанных в «Предлагаемом подходе к регулированию препаратов на основе клеток и тканей», 28 февраля 1997 г. (62 FR 9721), и не могут регулироваться согласно разделу 361 закона об общественном здравоохранении (закон PHS). Подобные препараты регулируются Федеральным законом о продуктах питания, лекарственных и косметических средствах и разделом 351 закона PHS.

4. Процедуры: Следует описать процедуры сбора клеток, в том числе место сбора клеток, а также любые используемые устройства или материалы.

B. Процедуры культивирования клеток

1. Процедуры контроля качества: Культивирование клеток должно быть надлежащим образом организовано в отношении качества материалов, мер производственного контроля, а также контроля и валидации оборудования. См. Раздел I, C, Общие вопросы.

2. Культуральные среды: Следует установить критерии приемлемости для всех сред и компонентов, в том числе параметры валидации сыворотки и факторов роста, а также методы контроля отсутствия занесенных агентов. Следует подробно записывать все компоненты, используемые в культуральных средах, указывая их источник и номер серии. Следует избегать использования таких компонентов среды, которые могут вызвать сенсибилизацию, например, определенной сыворотки животного происхождения, отдельных белков и антигенов групп крови. Должны быть утверждены количественные показатели подлинности, чистоты и активности в целях обеспечения воспроизводимости характеристик клеточной культуры. Более подробно требования к компонентам среды и биопрепаратам, добавляемым в культуры, изложены в документах «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов» (1993) и «Вопросы, связанные со сбором, обработкой и тестированием мононуклеарных лейкоцитов, активированных ex vivo, предназначенных для применения у человека» (1989).

Как указано в «Вопросах, связанных с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов», рекомендуется избегать использования пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков из-за риска возникновения серьезных реакций гиперчувствительности у пациентов.

3. Занесенные агенты в клеточных культурах: Необходимо документально подтвердить, что культивирование, размножение и лабораторная обработка клеток осуществляются в специальных условиях, предназначенных для минимизации контаминации занесенными агентами. При длительном культивировании клетки необходимо время от времени проверять на контаминацию. Испытания должны подтвердить, что в клетках отсутствуют бактерии, дрожжевые грибки, плесневые грибки, микоплазмы и занесенные вирусы. Подробная информация об испытаниях на занесенные агенты и микоплазмы представлена в руководстве «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов» (1993).

4. Контроль подлинности и гетерогеннности клеток: Следует выполнять производственные процедуры и испытания, обеспечивающие контроль над культурами клеток в отношении их подлинности и гетерогенности.

Методы культивирования культур и лабораторные помещения должны быть спроектированы таким образом, чтобы избежать контаминации одной культуры другой.

Во время культивирования клеток могут иметь место значительные изменения свойств клеточной популяции или избыточный рост клеточного типа, изначально присутствовавшего в малом количестве. Чтобы обнаружить подобные изменения, необходимо проводить количественную оценку подлинности клеток, например, посредством мониторинга антигенов клеточной поверхности или биохимических маркеров. Выбранный метод идентификации также должен обладать способностью к обнаружению контаминации или замещения другими клетками, проходящими обработку в том же помещении. Должны быть определены приемлемые пределы компонентного состава культуры. Иногда в качестве метода фенотипирования популяции могут выступать количественные анализы функциональной активности. Главная функция клеток должна контролироваться при выполнении манипуляций с клетками, а также во время периодических проверок, позволяющих гарантировать её неизменность. В некоторых случаях испытания подлинности должны включать проверку совместимости донора и реципиента и иммунологическое фенотипирование.

5. Характеризация терапевтического средства: Если желаемое терапевтическое действие основывается на определенном молекулярном соединении, синтезируемом клетками, необходимо предоставить достаточно полную информацию о структуре и биологических свойствах препарата, чтобы подтвердить наличие необходимой биологически активной формы.

6. Продолжительность жизни культуры: Следует описать основные характеристики культивируемой клеточной популяции (фенотипические маркеры, в качестве которых, в зависимости от ситуации, могут выступать: антигены клеточной поверхности, функциональные свойства, активность, проявляемая в биоанализах) и установить стабильность данных характеристик с учетом времени культивирования. Данный профиль следует использовать для определения сроков культивирования.

C. Процедуры, связанные с системами банков клеток: создание и характеризация главных банков клеток (МСВ), рабочих банков клеток (WCB) и клеток-продуцентов

Системы банков клеток могут использоваться для производства некоторых препаратов терапии соматическими клетками, которые неоднократно получают из одного и того же источника клеток, и для производства геннотерапевтических векторов при помощи пакующих клеток или клеток-продуцентов, примерами которых могут служить бактериальные клетки, продуцирующие плазмиду, или клетки млекопитающих, продуцирующие рекомбинантный вирусный вектор. Для работы с этими клетками необходима официальная система банков клеток (часто двухуровневая). Вопросы создания главных и рабочих банков клеток подробно рассмотрены в документе «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов» (1993) 58 FR 42974. Кроме того, можно также руководствоваться информацией, представленной в 21 CFR 610.18. Используемую систему банков клеток следует описать следующим образом:

1. Происхождение и история клеток: Следует предоставить описание происхождения и истории клеток.

2. Процедуры: Следует описать процедуры замораживания и восстановления клеток. Необходимо указать используемые компоненты (например, ДМСО или глицерол). А также указать количество ампул, сохраняемых в одной партии, и условия их хранения.

3. Характеризация: Подлинность клеток должна подтверждаться при помощи соответствующих генотипических и /или фенотипических маркеров. Доля клеточной популяции, имеющая подобные маркеры подлинности, является показателем чистоты. В случае с трансдуцированными клетками или клетками-продуцентами векторов следует подтвердить удерживание вектора и его подлинность при помощи рестрикционного картирования или количественного определения биологической активности белка, экспрессируемого инсерцированным геном.

4. Испытание на контаминирующие организмы: Следует продемонстрировать, что в МСВ отсутствуют контаминирующие биологические вещества, в том числе грибки, вирусы (помимо вектора), микоплазмы, бактерии (помимо используемого бактериального штамма-хозяина) и способные к репликации вирусы (которые в некоторых случаях связаны с используемым вектором) (см. раздел VI, В и С).

Если МСВ состоит из бактерий, несущих необходимые плазмиды, не обязательно проводить испытания на бактериофаги, но следует учитывать возможность присутствия бактериофагов, поскольку они могут оказывать отрицательное влияние на стабильность и урожайность.

5. Установление срока годности: План разработки препарата должен включать данные, демонстрирующие, как долго и при каких условиях клетки могут оставаться в замороженном состоянии и при этом сохранять приемлемый уровень активности после размораживания.

6. Испытания, проводимые для размороженных клеток: После размораживания и/или размножения клеток следует повторно провести испытания на жизнеспособность, подлинность клеток и их функции. Урожай жизнеспособных клеток и их количественных функциональных эквивалентов следует сравнить с цифрами, полученными до замораживания. Стерильность должна подтверждаться при использовании аликвот замороженных клеток.

При использовании рабочих банков клеток, следует провести для них сокращенные испытания на подлинность с использованием фенотипических или генотипических маркеров. Удерживание вектора и его подлинность должны подтверждаться теми же способами, что и для МСВ – при помощи рестрикционного картирования или количественного определения биологической активности секретируемого белка. Также следует показать, что рабочие банки клеток не контаминированы бактериями или вирусами.

Для клеток-продуцентов следует однократно провести длительное культивирование, превышающее максимальное число производственных пассажей, чтобы проанализировать, не приводят ли условия роста клеток к появлению новых контаминантов, и не нарушается ли целостность вектора (см. «Вопросы, связанные с производством и испытанием препаратов на основе моноклональных антител для применения у человека», 1997 г., 62 FR 9196). Спонсоры должны предложить график испытаний, предусматривающий проведение испытаний на тех этапах, которые позволят получить наиболее информативные и надежные данные.

Использование клеточных банков может оказаться невозможным в случае с определенными видами клеточных препаратов, создаваемыми отдельно для каждого пациента, например, аутологичными клетками для лечения конкретных пациентов. Тем не менее, следует проводить испытания для проверки наиболее важных характеристик итогового клеточного препарата.

D. Материалы, используемые в производстве

Материалы, используемые во время обработки in vitro, например, антитела, цитокины, сыворотка, протеин А, токсины, антибиотики, другие химические вещества или твердые основы, например, гранулы, могут повлиять на безопасность, чистоту и активность итогового терапевтического средства. Поэтому следует четко указать эти компоненты и утвердить программу квалификации с конкретными спецификациями для каждого компонента, чтобы определить его пригодность к применению в производственном процессе. Если используются материалы чистые для анализа (reagent grade), программа квалификации должна, при необходимости, включать испытания на безопасность, чистоту и активность компонента. При использовании клинически чистых компонентов (clinical grade) может использоваться сокращенная программа испытаний. Материалы животного происхождения в некоторых случаях необходимо проверять на наличие занесенных агентов. Если есть риск загрязнения инфекционными агентами, вызывающими губчатую энцефалопатию, необходимо предоставить сведения о сертификации страны происхождения материалов.

Должны быть установлены пределы максимальной концентрации для всех компонентов препарата, которые могут персистировать в готовом лекарственном средстве. Следует описать используемые методы удаления этих компонентов и предоставить результаты количественных анализов (включая описание методов и их чувствительности), подтверждающих эффективность удаления данных компонентов. Некоторые добавляемые компоненты могут вследствие связывания или поглощения присутствовать в вводимом пациенту клеточном препарате в количестве, поддающемся измерению. В этом случае необходимо оценить токсичность данных компонентов на животных или в других подходящих системах.

III. ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ И ИСПЫТАНИЯ ПРИ ВЫПУСКЕ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Применимо к клеточным препаратам, в том числе ex vivo трансдуцированным клеткам для генной терапии.

Итоговый биологический препарат, вводимый пациенту, а также производственный процесс и используемые материалы должны проходить контроль качества. Следует утвердить спецификации для готового препарата и других составляющих производственного процесса, а также диапазон приемлемых значений для каждого из составляющих.

Одной партией биологического препарата считается количество материала, тщательно перемешанного в одном биореакторе. Данный подход может применяться к терапии соматическими клетками и генной терапии с целью планирования процедур тестирования партий препарата. Это означает, что каждая клеточная популяция, препарат на основе вектора или другой препарат терапии соматическими клетками или генной терапии, создаваемый как уникальный готовый состав, должен проходить соответствующие испытания при выпуске партии. Препараты, предназначенные для конкретных пациентов, отличаются от препаратов, производимых большими сериями, поэтому при выборе критериев выпуска партии следует учитывать практические ограничения, связанные с каждым из протоколов. Воспроизводимость процедур определяется вариациями, отличающими одну серию от другой.

A. Подлинность клеток

Для подтверждения подлинности клеток и оценки их гетерогенности применяется количественное определение при помощи фенотипических и/или биохимических анализов (21 CFR 610.14).

B. Активность

В качестве средства измерения активности следует определить и количественно выразить главную функцию клеток, если она известна, и/или главные продукты, биосинтезированные клетками (21.CFR 610.10).

C. Жизнеспособность

Следует количественно определить жизнеспособность клеток и установить нижний предел приемлемости.

D. Испытание на занесенные агенты

Испытания должны показать, что клетки не контаминированы занесенными агентами, такими как бактерии, грибки, (21 CFR 610.12), микоплазмы («Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов», (1993), Приложение №2, (58 FR 42974) и вирусы. В настоящее время Агентство рассматривает новый нормативный документ, позволяющий валидировать производственный процесс, исключающий контаминацию микоплазмами (mycoplasma free manufacturing process), в тех случаях, когда итоговый препарат клеточной терапии имеет слишком короткий срок годности, чтобы пройти полное и достаточно чувствительное испытание до того момента, когда он будет введен пациентам.

E. Чистота

Следует проводить испытание на чистоту (21 CFR 610.13) или валидацию испытания на эндотоксины при помощи ЛАЛ-теста или других приемлемых методик. Пригодность и приемлемость методов испытания на эндотоксины должна рассматриваться отдельно для каждого конкретного случая. Необходимо валидировать применяемый метод, чтобы показать, что состав клеточного препарата не влияет на результаты испытания на эндотоксины. См. «Руководство по валидации анализа с лизатом амебоцитов мечехвоста, применяемого в качестве испытания итогового препарата на эндотоксины при тестировании парентеральных лекарственных средств для применения у человека и в ветеринарии, а также биопрепаратов и медицинских устройств», декабрь 1987 г.

F. Общее исследование безопасности

Для итогового препарата должно проводиться общее испытание на безопасность (21 CFR 610.11). При необходимости, можно разработать модифицированные процедуры согласно 21 CFR 610.9. В настоящее время Агентство рассматривает предложение, касающееся изменения правил проведения общего испытания на безопасность и сферы их применения, особенно в отношении препаратов клеточной терапии.

G. Замороженные банки клеток

При размораживании клеточных популяций (которые были заморожены для использования в будущем), а также их размножении и последующем введении пациентам, необходимо проводить испытания при выпуске партий для размороженных клеток. Испытания могут основываться на информации, представленной в Части II, C, касающейся клеточных банков.

IV. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВИДЫ ПРИМЕНЕНИЯ: ДОБАВЛЕНИЕ РАДИОИЗОТОПОВ ИЛИ ТОКСИНОВ К КЛЕТОЧНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Иногда терапевтическое или диагностическое применение препарата связано с модификацией клетки при помощи введения радиоактивной метки или биоактивных материалов, например, токсинов. Таким образом, клеточный имплантат может использоваться для доставки и обеспечения функционирования не только собственно клеточного препарата, но и других препаратов. Особенности сайта имплантации и локализации радионуклида или токсина или же метаболических свойств клеток могут представлять новые риски для безопасности. Их необходимо предвидеть и, по возможности, устранять.

Похожие специальные вопросы рассматривались ранее в контексте использования антител, меченных радиоактивным изотопом или конъюгированных с токсином, и описаны в документе «Вопросы, связанные с производством и испытанием препаратов на основе моноклональных антител для применения у человека» (1997). Несмотря на то, что применение этих принципов в отношении терапии соматическими клетками может иметь свою специфику, данное руководство все же следует учитывать.

V. ПРОИЗВОДСТВО, ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ И ИСПЫТАНИЯ ПРИ ВЫПУСКЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Представленную ниже информацию можно получить не для всех препаратов. Поэтому спонсорам разрешается представлять на рассмотрение в CBER альтернативные методики и данные. Вид информации, подтверждающей надлежащую безопасность препарата, частично зависит от природы предлагаемого клинического исследования, например: способа и частоты введения и предполагаемой популяции пациентов.

A. Конструирование и характеризация вектора

Исходный материал для вектора должен быть тщательно охарактеризован и задокументирован. Вирусные векторы или плазмиды следует получать из клонированных и хорошо охарактеризованных конструкций и проводить для них подтверждающие испытания на подлинность. Представленная информация должна включать данные о получении вектора, в том числе описание любых векторов, хелперных вирусов и клеточных линий-продуцентов, используемых для получения итоговой конструкции. Следует указать известные регуляторные элементы, такие как промоторы или энхансеры, содержащиеся в конструкции.

На ранней стадии разработки препарата достаточно предоставить информацию о характеризации вектора, включающую данные о последовательностях определенных участков вектора и/или результаты рестрикционного картирования, дополненные данными о характеризации белков. На более поздних этапах разработки и лицензирования следует предоставлять более подробные данные о характеризации. Если ввиду большого размера конструкции невозможно провести секвенирование всего вектора, бывает достаточно секвенировать генетическую вставку и фланкирующие области, а также любые значительные модификации векторного остова или сайтов, легко поддающихся модификации во время молекулярных манипуляций. Если есть данные о векторных последовательностях, изменяющих взаимодействия в системе вектор-хозяин, то их необходимо описать, а также представить информацию о стабильности системы клетка-хозяин/вектор.

B. Система производства вектора

Система производства вектора включает клетку-хозяина, итоговую генетическую конструкцию или, при необходимости, промежуточный продукт, используемый в производстве вектора (например, ретровирусную клетку-продуцент). Следует подробно описать процедуру выбора итоговой генетической конструкции, метод переноса гена в клетку-хозяина и характеризацию клона рекомбинантной клетки-хозяина, включая число копий вектора и физическое состояние итоговой векторной конструкции внутри клетки-хозяина (т.е. интегрированное или экстра-хромосомное). Кроме того, следует предоставить подробное описание процедур размножения клонов рекомбинантной клетки-хозяина, создания посевного материала и квалификации посевного материала. Информация о процедурах, связанных с банками клеток, представлена в разделе II, С.

C. Главные банки вирусов

Если в качестве посевного материала при производстве терапевтического вектора используется вирус (в сочетании с терапевтическим геном или без него), рекомендуется создать и охарактеризовать Главный банк вирусов. Это относится к векторам, получаемым из аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса, поксвирусов и других литических и нелитических вирусов. Спонсор должен описать исходные материалы (т.е. плазмиды, векторы, олигомеры и т.д.) и молекулярные методы, используемые для производства исходного или посевного вектора (seed vector). Следует продемонстрировать генетическую целостность и стабильность (т.е. подлинность) посевного вектора и биоактивность посевного материала вектора (vector seed). В отсутствие данных о биоактивности следует оценить экспрессию гена.

Также следует продемонстрировать, что в главном посевном материале отсутствуют занесенные агенты, включая вирусы, бактерии, грибки и микоплазмы. При производстве неспособных к репликации векторов или векторов с селективной репликацией, необходимо продемонстрировать, что в Главном банке вирусов (MVB) отсутствуют способные к репликации векторы, которые могут возникать в процессе создания MVB в результате контаминации или рекомбинации. Тестирование на другие недопустимые вирусы будет зависеть от вектора и от выполнимости анализов в присутствии векторного вируса. Общая информация по данному вопросу представлена в документе «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов» (1993) (58 FR 42974).

D. Испытания при выпуске партий векторов и соответствующие спецификации

В последующих разделах изложены общие рекомендации по проведению испытаний. Не все перечисленные испытания подходят ко всем классам векторов. Спонсорам следует выбирать подходящие для их случая протоколы испытаний и консультироваться со CBER при возникновении вопросов о применимости определенного испытания. Если лекарственная субстанция (нерасфасованный продукт, не обязательно представленный в виде готовой лекарственной формы) и лекарственное средство (продукт в готовой лекарственной форме) представляют собой одно и то же, тогда понадобится только один набор испытаний.

Для определения свойств, описанных ниже, могут использоваться любые стандартные анализы, при условии, что они являются количественными и обладают достаточной специфичностью и чувствительностью. Методики анализа следует валидировать посредством тестирования известного количества референтных партий, образцов с добавками (spiked samples) или при помощи других подходящих способов, а данные, подтверждающие выполнение анализа, следует включить в IND.

1. Испытания для лекарственной субстанции (нерасфасованный продукт, не обязательно представленный в виде готовой лекарственной формы):

a. Чистота (21 CFR 610.13)

i. Испытание на общее содержание ДНК или РНК, если оно подходит для состава вектора, например, A260 /A280.

ii. Испытание на однородность размера и структуры (сверхспиральной в сопоставлении с линейной), например, электрофорез в агарозном геле.

iii. Испытание на наличие РНК или ДНК хозяина, например, гель-электрофорез, включая испытание с зондом, специфичным по отношению к бактериям хозяина (bacterial host-specific probe).

iv. Испытание на белки, если они являются контаминантами, например, окрашивание серебром в геле.

v. Испытание на неинфекционные вирусы, в тех случаях, когда они являются контаминантами, например, пустыми капсидами. См. Раздел VI C.

vi. Испытание на токсичные материалы, задействованные в производстве.

b. Подлинность (21 CFR 610.14)

Испытание на подлинность вектора следует проводить для лекарственной субстанции при помощи таких методов, как рестрикционное картирование с использованием ферментов или ПЦР (см. 21 CFR 610.14). Если в помещении производятся несколько конструкций, следует удостовериться, что испытание на подлинность позволяет отличить конструкции друг от друга и обнаружить перекрестную контаминацию.

c. Занесенные агенты

По мере того, как повышается чувствительность и специфичность методов испытаний на занесенные агенты, спонсорам рекомендуется аккумулировать дополнительные данные (не указанные в существующих стандартах) для валидации методик испытаний, для того, чтобы в будущем можно было усовершенствовать данный подход. Если векторный продукт не позволяет провести необходимые анализы, например, литический вирусный вектор уничтожает индикаторные клетки, используемые в анализе на занесенный вирус, некоторую информацию можно получить на параллельных имитирующих культурах с использованием той же самой среды и других реактивов, которые позволяют достичь размножения контаминанта, или в анализах, использующих нейтрализующие антитела. Следует проводить следующие испытания:

i. Испытание на стерильность (21 CFR 610.12) – анализ на аэробные и анаэробные бактерии и грибки.

ii. Анализ на микоплазмы, в соответствии с рекомендациям документа «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов (1993)», Приложения 2, (58 FR 42974), в котором указываются процедуры определения микоплазменной контаминации.

iii. Испытание на занесенные вирусы. В некоторых случаях исходные материалы или клеточные линии, используемые в производстве вектора, связаны с риском контаминации занесенными вирусами. В других случаях занесенный вирус может появиться в процессе производства препарата. Рекомендуется выполнять тестирование на несколько потенциальных контаминирующих вирусов в соответствии с подробными рекомендациями документа «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов (1993)», 58 FR 42974, и проектом руководства ICH Q5A «Оценка вирусной безопасности биотехнологических препаратов, полученных из клеточных линий человеческого или животного происхождения», Этап 4, одобрен ICH 3/5/97. Анализы на способные к репликации ретровирусы и аденовирусы описаны ниже.

d. Активность (21 CFR 610.10)

Анализы для определения активности следует валидировать в процессе разработки препарата. Экспрессию инсерцируемого гена можно определить посредством трансфекции соответствующих клеток и демонстрации активности генного продукта при помощи соответствующего анализа, охарактеризованного с точки зрения чувствительности и специфичности. Анализ для определения активности должен, по возможности, количественно измерять биологическую активность продукта экспрессии гена (а не только его присутствие). Например, если в основе предлагаемой терапии лежит ферментная активность, предпочтительнее является анализ ферментной активности, устанавливающий преобразование субстрата в продукт, чем иммунологический анализ, обнаруживающий эпитопы на ферменте. Если невозможно использовать количественный анализ активности, следует проводить качественный анализ активности.

2. Испытания лекарственного средства (готовой лекарственной формы препарата): Векторный препарат в окончательной упаковке следует проверять на указанные ниже свойства при помощи количественных валидированных анализов. В случае если испытания на эндотоксины и общую безопасность проводятся для лекарственного средства (готового препарата), их необязательно выполнять для лекарственной субстанции (нерасфасованного лекарственного средства).

a. Стерильность (21 CFR 610.12), подлинность (21 CFR 610.14) и активность (21 CFR 610.10).

b. Чистота (21 CFR 610.13) или валидация испытания на эндотоксины при помощи LAL-теста или другого подходящего анализа (см. «Руководство по валидации реакции с лизатом амёбоцитов мечехвоста в качестве испытания готового препарата на эндотоксины, применяемого в отношении парентеральных лекарственных форм для применения у человека и в ветеринарии, биологических препаратов и медицинских изделий, 1987»).

c. Общее испытание безопасности, согласно 21 CFR 610.11. Необходимо отметить, что данное испытание не требуется для терапевтических препаратов на основе плазмидной ДНК, даже при добавлении липосом, поскольку они относятся к отдельному классу биотехнологических препаратов (уведомление Федерального реестра, том 61, №94, 14 мая 1996 г.)

VI. ВОПРОСЫ, СВЯЗАННЫЕ С ОПРЕДЕЛЕННЫМИ КЛАССАМИ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

A. Дополнительные вопросы, связанные с использованием препаратов на основе плазмидных векторов

Многие рассмотренные выше вопросы, касающиеся препаратов и контроля их качества, в равной мере относятся к препаратам на основе плазмидной ДНК. Полезная информация по данным препаратам также содержится в документе «Вопросы, связанные с вакцинами на основе плазмидных ДНК, используемыми для профилактики инфекционных заболеваний (1996)» 61 FR 68269. Как правило, следует выполнять полное секвенирование плазмиды. Следует охарактеризовывать плазмиды и устанавливать соответствующие спецификации в отношении наличия контаминантов РНК, белка и ДНК бактерии-хозяина, количества линейной и сверхспиральной ДНК в препарате и наличия токсичных химических веществ. Следует избегать использования в производстве таких токсичных химических веществ, как бромид этидия.

Как указано в документе «Вопросы, связанные с характеризацией клеточных линий, используемых для производства биопрепаратов», рекомендуется избегать использования в производстве пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков, в связи с риском возникновения у пациентов серьезных реакций гиперчувствительности. Если в производстве используется система селекции при помощи антибиотиков, не рекомендуется использовать селективные маркеры, которые приводят к резистенции к антибиотикам при широком клиническом использовании, чтобы избежать ненужного риска распространения устойчивости к антибиотикам на живущие во внешней среде микробы. Также, по возможности, следует проводить количественный анализ остаточного антибиотика в готовом препарате и изучать вероятность возникновения аллергических реакций. Если в производстве используются антибиотики, следует консультироваться с разделом 21 CFR 610.61(m) Кодекса федеральных постановлений в отношении требований к маркировке зарегистрированных биологических препаратов. Информация о воздействии на окружающую среду и использовании факторов устойчивости к лекарственным средствам содержится в Руководстве Национального центра исследования здоровья (NIH) по исследованиям рекомбинантных молекул ДНК (раздел III-A-1-a (59 FR 34496, в редакции 61 FR 59732)). Также могут применяться системы селекции без использования антибиотиков.

Плазмидные векторы могут вводиться совместно с липидными препаратами, местными анестезирующими средствами или другими химическими веществами, способствующими захвату ДНК. Если подобный агент, облегчающий захват ДНК, добавляется в процессе разработки состава, необходимо установить спецификации на его количественное содержание в готовом препарате и на его подлинность. Если в производстве липидного компонента используются токсические органические растворители, например, хлороформ, они должны удаляться в процессе обработки, а в спецификации для выпуска готового препарата должны быть включены испытания на остаточный растворитель.

B. Дополнительные вопросы, связанные с использованием препаратов на основе ретровирусных векторов

1. Испытания на способные к репликации ретровирусы: В представленной ниже схеме испытаний на способные к репликации ретровирусы (RCR) суммированы рекомендации, основанные на имеющейся в настоящее время информации. На текущий момент данная схема подвергается пересмотру, после завершения которого будет издано измененное руководство. Ввиду ограниченности знаний о рисках заражения ретровирусами и возможности образования рекомбинантных RCR на разных этапах производственного цикла, рекомендуется проводить испытания на нескольких этапах производственного процесса. Допускается использование альтернативных анализов (например, спасение генетического маркера (marker rescue)), если их чувствительность сопоставима с анализом PG4 S+L-. Испытание должно быть завершено до начала введения препарата пациентам, особенно если клетки можно подвергать криоконсервации; в противном случае испытания следует проводить параллельно введению. Чтобы получить биологическую информацию о событиях, имеющих место в процессе производства, также рекомендуется проводить молекулярную характеризацию любого RCR, обнаруженного в клинических партиях.

a. Главный банк клеток, продуцирующих вектор (однократное испытание):

i. Испытание супернатанта. Следует протестировать 5 % супернатанта клеточной культуры главного банка клеток при помощи амплификации на пермиссивной клеточной линии (например, Mus dunni), включая несколько слепых пассажей с последующим выполнением анализа PG4 S+L- или альтернативного анализа.

ii. Испытание клетки-продуцента. Следует сокультивировать 1 % пула клеток-продуцентов или 108 клеток (в зависимости о того, какая из величин меньше) с пермиссивной клеточной линией (например, Mus dunni), включая несколько слепых пассажей. Супернатант совместной культуры следует протестировать при помощи анализа PG4 S+L- или альтернативного анализа.

b. Рабочий банк клеток (однократное испытание): Рекомендуется проводить испытание супернатанта или совместное культивирование клеток при условиях, описанных выше для главного банка клеток.

c. Испытание серий векторного препарата:

i. Клинически чистый супернатант. Следует протестировать 5 % супернатанта при помощи амплификации на пермиссивной клеточной линии (например, Mus dunni), включая несколько слепых пассажей с последующим выполнением анализа PG4 S+L- или альтернативного анализа.

ii. Испытание клеток последнего производственного пассажа. Следует сокультивировать 1 % пула клеток последнего производственного пассажа или 108 клеток (в зависимости о того, какая из величин меньше) с пермиссивной клеточной линией (например, Mus dunni) и затем амплифицировать посредством нескольких слепых пассажей. Супернатант совместной культуры следует протестировать при помощи анализа PG4 S+L- или альтернативного анализа.

d. Испытание серий клеток, трансдуцированных ex vivo:

i. Следует сокультивировать 1 % пула трансдуцированных клеток или 108 клеток (в зависимости о того, какая из величин меньше) с пермиссивной клеточной линией (например, Mus dunni), включая несколько слепых пассажей. Супернатант совместной культуры следует протестировать при помощи анализа PG4 S+L- или альтернативного анализа.

ii. Следует протестировать 5 % супернатанта трансдуцированных клеток при помощи амплификации на пермиссивной клеточной линии (например, Mus dunni), включая несколько слепых пассажей. Супернатант совместной культуры следует протестировать при помощи анализа PG4 S+L- или альтернативного анализа.

2. Мониторинг пациентов: Пациентов, получающих препараты на основе ретровирусов, следует проверять на инфицирование RCR. По данному вопросу следует консультироваться со CBER.

C. Дополнительные вопросы, связанные с использованием аденовирусных векторов.

1. Измерение частиц или инфекционных единиц: Размер терапевтических доз аденовирусных геннотерапевтических векторов устанавливается на основе подсчета вирусных частиц, бляшкообразующих единиц (PFU) или инфекционных единиц (IU), определяемых в клеточных линиях, комплементирующих дефект репликации (не путать с измерением способных к репликации аденовирусов (RCA); см. раздел 2 ниже). Принимая во внимание потенциальную токсичность аденовирусных частиц, CBER рекомендует устанавливать размер терапевтической дозы для пациентов на основе измерения количества частиц. Этот подход является предпочтительным ещё и потому, что измерение количества частиц является быстрой и воспроизводимой процедурой. Однако, поскольку некоторые конечные результаты могут быть следствием функционирования определенного числа введенных инфекционных единиц, исследователям или спонсорам рекомендуется разработать информативные и воспроизводимые анализы определения инфекционности in vitro и установить достаточно строгие спецификации на относительное число инфекционных частиц по отношению к общему числу вирусных частиц.

Измерение аденовирусных частиц, как правило, основывается на подсчете геномной ДНК. Измеряя поглощение при длине волны 260 нм с использованием додецилсульфата натрия или других агентов, лизирующих вирус, можно подсчитать максимальное число аденовирусных частиц на основе OD260. Присутствие неаденовирусной нуклеиновой кислоты может исказить результаты подсчета частиц, поэтому ее содержание следует минимизировать во время процесса производства и вирусной очистки. Для подсчета вирусных частиц также используется электронный микроскоп.

В настоящее время титр препарата на основе аденовирусного вектора обычно указывает его инфекционный титр. В качестве клетки, используемой для определения титра, часто выступает клеточная линия-продуцент. Различия между вирусными векторами могут приводить к изменению характеристик роста и кинетики. Метод бляшкообразования эффективен для аденовирусных векторов с легко комплементируемым дефектом репликации. Векторы с несколькими дефектами репликации легче титровать при помощи альтернативных методов, например, при использовании флюоресцирующих антител. Оба анализа требуют оптимизации с учетом времени адсорбции, необходимости дезагрегации вируса, стабильности и т.д. Использование контроля при помощи стандартного вируса дикого типа может упростить сравнение титров между различными векторами и лабораториями.

В настоящее время рекомендованное соотношение в препарате вирусных частиц и биологически активного вируса составляет менее 100:1 для Фазы I исследований. Целью данной спецификации является обеспечение постоянства процесса производства рекомбинантных вирусов и максимальной биоактивности /количества частиц/ терапевтической дозы, а также ограничение возможной токсичности, вызванной вирусными структурными белками. Поскольку в настоящее время разрабатываются и валидируются новые анализы, рекомендуется проводить их сравнение со старыми анализами и использовать их по мере возможности при характеризации препаратов.

2. Определение способных к репликации аденовирусов: Присутствие RCA в клинических партиях аденовирусного вектора вызывает ряд опасений, связанных с безопасностью, в том числе возможность инфицирования аденовирусом, нежелательную репликацию вектора, вызванную присутствием хелперной функции дикого типа, и усиление воспалительной реакции в организме хозяина. Риски для безопасности, связанные с подобными факторами, и другие потенциальные нежелательные реакции будут различаться в зависимости от медицинского показания и популяции пациентов. При оценке рисков, связанных с RCA, возможности доклинических исследований безопасности ограничены, поскольку не существует животных моделей, в которых может беспрепятственно реплицироваться человеческий вирус дикого типа или способный к репликации рекомбинантный аденовирус.

Поэтому аденовирусные векторы, не способные к репликации, должны проверяться на присутствие способных к репликации аденовирусов (RCA). RCA могут появляться на различных этапах производственного процесса вследствие рекомбинации с последовательностями хозяина или контаминации. Количество RCA, появившихся в процессе производства, будет зависеть от дизайна вектора. Использование аденовирусных векторов с селективной репликацией вызывает дополнительные опасения и может потребовать использования дополнительных или других стратегий тестирования. Подобные случаи должны обсуждаться со CBER.

В настоящее время предпочтительным является определение RCA в готовом векторном препарате при помощи метода определения цитопатического эффекта/анализа клеточной культуры. Рекомендуется валидировать чувствительность анализа путем введения уменьшающегося количества частиц аденовируса дикого типа в тестируемый инокулят. Следует тщательно выбирать исходную множественность заражения (MOI) из-за токсичности высоких доз вирусного инокулята, не связанной с присутствием RCA. Также следует учитывать, что слишком высокая исходная MOI может привести к подавлению роста RCA вектором. Прежде чем считывать показания анализа для индикаторной клеточной линии, можно провести один или два слепых пассажей на клетках, пермиссивных для роста RCA (например, A549), чтобы амплифицировать RCA. Кроме того, рекомендуется применять количественный анализ, который позволит определить количество RCA в любой терапевтической дозе.

Ранее, согласно рекомендациям FDA, терапевтические дозы для пациентов, для которых инфицирование аденовирусом может быть связано с потенциальным риском, должны были содержать не более 1 бляшкообразующей единицы RCA или ее эквивалента. Однако Агентство признает, что современные методы производства в сочетании с предлагаемыми схемами дозирования могут сделать выполнение этого требования чрезмерно сложным. Поэтому если спонсоры захотят предложить другие спецификации, им следует предоставить данные, подтверждающие, что уровень RCA в препарате представляет приемлемый риск для предполагаемой популяции пациентов, способа введения и дозы. В настоящее время также рекомендуется проводить молекулярную характеризацию любого RCA, присутствующего в клинических партиях, чтобы получить биологическую информацию о событиях, имеющих место в процессе производства. Данная характеризация должна быть настолько детальной, насколько это практически достижимо, пока не получено больше данных о возникающих типах рекомбинации.

3. Аденоассоциированный вирус (AAV): Из-за ассоциации AAV с аденовирусом в настоящее время рекомендуется проводить испытание главного банка клеток, главного вирусного посевного материала и готового препарата на AAV.

D. Другие системы доставки генов

В настоящее время разрабатываются другие системы доставки генов, в том числе новые виды вирусных векторов или векторов на основе нуклеиновых кислот. Спонсорам, использующим новые системы, рекомендуется консультироваться со CBER на ранних этапах разработки, чтобы повысить безопасность и эффективность процесса разработки.

VII. МОДИФИКАЦИИ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ВЕКТОРОВ

Раньше CBER придерживался мнения, что любое изменение вектора означало создание нового препарата, и требовал подачи новой заявки IND. Полученные в последнее время научные данные позволят проявить гибкость в данном подходе. Целью CBER является содействие разработке эффективных видов терапии путем сокращения испытаний и объема документации, при условии соблюдения всех действующих требований к безопасности пациентов.

Препарат на основе модифицированного вектора ставит перед спонсором заявки IND два вопроса: должна ли подаваться новая заявка IND, и какие данные должны быть поданы на рассмотрение. Некоторые изменения, например, незначительные модификации генетической вставки или изменения гена устойчивости к антибиотикам, не обязательно требуют предоставления новой IND или повторения всех испытаний для нового препарата. В обязательном порядке должно быть описано получение нового вектора, а сам вектор должен отвечать спецификациям при выпуске препарата. Остальной набор данных будет зависеть от степени и природы модификаций вектора. Необходимость проведения дополнительных доклинических исследований будет определяться вероятностью изменения биологических свойств вектора, а не просто числом нуклеотидных изменений. В некоторых случаях исследования локализации ткани, изменения зародышевой линии, а также фармакологические/токсикологические исследования на животных могут быть необязательными. Вместо них могут быть проведены исследования безопасности, изучающие конкретные риски для безопасности, связанные с изменениями вектора.

Когда будет изучен ряд родственных векторов, имеющих небольшие модификации, они смогут рассматриваться как векторы одной панели, аналогично панелям моноклональных антител, описанным в документе «Вопросы, связанные с производством и испытанием препаратов на основе моноклональных антител для применения у человека», редакция 1997 г., 62 FR 9196. Как указано в документе, панели могут изучаться в рамках одной IND и подаваться на рассмотрение в одной заявке на лицензирование. Клинические исследования Фазы 3 должны включать некоторый объем опытных данных о каждом векторе панели, а эффективность устанавливается для всей панели в целом.

Модификации вектора должны обсуждаться со CBER в индивидуальном порядке. Если спонсор хочет сократить объем испытаний и содержание заявки IND на препарат или серию препаратов, он должен проконсультироваться со CBER относительно адекватности предлагаемой сокращенной схемы испытаний до начала клинических исследований. Данные, получаемые от спонсоров, помогают определить, изменяют ли определенные модификации векторов их поведение при сравнении in vivo, и, следовательно, есть ли необходимость в проведении полного объема испытаний.

VIII. ДОКЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ И ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

A. Общие принципы

Доклинические исследования помогают определить фармакологические и токсикологические эффекты, предиктивные в отношении реакции в человеческом организме, не только до начала клинических исследований, но также на всем протяжении процесса разработки препарата. Целями данных исследований являются: определение безопасных начальных доз и схемы увеличения доз для клинических исследований, определение органов-мишеней, на которые направлена токсичность, и параметров, подлежащих мониторингу у пациентов, получающих терапию, а также установление популяций, для которых определенное клеточное или геннотерапевтическое средство представляет более высокий риск в отношении токсичности.

При разработке дизайна доклинических исследований следует учитывать: 1) популяцию вводимых клеток или класс используемого вектора, 2) животный вид и физиологическое состояние, наиболее характерное для клинического показания и класса препарата, и 3) предполагаемые дозы, способ введения и схему лечения. Параметры, которые необходимо изучить, будут описаны ниже.

Ввиду уникальной и сложной природы препаратов, используемых в клеточной и генной терапии, традиционные фармакологические и токсикологические исследования не всегда подходят для определения безопасности и биологической активности данных средств. В дизайне доклинических исследований необходимо учитывать такие вопросы, как видовая специфичность трансдуцированного гена, восприимчивость к инфицированию вирусными векторами и сравнительная физиология. До начала клинических исследований подобных препаратов бывает полезно получить данные о безопасности и эффективности на имеющихся животных моделях, имитирующих медицинское показание.

В разделе 3.1. проекта руководства ICH S6 «Доклиническая оценка безопасности лекарственных средств, полученных при помощи биотехнологий» (Этап 4, одобрен ICH 7/16/97) обсуждается гибкое применение принципов Надлежащей лабораторной практики к испытаниям биотехнологических препаратов. Хотя базовые исследования безопасности, обосновывающие заявку на регистрацию (например, исследования канцерогенности, репродуктивной токсичности), должны проводиться в соответствии с требованиями части 58 статьи 21 CFR, другие испытания, которые обосновывают заявку на допуск к клиническим исследованиям, могут не обязательно строго следовать принципам GLP. В данном случае следует максимально точно выполнять все регуляторные требования, а имеющие место отступления должны оцениваться на предмет их влияния на ожидаемое клиническое применение и указываться в отчете, подаваемом в Агентство.

Если препарат обладает сходством с другими агентами, в отношении которых уже накоплен обширный клинический опыт, или в случае в которыми вставка другой экспрессионной кассеты не должна повлиять на токсичность или распространение вектора, может выполняться неполное доклиническое исследование (см. раздел VII выше).

Рекомендуется обсуждать план доклинических исследований с представителями CBER до начала самих исследований. Следует предусмотреть проведение клинических исследований, требующих быстрого набора пациентов, и заблаговременно провести необходимые доклинические исследования.

B. Выбор животного вида и использование альтернативных животных моделей

Не для каждого клеточного или геннотерапевтического средства доступны животные модели заболевания. В доклинических фармакологических исследованиях и исследованиях безопасности, проводимых для подобных препаратов, следует использовать наиболее подходящую, фармакологически значимую животную модель из всех, имеющихся в наличии. Подходящим животным видом считается тот, чья биологическая реакция на терапию будет имитировать реакцию в организме человека. Например, вектор, экспрессирующий человеческий цитокин, лучше всего испытывать на животном виде, у которого данный цитокин связывается с соответствующим рецептором цитокинов с такой же аффинностью, которая характерна для связывания с человеческими рецепторами, и вызывает фармакологическую реакцию, сопоставимую с реакцией в организме человека.

C. Терапия соматическими клетками и терапия генномодифицированными клетками

1. Биологическая/фармакологическая активность in vivo: В доклинических исследованиях следует изучить процедуру трансдукции, размер дозы размноженных или генетически модифицированных клеток и планируемый клинический способ введения. Фармакологические исследования на животных могут дать полезную информацию о функционировании модифицированных клеток in vivo, времени их жизни и направленной миграции (trafficking).

2. Токсикологические исследования: Исследование безопасности размноженных, активированных или генетически модифицированных соматических клеток должно проводиться на подходящей животной модели. Указанные выше данные о распределении, направленной миграции и жизнестойкости данных клеток in vivo, должны также оцениваться с позиций безопасности. Подопытные животные должны наблюдаться, по меньшей мере, в отношении общего состояния здоровья, биохимии сыворотки крови и гематологического профиля. Ткани-мишени следует проверять при помощи микроскопических методов исследования на наличие гистопатологических изменений.

D. Прямое введение In Vivo

В настоящее время разрабатывается ряд различных векторов для прямого введения в человеческий организм. Прямое введение любого из этих векторов чревато рисками для безопасности, которые будут рассмотрены в данном разделе. Во всех исследованиях токсичности и локализации, в том числе исследованиях гонадной ткани, описанных ниже, должен использоваться итоговый состав препарата, поскольку добавление материалов, например, липосом, или изменение рН или уровня соли может повлиять на токсичность или механизм распределения.

Специфические риски, связанные с каждым подклассом векторов, обычно рассматриваются в индивидуальном порядке. Агентство рекомендует обсуждать данные вопросы со CBER.

1. Способ введения: Способ введения векторов может оказывать влияние на токсичность in vivo. При оценке безопасности в доклинических исследованиях должен, по возможности, использоваться тот же способ и метод введения, что и в клинических исследованиях. Если это сложно осуществить на малых животных видах, рекомендуется использовать метод введения, похожий на планируемый клинический метод введения. Например, внутрилегочная инстилляция аденовирусных векторов посредством интраназального введения хлопковым крысам или мышам является приемлемой альтернативой прямому внутрилегочному введению при помощи бронхоскопа.

2. Выбор животного вида: Следует выбирать животный вид для доклинических исследований токсичности с учетом его чувствительности к инфекции и патологических последствий, вызываемых вирусом дикого типа, связанным с вектором, а также применимости животного вида в качестве модели биологической активности векторной конструкции. Модели грызунов предпочтительнее приматов, если они подвержены патологии, вызываемой конкретным классом вируса. При оценке активности вектора в животной модели заболевания можно собрать данные о безопасности на той же самой модели, чтобы оценить влияние связанных с заболеванием изменений физиологии или фоновой патологии на вызываемую вектором реакцию.

3. Выбор дозы: Дозы векторов для доклинических исследований должны выбираться на основе предварительных данных об активности, полученных в исследованиях in vitro и in vivo. Следует установить размер недействующей дозы, токсичной дозы и нескольких промежуточных доз, а также включить в исследование подходящие контроли, например, ранее не использовавшихся в опытах животных или животных, получающих плацебо. Для препаратов, доступных в ограниченном количестве или характеризующихся низкой токсичностью, в качестве максимально допустимой дозы может использоваться самая высокая доза, прошедшая проверку в доклинических исследованиях. В доклинических исследованиях должна использоваться, как минимум, одна доза, эквивалентная предлагаемой клинической дозе, и, как минимум, один уровень повышения дозы (dose escalation level), который является выше уровня повышения дозы, предлагаемого для клинического исследования. Число вариантов человеческой дозы, необходимое для определения достоверного диапазона безопасных доз, может варьироваться в зависимости от класса используемого вектора и схожести животного вида с человеком. Увеличение доз, основанное либо на массе тела, либо на общей площади поверхности тела, упрощает межвидовое сравнение. Полученная информация может использоваться для определения диапазона безопасных доз вектора для использования в клинических исследованиях, а также для определения приемлемой схемы увеличения доз.

4. Токсикологические испытания: Подопытные животные должны наблюдаться в отношении общего состояния здоровья, биохимии сыворотки крови и гематологического профиля. Ткани животных следует проверять на наличие гистопатологических изменений.

5. Распределение вектора за пределами сайта введения: Рекомендуется проводить исследования локализации, определяющие распределение вектора после введения в предполагаемый сайт. Везде, где это возможно, должен использоваться предлагаемый способ введения. Дополнительным группам животным можно ввести препарат внутривенно, имитируя наихудший вариант развития событий, при котором вектор распространяется по всему организму. Оценка переноса гена в здоровые, окружающие и отдаленные ткани, а также в сайт-мишень должна проводиться при помощи максимально чувствительных методов обнаружения и сопровождаться анализом персистенции гена. Выбранные уровни дозировки должны соответствовать уровням, используемым в исследованиях токсичности. При обнаружении неправильной или непредвиденной локализации необходимо провести дополнительные исследования, чтобы определить, происходит ли экспрессия гена, и связано ли его присутствие с патологическими эффектами.

a. Экспрессия генного продукта и индукция иммунных ответов

Экспрессия продукта терапевтического гена в нужных или ненужных тканях может привести к непредвиденному возникновению токсичности, которая должна быть изучена заранее в доклинических исследованиях. Опасность могут представлять воспалительные, иммунные или аутоиммунные реакции, вызванные генным продуктом. Исследования на животных следует проводить в течение достаточно длительного времени, чтобы позволить подобным реакциям развиться. Иммунные реакции организма хозяина на вирусные или трансгенные белки могут снижать пользу от их повторного введения в клинических условиях.

b. Локализация вектора в репродуктивных органах

В случае с векторами для прямого введения следует учитывать риск переноса вектора в половые клетки. Необходимо изучить животные тестикулярные или овариальные образцы на наличие последовательностей вектора при помощи максимально чувствительного метода. Если признаки вектора обнаруживаются в гонадах, следует провести дополнительные исследования, чтобы определить, присутствуют ли векторные последовательности в половых клетках или же в стромальных тканях, используя такие методики, как разделение клеток, ПЦР in situ и др. Образцы спермы для анализа могут быть получены от взрослых животных, в том числе мышей (G.D. Snell,

et. al., Anat. Rec., 90:243-253, 1944; J.C. Kile, Jr., Anat. Rec.,

109:109-117, 1951). Полученный материал проверяется на присутствие вектора в половых клетках.

6. Иммунный статус организма хозяина и его влияние на геннотерапевтические векторы: При анализе соотношения риска/пользы препаратов, особенно вирусных векторов, следует учитывать иммунный статус предполагаемых реципиентов генной терапии. Если исключение иммунокомпрометированных пациентов слишком ограничивает клинический протокол, допускается использование иммуносупрессированных, генетически иммунодефицитных или новорожденных животных в доклинических исследованиях для оценки потенциального риска для безопасности.

IX. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По мере разработки новых классов генной терапии и терапии соматическими клетками, скорее всего, будут меняться связанные с ними опасения и методы испытаний. В настоящем руководстве рассмотрены вопросы, которые должны изучаться в настоящее время, и представлена основа для анализа новых появляющихся технологий. CBER предлагает ученым, предпринимателям и другим заинтересованным сторонам присылать свои комментарии и предложения, касающиеся развития стратегии в данной области.