Современные тенденции в гликозилировании,
гликоанализе и гликоинжиниринге терапевтических
антител и FC-пептидилированных белков
Абстракт: Mоноклональные антитела (MAbs) являются наиболее быстро растущей группой
фармацевтических препаратов для применения у человека. К настоящему времени одобрено более
20 препаратов на основе моноклональных антител и еще несколько сотен проходит клинические
испытания по разным показаниям к применению: осложнения, включая онкологические,
воспалительные заболевания, трансплантация органов, кардиология, вирусная инфекция,
аллергические реакции, рост и восстановление тканей. Большинство используемых в настоящее
время терапевтических антител являются гуманизированными или человеческими
иммуноглобулинами (IgGs) и продуцируются в эукариотических клетках в виде гликопротеинов.
В настоящее время также активно исследуются многие другие альтернативные системы
продуцирования и способы улучшения существующих конструктов. В среднем, на долю гликанов
иммуноглобулинов (IgG) приходится 3% общей массы молекулы. Несмотря на такое низкое
процентное соотношение, определенные гликановые формы участвуют в естественной
эффекторрной функции иммунных реакций. С другой стороны, гликановые формы, как правило,
не подвергающиеся биосинтезу, могут приводить к развитию у пациентов аллергических реакций,
оказывать иммуногенное действие и ускорять плазменный клиренс меченных антител. Такие виды
гликанов необходимо определять и контролировать, а также ограничивать их применение в
терапевтических целях. Успех гликозилирования зависит от многих факторов, таких как, система
продуцирования, выбор клонируемой популяции, производственный процесс, и выбор способа
(генетический или химический).
В настоящее время представлен хороший обзор моделей гликозилирования, характерных для
зарегистрированных в настоящее время терапевтических антител, продуцируемых в клеточных
линиях млекопитающих, который детально описывает классические и современные аналитические
методы, используемые для описания характеристик гликоформ, а также обсуждаются ожидаемые
преимущества от обработки углеводных компонентов антител при помощи биологического и
химического производства, а также с использованием альтернативных биологических систем
продуцирования, разработанных для нового поколения терапевтических антител и Fc-
пептидилированных белков.
Ключевые слова: Терапевтические антитела, Fс-пептидилированные белки, масс-спектрометрия,
капиллярный электрофорез, гликоинжиниринг, гликомика, гликоаналитика.
ВВЕДЕНИЕ
Согласно оценкам, около 30% новых лекарственных средств, регистрация которых
запланирована на следующую декаду, будет основано на антителах и их производных [1,
2, 3]. В настоящее время известно пять классов антител или иммуноглобулинов человека
(IgG, IgM, IgA, IgD и IgE), которые отличаются друг от друга, как функциями, так и
структурно, в т.ч. карбогидраты [4,5]. Гликозилирование является одной из наиболее
частых пост-трансляционных модификаций белка и имеет непосредственное отношение к
эффекторным функциям антител, иммуногенности, плазматическому клиренсу [6] и
устойчивости к протеазам [7, 8]. Размер гликома человека значительно превышает размер
генома человека, таким образом, было обнаружено более 30 генетических заболеваний и
структурных изменений, связанных с синтезом гликана [9]. В случае с гликопротеинами,
большинство олигосахаридов прикрепляются с помощью N-гликозидной связи (N-
олигоманноза) к аспаргиновым остаткам, комплексным или гибридным олигосахаридам
[10] или, с помощью O-гликозидной связи, к серин-триониновым соединениям [11].
Все терапевтические антитела, которые в настоящее время зарегистрированы,
являются иммуноглобулинами (IgG) или их производными. Иммуноглобулины человека
G являются тетрамерными гликопротеинами (≈ 150 кДа), состоящими из двух тяжелых
цепей (HC, ≈ 50 кДа) и двух легких цепей (LC, ≈ 25 кДа) (Рис. 1А) с плазменной
концентрацией около 10 г/л. Они делятся на четыре подкласса, или изотипа,
отличающихся друг от друга тяжелыми цепями (1,2,3 и 4 в соотношении с 66/23/7/4).
Дисульфидные мосты (16 для IgG1 и IgG4; 18 для IgG2) и нековалентные взаимодействия
поддерживают их трехмерную структуру. Тяжелые и легкие цепи соединяются с двумя
(для IgG1 и IgG4) или тремя (для IgG2) дисульфидными связями, размещенными вместе в
небольшом шарнирном домене, который также содержит папаиновый участок
рестрикции, производящий два фрагмента Fabs и один Fc (каждый приблизительно по 50
кДа). Остальные 12 или 14 цистиновых моста являются внутримолекулярными и
определяют границы шести разных глобулярных доменов: один переменный (V
L
) и один
константный для легких цепей (CL), один переменный (VL) и один константный для
тяжелых цепей (C
H
1, C
H
2 и C
H
3) [5]. IgG3 характеризуется более длинным и подвижным
шарнирным доменом с одиннадцатью дисульфидными мостиками внутри тяжелой цепи
[12]; как правило, их не используют в разработках терапевтических антител, поскольку
для них характерен более быстрый период полувыведения из плазмы, чем у трех других
изотипов (7 дней и 21 день, соответственно) [3, 13].
Так же, как и естественные иммуноглобулины (IgG), все рекомбинантные антитела
содержат аминокислотную последовательность Asn-X-Ser/ Thr (в которой Х –
аминокислота за исключением Pro) для N-гликозилирования в их тяжелой цепи
константного домена С
Н
2. Гликаны IgG составляют лишь 2-3% от общей массы антитела,
которая является низкой по сравнению, например, с массой эритропоэтина (ЕРО, 265
аминокислот, ММ = 32-45 кДа, карбогидраты – 40%, три сайта N-гликозилирования
(Asn
24,36,83
), состоящие из нескольких комплексов антенн; один сайт О-гликозилирования
(Ser
126
) [14,15,16]. Несмотря на то, что структура эритропоэтина (ЕРО) отличается
высокой сложностью, в недавнее время в Европе было зарегистрировано три биоаналога
(www.emea.europa.eu). N-гликаны, полученные из иммуноглобулинов (IgG), как правило,
размещаются на остатке Asn
297
каждой тяжелой цепи (Рис. 1А), а отдельные гликоформы
участвуют в важнейших цитотоксических эффекторных функциях иммунной системы
[17]. Гликозилирование также влияет на период полувыведение из плазмы путем
связывания с неонатальным Fc-гамма рецептором (FcRn) [18]. Гликоформы, которые
обычно не подвергаются биосинтезу в организме человека, могут иметь иммуногенный
потенциал, поэтому они должны быть определены и подсчитаны, а их применение в
терапевтических целях должно осуществляться в клинических условиях, особенно, если
предполагается многократное введение препарата. Гликаны нормальных
иммуноглобулинов (IgG) человека представляют собой комплекс двухантенного типа
(Рис. 2а) [4]. Консервативное ядро гептасахарида состоит из 2 остатков N-
ацетилглюкозамина (GlcNAc), 3 остатков маннозы (Man) и 2 остатка ацетилглюкозамина
(GlcNAc), которые присоединяются гликаном β-1,2 к α-6 маннозе и α-3 маннозе,
формируя 2 плеча. Дополнительные остатки фукозы (Fuc), галактозы (Gal) и N-
ацетилнейраминовой кислоты (NANA) могут присутствовать, а могут и нет. В настоящее
время среди гликанов наблюдается значительная неоднородность. Так, насчитывается
более 400 гликоформ, причиной чему служит случайное объединение тяжелых цепей
гликанов, обладающих разными структурами, что также многократно описывалось Р.
Джефферисом и его коллегами на основании проведенных ими исследований [6, 19]. Для
того, чтобы иметь возможность предсказывать схемы гликозилирования и задавать
направление процессу гликоинжиниринга антител, создаются математические модели N-
связанного гликозилирования [20].
ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ЗАРЕГИСТРИРОВАННЫХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ
АНТИТЕЛ
Изотипы иммуноглобулинов и гликозилирование
Моноклональные антитела являются очень удачным классом терапевтических
препаратов [2, 21, 22]. С момента регистрации первого из них – мышиного
моноклонального антитела (препарат Ортоклон/муромонаб) – прошло 22 года. С тех пор
в разных странах было зарегистрировано, по крайней мере, еще 28 антител и производных
антител (фрагменты Fab, иммуноконъюгатов, радиоиммуноконъюгатов, растворимых FC-
пептидилированных белков), которые в основном предназначаются для лечения
онкологических заболеваний (11), ревматоидного артрита и аутоиммунных заболеваний
(11; ритуксимаб используется в обеих группах заболеваний). Моноклональные антитела
также имеют и многие другие терапевтические показания, например, они используются в
транспланталогии (3), кардиологии (1), для лечения вирусных инфекций (1),
аллергических реакций (1), для роста и восстановления тканей (1) и при гемоглобинурии
(1).Таблица 1. Интересно отметить, что с момента регистрации ретуксимаба (анти-CD20)
прошло целых 10 лет, прежде чем в апреле 2007, в Индии, было запущено первое
биоподобное антитело (Редитукс, Д-Р Редди’с). Второе и третье поколение антител CD20,
которые были охарактеризованы разными механизмами действия и имели разные
эпитопы в качестве мишеней, активно проходили доклинические и клинические
испытания, включая 3 фазу клинических испытаний. Полипептидная последовательность
Ретуксимаба также часто используется в качестве протитипа для оценки новейших
экспрессирующих систем вариантов, полученных с помощью гликоинжиниринга.
Большинство химерных, гуманизированных и человеческих иммуноглобудинов (IgG)
относятся к изотипу IgG1. Тем не менее, за последнее время на фармацевтическом рынке
появились иммуноглобулины других изотипов: два препарата на основе IgG4 (Mylotarg/
gemtuzumab и Tysabri/ natalizumab), один на основе IgG2 (Vectibix/ panitumumab) и один
смешанного типа IgG2/4 (Soliris/eculizumab) [23], а также, в настоящее время, не один
десяток препаратов проходит клинические испытания [4,21,24]. Не смотря на то, что по
сравнению с IgG1, они обладают более высокой гетерогенностью и имеют отличный
олигомерный статус (наполовину антитела и биспецифические гетеротетрамеры IgG4
[13,25,26]); 2-й и 4-й дисульфидные мосты примыкают к тяжелым цепям и формируют
димеры для IgG2 [13, 27], таким образом, данные два изотипа часто выбирают и
клинически разрабатывают во избежание воздействия в качестве эффектора
цитотоксической функции, которая характерна для структур Fc и их гликозилирования.
Согласно оценкам, приблизительно у 20% иммуноглобулинов (IgG), содержащихся в
плазме крови человека, в их вариабельных доменах есть дополнительный сайт N-
гликозилирования, как в легких (каппа и лямбда), так и в тяжелых цепях (гамма)
[24,28,29]. Схожая картина наблюдается и в случае химерного рекомбинантного антитела
Эрбитукс/цетуксимаба, которое показало себя, как гипергликозилированный в
константном домене, но полностью галактозилированный в вариабельном домене тяжелой
цепи Аsn
88
(-Asn-Asp-Ala-Thr-консенсусной последовательности) [30 , 31] (Рис. 1).
Аналогичное наблюдение было недавно сделано и в отношении полностью человеческого
рекомбинантного иммуноглобулина IgG2, имеющего полностью галактозилированный и
частично сиалилированный участок Fab и слабо галактозилированный участок Fc, что
объясняет наличие стерических несоответствий внутри двух гликановых цепей, стоящих
перед CH2 [32]. Цетуксимаб также содержит третий потенциальный сайт N-
гликозилирования на легкой цепи Asn
42
(-Asn-Gly-Ser-Pro консенсусной
последовательности), который, на самом деле, не гликозилированный (наблюдения Р.
Джефферис [18]). Не так давно Дюбуа и др. предложил объяснение: наличие Pro на Y в -
Asn-X-Ser / Thr-Y-консенсусной последовательности, как и в положении X,
неблагоприятно для гликопроцессинга[33].
В последнее время для получения современных поколений гомогенных
моноклональных антител, предпочитается удаление сайтов гликозилирования из
вариабельных доменов путем генетического гликоинжиниринга. Например, родительское
мышиное антитело Герцептина 4D5 содержит в легкой цепи каркаса Asn
65
(консенсусной
последовательности -Asn-Asp-Ala-Thr-) сайт N-гликозилирования. Данные карбогидраты
не требовались для получения фармакологической активности, и мутировали в Ser в
конечной гуманизированной версии транстузумаба, который поступил в продажу [34]. В
таком случае, после удаления сайтов гликозилирования из вариабельных доменов, для
реконструкции части каркаса и адаптации к мутациям CDR может потребоваться
матричное созревание [35]. С химической точки зрения, данный подход способствует
получению гомогенных антител, которые более удобны для разработки
биофармацевтических препаратов, особенно на стадии перехода к промышленному
производству, изменения производственных процессов и проведения сопутствующих
испытаний сопоставимости.
Также совсем недавно впервые был описан процесс О-маннозилирования серина (+
162 Da) в человеческой легкой цепи лямбда-типа IgG2, продуцированного в двух разных
клеточных линиях (стабильной CHO и транзиентной COS), что указывает на то, что
модификация не повлияла на систему продуцирования [36]. В настоящее время остается
не выясненным, возможно ли добавление гексозы к естественным IgG, и какова
биологическая значимость такой модификации. Остатки Ser
66
присутствуют только в
легких цепях лямда-типа. Для цепей каппа-типа их присутствие не характерно.
Соотношение каппа/лямбда составляет 99/1 и 67/33 у мышей и людей, соответственно.
Сейчас в продаже имеется только один препарат на основе легкой цепи лямбда-типа,
содержащей антитело (Бексар/ Tositumomab), возможно из-за того, что 1 поколение
моноклональных антител было получено путем иммунизации мышей с последующей
химеризацией или гуманизацией доминантного мышиного антитела (Табл.1). Это может
изменить будущее: несколько полностью человеческих моноклональных антител,
содержащих лямбда-цепи, в настоящее время проходят клинические испытания. Они были
получены с помощью библиотек фагового дисплея, кодирующих одноцепочечные
вариабельные фрагменты антител человека (scFv) или путем иммунизации трансгенных
мышей, несущих гены человека IgG, с антигеном-мишенью.
Помимо IgG, на сегодняшний день всего несколько IgM и IgA было исследовано в
рамках ранних клинических испытаний и только по определенным показаниям
(септический шок для IgM и введение через слизистую оболочку для IgA). Оба изотипа
являются сложными многомерными гликопротеинами с несколькими сайтами
гликозилирования (от 7 до 11% гликанов и О-гликозилирование в шарнирном домене
димерных IgA1 (360 кДа); 12% гликанов и несколько участков N-гликозилирования в
пентамерных IgM (935 кДа)) [5]. Процессы, предшествующие и последующие выделению
IgM и IgA, менее развиты и эффективны, чем те, что используются для IgG, особенно это
касается крупномасштабного фармацевтического производства [37].
Современные клеточные системы продуцирования и гликозилирования (Табл.1)
Процесс гликозилирования находится в тесной взаимосвязи с производственной
системой, выбранной клональной клеточной популяцией и процессом культивирования
(т.е. стратегией питания) [38,39]. С тех пор, как овариальные клетки китайского хомячка
(СНО) и клетки мышиной миеломы (NS0, SP2/0) вышли в продажу, они стали золотым
стандартом среди клеток-хозяев млекопитающих, используемых в производстве
терапевтических антител и FC-пептидилированных белков [40,41]. По статистике, 48% из
них получают из клеток СНО, 45% - из мышиных клеток (21% из NS0, 14% из SP2/0 и
10% из гибридомы) и 7% из E.coli (не гликозилированной фрагмент Fab), что
представлено в Табл. 1
Большинство этих клеточных линий были адаптированы к росту в суспензионной
культуре и хорошо подходят в качестве культуры для реактора, при переходе к
промышленному масштабу производства и при большом объеме производства, вплоть до
20000 л и производительностью до 5 г/л [37]. Данные характеристики способствуют
постоянному выбору определенных антител [42,43]. В зависимости от терапевтических
показаний, дизайна и количества клинических испытаний, для проведения I фазы
клинических испытаний необходимо от 0,5 до 1 кг, от 1 до 5 кг для II фазы и от 10 до 60 кг
для III фазы испытаний. Антитела, пользующиеся наибольшим спросом, в настоящее
время ежегодно производятся в больших масштабах. Гликоформы IgG, полученные из
СНО (рис. 2б) близки к человеческим, за исключением третьего плеча N-
ацетилглюкозамина, в котором представлено около 10% гликоформ IgG человека и очень
малые количества терминальной N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA) [6]. Мышиные
моноклональные антитела, полученные из клеток типа NS0, демонстрируют больше
различий (рис. 2в). Они представляют малые количества гликоформ с дополнительной α-
1,3 галактозой и различными сиаловыми кислотами: N-гликолилнейраминовой кислотой
(NGNA), либо N-ацетилнейраминовой кислотой (NANA). NGNA является
преобладающим типом сиаловой кислоты, присутствующим в гликопротеинах,
продуцируемых мышиными клетками, но даже при этом, после получения из клеток CHO,
обнаруживаются только ее следы [44,45]. Сообщается, что NGNA обладает
иммуногенным действием на человека [46], однако с практической точки зрения,
содержание N-гликолилнейраминовой кислоты в области Fc большинства
моноклональных антител, полученных из NS0, как правило, очень низкое (около 1-2%).
Помимо этого, не было зарегистрировано серьезных нежелательных явлений, связанных с
применением данной гликоформы, доступной в настоящее время в виде моноклональных
антител на основе NS0 и SP2/0, в том числе препарата на основе моноклональных антител
Синагис/Паливизумаб (против респираторно-синцитиального вируса человека (РСВ)),
который используется у новорожденных с 1998 года. То же самое касается и остатка
мышиной галактозы α-1,3, которая в целом встречается очень редко (2-4%) у Asn
297
[47].
Одном серьезным исключением является моноклональное антитело С225 (Эрбитукс),
для которого характерно наличие второго сайта N-гликозилирования в области Fab в
тяжелой цепи Fab
88
. Что касается одобренной к продаже версии Цетуксимаба,
производство которого осуществляется в клетках SP2/0, недавно была обнаружена 21
гликоформа, в которой приблизительно 30% включает по крайней мере один остаток
галактозы α-1,3, 12% - остатки NGNA и следы олигоманнозы [31]. Важно, что и α -1,3-
галактозы и NGNA обнаруживались только в фрагментах Fab в отличие от фрагмента Fc, в
которых определялись только типичные для них гликоформы IgG, G0F, G1F и G2. В
недавнем докладе об анафилактической реакции, связанной с применением цетуксимаба,
говорится о том, что у пациентов, у которых отмечалось развитие данной нежелательной
реакции и получавших Эрбитукс, был обнаружен специфический иммуноглобулин IgG к
эпитопу галактозы α-1,3 [48]. При использовании твердофазного иммуноферментного
анализа (ImmunoCAP), данные IgE связывались с цетуксимабом, продуцированным
клетками SP2/0, и фрагментом, но не с фрагментом Fc. Интересно, что в случае версии
цетуксимаба, полученного от клеток CHO (CHO-С225), иммунореактивность не
фиксировалась.
Как и в случае с Эрбитуксом, описано много гликановых профилей
зарегистрированных моноклональных антител, которые были полученны при
использовании различных клеточных линий: MabCampath/алемтузумаб [46], Rituxan/
ритуксимаб и Herceptin/ транстузумаб [49] – продуцированных в клетах СНО; TheraCIM/
нимотузумаб [50] и Synagis/ паливизумаб [51] – продуцированные в клетках NS0. Доступ
к такого рода данным имеет первостепенное значение для получения необходимой
информации о структуре и активности гликанов, а также для целей, связанных с
эффективностью и улучшением следующих поколений моноклональных антител или для
использования этих данных в исследовании сопоставимости биоаналогов.
Альтернативные клеточные системы продуцирования и гликозилирование
Безусловно, в будущем на фармацевтический рынок попадут антитела, полученные с
помощью альтернативных систем (Табл.2). Тем не менее, на сегодняшний день одним из
ограничивающих факторов являются различия в оборудовании, используемом для
получения иммуногенных рекомбинантных гликопротеинов путем гликозилирования [52].
Клетки плесени, грибов, насекомых и растений ограничивают возможности
гликозилирования [53], и данное препятствие следует обойти путем гуманизации путей
гликозилирования, о чем будет рассказано в разделе, посвященном гликоинжинирингу.
Прокариоты. Получение корректно гликозилированного белка в бактериальных
клетках невозможно, тем не менее, белки являются системой продуцирования выбора для
безоболочечных (например, Люцентис/ранибизумаб) или пегилированных Fab-
фрагментов (например, симзия/цертолизумаб пегол). Полноразмерные антитела также
могут продуцироваться без участия гликанов, если они экспрессируются в E.coli [54] или
в свободно экспрессирующих системах, основанных на лизатах E.Coli [55]. Другой
вариант заключается в получении негликозилированных антител в непрокариотическийх
системах путем биоинжиниринга Asn
297
с использованием остатков Asp, Gln или Ala,
например, [56] или мутации Thr-киназы, присутсвующей в –AsnXxxThr
299
– консенсусной
последовательности.
Таблица 1. Перечень зарегистрированных терапевтических антител и их
производных: изотипы или форматы, экспрессионные системы, мишени и
показания, фармакокинетика и иммуногенность
МА/МНН
(www.who.org)
Продуце
нт
Формат
Одо
брен
Компания
Показания
Период
полувыведе
ния
Мишень
Путь
введения
Иммуноге
нность
Аркалист/
рилонацепт
CHO
IL1R-Fc
2008
Regeneron
КАПС
(аутоиммунный)
IL-1 trap
5.3-7.6
п/к
/
Вектибикс/
панитумумаб
CHO
HuIgG2k
2006
Amgen
Колоректальный
рак
EGFR
3.6-10.9
в/в (2 нед)
1-4%
Актемра/ тоцилизумаб
CHO
HzIgG1k
2006
Roche/ Chugai
Болезнь
Кастлемана
IL-6R
/
в/в
/
Орсения/ абатацепт
CHO
CTLA4-Fc
2005
BMS
Ревматоидный
артрит
CD80/CD86
/
/
/
Авастин/ бевацизумаб
CHO
HzIgG1k
2004
Genentech/
Roche
Колоректальный
рак, рак головы и
шеи, груди
VEGF-A
12-14
в/в
0%
Ксолар/ омализумаб
CHO
HzIgG1k
2003
Genentech/
Novartis
Аллергия
IgE-Fc
20-35
п/к
0%
Раптива/ Эфализумаб
CHO
HzIgG1k
2003
Genentech/
Serono
Псориаз
CD11a
5-10
п/к
2-6%
Амевив/ алефацепт
CHO
LFA-3-Fc
2003
BiogenIdec
Псориаз , РА,
Трансплантация
CD2
11,3
п/к
/
Хумира/ адалимумаб
CHO
HuIgG1k
2002
Abbott
Ревматоидный
артрит
TNFalpha
14,7-19,3
п/к
5-12%
Зевалин/ ибритумомаб
CHO
MuIgG1k
2002
Biogen-dec
Неходжкинская
лимфома
CD20
1,1
в/в
30%
Мабкампат/
алемтузумаб
CHO
HzIgG1k
2001
Millenium
хроническая
лимфоцитарная
лейкемия B клеток
(CLL)
CD52
12
в/в
50%
Герцептин/
трастузумаб
CHO
HzIgG1k
1998
Genentech
Рак груди
HER-2
2,7-10
в/в
0.1%
Энбрел/ этанерцепт
CHO
HzIgG1k
1998
Amgen/ Wyeth
Псориаз, РА
TNFalpha
4
п/к
/
Ритуксан/ ритуксимаб
CHO
p75 TNFR-
Fc
1997
Genentech/
BiogenIdec
Неходжкинская
лимфома, РА
CD20
9,4
в/в
0% (НХЛ)
67% (РА)
Солирис/ экулизумаб
NS0
HzIgG1k
2007
Alexion
Пароксизмальная
ночная
гемоглобинурия
C5
5-11
в/в
/
ТераСИМ/
нимотузумаб
NS0
HzIgG2/4k
2005
YM Biosciences
Рак головы и шеи
EGFR
/
в/в
/
Тисабри/ натализумаб
NS0
HzIgG1k
2004
Biogen-Idec
РА
alpha4
integrin
14
в/в
7%
Милотарг/ гемтузумаб
(иммуноконъюгат)
NS0
HzIgG4k
2000
Wyeth
Острая
миелоцитарная
лейкемия
CD33
1,9-2,5
в/в
0%
Синагис/ паливизумаб
NS0
HzIgG4k
1998
Medimmune/
Astra-
Zen.
Респираторно-
синцитиальный
вирус
F protein
19-27
в/м
0-1%
Зенапакс/ даклизумаб
NS0
HzIgG1k
1997
PDL/ Roche
Отторжение при
трансплантации
CD25
20
в/в
8-34%
Эрбитукс/ цетуксимаб
SP2/0
ChIgG1k
2004
Imclone/ Merck-
Serono/BMS
Колоректальный
рак, рак головы и
шеи
EGFR
4,8
в/в (1 нед)
5%
Ремикейд/
инфликсимаб
SP2/0
ChIgG1k
1998
Centocor/
Scherring
Болезнь Крона,
псориаз
TNFalpha
9,5
в/в
8-61%
Симулект/
базиликсимаб
SP2/0
ChIgG1k
1998
Novartis
Отторжение при
трансплантации
CD25
4-16
в/в
0-1%
РеоПро/ абциксимаб
SP2/0
ChFab
1994
Centocor/ Lilly
High-risk
angioplasty53%
GPIIb
4,8
в/в(1 нед)
4-21%
Бексар/ тостумомаб
Гибрид
MuIgG2a
2003
GSK
Неходжкинская
лимфома
CD20
2,7-2,8
в/в
9%
Панорекс/ эдреколомаб
Гибрид
Hybr.
MuIgG2ak
1995
Centocor/ GSK
CRC
EpCAM
/
в/в
/
Ортоклон/ муромаб
Гибрид
MuIgG2ak
1986
Johnson &
Johnson
Отторжение при
трансплантации
CD3
0,73
в/в
53%
Симзия/ цертолизумаб
пегол
E.Coli
HzFab’-
PEG
2008
UCB
Болезнь Крона
TNFalpha
/
п/к
Низкий(PE
G)
Луцентис/
ранибизумаб
E.Coli
HzFab
2006
Genentech
Возрастная
макулярная
дегенерация
VEGF-A
/
и/в
/
*в днях (дата по ФК взята у Танг Л. И др, 2004 г.; Лобо и др., 2004 и с сайта www.emea.europa.eu . *данные по иммуногенности взяты у
ванн Валле и др., 2007г. [159] и www.emea.europa.eu.
AML – острая миелоидная лейкемия; CAPS – киопринин-ассоциированный периодический синдром; CLL – хроническая
лимфоцитарная лейкемия; CRC – колоректальный рак; H&N – рак шеи и головы; в/в – внутримышечно; и/в – интравитерально; в/в –
внутривенно; NHL – неходжкинская лимфома; PNH – пароксизмальная ночная гемоглобинурия (хроническое разрушение
эритроцитов); RA – ревматоидный артрит; Redinux – биоаналог Ритуксимаба, зарегистрированный в 2007 году в Индии; п/к –
подкожно; Международные непатентованные наименования моноклональных антител (www.whо.int). Существуют правила, согласно
которым, берется запоминающийся префикс, за ним следует инфикс, который указывает на конкретное заболевание (ту – тумор, кар –
сердечно-сосудистый ви – вирус, лим – иммунный), и суффикс, обозначающий вид моноклонального антитела [мышиный – омаб,
химерный – ксимаб (мышь, крыса, все приматы, кроме человека); гуманизированный – зумаб; человеческий - умаб]. Последняя
согласная буква слога мишени/заболевания может быть опущена для облегчения произношения (например, паливизумаб, трастузумаб,
ритуксимаб, …).
Рис. 1. Структурная характеристика IgG1k на четырех различных уровнях «сверху-вниз» (уровень 1 –
интактный IgG; уровень 2 – легкие и тяжелые цепи после сокращения) и анализ «снизу-вверх» (уровень 3 –
пептидное и гликопептидное картрирование после ферментативного расщепления; уровень 4 – гликановый
анализ после выходы PNG-азы F).
Рис. 2. (А) Гликаны человеческих и рекомбинантных антител, продуцируемые в (В) хомячковых (клеточные
линии CHO) и (С) мышиных клеточных линиях (NS0 или SP2/0, мышиная гибридома). Данные структуры
используются для вычисления теоретических масс при выполнении масс-спектрометрического анализа
(GlcNac = 203.19 Да; Man, Gal = 162,14 Да; Fuc = 146,14 Да; NGNA = 291,09 Да; NANA = 275.00 Да; 2АВ =
136,15 Да). Данные структуры представлены в соответствии с номенклатурой, предложенной Консорциумом
по функциональной гликомике (http://www.functionalglycomics.org/).
Таблица 2. Используемые и альтернативные системы продуцирования
терапевтических антител и их производных
Клеточные культуры
o Клеточные культуры млекопитающих
CHO (овариальные клетки китайского хомячка)
/дигидрофолатредуктаза + Метотрексат или глутаминсинтетаза
(1)
NS0 (клетки мышиной миеломы) / глутаминсинтетаза (GS)
(1)
SP2/0 (клетки мышиной миеломы)
(1)
YB2/0 (клетки миеломы крыс)
BNK (почка новорождённого хомяка)
COS (фибробласты почки африканской зеленой мартышки)
HEK293 (человеческие эмбриональные клетки почек)
PER.C6 (клетки сетчатки глаза человека)
NM-А9 (лейкемические клетки, полученные у человека)
o Клетки птиц (EBx)
o Клетки насекомых (Sf9)/ Бакуловирус
(2)
, Дрозофила обыкновенная
o Дрожжевые грибы (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae
(2)
);
мицелиальные грибы (Aspergillus niger)
o Бактерии (E. coli, Campilobacter jejuni): scFv, Fab
(1)
, (Fab’)2, IgG (а-
гликозилированный)
o Клетки растений (в биореакторах): Lemna minor (Ряска малая( водное
растение)), Physcomitrella patens (лишайник), табак
Трансгенные организмы
o Трансгенные животные: козы
(2)
(hu-антитромбин, ЕМЕА 2006), кролики,
мыши
o Трансгенные куриные яйца
o Трансгенные растения (в открытом грунте): табак, кукуруза, картофель, соя,
рис, люцерна
(1)
Одобрено для зарегистрированных терапевтических моноклональных антител;
(2)
Одобрено для зарегистрированных вакцин или биопрепаратов
Клетки человека. В недавнее время в качестве новой системы продуцирования
моноклональных антител были предложены клетки, полученные от ретинобластомы
человека PER.C6, способные переносить человеческий профиль гликозилирования и
соотношение G0F/G1F/G2F близким к 1/2/1 [57]. Фактически, данное соотношение может
также наблюдаться и у моноклональных антител, полученных от клеток NS0 [58] и других
гликоформ, что встречается в минимальном количестве случаев, как описывается ниже.
Трансгенные животные. Первый биофармацевтический препарат, полученный в молоке
тренсгенных коз, был зарегистрирован в Европе в 2006 году (Атрин/GTC Biotherapeutics,
рекомбинантный человеческий антитромбин) [59]. Данный рекомбинантный
гликопротеин содержит 3 сайта N-гликозилирования и демонстрирует отличный от
человеческого гликановый профиль (более высокий уровень маннозы, 50%NGNA) [60].
АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛИКОФОРМ
Все IgG демонстрируют одинаковые пост-трансляционные модификации:
циклизация пироглютамовой кислоты легкой и тяжелой цепей у моноклональных антител,
содержащих остатки N-терминального глютамина или глютаминовой кислоты, Т-
гликозилирование тяжелой цепи домена C
H
2 и выделение С-концевого лизина [19].
Данные микроварианты можно исследовать с помощью методов, в основе которых лежит
масс-спектрометрия (MS) [27, 61, 62]. На первом этапе исследования структуры антител
необходимо использовать как подход «сверху вниз» (прямое измерение массы интактного
IgG легкой и тяжелой цепей), так и подход «снизу вверх» (пептиды, гликопептиды,
гликановый фингерпринтинг и структурный анализ) (Рис. 1) [63]. На втором этапе
исследования, когда, после выпуска PNG-азы для партии образца, гликоформы уже
известны, в целях планового КК уместно проведение прямого масс-фингерпринтинга
интактного IgG с использованием высокоточных масс-спектрометров [64,65].
ДСН-ПААГ и ИЭФ
Блочный электрофорез в плоском геле (Электрофорез в полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия, ДСН-ПААГ (SDS-PAGE), метод разделения
модификаций по массе) и ИЭФ (метод разделения модификаций по заряду) являются
методами, которые регулярно используются в исследовании белков и гликопротеинов.
На рис. (3А) показан анализ ДСН-ПААГ, в котором смесь двух IgG (
моноклональное антитело №1 и №2) в геле была в разных случаях обработана с/без PNG-
азы F, а также с/без добавления восстанавливающего агента. На самом деле, с помощью
плоского геля невозможно различить челое гликозилированное моноклональное антитело
лот дегликозилированного (потеря лишь 3 из 150 кДа). После реакции восстановления,
наблюдается небольшое смещение в массе тяжелой цепи (3 кДа из 50 кДа), при этом не
наблюдается никакой разницы для легкой цепи обоих моноклональных антител, как и
ожидалось.
На рис. (3B) показан Изоэлектрический фокусирующий гель для тех жен антител,
как обработанных, так и необработанных PNG-азой F. "Кислотные" сдвиги наблюдаются
на обеих полосах в обоих случаях, что объясняется получением отрицательно заряженной
аспарагиновой кислоты вместо нейтрального аспаргина, связанного с N-гликаном.
Наблюдаемая остальная неоднородность в вариантах заряда объясняется С-концевым
вариантом лизина.
Рис. (3). (А) На рисунке представлен график блочного электрофореза в плоском геле SDS-PAGE для двух
моноклональных антител (линия 1 и 3), обработанных с PNG-газой F, восстановленных (линия 6 и 8),
восстановленных и обработанных с PNG-азой F (линия 7 и 8). (В) 2 для ИЭФ с двумя разными
моноклональными антителами (линия 1 и 3), обработанными с PNG-азой F (линия 2 и 4). При анализе с
гелем SDS-PAGE после обработки PNG-газой F заметно изменение массы тяжелой цепи, а не всего IgG,
поскольку данный метод не достаточно чувствителен. При анализе ИЭФ наблюдается изменение pI на всех
пленках, поскольку данный вид анализа является более кислотным и показывает популяцию отрицательных
зарядов.
Капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (CESDS)
Капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия является самым
результативным количественным методом исследования (интегрирование площадей
пиков), имеющим потенциал заместить собой плоские гели [66]. Рис. (4) показаны
примеры электроферограмм интактного IgG (глико-H2L2), обработанного с/без PNG-азы
F в восстановительных и не восстановительных условиях. По сравнению с рис. (3А),
данный метод является более результативным и позволяет дать относительную
количественную оценку основного пика (глико-H2L2), не гликозилированного варанта
(NG-H2L2), а также фрагментов антител, которые на этапе культивирования (H2L, H2, H и
L) были подвержены обработке не полностью [49, 51].
Это же касается разрешения и относительной количественной оценки методом
капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF) и cIEF с детекцией
непосредственно в капилляре (iCE280) по сравнению с классическим плоским гелем IEF
[67,68].
Нормально-фазовая и обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная
хроматография (НФ- и ОФ-ВЭЖХ) гликанов, полученных с помощью PNG-азы.
НФ-ВЭЖХ - это устоявшийся аналитический метод разделения смесей
олигосахаридов после ферментативного получения олигосахаридов (например, PNG-азы
F) и флуоресцентным методом (например, 2-аминобензамид). Суб-пикомолярные уровни
могут быть обнаружены и количественно определены с высокой точностью [69].
На рис. (5) представлен наглядный пример хроматограммы НФ-ВЭЖХ для
олигосахаридов после расщепления моноклонального антитела, полученного от клеток
NS0, с помощью PNG-азы F. Были изолированы разные пики и переданы на анализ в
автономном режиме путем проведения MALDI-TOF масс-спектрометрии. Семь из них
показали совпадения по показателю массы 2АВ-меченных структур в результатах
испытания и в данных, полученных в результате расчетов.
Для дальнейшего подтверждения биохимическими методами, гликаны могут
подвергаться последовательному расщеплению избирательной экзогликозидазой, как
описывает Guile и др. [69] (нейраминидазой, α-галактозидазой, β-галактозидазой, β-
гексоаминидазой, α-фукозидазой, α-маннозидазой, β-маннозидазой) и, после этого,
регулярно использоваться во многих лабораториях. Доработанная версия данного
протокола была разработана группами П.М. Рудда и Р.А. Двека [70]. Недавно стало
известно о существовании альтернативного он-лайн метода ОФ-ВЭЖХ масс-
спектрометрии [71], который делает возможным расщепление олигосахаридов с высоким
содержанием маннозы, гибридных и сложных гликанов, полученных из
предположительно терапевтических IgG на поздней стадии развития; при использовании
данного метода гликопрофилирования, наиболее гетерогенные антитела были исключены
в процессе отбора.
Как показано на (рис. 6), НФ-ВЭЖХ может использоваться в фингерпринтинге
гликанов IgGs для моноклональных антител, продуцируемых в различных клеточных
линиях (например. CHO или NS0), что четко демонстрирует различные модели.
Моноклональные антитела, продуцируемые клетками NS0, демонстрируют малое
количество гликоформ с дополнительной α-1,3-галактозой и различными сиаловыми
кислотами (NGNA или NANA). То же касается и моноклональных антител,
продуцируемых клетками растений и клетками CHO [72], когда для высвобождения
гликанов используется используя PNG-аза A.
Также, сообщается об использовании альтернативных методах разделения, например,
гидрофильной жидкостной хроматографии цвиттер-ионного типа (ZIC-HILIC), с помощью
которой можно достичь более эффективного разделения изомерных N-гликанов [73].
Электрофорез углеводов с использованием флуорофора (FACE)
Электрофорез углеводов с использованием флуорофора и секвенатора ДНК (DSA-
FACE) основан на электрофорезе в полиакриламидном геле и предназначен для
разделения карбогидратных цепей [74] 8-амино-1,3,6-пиренетрисульфоновой кислоты.
Данный метод был адаптирован для стандартного секвенатора ДНК и с недавних пор
используется, к примеру, для характеристики слитых белков маннозилированных
антиферментов [75].
Рис. (4) Капиллярный электрофорез (А) интактного рекомбинантного IgG; (В) и рекомбинантного IgG,
обработанного PNG-азой F.
Рис. (5). (А) НФ-ВЭЖХ олигосахаридов, высвобожденных с помощью обработанного PNG-азой рекомбинантного IgG и
дериватизированного флуоресцентным красителем (2-АВ). Для получения интерпретации, структура каждого
изолированного пика может быть передана для исследования с помощью MALDI-TOF MS (времяпролётная масс-
спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы) (расчетная масса/экспериментальная масса)
и/или последовательное расщепление экзогликозидазой.
Анализ сиаловых кислот высвобожденных гликанов
По сравнению с другими гликопротеинами, IgG плохо поддаются сиалированию [6,
76]. На рис. (7) представлен профиль гликоформы рекомбинантного моноклонального
антитела, обработанного PNG-азой F, дериватизированного (2-АВ), проанализированного
с помощью НФ-ВЭЖХ и обработанного или не обработанного нейраминидазой. Было
обнаружено, что нейраминовой кислотой было увенчано всего два небольших пика.
Единицы сиаловой кислоты (также называемые «нейраминовые кислоты») часто
характеризуются как менее устойчивые и склонные к распаду после высвобождения
гликанов и подготовки образца. Для того, чтобы рассмотреть данный момент подробнее,
были разработаны специальные методы [77] мелкого дозирования N-
гликолилнейраминовой кислоты (NGNA) и N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA), как
показано на рис. (7C и D), что основано на гидролизе моноклональных антител, мечении
1,2,-диамино-4,5-метилендиоксибензол (DMB) и анализе методом ОФ-ВЭЖХ с
флуоресцентным детектированием. Также группой, имеющей отношение к
исследованиям в области высокоэффективной гликомики, недавно были предложены
новые методы дозирования углеводородов [78].
Капиллярный электрофорез (CE) высвобожденных гликанов
Капиллярный электрофорез с лазерно-флуоресцентным детектированием (LIF) – это
еще один метод анализа на олигосахариды, отличающийся высокой эффективностью,
благодаря высокому разрешению и совместимости с автоматическими операционными
системами. Способы применения данного метода были недавно опубликованы группой
Kamoda и др. [51], также на примере олигосахаридов, выделенных из IgG c производными
2-AB. Как это показано на рис. (8), данный метод предлагает новые преимущества по
сравнению с классической НФ-ВЭЖХ в виде более быстрой и простой подготовки
образцов, менее продолжительных аналитических циклов (10 мин, вместо 120) и лучшего
разделения (например, гликоформы G1F/G1'F полностью разделяются в случае анализа
CE, и могут быть точнее определены количественно для исследования соотношения
структура-активность). В дополнение к этому, структурный анализ, в котором совместно
используется капиллярный электрофорез и масс-спектрометрия (CE-MS), выглядит
солидно [49, 79].
Рис.6. Фингерпринтинг НФ-ВЭЖХ двух рекомбинантных антител, продуцированных в клетках CHO (А и В), и двух – в
NS0. 4 основные гликоформы всех четырех антител рассмотрены в различных пропорциях (G0F, G1F/G1’F, G2F). В
случае с моноклональными антителами, полученными из клеток NS0, в малом количестве присутствуют
дополнительные гликоформы, свойственные мышам (моно- и ди- alpha-1, 3 GalGal и следы моно- и ди- NGNA).
Масс-спектрометрия (МС)
Масс-спектрометрия является особенно быстрым и надежным методом
дифференцирования отпечатков гликоформ моноклональных антител, продуцированных,
например, из клеток CHO и NS0, и оценить относительную долю между основными
гликоформами (G0F, G1F и G2F). Интересно, что с приходом последнего поколения
электрораспылительной ионизации - время-пролетных масс-спектрометров (ESI-TOF),
масса интактных антител может быть измерена с точностью до 40 ppm (+/- 6 Да), что
значительно ускоряет скрининг и традиционное описание характеристик моноклональных
антител по принципу «сверху вниз» [65,80]. Кроме того, текущее разрешение масс-
спектров позволяет также исследовать асимметрию N-связанных двухантенных
олигосахаридов между двумя тяжелыми цепями, как показано на рис. 9, используя для
этого не измененные или восстановленные антитела. Такой вид анализа противоречил
традиционно используемым методам аналитического анализа, применяемым в отношении
углеводородов после ферментативного высвобождения гликанов или, опосредованно,
путем жидкостной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS) Fc-фрагментов, сохраняя
внутренние дисульфидные мосты после протеолиза Lys-C [81]. Поскольку биологические
системы сталкиваются с некоторым объемом симметричных и асимметричных структур,
данный новый тип информации в будущем, безусловно, будет способствовать более
глубокому пониманию взаимосвязи структура-активность гамма рецепторов IgG/Fc и
разработке моноклональных антител, обладающих улучшенными свойствами Fcgamma-R
[82, 83].
Рис. (7). Сиаловые кислоты. Полученная с помощью НФ-ВЭЖХ, хроматограмма олигосахаридов, отделенных при
помощи PNG-азы от 2-АВ дериватизированных из IgG, продуцированных в клетках NS0 (А) без и (В) с обработкой
нейроминидазой: удаляется только 2 меньших пика, что свидетельствует о присутствии следова сиалированных
олигосахаридов. Это подтверждается особым дозированием NGNA и NANA с помощью ВЭЖХ, как показано для (С)
такого же антитела и для (В) Герцептина, используемого в качестве контроля (продуцированный CHO).
Рис.(8). Фингерпринтинг с помощью капиллярного электрофореза с индуцированной лазером флуоресценцией (CE-LIF)двух
рекомбинантных антител, продуцированных в клетках CHO (А и В) и двух, продуцированных в клетках NS0, соответственно.
Гликоформы всех 4 антител представлены в разных пропорциях (G0F, G1F/G’F, G2F). У моноклональных антител, продуцированных в
клеточной линии NS0, в небольшом количестве присутствует характерная для мышей гликоформа (одно- и двух- α1,3 GalGal, а также
моно- и двух- NGNA). По сравнению с НФ-ВЭЖХ, капиллярный электрофорез (СЕ) позволяет быстрее и проще осуществлять
подготовку образца, а так же требует меньшего времени на само испытание (16 мин по сравнению со 115 мин) и лучшее разделение
(например, разрешение G1F/G1’F, G2…).
На рис. (9) показаны масс-спектры гуманизированных моноклональных антител,
продуцируемых в клетках NS0 методом электрораспылительной ионизации (ESI), или
других, не измененных (F) или обработанных PNG-азой F (B), антител, так же, как и
результаты анализа относящихся к ним легких (С) и тяжелых (D) цепей после обработки
восстановителем, например, дитиотреитолом того же антитела. Спектры состоят из
типичных серий многократно заряженных ионов с о значениями отношения массы к
заряду (m/z) варьирующих в пределах приблизительно от 1500 до 4000 (m/z). На каждом
рисунке ниже показаны соответствующие развернутые спектры. Исследуемые массы
сравнивались с массами, вычисленными с помощью аминокислотной последовательности,
полученной из кДНК, предполагая, что в ней присутствует 16 дисульфидных мостиков, N-
терминальные пироглютамовые кислотные образования тяжелой цепи и С-терминальные
остатки лизина (145 685 Da). Масса исследуемого моноклонального антитела,
обработанного PNG-азой F, совпала с расчетами (145 695 Да; разность массы составила +
10 Да). Спектр недегликозилированного моноклонального антитела был охарактеризован
9-ю равноудаленными друг от друга пиками (162 Да), которые соответствуют массе
дополнительных гексоз (например, галактозы). Похожие экспериментальные массы также
измерялись для легких цепей ( приблю. 24 063 Да / расч. 24 063 Да) и для тяжелых цепей
(расч. 48 796 Да), корректированные на массы основных известных гликоформ (G0F: 50
240 Да/ + 1444 Да; G1F: 50 402 Да/ + 1606 Да; G2F: 50 563 Да/ + 1767 Да; G2FG: 50 726 Да/
+1930 Да). В конечном счете, для оценки тонкой молекулярной структуры гликанов, для
высвобожденных N-глаканов проводится тандемная масс-спектрометрия (LC-IT-MS/MS,
MALDITOF / TOF) [31,65]. Характерная схема фрагментации N-гликана G2F, полученная
с помощью IT-MS/MS, представлена на рис. (10). При использовании подхода «снизу
вверх», 9 упомянутых ранее пика, могут интерпретироваться, как следующие пары
гликолевых вариантов: G0F/G0F, G0F/G1F, G1F/G1F or G0F/G2F (isobaric), G1F/G2F,
G2F/G2F, G2F/G2F + G, G2F/G2F + 2G, G2F/G2F + 3G, G2F/G2F + 4G [64]. С помощью
LC-ESI-TOF у моноклональных антител, продуцируемых в клетках CHO, спектры будут
проявлять меньше гликолевых вариантов [65]. Сопоставление пептидов и гликопептидов
LC-MS выполняется после ферментативного расщепления всего антитела или фрагментов
тяжелой цепи или ВСБ/ФК – это еще один способ получить информацию о гликолевых
вариантах [58]. Asn297, расщепленные с помощью трипсина, и содержащие нонапептиды
(EEQYN297STYR по сравнению с EEQYD297STYR после расщепления с PNGазой F),
также недавно использовались для определения с помощью LC-MS уровня содержания
негликозилированных вариантов IgG, продуцированных в клетках трансгенных растений
[84] и в клетках HEK293, соответственно [85].
Более точного результата анализа гликопептидов, взятых из сложной смеси пептидов
моноклонального анитела, можно достичь и путем обогащения гликопептидов с помощью
обращённо-фазовой хроматографии наночастиц в колонке с углеграфитовой структурой
[65]. Среди других усовершенствованных в последнее время методов масс-спектрометрии,
также было сообщено о появлении нового квадрупольного времяпролетного масс-
спектрометра ионной подвижности (ESIQ - IM-TOF) [86]. Для подтверждения
конформационных изменений моноклональных антител, связанных со статусом
гликозилирования в тяжелых цепях, в сочетании с масс-спектрометрией использовался
метод ионной подвижности. В будущем, воздействие гликозилирования на
конформационный статус неизмененных моноклональных антител сможет, с помощью
данного подхода, подлежать более точной оценке путем дифференциального анализа
молекулы, дегликозилированной в естественных условиях [65].
Следует помнить о том, что избыток в 162 Да (масса гексозы)или превышение в несколько
162 Да может быть вызван гликированием в лизине, опосредованном производственным
процессом, разработкой [87] или O-маннозилированием [36]. Такой тип гликовариантов
не чувствителен к расщеплению с использованием PNG-азы, не чувствительн к
расщеплению PNG-азой и может быть точно картрирован с помощью, например, боронат-
аффинной хроматографии и масс-спектрометрии в случае гликирования [88,89,90].
Рентгенодифракционный и ядерный магнитный резонанс
Характеристика тонкоструктурных гликанов была получена с помощью кристализации
Fc-фрагментов и путем проведения анализа полученных гликанов методом ядерного
магнитного резонанса [91, 92, 93]. Оба структурных метода, как правило, не используются
c углеводами антител, однако их использование эффективно с целью доказательства того,
что присутствие гликановых агентов требуется для достижения однородности
моноклональных антител [94].
Проведение ЯМР анализа гликанов зачастую затруднительно, поскольку спектры часто
перекрываются, а конформационные ограничения низкие. К счастью, в данной области
аналитической науки также достигнут определенный прогресс. Для структурной
гликобиологии наиболее перспективным методом представляется ЯМР в ультравысокой
области спектра, например, при длине волны 920 Мгц [95].
Гликоанализ с высокой пропускной способностью
Согласно данным группы P. Rudd, G Kwek [70, 96], в настоящее время проводится
разработка нескольких новых методов гликоанализа с высокой пропускной способностью,
а также методов анализа с использованием лектиновой матрицы, недавно предложенного
в качестве скрининга на этапе клонирования, разработки процесса и производства антител
[97]. Лектины представляют собой широкое семейство белков, распознающих гликаны
благодаря высокой аффинности моносахаридов [98]. Анализы основаны на использовании
хорошо изученных растительных лектинов с особенностями перекрывания для наиболее
часто встречающихся гликоформ (G0F; G1F; G2F; Gal (альфа 1-3) Gal; сиаловых кислот;
гликанов с высоким содержанием маннозы; двух-, трех- и четырех-антенного типа).
ПРЕИМУЩЕСТВА УПРАВЛЕНИЯ КОМПОНЕНТАМИ УГЛЕВОДОВ В
АНТИТЕЛАХ
В отличие от классических гуманизированных или человеческих антител, их
производные, полученные с помощью инженерии, активно исследуются с целью
оптимизации функций эффектора и ограничения иммуногенности [2, 35, 99].
Аналитические методы, описанные выше, являются ключевыми инструментами для
точной доработки терапевтических антител.
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC) и
Комплементзависимая цитотоксичность (CDC) (Рис. 11а)
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC) и
Комплементзависимая цитотоксичность (CDC) представляют собой важные функции
эффектора, особенно для моноклональных антител IgG1, разработанных для применения в
онкологии, когда главная цель терапии сводится к выборочному уничтожению
опухолевых клеток. Ветвления N-ацетилглюкозамина [100, 101, 102, 103],
ассоциированного с истощением остатков фукозы (например по причине генетического
нокдауна альфа-1, 6- фукозилтрансферазы) на предмет содержания олигосахаридов в
консервативной области Fc рецепторов, приводит к повышению ADCC в условиях in vitro
до 100 раз [10, 93, 104, 105, 106]. Также ADCC повышалась у нефукозилированных IgG4
при улучшенном связывании с FcgammaRIII [107], Fc-пептидилированных белков
TNRFRII-Fc, LFA3-Fc, IL-1R-Rc [108, 109], Fc-гибридных пептидов, также называемых
«пептидными антителами» [32], одноцепочечных Fc (scFv-Fc) и биспецифических антител
(bsAbs), состоящих из двух разных одноцепочечных Fv с двойной специфичностью
(опухолевый антиген TAG72 и муцин MUC1), объединенных субстанцией Fc (scFv2-Fc)
[110].
Рис. 9. LC-ES-TOF масс-спектрометрия интактного рекомбинантного IgG (А), продуцированного в клеточной линии
NS0, (В) то же самое антитело, отправленное на расщепление PNG-азой F, (С) легкая и тяжелая цепи, полученные после
реакции восстановления, алкилирования и хроматографического разделения.
Такие специфические профили предпочитаются в гликоинжиниринге систем
продуцирования, значительно улучшая тем самым функции ADCC ex vivo. Suzuki и др.,
например, с помощью периферийных мононуклеарных клеток крови (PMBCs), взятых от
здоровых доноров и от больных раком молочной железы, продемонстрировал, что для
достижения сопоставимых ADCC необходимо в десять раз меньше антител по сравнению
с Герцептином/трастузумабом [111]. Требуется провести клинические исследования,
которые, в случае подтверждения данной информации, могли бы позволить сократить
стоимость комплексного лечения (цитостатическими препаратами и/или
моноклональными антителами), имеющего несколько целей или иной механизм действия
(факторы роста, апоптоз, ангиогенез), который отсрочивает ускальзывание опухоли,
например, HER1/VEGFR, HER1/HER2, HER2/HER3, HER1/IGF-1R... [112,113]. Для
крупномасштабного производства нефукозилированных терапевтических антител, была
выведена стабильная высокопроизводительная линия клеток CHO (1,7 г/л), что указывает
на готовность технологического процесса к выпуску пилотных серий препаратов для
клинических испытаний [104].
Недавно К. Чжоу также сообщил о производстве нефукозилированной олигоманнозы,
содержащей антитела [114] в клетках CHO, выращенных во взаимодействии с
кифунензином, являющимся ингибитором альфаманнозидазы I. Данные антитела
продемонстрировали рост аффинности с рецепторами FcgammaRIIIA и ADCC и сократили
связывание с C1q. Период полувыведения сыворотки у мышей не изменился, однако
показатели фармакокинетики пока не известны; в целом, гликопротеины с высоким
содержанием маннозы отличаются меньшим периодом полувыведения [37].
Улучшение моноклональных антител c ветвлением N-ацетилглюкозамина, полученных с
помощью гликоинжиниринга, в части цитотоксичности и/или подавление активности
фукозы, не наблюдалось в клетках CHO, а также в большинстве таких альтернативных
систем, как зараженные бакуловирусом клетки насекомых [101], клетки птицы [115],
клетки крысы YB2/0 [116], дрожжи [117], гидрофит [72], мох [103, 118] и табак [103].
Для предотвращения аллоиммунизации были исследованы антитела антирезус Rho (D),
продуцируемые в клетках миеломы крыс и отличающиеся низким содержанием фукозы и
высоким содержанием галактозы (FOG-1, R297), в результате чего был выявлен более
высокий уровень ADCC по сравнению с такими же антителами, продуцированными в
клеточной линии CHO [116]. В 1 фазе исследований было показано, что моноклональные
антитела R297 обеспечивают быструю и полную очистку эритроцитов у здоровых
добровольцев [119]. Не смотря на то, что очистка протекала гораздо быстрее, чем в случае
с поликлональным иммуноглобулином антирезус Rho (D), полученным из клеток
донорской плазмы [120], изменение гликозилирования может повысить связывание с
рецепторами естественной иммунной системы. Та же крысиная клеточная линия YB2/0
была выбрана для продуцирования EMAB-6, являющихся моноклональными антителами к
CD22 с низким содержанием фукозы и улучшенным рецептором связывания Fcgamma
IIIA. Недавние исследования ex vivo, в которых использовались мононуклеары, взятые из
периферической крови больного хронической лимфатической лейкемией, ЕМАВ-6
вызывали больший рост ADCC по сравнению с ритуксимабом [121].
Несколько других антител, полученных с помощью гликоинжиниринга и имеющих
направленное действие против GD3 (BioWa), CCR4 (KM2760, BioWa) [122], CD20
(GA101/R7159, Glycart-Roche) CD30 (MDX-1401, BioWa/Medarex), CD52 (Glycart/Roche
[2], IL5R (BIW-8405, BioWа/Medimmune) в настоящее время находятся на этапе ранних
клинических исследований по разным показаниям (рак, воспалительные процессы, астма).
Будет интересно отслеживать результаты данных испытаний. Большая часть ободряющей
информации касательно ADCC была получена in vitro и ex vivo (в результате исследования
мононуклеаров, взятых из периферической крови пациентов или добровольцев) [111] или
in vivo на трансгенных моделях мышей; клинические результаты у пациентов находятся на
этапе оценки и обсуждения. В настоящее время зарегистрировано три препарата
моноклональных антител к EGFR, предназначенных для лечения рака прямой кишки, рака
головы и шеи (Эрбитукс/цетуксимаб) [21].
Два из них (Эрбитукс/цетуксимаб и ТераСИМ/нимотузумаб) являются препаратами на
основе иммуноглобулина IgG1 и дают рост ADCC in vitro. С другой стороны,
Вертибикс/панитумумаб, третий IgG2, действует как антагонист EGF и клинически
эффективен с целью регресса опухоли без эффекторных функций. HuMax-EGFR является
еще одним препаратом на основе моноклональных антител к HER1, который в ходе
клинических исследований продемонстрировал свою способность блокировать
связывание с EGF, взаимодействовать с клеточной сигнализацией и активировать клетки-
эффекторы, необходимые для ADCC, независимо от фукозилирования Fc-фрагментов.
Еще один пример касается моноклональных антител антагонистов IGF-1R, которые в
настоящее время проходят серию клинических испытаний по применению в лечении рака.
Для данных антител, находящихся на стадии клинического исследования, были выбраны
три разных изотипа с разной способностью по запуску эффекторной функций: с одной
стороны IgG1 (Amgen, ImClone, Merck/Pierre Fabre, Roche/GenmAb, Sanofi-
Aventis/Immunogen, Schering-Ploug), и с другой - IgG2 (Pfizer-Abgenix) [21] и
негликозилированный IgG4 (BiogenIdec).
Гуманизация гликозилирования в гетерологичной экспрессирующей системе и
усиление эффекторной функции
N-гликаны с высоким содержанием маннозы содержат от пяти до девяти остатков
маннозы и обнаруживаются в дрожжах [16], клетках насекомых [123] и растений [124], но
не обнаруживаются в естественных человеческих антителах [6, 125, 126]. Клиренс
гликовариантов с высоким содержанием маннозы повышается при связывании с
макрофагальным маннозным рецептором в печени [127]. В более общем смысле,
иммунный ответ направлен против ксенобиологических гликоформ, на ускорение очистки
крови и ограничение терапевтического потенциала [128, 129]. Прикладываются огромные
усилия к разработке белков, содержащих гуманизированные гликоформы, полученные с
помощью гликоинжиниринга. Данные системы включают трансгенных животных [59],
куриц [130, 131], клетки насекомых [131] и трансгенные антитела, полученные из
растений, например, которые отличаются высоким уровнем галактозы, неопределяемыми
уровнями ксилозы и следами фукозы [132, 133]. Штаммы дрожжей также были
подвержены генетической трансформации для получения моноклонального антитела с
«гуманизированными» гликоформами, усиленными эффекторными функциями
(например, третье плечо, недостаток фукозы) [134] и возможностью получения более
высоких титров белка (>2 г/л) или таких же титров, но в более короткий срок при
использовании тех же клеточных линий млекопитающих, но с более низкой стоимостью
производства (например, используя менее дорогостоющую химическую питательную
среду, невирусная инактивация).
Основные достижения в гликоинжиниринге Pichia pastoriasis был достигнут с полностью
гуманизированными сиалированными гликопротеинами [45]; штаммы дрожжей были
подвержены инженерии с целью продуцирования антител к CD20, обладающих
уникальной гликановой структурой для каждого антитела [117].
Мицелиальные грибы (аспергиллус нигер) также подвергались гликоинжинирингу путем
удаления генов, кодирующих гликозилирующие фрагменты грибов, и внедрения генов,
необходимых для продуцирования гуманизированного комплекса N-гликанов [135].
Растения являются еще одной интересной системой продуцирования с точки зрения
получения рекомбинантных белков [124]. Основное беспокойство представляет собой
присутствие сахаров бета-1,2 ксилозы (отсутствующей в гликанах человека) и альфа-1,3
фукозы (вместо альфа-1,6 фукозы), которые являются аллергенными эпитопами для
человека [136]. Десять лет назад первое поколение антител, полученных из растений,
прошло только ранний этап клинических исследований, в ходе которого рассматривалось
местное применение препарата (например, при генитальном герпесе [137], кариесе [138]).
Совсем недавно было достигнуто контролируемое гликозилирование антител против
бешенства, путем экспрессии в ростках табака тяжелых и легких цепей человека,
генетически совмещенных с последовательностью Lys-Asp-Glu-Leu («KDEL») в C-
терминальных областях [139]. Любопытный факт заключается в том, что данный
сигнальный пептид не препятствует удерживанию гликопротеинов в эндоплазматическом
ретикулуме (ЭР) и биосинтезу основных вариантов олигоманнозы, не содержащих бета-
1,2 ксилозы и альфа-1,3 фукозы. Тем не менее, олигоманноза не обнаруживается в
естественных плазматических IgG человека, и персистенция дополнительных
ксенопептидных последовательностей «LEDKRS» или «LEDKESGRA AASGGGGDV» в
С-конце [140] как легкой, так и тяжелой цепей, ограничивает терапевтическое применение
моноклональных антител у человека.
Мох (Physcomitrella patens) предложен в качестве альтернативы, как система культуры
изолированных тканей, пригодная для продуцирования моноклональных антител в фото-
биореакторах [118, 141, 142]. Гликановые матрицы, неиммуногенные и имеющие
улучшенное содержание ADCC, были получены путем намеренной замены гена с целью
блокировки процессинга двух сахаров, не имеющих отношения к млекопитающим
(ксилосилтрансферазы и фукосилтранферазы). Аналогичная стратегия применялась и в
отношении табака [133, 143].
Экспрессирующая система Ряски малой (гидрофит) запускает быструю клональную
экспансию и выделение моноклональных антител в разовых объемах до 300 г при полном
соблюдении мер предосторожности и в отсутствии рисков , связанных с переносом
патогенов млекопитающих. Во избежание экспрессии иммуногенных растительных
гликанов, одновременно проводилась экспрессия c единичным транскриптом RNAi к
молчащей альфа-1,3 фукосилтрансферазе и бета-1,2 ксилосилтрансферазе, ожидаемый
срок стабильности составляет 3 года. В качестве проверки обоснованности концепции,
было проведено исследование, в котором повышенная активность ADCC in vitro и
связывание Fcgamma RIIIa были продемонстрированы на примере сравнения
моноклонального антитела к CD30 и того же антитела, продуцированного в клеточной
линии СНО [72].
Противовоспалительное усиление путем Fc-сиалирования (Рис. 11 с)
Сиалированные гликаны являются характерной и естественной составляющей
гликопротеинов у видов, что отражается, например, в переносе специфичности
гемагглютининов вируса птичьего гриппа на вирусы гриппа человека (альфа 2-3 сиалил на
альфа 2-6). [144] Тем не менее, в отличие от других циркулирующих гликопротеинов
(например, эритропоэтин [16]), иммуноглобулины (IgG) человека плохо поддаются
сиалированию [76]. Такое же наблюдение было сделано и относительно рекомбинантных
антител, продуцируемых в эукариотических клетках [145]. Интересно, что недавно было
показано, что сиалирование антител может подавить воспаление и уменьшить
цитотоксичность путем задействования Fc-фрагмента различными рецепторами Fcgamma
[17,146]. Для этой цели, в условиях in vitro было достигнуто десиалирование путем
инкубации антитела с нейраминидазой, в результате чего противовоспалительные
свойства IgG утрачивались. С другой стороны, чрезмерно сиалированные антитела были
получены путем очистки с помощью аффинной хроматографии с лектинами, связанными
с агарозой (агглютинин Sambucus nigra) и продемонстрировали повышенную
противовоспалительную активность. Также, сиалированные рекомбинантные антитела
получают из дрожжей, подверженных генной инженерии [4, 6], или из клеточных линий
лейкемии NM-F9, выращенных на контролируемой обогащенной среде [53]. Высокий
уровень сиалирования антител ассоциируется с пониженным ADCC [147].
Повышение однородности гликанов
Для того, чтобы ограничить количество гликоформ и повысить однородность антител,
ферменты, участвующие в синтезе гликанов, можно использовать in vitro, для получения
гликановых единиц. Например, полное галактозилирование иммуноглобулинов человека
с использованием гликотрансферазы было достигнуто при испытании пилотной партии
гликоформы G2F объемом 1 кг в качестве доказательства правильности концепции
(показатель чистоты составил >98 %) [148].
Улучшение плазматических показателей полувыведения
Большинство гликопротеинов удаляют из обращения, если они содержат такие структуры
углеводов, которые распознаются специфическими рецепторами (например, высокая
манноза и комплекс олигосахаридов, не содержащих сиаловую кислоту, рецепторами
маннозы и рецепторами гликопротеина без сиаловой кислоты, соответственно) [149,150].
Например, было доказано, что период полувыведения и терапевтическая активность явно
зависят от присутствия концевой сиаловой кислоты [16]. Тем не менее, среди
циркулирующих гликопротеинов, антитела рассматриваются как исключения [16]. Как и
прежде, гликозилирование антител в длительном плазматическом периоде полувыведения
посредством связывания с неонатальным рецептором FcgammaRn, остается
исследованным только на мышах, поскольку полученные данные сложно
экстраполировать на человека [3,10,104,151,152]. Период полувыведения из сыворотки
крови иммуноглобулинов человека IgG1, 2 и 4 занимает удивительно длительное время
(21-23 дня) по сравнению с IgG3 (7 дней), IgA (6 дней), IgM (5 дней) или таких
фрагментов антител, как F(ab’)2, Fab, scFv (несколько часов), если они не были получены
с помощью PEG (например, Цимзия/цертолизумаб пегол). Период полувыведения
зарегистрированных рекомбинантных гуманизированных и человеческих антител может
длиться до 20 дней, примерно столько же по длительности, как и естественные IgG
человека независимо от системы продуцирования: СНО или NS0, Таблица 1 [128, 129].
Антитела, полученные с помощью генной инженерии, с более длительным периодом
полувыведения (например, 6 недель) разработаны так с целью сокращения частоты
повторных введений препарата пациентам, которые проходят долгосрочное лечение, а
также в будущем, планируется сократить и дозы; данный прогресс связан с мутациями в
Fc области аминокислотных остатков [151, 153]. В двух последних документах Raju и
Scallon сообщили данные, которые указывают, что терминальные единицы Fc-гликанов
также важны для стабильности антител (устойчивость к протеазе) и, следовательно,
фармакокинетики [7,154].
Маннозилированные белки на основе смеси антитело-фермент
Антитело-направленный фермент пролекарственной терапии (ADEPT) основан на
противоопухолевых антителах, объединенных с ферментами, которые способны
избирательно трансформировать пролекарственное средство в активный цитотоксический
препарат непосредственно в опухоли. Маннозилированные белки, полученные путем
объединения антитела и фермента, пригодные для клинического применения,
продуцировались в экспрессирующей системе Pichia pastoris и показали высокий клиренс,
необходимый для ADEPT [75]. Kolgelberg и др. с помощью проточной цитометрии и
иммунофлюоресценции доказали, что MFECP1, пептидилированный белок-антитело,
продуцируемый в грибах, специфический к раковоэмбриональному антигену (CEA),
удаляется с помощью эндоцитируемого и маннозного рецепторов. Данные рецепторы
связывают гликаны с содержанием маннозы. Клиренс MFECP1 происходит in vivo с
помощью маннана.
Цитотоксические иммуно-конъюгаты
Лекарственные средства, отличающиеся высокой цитотоксичностью, также могут быть
ковалентно прикреплены к антителам для улучшения их терапевтической эффективности
[155,156], избирательности (например, иммунного таргетинга опухолевых клеток) или их
способности достигать цитоплазмы после интернализации моноклонального антитела.
Такие лекарственные средства препараты могут произвольно прикрепляться к доступным
остаткам лизина, распределенным по легкой или тяжелой цепям. Несмотря на то, что при
помощи точных параметров мечения, можно было бы различить некоторые остатки
лизина (от 80 до 95), остается риск, касающийся связывания с лизином, присутствующим
в CDR, соответственно, с потерей целевого связывания.
Кроме того, сайт-специфическое связывание может быть достигнуто с одним или
несколькими из восьми остатками цистеина, задействованными в дисульфидных мостиках
между цепями после восстановительной реакции в мягких условиях, или с гликаном после
мягкой окислительной реакции [157] по типу гидразонной связи для винкаалкалоидов.
Химико-ферментативные методы, основанные на бета-1,4-галактосилтрансферазе могут
использоваться для передачи кето-галактозы C2 асиалированным остаткам GlcNac на
моноклональных антителах для дальнейшей селективной глико-конъюгации [158].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Гликаны представляют собой лишь небольшую часть структуры антител (2-3%), однако
они добавляют сложности, неоднородности и принимают уникальное участие в
осуществлении эффекторных функций. Все зарегистрированные в настоящее время
препараты на основе моноклональных антител продуцируются в эукариотических клетках
и имеют схожий с человеческим гликановый профиль. В свою очередь, гликозилирование
у видов, не являющихся млекопитающими, является единственным ограничением для
развития альтернативной продуцирующей системы, пригодной для разработки
терапевтических моноклональных антител для системного применения.
Развитие человекеских клеточных линий (HEK293, PER.C6), гуманизация биосинтеза
гликанов в экспрессирующих системах, основанных на видах, не являющихся
млекопитающими (дрожжах, грибах, клетках насекомых, растений), выбор
гликопрофилей с низким содержанием фукозы и гликоинжиниринг, осуществляемый для
повышения цитотоксических эффекторных функций (третее ацетилгликозиловое
делящееся плечо) или противовоспалительные свойства являются ключевыми моментами
в разработке последующих поколений терапевтических антител и Fc-химерных
производных.
Помимо классических электрофоретического и хроматографического методов, все более
важную роль, как в ходе скрининга с использованием моноклональных антител, так и при
составлении точных структурных характиристик углеводов играет сочетание масс-
спектрометрии с жидкостной хроматографией или капиллярным электрофорезом. В
настоящее время на стадии разработки находятся новые методы анализа гликанов,
отличающиеся высокой пропускной способностью. Эти новые высокопроизводительные
аналитические методы также помогут при анализе гликановых структур специфических
антигенов в исследованиях соотношений «структура-свойство».
Дополнительные признаки растущего интереса фармацевтической отрасли к разработке
гликанов и составлению профилей моноклональных антител были определены недавним
приобретением компанией Merck (США) [96] компаний GlycArt by Roche (Швейцария) и
GlycoFi а также путем учреждения и развития биотехнологических компаний,
специализирующихся на производстве рекомбинантных гликопротеинов,
гликоинженеринге и/или гликоанализе: AviGen (США), Biolex (США), BioWa (Япония),
GlyCode (Франция), GlycoDiag (Франция), GlycoForm (Великобритания), GlycoTope
(Германия), Greenovation (Германия), Glyence (Япония), LFB (Франция), M-Scan
(Великобритания/Швейцария/США), Neose (США), ProBiogen (Германия), Procogonia
(Израиль), ProteoDynamics (Франция), Prozyme (США), Vivalis (Франция). Таблица 3.
АББРЕВИАТУРЫ
2-АВ = 2-аминобензамид
ADCC = Антителозависимая клеточная цитотоксичность
ADEPT = Антитело-направленный фермент пролекарственной терапии
CDC = Комплементзависимая цитотоксичность
CDR = Участки, определяющие комплементарность
CE = Капиллярный электрофорез
CHO = Яичник китайского хомячка
cIEF = Капиллярное изоэлектрическое фокусирование
Da = Дальтон
DTT = Дитиотреитол
EPO = Эритропоэтин
ESI = Электрораспылительная ионизация
ESI-Q-IM-TOF = квадрупольная времяпролётная масс-спектрометрия с
электрораспылительной ионизацией
FcgammaRn = Неонатальный рецептор Fс
Fuc = Фукоза
Gal = Галактоза
GlcNAc = N-ацетилглюкозамин
НС = Тяжелая цепь
iCE280 = Капиллярный электрофорез с изоэлектрическим фокусированием
IEF = Изоэлектрическое фокусирование
IgG = Иммуноглобулин G
IT = Ионная ловушка
LC = Жидкостная хроматография
LIF = Лазерно-индуцированная флуоресценция
MAb = Моноклональное антитело
MALDI-TOF = Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
Man = Манноза
MS = Масс-спектрометрия
MS/MS = Тандемная масс-спектрометрия
NANA = N-ацетилнейроминовая кислота
NGNA = N-гликолилнейраминовая кислота
NMR = Ядерно-магнитный резонанс
NP-HPLC = Высокоэффективная жидкостная хроматография с нормальными фазами
NS0 = Клетки мышиной миеломы
PBMC = Мононуклеары периферической крови
PEG = Полиэтиленгликоль
PK = Фармакокинетика
RP-HPLC = Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография
scFv = Одноцепочечный фрагмент вариабельной области
SDS-PAGE = Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата
натрия (ДСН-ПААГ-электрофорез)
UPLC = Ультра-эффективная жидкостная хроматография
VH = Вариабельные домен тяжелой цепи
VL = Вариабельный домен легкой цепи
ZIC-HILIC = Гидрофильная жидкостная хроматография цвиттер-ионного типа
ПРИМЕЧАНИЯ
[1] Reichert, J. M., Rosensweig, C. J., Faden, L. B. and Dewitz, M. C. (2005) Nat. Biotechnol., 23(9), 1073-1078.
[2] Carter, P. J. (2006) Nat. Rev. Immunol., 6(5), 343-357.
[3] Jefferis, R. (2007) Expert. Opin. Biol. Ther., 7(9), 1401-1413.
[4] Jefferis, R. (2006) BioProcess International, 4(9), 40-43.
[5] Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M. and Dwek, R. A. (2007) Annu. Rev. Immunol., 25, 21-
50.
[6] Jefferis, R. (2005) Biotechnol. Prog., 21(1), 11-16.
[7] Raju, T. S. and Scallon, B. J. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun., 341(3), 797-803.
[8] Raju, T. S. (2003) BioProcess International, 1(4), 44-53.
[9] Freeze, H. H. (2006) Nat. Rev. Genet., 7(7), 537-551.
[10] Kanda, Y., Yamada, T., Mori, K., Okazaki, A., Inoue, M., Kitajima- Miyama, K., Kuni-Kamochi, R., Nakano,
R., Yano, K., Kakita, S., Shitara, K. and Satoh, M. (2007) Glycobiology., 17(1), 104-118.
[11] Jenkins, N., Parekh, R. B. and James, D. C. (1996) Nat. Biotechnol., 14(8), 975-981.
[12] Brekke, O. H., Michaelsen, T. E. and Sandlie, I. (1995) Immunol. Today, 16(2), 85-90.
[13] Salfeld, J. G. (2007) Nat. Biotechnol., 25(12), 1369-1372.
[14] Kawasaki, N., Ohta, M., Hyuga, S., Hyuga, M. and Hayakawa, T. (2000) Anal. Biochem., 285(1), 82-91.
[15] Shriver, Z., Raguram, S. and Sasisekharan, R. (2004) Nat. Rev. Drug Discov., 3(10), 863-873.
[16] Hamilton, S. R., Davidson, R. C., Sethuraman, N., Nett, J. H., Jiang, Y., Rios, S., Bobrowicz, P., Stadheim, T.
A., Li, H., Choi, B. K., Hopkins, D., Wischnewski, H., Roser, J., Mitchell, T., Strawbridge, R. R., Hoopes, J., Wildt,
S. and Gerngross, T. U. (2006) Science., 313(5792), 1441-1443.
[17] Nimmerjahn, F. and Ravetch, J. V. (2007) J. Exp. Med., 204(1), 11- 15.
[18] Magdelaine-Beuzelin, C., Kaas, Q., Wehbi, V., Ohresser, M., Jefferis, R., Lefranc, M. P. and Watier, H. (2007)
Crit. Rev. Oncol. Hematol., 64(3), 210-225.
[19] Walsh, G. and Jefferis, R. (2006) Nat. Biotechnol., 24(10), 1241- 1252.
[20] Krambeck, F. J. and Betenbaugh, M. J. (2005) Biotechnol. Bioeng., 92(6), 711-728.
[21] Reichert, J. M. and Valge-Archer, V. E. (2007) Nat. Rev. Drug Discov., 6(5), 349-356.
[22] Dübel, S. (2007) in Handbook of therapeuti antibodies, Technologies (Dübel, S. Ed.), Wiley-VCH Publishers,
Weinheim.
[23] Rother, R. P., Rollins, S. A., Mojcik, C. F., Brodsky, R. A. and Bell, L. (2007) Nat. Biotechnol., 25(11), 1256-
1264.
[24] Mimura, Y., Ashton, P. R., Takahashi, N., Harvey, D. J. and Jefferis, R. (2007) J. Immunol. Methods., 326(1-2),
116-126.
[25] Forrer, K., Hammer, S. and Helk, B. (2004) Anal. Biochem., 334(1), 81-88.
[26] van der Neut, Kolfschoten M., Schuurman, J., Losen, M., Bleeker, W. K., Martinez-Martinez, P., Vermeulen,
E., den Bleker, T. H., Wiegman, L., Vink, T., Aarden, L. A., De Baets, M. H., van de Winkel, J. G., Aalberse, R. C.
and Parren, P. W. (2007) Science., 317(5844), 1554-1557.
[27] Chelius, D., Huff Wimer, M. E. and Bondarenko, P. V. (2006) J. Am. Soc. Mass Spectrom., 17(11), 1590-1598.
[28] Huang, L. H., Biolsi, S., Bales, K. R. and Kuchibhotla, U. (2006) Anal. Biochem., 349(2), 197-207.
[29] Lim, A., Reed-Bogan, A. and Harmon, B. J. (2008) Anal. Biochem., 375(2), 163-172.
[30] Holland, M., Yagi, H., Takahashi, N., Kato, K., Savage, C. O. S., Goodall, D. M. and Jefferis, R. (2006)
Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 1760(4), 669-677.
[31] Qian, J., Liu, T., Yang, L., Daus, A., Crowley, R. and Zhou, Q. (2007) Anal. Biochem., 364(1), 8-18.
[32] Kleemann, G. R., Beierle, J., Nichols, A. C., Dillon, T. M., Pipes, G. D., and Bondarenko, P. V. (23-2-2008)
Anal. Chem., In press.
[33] Dubois, M., Fenaille, F., Clement, G., Lechmann, M., Tabet, J. C., Ezan, E. and Becher, F. (2008) Anal. Chem.,
80(5), 1737-1745.
[34] Carter, P., Presta, L., Gorman, C. M., Ridgway, J. B., Henner, D., Wong, W. L., Rowland, A. M., Kotts, C.,
Carver, M. E. and Shepard, H. M. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(10), 4285- 4289.
[35] Presta, L. G. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev., 58(5-6), 640-656.
[36] Martinez, T., Pace, D., Brady, L., Gerhart, M. and Balland, A. (2007) J. Chromatogr. A., 1156(1-2), 183-187.
[37] Werner, R. G., Kopp, K. and Schlueter, M. (2007) Acta Paediatr. (Suppl.), 96(455), 17-22.
[38] Zhang, Jinyou and Robinson, David (2005) Cytotechnology, 48(1), 59-74.
[39] Serrato, J. A., Hernandez, V., Estrada-Mondaca, S., Palomares, L. A. and Ramirez, O. T. (2007) Biotechnol.
Appl. Biochem., 47(Pt 2), 113-124.
[40] Seamans, T.C., Fries, S., Beck, A., Wurch, T., Chenu, S., Chan, C., Ushio, M., Bailey, J., Kejariwal, A.,
Ranucci, C., Villani, V., Ozuna, S., Goetsch, L., Corvaïa, N., Salmon, P., Robinson, D. and Chartrain, M. (2008)
BioProcess International, 6(3), 26-36.
[41] Seamans, T.C., Fries, S., Beck, A., Wurch, T., Chenu, S., Chan, C., Ushio, M., Bailey, J., Kejariwal, A.,
Ranucci, C., Villani, V., Ozuna, S., Goetsch, L., Corvaïa, N., Salmon, P., Robinson, D. and Chartrain, M. (2008)
BioProcess International 6(4), 34-42.
[42] Butler, M. (2005) Appl. Microbiol. Biotechnol., 68(3), 283-291.
[43] Birch, J. R. and Racher, A. J. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev., 58(5- 6), 671-685.
[44] Hokke, C. H., Bergwerff, A. A., van Dedem, G. W., van Oostrum, J., Kamerling, J. P. and Vliegenthart, J. F.
(1990) FEBS Lett., 275(1-2), 9 14.
[45] Hamilton, S. R. and Gerngross, T. U. (2007) Curr. Opin. Biotechnol., 18(5), 387-392.
[46] Sheeley, D. M., Merrill, B. M. and Taylor, L. C. (1997) Anal. Biochem., 247(1), 102-110.
[47] Beck, A., Klinguer-Hamour, C., Bussat, M. C., Champion, T.,
Haeuw, J. F., Goetsch, L., Wurch, T., Sugawara, M., Milon, A.,
Van Dorsselaer, A., Nguyen, T. and Corvaia, N. (2007) J. Pept.
Sci., 13(9), 588-602.
[48] Chung, C. H., Mirakhur, B., Chan, E., Le, Q. T., Berlin, J., Morse, M., Murphy, B. A., Satinover, S. M., Hosen,
J., Mauro, D., Slebos, R. J., Zhou, Q., Gold, D., Hatley, T., Hicklin, D. J. and Platts-Mills, T. A. (2008) N. Engl. J.
Med., 358(11), 1109-1117.
[49] Kamoda, S. and Kakehi, K. (2006) Electrophoresis., 27(12), 2495- 2504.
[50] Matamoros Fernandez, L. E., Kalume, D. E., Calvo, L., Fernandez, Mallo M., Vallin, A. and Roepstorff, P.
(2001) J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl., 752(2), 247-261.
[51] Kamoda, S., Ishikawa, R. and Kakehi, K. (2006) J. Chromatogr. A., 1133(1-2), 332-339.
[52] Chiba, Y. and Jigami, Y. (2007) Curr. opin. chem. Biol., 11(6), 670-676.
[53] Baumeister, H., Schöber, U., Stahn, R., Pettan, H. and Goletz, S. (2006) BioProcess International, 4(5), 36-41.
[54] Simmons, L. C., Reilly, D., Klimowski, L., Raju, T. S., Meng, G., Sims, P., Hong, K., Shields, R. L., Damico,
L. A., Rancatore, P. and Yansura, D. G. (2002) J. Immunol. Methods., 263(1-2), 133- 147.
[55] Frey, S., Haslbeck, M., Hainzl, O. and Buchner, J. (2008) Biol. Chem., 389(1), 37-45.
[56] Presta, L. G. (2005) J. Allergy Clin. Immunol., 116(4), 731-736.
[57] Jones, D., Kroos, N., Anema, R., van Montfort, B., Vooys, A., van der, Kraats S., van der, Helm E., Smits, S.,
Schouten, J., Brouwer, K., Lagerwerf, F., van Berkel, P., Opstelten, D. J., Logtenberg, T. and Bout, A. (2003)
Biotechnol. Prog., 19(1), 163-168.
[58] Beck, A., Bussat, M. C., Zorn, N., Robillard, V., Klinguer-Hamour, C., Chenu, S., Goetsch, L., Corvaia, N.,
Van Dorsselaer, A. and Haeuw, J. F. (2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 819(2), 203-218.
[59] Echelard, Y., Ziomek, C. A. and Meade, H. M. (2006) BioPharm International, 19(8), 36-46.
[60] Edmunds, T., Van Patten, S. M., Pollock, J., Hanson, E., Bernasconi, R., Higgins, E., Manavalan, P., Ziomek,
C., Meade, H., McPherson, J. M. and Cole, E. S. (1998) Blood, 91(12), 4561-4571.
[61] Rehder, D. S., Dillon, T. M., Pipes, G. D. and Bondarenko, P. V. (2006) J. Chromatogr. A., 1102(1-2), 164-
175.
[62] Srebalus Barnes, C. A. and Lim, A. (2007) Mass Spectrom. Rev., 26(3), 370-388.
[63] Wang, L. T., Amphlett, G., Lambert, J. M., Blattler, W. and Zhang, W. (2005) Pharm. Res., 22(8), 1338-1349.
[64] Beck, A., Wagner-Rousset, E., Goetsch, L. and Corvaïa, N. (2008) Screening Trends in Drug Discovery, 9, 18-
20.
[65] Wagner-Rousset, E., Bednarczyk, A., Bussat, M. C., Colas, O., Corvaïa, N., Schaeffer, C., Van Dorsselaer, A.,
and Beck, A. (2008) J. Chromatog. B: Biomed. Sci. Appl., In press.
[66] Michels, D. A., Brady, L. J., Guo, A. and Balland, A. (2007) Anal. Chem., 79(15), 5963-5971.
[67] Flatman, S., Alam, I., Gerard, J. and Mussa, N. (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,
848(1), 79-87.
[68] Li, N., Kessler, K., Bass, L. and Zeng, D. (2007) J. Pharm. Biomed. Anal., 43(3), 963-972.
[69] Guile, G. R., Rudd, P. M., Wing, D. R., Prime, S. B. and Dwek, R. A. (1996) Anal. Biochem., 240(2), 210-226.
[70] Royle, L., Radcliffe, C. M., Dwek, R. A. and Rudd, P. M. (2006) Methods Mol. Biol., 347:125-43., 125-143.
[71] Chen, X. and Flynn, G. C. (2007) Anal. Biochem., 370(2), 147-161.
[72] Cox, K. M., Sterling, J. D., Regan, J. T., Gasdaska, J. R., Frantz, K. K., Peele, C. G., Black, A., Passmore, D.,
Moldovan-Loomis, C., Srinivasan, M., Cuison, S., Cardarelli, P. M. and Dickey, L. F. (2006) Nat. Biotechnol.,
24(12), 1591-1597.
[73] Takegawa, Y., Deguchi, K., Keira, T., Ito, H., Nakagawa, H. and Nishimura, S. (2006) J. Chromatogr. A,
1113(1-2), 177-181.
[74] Callewaert, N., Geysens, S., Molemans, F. and Contreras, R. (2001) Glycobiology., 11(4), 275-281.
[75] Kogelberg, H., Tolner, B., Sharma, S. K., Lowdell, M. W., Qureshi, U., Robson, M., Hillyer, T., Pedley, R. B.,
Vervecken, W., Contreras, R., Begent, R. H. and Chester, K. A. (2007) Glycobiology., 17(1), 36-45.
[76] Kobata, A. (2007) Biochim. Biophys. Acta., 1780(3), 472-478.
[77] Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H. and Nakamura, M. (1989) Anal. Biochem.,
179(1), 162-166.
[78] Miura, Y., Shinohara, Y., Furukawa, J., Nagahori, N. and Nishimura, S. (2007) Chemistry., 13(17), 4797-4804.
[79] Gennaro, L. A. and Salas-Solano, O. (22-4-2008) Anal. Chem., In press.
[80] Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J. and Bondarenko, P. V. (2006) J. Am. Soc. Mass
Spectrom., 17(6), 867-872.
[81] Masuda, K., Yamaguchi, Y., Kato, K., Takahashi, N., Shimada, I. and Arata, Y. (2000) FEBS Lett., 473(3),
349-357.
[82] Lazar, G. A., Dang, W., Karki, S., Vafa, O., Peng, J. S., Hyun, L., Chan, C., Chung, H. S., Eivazi, A., Yoder, S.
C., Vielmetter, J., Carmichael, D. F., Hayes, R. J. and Dahiyat, B. I. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103(11),
4005-4010.
[83] Desjarlais, J. R., Lazar, G. A., Zhukovsky, E. A. and Chu, S. Y. (2007) Drug Discov. Today., 12(21-22), 898-
910.
[84] Karnoup, A. S., Kuppannan, K. and Young, S. A. (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,
859(2), 178-191.
[85] Gaza-Bulseco, G., Bulseco, A., Chumsae, C. and Liu, H. (2008) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed.
Life Sci., 862(1-2), 155- 160.
[86] Olivova, P., Chen, W., Chakraborty, A. B. and Gebler, J. C. (2008) Rapid Commun. Mass Spectrom., 22(1), 29-
40.
[87] Harris, R. J. (2005) Dev. Biol. (Basel)., 122, 117-127.
[88] Quan, C., Alcala, E., Petkovska, I., Matthews, D., Canova-Davis, E., Taticek, R. and Ma, S. (2008) Anal.
Biochem., 373(2), 179-191.
[89] Gadgil, H. S., Bondarenko, P. V., Pipes, G., Rehder, D., McAuley, A., Perico, N., Dillon, T., Ricci, M. and
Treuheit, M. (2007) J. Pharm. Sci., 96(10), 2607-2621.
[90] Zhang, B., Yang, Y., Yuk, I., Pai, R., McKay, P., Eigenbrot, C., Dennis, M., Katta, V. and Francissen, K. C.
(2008) Anal. Chem., .
[91] Krapp, S., Mimura, Y., Jefferis, R., Huber, R. and Sondermann, P. (2003) J. Mol. Biol., 325(5), 979-989.
[92] Woof, J. M. and Burton, D. R. (2004) Nat. Rev. Immunol., 4(2), 89- 99.
[93] Matsumiya, S., Yamaguchi, Y., Saito, J., Nagano, M., Sasakawa, H., Otaki, S., Satoh, M., Shitara, K. and Kato,
K. (2007) J. Mol. Biol., 368(3), 767-779.
[94] Yamaguchi, Y., Nishimura, M., Nagano, M., Yagi, H., Sasakawa, H., Uchida, K., Shitara, K. and Kato, K.
(2006) Biochim. Biophys. Acta., 1760(4), 693-700.
[95] Kato, K., Sasakawa, H., Kamiya, Y., Utsumi, M., Nakano, M., Takahashi, N. and Yamaguchi, Y. (2007)
Biochim. Biophys. Acta., 1780(3), 619-625.
[96] Sheridan, C. (2007) Nat. Biotechnol., 25(2), 145-146.
[97] Rosenfeld, R., Rosenberg, R., Olender, R., Plaschkes, I., Dabush, D., Himmelfarb, C., Smilansky, S., Boehme,
S., Forrer, K. and Ben-Yakar Maya, R. (2007) BioProcess International, 5(2), 38-47.
[98] Sharon, N. and Lis, H. (2001) Adv. Exp. Med. Biol., 491, 1-16.
[99] Filpula, D. (2007) Biomol. Eng., 24(2), 201-215.
[100] Umana, P, Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H. and Bailey, E. (1999) Nat. Biotechnol., 17(2), 176-180.
[101] Hodoniczky, J., Zheng, Y. Z. and James, D. C. (2005) Biotechnol. Prog., 21(6), 1644-1652.
[102] Ferrara, C., Brunker, P., Suter, T., Moser, S., Puntener, U. And Umana, P. (2006) Biotechnol. Bioeng., 93(5),
851-861.
[103] Rouwendal, G. J., Wuhrer, M., Florack, D. E., Koeleman, C. A., Deelder, A. M., Bakker, H., Stoopen, G. M.,
van, Die, I, Helsper, J. P., Hokke, C. H. and Bosch, D. (2007) Glycobiology., 17(3), 334- 344.
[104] Kanda, Y., Yamane-Ohnuki, N., Sakai, N., Yamano, K., Nakano, R., Inoue, M., Misaka, H., Iida, S.,
Wakitani, M., Konno, Y., Yano, K., Shitara, K., Hosoi, S. and Satoh, M. (2006) Biotechnol. Bioeng., 94(4), 680-
688.
[105] Iida, S., Misaka, H., Inoue, M., Shibata, M., Nakano, R., Yamane- Ohnuki, N., Wakitani, M., Yano, K.,
Shitara, K. and Satoh, M. (2006) Clin. Cancer Res., 12(9), 2879-2887.
[106] Satoh, M., Iida, S. and Shitara, K. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther., 6(11), 1161-1173.
[107] Niwa, R., Natsume, A., Uehara, A., Wakitani, M., Iida, S., Uchida, K., Satoh, M. and Shitara, K. (2005) J.
Immunol. Methods., 306(1- 2), 151-160.
[108] Shoji-Hosaka, E., Kobayashi, Y., Wakitani, M., Uchida, K., Niwa, R., Nakamura, K. and Shitara, K. (2006) J.
Biochem., 140(6), 777- 783.
[109] Jazayeri, J. A. and Carroll, G. J. (2008) BioDrugs, 22(1), 11-26.
[110] Natsume, A., Wakitani, M., Yamane-Ohnuki, N., Shoji-Hosaka, E., Niwa, R., Uchida, K., Satoh, M. and
Shitara, K. (2006) J. Biochem., 140(3), 359-368.
[111] Suzuki, E., Niwa, R., Saji, S., Muta, M., Hirose, M., Iida, S., Shiotsu, Y., Satoh, M., Shitara, K., Kondo, M.
and Toi, M. (2007) Clin. Cancer Res., 13(6), 1875-1882.
[112] Goetsch, L., Gonzalez, A., Leger, O., Beck, A., Pauwels, P. J., Haeuw, J. F. and Corvaia, N. (2005) Int. J.
Cancer., 113(2), 316- 328.
[113] Cai, Z., Zhang, G., Zhou, Z., Bembas, K., Drebin, J. A., Greene, M. I., and Zhang, H. (11-2-2008) Oncogene.,
In press.
[114] Zhou, Q., Shankara, S., Roy, A., Qiu, H., Estes, S., McVie-Wylie, A., Culm-Merdek, K., Park, A., Pan, C. and
Edmunds, T. (2008) Biotechnol. Bioeng., 99(3), 652-665.
[115] Zhu, L., Van de Lavoir, M. C., Albanese, J., Beenhouwer, D. O., Cardarelli, P. M., Cuison, S., Deng, D. F.,
Deshpande, S., Diamond, J. H., Green, L., Halk, E. L., Heyer, B. S., Kay, R. M., Kerchner, A., Leighton, P. A.,
Mather, C. M., Morrison, S. L., Nikolov, Z. L., Passmore, D. B., Pradas-Monne, A., Preston, B. T., Rangan, V. S.,
Shi, M., Srinivasan, M., White, S. G., Winters- Digiacinto, P., Wong, S., Zhou, W. and Etches, R. J. (2005) Nat.
Biotechnol., 23(9), 1159-1169.
[116] Sibéril, S., De Romeuf, C., Bihoreau, N., Fernandez, N., Meterreau, J. L., Regenman, A., Nony, E., Gaucher,
C., Glacet, A., Jorieux, S., Klein, P., Hogarth, M. P., Fridman, W. H., Bourel, D., Béliard, R. and Teillaud, J. L.
(2006) Clin. Immunol., 118(2-3), 170-179.
[117] Li, H., Sethuraman, N., Stadheim, T. A., Zha, D., Prinz, B., Ballew, N., Bobrowicz, P., Choi, B. K., Cook, W.
J., Cukan, M., Houston- Cummings, N. R., Davidson, R., Gong, B., Hamilton, S. R., Hoopes, J. P., Jiang, Y., Kim,
N., Mansfield, R., Nett, J. H., Rios, S., Strawbridge, R., Wildt, S. and Gerngross, T. U. (2006) Nat. Biotechnol.,
24(2), 210-215.
[118] Nechansky, A., Schuster, M., Jost, W., Siegl, P., Wiederkum, S., Gorr, G. and Kircheis, R. (2007) Mol.
Immunol., 44(7), 1815-1817.
[119] Beliard, R., Waegemans, T., Notelet, D., Massad, L., Dhainaut, F., Romeuf, C., Guemas, E., Haazen, W.,
Bourel, D., Teillaud, J. L. and Prost, J. F. (2008) Br. J. Haematol., 141(1), 109-119.
[120] Kumpel, B. M. (2007) Vox Sang., 93(2), 99-111.
[121] De Romeuf, C., Dutertre, C. A., Garff-Tavernier, M., Fournier, N., Gaucher, C., Glacet, A., Jorieux, S.,
Bihoreau, N., Behrens, C. K., Beliard, R., Vieillard, V., Cazin, B., Bourel, D., Prost, J. F., Teillaud, J. L. and Merle-
Beral, H. (2008) Br. J. Haematol., 140(6), 635-643.
[122] Yano, H., ishida, T., Inagaki, A., Ishii, T., ding, J., Kusumoto, S., Komatsu, H., Iida, S., Inagaki, H. and Ueda,
R. (2007) Clin. Cancer Res., 13(21), 6494-6500.
[123] Shi, X. and Jarvis, D. L. (2007) Curr. Drug Targets., 8(10), 1116- 1125.
[124] Saint-Jore-Dupas, C., Faye, L. and Gomord, V. (2007) Trends Biotechnol., 25(7), 317-323.
[125] Takahashi, N., Ishii, I., Ishihara, H., Mori, M., Tejima, S., Jefferis, R., Endo, S. and Arata, Y. (1987)
Biochemistry, 26(4), 1137-1144.
[126] Wada, Y., Azadi, P., Costello, C. E., Dell, A., Dwek, R. A., Geyer, H., Geyer, R., Kakehi, K., Karlsson, N. G.,
Kato, K., Kawasaki, N., Khoo, K. H., Kim, S., Kondo, A., Lattova, E., Mechref, Y., Miyoshi, E., Nakamura, K.,
Narimatsu, H., Novotny, M. V., Packer, N. H., Perreault, H., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G., Reinhold, V. N.,
Rudd, P. M., Suzuki, A. and Taniguchi, N. (2007) Glycobiology, 17(4), 411-422.
[127] Wright, A. and Morrison, S. L. (1998) J. Immunol., 160(7), 3393- 3402.
[128] Lobo, E. D., Hansen, R. J. and Balthasar, J. P. (2004) J. Pharm. Sci., 93(11), 2645-2668.
[129] Tang, L., Persky, A. M., Hochhaus, G. and Meibohm, B. (2004) J. Pharm. Sci., 93(9), 2184-2204.
[130] Suzuki, N. and Lee, Y. C. (2004) Glycobiology, 14(3), 275-292.
[131] Kost, T. A., Condreay, J. P. and Jarvis, D. L. (2005) Nat. Biotechnol., 23(5), 567-575.
[132] Gomord, V., Chamberlain, P., Jefferis, R. and Faye, L. (2005) Trends Biotechnol., 23(11), 559-565.
[133] Bakker, H., Rouwendal, G. J. A., Karnoup, A. S., Florack, D. E. A., Stoopen, G. M., Helsper, J. P. F. G., Van
Ree, R., Van Die, I. and Bosch, D. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(20), 7577-7582.
[134] Wildt, S. and Gerngross, T. U. (2005) Nat. Rev. Microbiol., 3(2), 119-128.
[135] Kainz, E., Gallmetzer, A., Hatzl, C., Nett, J. H., Li, H., Schinko, T., Pachlinger, R., Berger, H., Reyes-
Dominguez, Y., Bernreiter, A., Gerngross, T., Wildt, S. and Strauss, J. (2008) Appl. Environ. Microbiol., 74(4),
1076-1086.
[136] Garcia-Casado, G., Sanchez-Monge, R., Chrispeels, M. J., Armentia, A., Salcedo, G. and Gomez, L. (1996)
Glycobiology, 6(4), 471- 477.
[137] Zeitlin, L., Olmsted, S. S., Moench, T. R., Co, M. S., Martinell, B. J., Paradkar, V. M., Russell, D. R., Queen,
C., Cone, R. A. and Whaley, K. J. (1998) Nat. Biotechnol., 16(13), 1361-1364.
[138] Ma, J. K. and Vine, N. D. (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 236, 275-292.
[139] Tekoah, Y., Ko, K., Koprowski, H., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Dwek, R. A. and Rudd, P. M. (2004)
Arch. Biochem. Biophys., 426(2), 266-278.
[140] Bardor, M., Cabrera, G., Rudd, P. M., Dwek, R. A., Cremata, J. A. and Lerouge, P. (2006) Curr. Opin. Struct.
Biol., 16(5), 576-583.
[141] Schuster, M., Jost, W., Mudde, G. C., Wiederkum, S., Schwager, C., Janzek, E., Altmann, F., Stadlmann, J.,
Stemmer, C. and Gorr, G. (2007) Biotechnol. J., 2(6), 700-708.
[142] Decker, E. L. and Reski, R. (2007) Curr. Opin. Biotechnol., 18(5), 393-398.
[143] Schahs, M., Strasser, R., Stadlmann, J., Kunert, R., Rademacher, T. and Steinkellner, H. (2007) Plant
Biotechnol. J., 5(5), 657-663.
[144] Chandrasekaran, A., Srinivasan, A., Raman, R., Viswanathan, K., Raguram, S., Tumpey, T. M., Sasisekharan,
V. and Sasisekharan, R. (2008) Nat. Biotechnol., 26(1), 107-113.
[145] Jefferis, R. (2005) Adv. Exp. Med. Biol., 564, 143-148.
[146] Kaneko, Y., Nimmerjahn, F. and Ravetch, J. V. (2006) Science, 313(5787), 670-673. [147] Scallon, B. J.,
Tam, S. H., McCarthy, S. G., Cai, A. N. and Raju, T. S. (2007) Mol. Immunol., 44(7), 1524-1534.
[148] Warnock, D., Bai, X. M., Autote, K., Gonzales, J., Kinealy, K., Yan, B., Oian, J., Stevenson, T., Zopf, D. and
Bayer, R. J. (2005) Biotechnol. Bioeng., 92(7), 831-842.
[149] Keck, R., Nayak, N., Lerner, L., Raju, S., Ma, S., Schreitmueller, T., Chamow, S., Moorhouse, K., Kotts, C.
and Jones, A. (2008) Biologicals, 36(1), 49-60.
[150] Jones, A. J., Papac, D. I., Chin, E. H., Keck, R., Baughman, S. A., Lin, Y. S., Kneer, J. and Battersby, J. E.
(2007) Glycobiology, 17(5), 529-540.
[151] Hinton, P. R., Xiong, J. M., Johlfs, M. G., Tang, M. T., Keller, S. and Tsurushita, N. (2006) J. Immunol.,
176(1), 346-356.
[152] Millward, T. A., Heitzmann, M., Bill, K., Langle, U., Schumacher, P. and Forrer, K. (2008) Biologicals, 36(1),
41-47.
[153] Dall'Acqua, W. F., Kiener, P. A. and Wu, H. (2006) J. Biol. Chem., 281(33), 23514-23524.
[154] Raju, T. S. and Scallon, B. (2007) Biotechnol. Prog., 23(4), 964- 971.
[155] Lazar, A. C., Wang, L., Blattler, W. A., Amphlett, G., Lambert, J. M. and Zhang, W. (2005) Rapid Commun.
Mass Spectrom., 19(13), 1806-1814.
[156] Wu, A. M. and Senter, P. D. (2005) Nat. Biotechnol., 23(9), 1137- 1146.
[157] Vogel, C. W. (2004) Methods Mol. Biol., 283, 87-108.
[158] Boeggeman, E., Ramakrishnan, B., Kilgore, C., Khidekel, N., Hsieh-Wilson, L. C., Simpson, J. T. and Qasba,
P. K. (2007) Bioconjug. Chem., 18(3), 806-814.
[159] Van, Walle, I, Gansemans, Y., Parren, P. W., Stas, P. and Lasters, I. (2007) Expert. Opin. Biol. Ther., 7(3),
405-418.
