Стратегии мечения гликанов и их применение для идентификации и количественного определения

Стратегии мечения гликанов и их применение для идентификации и количественного определения

Краткий обзор Для большинства методов анализа олигосахаридов из биологических источников требуется этап дериватизации гликанов: гликаны могут быть дериватизированы путём введения хромофора или флуорофора, облегчающих их детектирование после хроматографического или электрофоретического разделения. Дериватизацию можно также применять для присоединения заряженных или гидрофобных групп к восстанавливающему концу, что увеличивает разделение и масс-спектрометрическое детектирование гликанов. Более того, такие этапы дериватизации, как перметилирование, нацелены на стабилизацию остатков сиаловой кислоты, увеличение масс-спектрометрической чувствительности и способствование подробной структурной характеризации с помощью (тандемной) масс-спектрометрии. Наконец, метки многих гликанов служат в качестве связующих звеньев для прикрепления олигосахаридов к поверхностям или белкам-носителям, что позволяет проводить исследования взаимодействия с углеводсвязывающими белками. В настоящем обзоре обсуждаются различные стороны стратегий мечения гликанов, их разделения и детектирования.

Ключевые слова: капиллярный электрофорез, углевод, дериватизация, жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, обзор

Список сокращений

2-АК – 2-аминобензойная кислота

2-АБ – 2-аминобензамид

АНТС – 2-аминонафталинтрисульфоновая кислота

АПТС – 1-аминопирен-3,6,8-трисульфоновая кислота

БАКГ – 6-(биотинил)-аминокапроилгидразид

ФЭ – фоновый электролит

БНАГ – биотинил-L-3-(2-нафтил)-аланингидразид

БОК – трет-бутоксикарбонил

УСБ – углеводсвязывающий белок

КЭ – капиллярный электрофорез

КГЭ – капиллярный гель-электрофорез

СИД – столкновительно-индуцированная диссоциация

ДГБ – 2,5-дигидроксибензойная кислота

ЭРИ – электрораспылительная ионизация

GU – единица глюкозы

HILIC – гидрофильная хроматография

ВЭАОХ – высокоэффективная анионообменная хроматография

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ЖХ – жидкостная хроматография

МАЛДИ – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

МЭКХ – мицеллярная электрокинетическая хроматография

АП – 2-аминопиридин

ИАД – импульсное амперометрическое детектирование

ПГУ – пористый графитизированный углерод

ФМП – 1-фенил-3-метил-5-пиразолон

ОФ – обращённая фаза, обращённо-фазовый

RSD – относительное стандартное отклонение

ТФЭ – твердофазная экстракция

ВП – времяпролётный

Введение

Анализ гликанов всё чаще применяется в биологических исследованиях, клиническом анализе и фармацевтическом биотехнологическом производстве. Конкретные профили гликозилирования связывают с состояниями здоровья или болезни [1–4]. Более того, изменения, вызванные гликозилированием, могут модулировать биологическую активность белков, что продемонстрировано на примере гликозилирования части Fc рекомбинантного иммуноглобулина G [5, 6].

Многие подходы к анализу олигосахаридов, входящих в гликопротеины, описаны в [7–9], а стратегии анализа гликозилирования иммуноглобулина G (природного и рекомбинантного) недавно были обобщены в [10]. Большое количество методов направлено на анализ отщеплённых и затем дериватизированных гликанов. Эти подходы позволяют провести углубленный анализ строения олигосахаридов независимо от несущего гликопротеина, но не дают никакой информации об участке присоединения гликана. Поскольку применение методов разделения с оптическим или масс-спектрометрическим детектированием для характеризации гликанов затруднено отсутствием хромофора или их низкими ионизационными свойствами, то применяется обширный набор стратегий дериватизации с большим количеством различных меток.

В настоящем обзоре рассматриваются различные методики, применяемые для дериватизации гликанов, например, восстановительное аминирование, реакция Михаэля, мечение гидразидом и перметилирование, а также рассматриваются некоторые вопросы очистки дериватизированных гликанов. Кроме того, будут рассмотрены стратегии анализа меченых олигосахаридов с помощью методик хроматографического, электромиграционного разделения, масс-спектрометрии (МС), а также использование этих методик для количественного определения. Будут обсуждаться критерии выбора стратегий дериватизации и методов детектирования.

Стратегии дериватизации

В литературе описано большое число стратегий дериватизации гликанов. Наиболее широко используемой реакцией является восстановительное аминирование. Также часто применяется перметилирование. Кроме того, в качестве альтернативных реакций могут использоваться реакция Михаэля или мечение гидразидом. Для реакции мечения могут применяться различные соединения, вводящие требуемую функциональную группу. Применение конкретного метода отщепления может накладывать ограничения на выбор методов мечения. Восстановительное аминирование, реакция Михаэля и мечение гидразидом применяются при наличии у гликана восстанавливающего конца, который отсутствует у O-гликанов, отщепляемых с помощью восстановительного β-элиминирования. Реактивы для мечения обычно присутствуют в большом избытке, и в большинстве аналитических методик необходимо провести обработку образца, чтобы удалить избыток этих реактивов. Наиболее часто для этого используются эксклюзионная хроматография и твердофазная экстракция (ТФЭ).

Методы отщепления

Необходимым условием детектирования олигосахаридов является наличие эффективного и надёжного метода отщепления их от белковых или пептидных остовов [7]. Известно несколько методов отщепления N-гликанов и O-гликанов (см. рисунок 1) [7–19].

Обычно отщепление N-гликанов проводят ферментативно с помощью ПНГазы F или A (см. рисунок 1). В гидразинолизном подходе, применяемом как для N-гликанов, так и для
O-гликанов [7,18, 19], образуются гликаны со свободным восстанавливающим концом. Даже не смотря на то, что механизм реакции гидразинолиза не до конца ясен, принято считать, что гликан отщепляется на начальном этапе β-элиминирования, а затем происходит реакция с гидразидом, в результате чего образуется гидразон [19]. Данный метод имеет значительные недостатки, такие как необходимость использования безводного гидразина, который является высокотоксичным и взрывоопасным химическим веществом, применяемым также в качестве ракетного топлива [20]. Различные группы указали ещё на несколько недостатков метода гидразинолиза: например, отщепление O-гликанов путём гидразинолиза, за которым должны произойти пере-N-ацетилирование и соответствующий этап расщепления ацетогидразона, которые являются ключевыми для получения интактных гликанов со свободным восстанавливающим концом [7, 9, 18–23].

Ферментативное отщепление O-гликанов имеет весьма ограниченное использование ввиду очень узкой субстратной специфичности имеющихся ферментов. На рынке доступны только две O-гликаназы [7], использование которых, к сожалению, ограничивается отщеплением незамещённого кора 1 дисахарида Galβ1-3GalNacα, связанного с серином или треонином. Таким образом, химическое отщепление является основным методом высвобождения O-связанных олигосахаридов; имеются также сообщения о некоторых других методах (см. рисунок 1), все из которых, однако, имеют риск того, что может пройти нежелательный этап распада, называемый реакцией «отщепления» («peeling») [19]. Отщеплением (peeling) называют основно-катализируемую реакцию элиминирования, в результате которой происходит потеря заместителя по третьему положению в наиболее близком к кору остатке олигосахарида [19].

Восстановительное аминирование

Реакция

С помощью восстановительного аминирования можно пометить восстанавливающий конец гликанов.. В данной реакции происходит конденсация метки, содержащей первичную аминогруппу, и альдегидной группы гликана, в результате чего образуются имин или основание Шиффа, которые затем восстанавливаются до вторичного амина (см. рисунок 2a). Реакция часто проводится в диметилсульфоксиде в присутствии уксусной кислоты [24], но описаны также альтернативные подходы, в которых используются тетрагидрофуран [25] и метанол [26]. Преимуществом данного метода мечения является стехиометрическое взаимодействие метки и гликана в соотношении 1:1, что позволяет провести прямое количественное определение по интенсивности флуоресценции или УФ-поглощения.

Метки

Для восстановительного аминирования гликанов используют различные метки. В двух обзорах [27, 28] приведён обширный, хотя и не полный перечень меток, используемых для восстановительного аминирования. Наиболее широко применяемыми метками являются
2-аминобензамид (2-АБ), 2-аминобензойная кислота (2-АК), 2-аминопиридин (АП),
2-аминонафталинтрисульфоновая кислота (АНТС) и 1-аминопирен-3,6,8-трисульфоновая кислота (АПТС). Доступны наборы для мечения метками 2-АБ, 2-АА и АП (см., например, http://www.ludger.com), а также для мечения АПТС (см. http://www.beckmancoulter.com) и АНТС (см. http://www.prozyme.com). Метка 2-АБ имеет дефицит отрицательного заряда и широко применяется в хроматографическом анализе. Была создана обширная база данных, в которой используются нормированные положения пиков элюирования помеченных 2-АБ гликанов в гидрофильной хроматографии (HILIC) с флуоресцентным детектированием, по которым можно присвоить гликану определённое строение [29]. Также в анализе профиля с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) широко используется метка АП [30, 31], и для неё также были созданы базы, позволяющие присвоить гликанам определённое строение по нормированным положениям пиков элюирования [32]. Одним из главных недостатков АП является необходимость проводить его перекристаллизацию перед использованием, поскольку имеющаяся в продаже субстанция не обладает достаточной чистотой. Метка 2-АК имеет один отрицательный заряд, что делает её универсальной. Она используется в разделениях, проводимых с помощью ВЭЖХ и капиллярного электрофореза (КЭ), а также в анализе матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов, позволяя детектировать как нейтральные, так и сиалированные молекулы гликанов. [33–36]. Метка АПТС имеет три отрицательных заряда и поэтому хорошо подходит для КЭ и капиллярного гель-электрофореза (КГЭ; см. ниже) [37, 38]. Однако олигосахариды, помеченные АПТС, трудно анализировать с помощью МАЛДИ [39].

Также была изучена возможность применения в количественном определении других меток: для анализа гликозилирования вводилась метка A [D4]АП [40]. Были получены обнадёживающие результаты; однако при разделении гликанов, помеченных [H4]АП и [D4]АП, на колонке C18, наблюдались небольшие различия времён удерживания. Испытания на других неподвижных фазах не проводились [40].

В альтернативном подходе олигосахариды из хондроитинсульфатов были помечены [H4]2-АК или [D4]2-АК [41, 42], а разделение было проведено с помощью эксклюзионного метода, что позволило избежать возможных смещений времени удерживания. Был достигнут сдвиг массы только в 4 Да, что могло привести к частичному наложению изотопных огибающих пары гликанов при масс-спектрометрическом детектировании. В другом методе олигосахариды метят аланином [12C6] и аланином [13C6] [43, 44]. При использовании данного подхода разница между двумя различными гликанами составляет 6 Да, что является достаточным, чтобы получить высокое разрешение изотопного распределения пар гликанов при МС. Более того, удаётся избежать использования дейтерия, и поэтому на колонках C18 не наблюдается сдвигов удерживания.

Восстановитель

Наиболее широко в качестве восстановителя применяется цианоборогидрид натрия. Сообщалось об очень высоких выходах помеченных олигосахаридов при использовании данного соединения [24]. Также в качестве восстановителя используются триацетоксиборогидрид натрия [45] и диэтеламин-боран [46]; однако в области анализа гликанов эти соединения применяются не столь широко.

Недавно мы описывали применение 2-пиколин-борана в качестве альтернативы для восстановительного аминирования олигосахаридов с помощью 2-АК и 2-АБ [47]. Применение цианоборогидрида натрия приводит к выделению токсичного соединения циановодорода, а 2-пиколин-боран является эффективной и нетоксичной альтернативой. При сравнении этих двух соединений мы наблюдали одинаковую эффективность в восстановительном аминировании при использовании различных меток, таких как АПТС (результаты не опубликованы), 2-АК и 2-АБ [47]. Более того, 2-пиколин-боран можно использовать как в водных, так и неводных условиях [47]. Благодаря своим превосходным свойствам 2-пиколин-боран полностью заместил цианоборогидрид натрия в протоколах гликоанализа, используемых в нашей лаборатории, и мы надеемся, что то же самое произойдёт и в других лабораториях.

Оптимальные условия реакции

Об оптимальных условиях реакции восстановительного аминирования N-гликанов метками 2-АБ и 2-АК и при использовании в качестве восстановителя NaCNBH3 сообщили Bigge и др. в 1995 г. [24]. Была рекомендована концентрация метки 0,25 М или выше, а концентрация восстановителя – не менее 1 М. Дериватизация увеличивается при добавлении ледяной уксусной кислоты вплоть до концентрации 30 % (об/об). Было установлено, что оптимальной температурой реакции являются 60 °C. В данных условиях все гликаны дериватизируются в течение 2 ч, а реакции распада гликанов, такие как кислотно-катализируемая потеря сиаловой кислоты, минимизированы. В другом исследовании было оценено влияние различных кислот на дериватизацию олигосахаридов меткой АПТС [48]. Было показано, что при проведении дериватизации при 37 °C в течение 16 ч использование кислот с низкими значениями pKa, таких как лимонная, яблочная и малоновая кислоты, даёт более высокий выход по сравнению с использованием уксусной кислоты. При более высоких температурах и в очень кислой среде произойдёт частичный распад гликанов, сопровождающийся потерей сиаловых кислот [49].

Реакция Михаэля

Мечение восстанавливающего конца гликанов посредством реакции Михаэля такими реактивами, как 1-фенил-3-метил-5-пиразолон (ФМП), проводится в щелочных условиях [50]. Это позволяет избежать значительного риска потери сиаловых кислот в кислой среде, который имеется в реакции восстановительного аминирования (см. выше).

Данная реакция представляет собой нуклеофильное присоединение карбаниона к α,β-ненасыщенному карбонильному соединению и является одним из наиболее эффективных методов мягкого образования связей C–C. Подробное структурное описание этой методики мечения гликанов, включая общую схему реакции, было дано You и др. [50]; в упрощённом виде описание реакции представлено на рис. 2b. Наиболее часто применяются такие метки, как ФМП [51, 52] или его метоксилированный аналог 1-(п-метокси)-фенил-3-метил-5-пиразолон [53]. Реакция дериватизации представляет собой основно-катализируемую реакцию Михаэля, а процесс мечения проходит в два этапа и включает превращение молекул метки в донорные молекулы Михаэля и последующее их присоединение к восстанавливающему концу гликана в стехиометрическом соотношении две молекулы метки на одну молекулу гликана (II на рис. 2b; [50]). После присоединения первой молекулы метки происходит потеря молекулы воды [50], что приводит к образованию α,β-ненасыщенного карбонильного соединения. На следующем этапе присоединяется вторая молекула метки, и образуется 1,4-продукт присоединения Михаэля. You и др. [50] ввели новый реактив для мечения гликанов в присутствии ионов аммония в качестве катализатора – 1-(2-нафтил)-3-метил-5-пиразолон, в результате чего увеличилась чувствительность УФ-детектирования, а реакция протекала быстрее по сравнению с применявшимся ранее ФМП [50].

Использование ФМП и родственных меток ограничено, так как до сих пор не сообщалось о наличии у таких меток флуоресценции. Более того, поскольку к гликану присоединяются две молекулы метки, хроматографические свойства дериватизированных олигосахаридов определяются этими метками, что может оказать неблагоприятное влияние на разделение изомеров.

Мечение гидразидом

Другую методику мечения можно выполнить с помощью реакции гликанов с метками, предоставляющими гидразидную концевую группу (механизм реакции см. на рис. 2c). Мечение гидразидом может проводиться для масс-спектрометрического детектирования [54] в сочетании с хроматографией [55] или для анализа биомолекулярного взаимодействия [56–59].

Lattova и Perreault [54] продемонстрировали, что превращение моносахаридов и олигосахаридов в соответствующие фенилгидразоны является количественным; это означает, что после проведения методики мечения на масс-спектрах не наблюдаются непрореагировавшие сахара [54]. Кроме того, было показано, что низкие пикомолярные концентрации образца являются достаточными для того, чтобы провести структурную идентификацию с помощью МАЛДИ-МС и масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (electrospray ionization; ЭРИ) [55]. Благодаря такой метке, как триметиламмонийэтангидразид (реактив Жирара Т), на восстанавливающем конце гликана появляется постоянный положительный заряд [60]. Эта метка является пригодной для чувствительного анализа гликанов с помощью МАЛДИ-времяпролётной (ВП)-МС.

Shinohara и др. [58] были одними из первых, кто использовал мечение олигосахаридов гидразидом для введения биотиновой метки, что позволило провести дальнейшие исследования биомолекулярного взаимодействия путём иммобилизации гликанов на носителях, покрытых стрептавидином [58]. Затем последовало несколько применений данного подхода, включающих получение различных производных гидразидов [56, 57]. Leteux и др. [56] описали получение производных соединений биотингидразида и олигосахаридов с помощью биотинил-L-3-(2-нафтил)-аланингидразида (БНАГ) и 6-(биотинил)-аминокапроилгидразида (БАКГ), у которых кольцо моносахарида в восстанавливающем конце невосстановленное. В этом исследовании сравнивались производные соединения, полученные с помощью БНАГ, БАКГ и 2-амино-(6-амидобиотинил)пиридина (последний был получен в условиях восстановительного аминирования. Метка БНАГ имеет две выгодные особенности: наличие хромофора/флуорофора [подобно 2-амино-(6-амидобиотинил)пиридину] в сочетании с наличием интактного пиранозного кольца помеченного гликана (подобно производным соединениям, полученным с помощью БАКГ) [56]. Далее эти же авторы провели важное исследование, в котором те же метки гликанов, конъюгированные с олигосахаридами на стрептавидиновой матрице, использовались для исследования их взаимодействия с моноклональными антителами, адгезивными молекулами и E-, P- и L-селектинами [57].

(Пер-)метилирование

При перметилировании атомы водорода гидроксильной, амино- и карбоксильной групп замещаются метильными радикалами, в результате чего образуются гидрофобные производные соединения сахаров (рис. 2d) [61]. Этот этап дериватизации очень выгоден, так как он увеличивает мощность сигнала олигосахаридов в МС в сочетании как с ЭРИ, так и с МАЛДИ [8]. Перметилирование облегчает интерпретацию спектра, так как и кислотные, и нейтральные структуры могут быть измерены в режиме регистрации положительных ионов [62], поскольку сиаловые кислоты после проведения методики стабилизированы [22]. Более того, тандемная МС натриевых аддуктов перметилированных гликанов даёт подробную информацию о положениях связей [63]. При структурной характеризации гликанов перметилированию часто предшествует восстановление альдозы восстанавливающего конца борогидридом натрия до альдита с открытым кольцом, в результате чего происходит мечение массой, облегчающее интерпретацию спектра [63].

Ciucanu и Kerek [64] ввели базовый протокол перметилирования, который стал стандартной методикой и применяется во многих случаях лишь с небольшими изменениями для анализа как O-гликанов, так и N-гликанов [50, 62, 63, 65–68]. Morelle и Michalski [22] представили подробный пошаговый протокол и обобщили преимущества и недостатки данной методики. Недавно Kang и др. [69] предложили упаковывать твёрдую фазу (гидроксид натрия в виде гранул меш или порошка) в колонки microspin или в кварцевые капилляры, так как это позволяет провести за короткое время эффективную и количественную дериватизацию олигосахаридов в микромасштабе [69]. Позднее авторы приспособили этот миниатюрный подход для создания высокопропускного метода и объединили его со стратегией мечения изотопами [70, 71].

Недавно был введён интересный подход последовательного двойного перметилирования для анализа сульфатированных гликанов. Вкратце, образцы сульфатированных гликанов подвергают перметилированию до метанолитического отщепления их сульфатных групп. Далее эти олигосахариды подвергают второму этапу перметилирования, на котором проводят мечение дейтерометилиодидом гидроксильных групп, образовавшихся в результате метанолиза. Сравнивая МС2-спектры столкновительно-индуцированной диссоциации (СИД) перметилированного и перметилированного и дейтерометилированного образцов, можно рассчитать исходное число сульфатных групп в гликане. Данный метод позволяет проводить детектирование и структурную характеризацию сульфатированных гликанов с помощью МС, избегая при этом подавления сигнала вследствие наличия сульфатных групп [72].

В альтернативных протоколах метилирования происходит только превращение карбоксильных групп моносахаридов, таких как сиаловые кислоты, в метиловые эфиры, что приводит к стабилизации связей сиаловых кислот для последующего масс-спектрометрического анализа [73].

Стратегии очистки

После дериватизации часто необходимо очистить помеченные гликаны до проведения анализа. Должен быть удалён не только избыток солей (например, для МАЛДИ анализа), но также необходимо уменьшить концентрацию метки, которая обычно присутствует в большом избытке на этапе мечения. Для этой цели применяются пять основных стратегий: твердофазная экстракция (ТФЭ) [22, 29, 34, 74, 75], жидкостно-жидкостная экстракция [64], гель-фильтрация [76, 77], бумажная хроматография [23] и осаждение [75]. Типичные примеры стратегий очистки приведены в таблице 1. ТФЭ проводится главным образом после восстановительного аминирования и мечения гидразидом [55], в то время как жидкостно-жидкостная экстракция является предпочтительным методом после перметилирования [61, 64, 69] или реакции Михаэля [51, 52, 78]. В методике перметилирования за жидкостно-жидкостной экстракцией может последовать ТФЭ C18 [79]. Бумажная хроматография может быть использована после восстановительного аминирования и мечения гидразидом [19, 80]. Осаждение ацетоном широко не применяется, но может быть использовано для удаления белков [75]. Данные стратегии сильно различаются по сложности и затрате времени на обработку образцов. Среди этих пяти стратегий предпочтительным методом анализа больших наборов образцов является ТФЭ, так как её можно приспособить для высокопропускных устройств [34]. Существует относительно большое разнообразие неподвижных фаз для ТФЭ, и её широко используют для очистки дериватизированных гликанов. Для очистки дериватизированных гликанов с помощью ТФЭ используются несколько неподвижных фаз: обращённая фаза (ОФ), пористый графитизированный углерод (ПГУ), HILIC и анионообменная хроматография.

Получение природными гликанама гидрофобных свойств посредством дериватизации (например, с помощью метки 2-АБ; см. также ниже) необходимо для их адсорбции к обращённо-фазовому материалу, поскольку недериватизированные гликаны не обладают достаточным удерживанием в этом материале.

ПГУ первоначально и наиболее широко применялся для недериватизированных гликанов [81], однако имеются сообщения о его использовании для помеченных гликанов [82, 83]. Этот оптимизированный метод является высокоспецифичным для гликанов, даже несмотря на то, что его механизм не до конца ясен [84]. Элюирование обычно проводится смесью ацетонитрил/вода, содержащей трифторуксусную кислоту (таблица 1). Недостатками данного метода являются сравнительно высокая стоимость ПГУ и то, что избыток метки, в зависимости от её свойств, может быть и не удалён.

Развивается подход по очистке главным образом восстановительно аминированных гликанов с помощью HILIC [29, 33, 34]. Описано несколько неподвижных фаз для HILIC. В данном подходе гликаны удерживаются за счёт своих гидрофильных свойств, тогда как избыток менее гидрофильной метки может быть удалён. Недавно мы описывали применение целлюлозы для очистки гликанов, помеченных 2-АК, на высокопропускной платформе [34]. Так как дериватизированные гликаны можно элюировать водой, образцы могут храниться непосредственно, без риска кислотно-катализируемого гидролиза сиаловых кислот.

К стратегиям очистки гликанов можно также отнести фракционирование с помощью анионообменной хроматографии олигосахаридов, помеченных АП или 2-АБ, которое позволяет отделить нейтральные гликаны от сиалированных [92, 93].

Таблица 1 – Очистка образцов после мечения гликанов

Продолжение таблицы 1

ТФЭ – твердофазная экстракция; ОФ – обращённая фаза; ПГУ – пористый графитизированный углерод; HILIC – гидрофобная хроматография; ВА – восстановительное аминирование; МГ – мечение гидразидом; БАКГ – 6-(биотинил)-аминокапроилгидразид;
2-АБ – 2-аминобензамидин; 2-АК – 2-аминобензойная кислота; АПТС – 1-аминопирен-3,6,8-трисульфоновая кислота; АП – 2-аминопиридин, РМ – реакция Михаэля; ФМП – 1-фенил-3-метил-5-пиразолон; ДАП – 2,6-диаминопиридин; ТФУ – трифтоуксусная кислота; АЦН – ацетонитрил

Разделение и детектирование

Методики электромиграционного разделения

Методики электромиграционного разделения в настоящее время часто применяются в анализе гликанов и углеводов, обеспечивая высокоскоростные разделения и высокое разрешение, о чём было дано представление в ряде обзоров [39, 94–101]. Разделения основаны на различной эффективной электрофоретической подвижности аналитов в среде для разделения при наложении внешнего напряжения. В то время как «кислые» гликаны, в состав которых входят сиаловая, глюкуроновая кислоты, сульфаты или фосфаты, при низких значениях pH имеют отрицательный заряд (pKa сиаловых кислот 2,0–2,8 [102]), у «нейтральных» гликанов при очень высоких значениях pH появятся только частичные отрицательные заряды вследствие депротонирования гидроксильных групп (см. также «Высокоэффективная анионообменная хроматография»).

Применявшиеся до сих пор методики электромиграционного разделения включают капиллярный электрофорез (КЭ), гель-электрофорез (также называемый электрофорезом углеводов с использованием флуорофора), КГЭ и капиллярную электрохроматографию (см. таблицу 2). В КЭ разделение происходит по величине зарядов, поэтому сиалоформы сравнительно легко разделяются с высоким разрешением [34]. Интересный подход к разделению помеченных АПТС гликанов был представлен Zhuang и др. [103]. Авторы использовали чип-технологию и КЭ [фоновый электролит (ФЭ) – 1 мМ фосфат и 20 мМ N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N′-этансульфоновая кислота с pH 6,8]. Был проведён очень быстрый анализ (менее 3 мин) с высоким разрешением (см. рисунок 3). Дальнейшее разделение на основании размера и формы гликанов нуждается в более тщательном подборе состава ФЭ, но может быть также достигнуто путём корректировки pH и концентрации органических модификаторов в ФЭ [104, 105]. Также может использовано разделение по размеру при помощи МЭКХ или КГЭ, позволяющее разделить структурные изомеры. Иногда для большего увеличения чувствительности разделения используется борат [106, 107]. Опубликован ряд методов для гликанов, помеченных 2-АК и АПТС, в которых в качестве отсеивающей матрицы в основном применяется полиэтиленгликоль (молекулярная масса 20000–300000) [36, 108–110]. Для анализа профиля гликанов, помеченных АПТС, с высокой пропускающей способностью было разработано мультиплексирование с помощью ДНК-секвенсора [37, 38, 77]. Главным недостатком методов, основанных на КГЭ, является их несовместимость с МС, так что идентификация усложняется и может быть выполнена только путём применения стандартов или проведения дополнительных экспериментов, таких как повторный анализ образца после обработки экзогликозидазой [36, 37, 110]. Таким образом, в последние годы наблюдается увеличение использования капиллярной электрохроматографии для анализа гликанов ([111–117]. Данная методика позволяет провести разделение, основанное на величине зарядов частиц, при наложении внешнего электрического поля и обеспечивает ортогональное хроматографическое взаимодействие для повышенной селективности. Поэтому можно ожидать дальнейшего роста применения данного подхода, особенно в сочетании с МС.

Таблица 2 – Некоторые типичные методы и применения методик электромиграционного разделения для анализа олигосахаридов

Продолжение таблицы 2

Продолжение таблицы 2

Продолжение таблицы 2

Продолжение таблицы 2

Продолжение таблицы 2

АНТС – 2-аминонафталинтрисульфоновая кислота; КГЭ – капиллярный гель-электрофорез; МЭКХ – мицеллярная электрокинетическая хроматография; FACE – электрофорез углеводов с использованием флуорофора; ЦД – циклодекстрин; КЭ – капиллярный электрофорез; ЛИФ – лазерно-индуцированная флуоресценция; МАЛДИ – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; МС – масс-спектрометрия; трис – трис(гидроксиметил)аминометан; ПЭО – полиэтиленоксид; ПЭГ – полиэтиленгликоль; 3-АК – 3-аминобензойная кислота; ДСН – додецилсульфат натрия; ТЭА – тетраэтиламмоний; СБЭ – сульфобутиловый эфир; ЭАКК – ε-аминокапроновая кислота; ГЭПЭК – N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N′-этансульфоновая кислота; ЭОП – электроосмотический поток

a – 12 % раствор акриламида/бисакриламида (19:1), полимеризованный с персульфатом аммония и N,N,N′,N′-тетраэтиэтилендиамином

b – молекулярный вес не установлен

Большинство работ, в которых используется методика электромиграционного разделения, проводится в области идентификации гликанов. Однако КЭ также используется для полуколичественного сравнения отношений площадей пиков гликанов в КЭ-МС [104].

В литературе представлены несколько стратегий анализа гликанов и олигосахаридов с помощью методик электромиграционного разделения, которые отличаются по способу достижения разделения.

1. Прямой анализ. Чтобы добиться электрофоретической подвижности гликанов, применяются фоновые электролиты с высокими значениями pH, вызывающие диссоциацию гидроксильных групп олигосахаридов. Кроме того, может быть проведено целенаправленное разделение сиалированных и фосфорилированных гликанов; нейтральные гликаны переносятся только за счёт электроосмотического потока и не подвергаются дальнейшему разделению. Анализ непомеченных гликанов возможно провести с помощью прямого УФ-детектирования в области очень длинных волн [118] или непрямого детектирования с соответствующими пробами, добавленными в ФЭ [118–121]. Также могут применяться МС- [104, 122] и электрохимическое [123] детектирование.

2. Введение заряженных носителей. Было показано, что кислоты некоторых металлов образуют комплексы с соседними диольными группами – главным образом с цис-диолами, но могут также образовываться комплексы и с транс-диолами [106,107], и благодаря этому у гликанов появляется заряд. В основном используются борат или борные кислоты [124, 125]. Эти комплексообразователи также могут быть добавлены в низкой концентрации в фоновый электролит, что позволяет увеличить разрешение путём изменения селективности разделения, если применяются метки [36, 109, 110, 126]. В принципе, для анализа непомеченных гликанов может использоваться МЭКХ, однако из-за ограничений детектирования данная методика в основном используется для разделения помеченных гликанов (применяются нейтральные метки, такие как 2-аминоакридон [98, 127–129] и 2-АБ), а в качестве разделяющего носителя в ней применяются заряженные циклодекстрины [98].

3. Введение меток. В методиках электрофоретического разделения мечение гликанов в основном выполняет две функции: с одной стороны, метки делают возможным или позволяют провести флуоресцентное или масс-спектрометрическое детектирование; с другой стороны, метки увеличивают или, в случае нейтральных гликанов, позволяют провести разделение путём введения в гликаны заряда, вследствие чего у последних появляется электрофоретическая подвижность. У нас имеется возможность различать нейтральные метки (применяемые только для целей детектирования), катионные и анионные метки.

Нейтральные метки редко применяются в методиках электромиграционного разделения, поскольку в этом случае электрофоретическая подвижность должна быть достигнута другими способами; в этом отношении можно рассматривать лишь сиалированные гликаны, либо же может быть применена МЭКХ, в которой используются заряженные мицеллярные носители. Примером является применение 2-АБ [98] или 9-флуоренилметилхлороформиата на функцию аминов после высвобождения [130]. Для анализа моносахаридов было применено несколько катионных меток, таких как 6-аминохинолин [131, 132], дансилгидразин [133], бензоилгидразин [134], аминопиридин [131] и аминоакридон [127–129]. Не рекомендуется использовать их для сложных гликанов, в состав которых входят сиаловые кислоты, поскольку, если бы электрофоретическая подвижность всех гликанов имела направление к детектору, то это создало бы трудности: нейтральные гликаны (относится только к кору гликанов) будут заряжены положительно, в то время как для сиалированных гликанов не всегда удаётся достичь общего катионного заряда, что приводит к тому, что разделяться и перемещаться по направлению к детектору будет смесь катионов и анионов. Таким образом, большинство работ, касающихся анализа гликанов с помощью методик электромиграционного разделения, выполнено при использовании анионных меток, при этом наиболее часто используются АПТС, АНТС, 3-аминобензойная кислота и 2-АК (см. таблицу 2). АПТС, имеющая три заряженные группы сульфоновой кислоты, может использоваться в широком диапазоне pH, в то время как для анализа помеченных аминобезнойной кислотой гликанов, в состав которых входят сиаловые кислоты, рекомендуются более высокие значения pH, которые позволят достичь общего отрицательного заряда для всех гликанов.

Хроматографическое разделение

Хроматографическое разделение гликанов может быть выполнено с помощью адсорбционной хроматографии, которая в основном осуществляется в режиме ВЭЖХ, гель-проникающей хроматографии (эксклюзионной хроматографии [148]) или с помощью (капиллярной) газовой хроматографии [85, 149]. Последняя методика используется для анализа моносахаридов при определении состава гликоконъюгата [149] или для анализа сцепления [85]. В данном разделе описывается адсорбционная хроматография для анализа гликанов, поскольку большинство последних хроматографических разработок для анализа гликанов произошли именно в этой области. Более того, основной упор будет сделан на разделение с помощью ВЭЖХ, а другие, более старые методики адсорбционной хроматографии, такие как бумажная и тонкослойная хроматография моносахаридов, объединённые с детектированием радиоактивного трития, которым помечен восстанавливающий конец, будут исключены из рассмотрения [150, 151].

Гидрофильная хроматография (HILIC)

ВЭЖХ в режиме HILIC является широко применяемой методикой для разделения олигосахаридов [152–154]. Чаще всего используют неподвижные фазы, компонентом которых является диоксид кремния с привитыми аминогруппами: собственно диоксид кремния с привитыми аминогруппами и ZIC HILIC фазы [31, 152–154]. Также широко используют диольные фазы [155]. Часто основным механизмом удерживания является связывание водорода.

Чтобы фазы с привитыми аминогруппами можно было использовать в режиме чистой HILIC (когда не происходит обмена анионами), для них необходимо создать довольно высокие концентрации ионов, подавляющих ионные взаимодействия кислотных групп гликанов, таких как сульфатные и карбоксильные группы сиаловых кислот, с аммонийными группами неподвижной фазы. Обычно используют летучие буферы, например, уксусную кислоту/триэтиламин, в концентрациях до 200 мМ [156]. Использование фаз с привитыми аминогруппами при низких концентрациях приводит к смешанному режиму разделения HILIC/анионный обмен, который будет обсуждаться ниже.

В случае ZIC-HILIC, в которых на зёрна диоксида кремния или на полимерные зёрна привиты цвиттер-ионные сульфобетаиновые группы, параметры удерживания сиалированных помеченных АП гликанов меняются, если вместо 5 мМ ацетата аммония в растворителе содержится 20 мМ ацетата аммония, в то время как параметры удерживания нейтральных гликанов остаются без изменений, что указывает на комбинированные ионные и неионные взаимодействия в этих фазах (смешанный режим) [31].

В случае амидных и диольных фаз ионные взаимодействия играют небольшую роль, а основной причиной, вызывающей их, являются остающиеся в материале-носителе незащищённые группы диоксида кремния. Поэтому эти фазы также можно использовать в режиме чистой HILIC при низких концентрациях солей, например, при концентрации формиата аммония 50 мМ, pH 4,4 [29]. Типичным равновесным условием ВЭЖХ в режиме HILIC для моносахаридов и олигосахаридов является смесь, состоящая из 10–25 % воды в ацетонитриле с низкой концентрацией кислоты или соли (чаще всего ниже 100 мМ). При элюировании происходит градиентное увеличение доли воды в подвижной фазе обычно до 50 %.

Для того чтобы в режиме HILIC провести чувствительное детектирование, гликаны почти всегда метят хромофором или флуорофором. Наиболее часто используются такие метки, как АП [93], 2-AB [29] и 2-АК [34], но также могут использоваться и другие метки, например, 3-(ацетиламино)-6-аминоакридин [157]. Так как большинство этих меток имеют гидрофобные свойства, дериватизованные гликаны проявляют слегка меньшее время удерживания по сравнению с природными, непомеченными гликанами. Флуоресцентное детектирование проводится в основном с помощью детекторов, оснащённых ксеноновой лампой, а для достижения высокой чувствительности монохроматоры возбуждения и эмиссии могут быть выставлены на оптимальные длины волн для выбранной метки.

Иногда HILIC называют «разделением по размеру» из-за наличия взаимосвязи между размером гликана и временем его удерживания. Однако вклад дополнительных моносахаридов в удерживание олигосахарида может меняться значительно и зависит от состава сахаров в гликане. Вообще говоря, гексозы, как правило, дают большее (увеличенное) удерживание по сравнению с N-ацетилгексозаминами дезоксигексоз (фукоз) [23, 29]. HILIC также имеет значительный потенциал для разделения структурных изомеров [158–162]. Например, кор-фукозилированные двухантенные моногалактозилированные
N-гликаны, несущие галактозу в антенне по положению 6 (изомер 1) или антенне по положению 3 (изомер 2), частично разделяются с помощью HILIC после мечения
3-(ацетиламино)-6-аминоакридином [157].

Разделения, проводимые с помощью HILIC с флуоресцентным детектированием, являются весьма надёжными. Колебания времён удерживания могут быть компенсированы путём проведения стандартизации элюирующих свойств с помощью глюкозной лестницы (частичный гидролизат декстранов). Временная ось может быть приведена к оси единиц глюкозы (GU), связывая миграционные свойства олигосахаридов с порядком элюирования этих олигомеров глюкозы [29]. Rudd с коллегами создали базу данных (GlycoBase и autoGU), которая позволяет установить структурное соответствие помеченных 2-АБ олигосахаридов на основании порядка перемещения в колонке TSK-amide-80. В этой базе данных для помеченных 2-АБ гликанов приведены GU до и после расщепления экзогликозидазами [29, 163]. Использование в последнее время меньших по размеру частиц для HILIC (3 мкм вместо 5 мкм), покрытых амидами, привело к заметному уменьшению времени анализа [29, 157], что делает HILIC в сочетании с флуоресцентным детектированием подходящим методом для среднесрочного и высокопропускного анализа гликозилирования [29, 164].

Недавно был предоставлен подробный обзор анализа гликозилирования с помощью HILIC с масс-спектрометрическим детектированием [152]. Масс-спектрометрическое детектирование помеченных и непомеченных гликанов совместимо с разделением при использовании HILIC, в частности, если используются амидные или диольные фазы; это возможно благодаря низким концентрациям кислоты или летучей соли в сочетании с относительно высоким процентным содержанием ацетонитрила, что является выгодным для ЭРИ [152, 155]. Чтобы детектирование было высокочувствительным, разделение при помощи HILIC в сочетании с ЭРИ-МС часто проводится в уменьшенном масштабе вплоть до наноуровневого [152, 159, 160, 165], что позволяет провести детектирование низких фемтомолярных количеств гликанов (абсолютное введённое количество) как в природной, так и в помеченной 2-АБ форме (рис. 4) [159]. Подобно HILIC с флуоресцентным детектированием, в HILIC с нано-ЭРИ-ионноловушечной МС могут использоваться GU, если в качестве внутреннего стандарта применяется помеченная 2-АБ декстрановая лестница. Однако в этом случае основной информацией, позволяющей идентифицировать гликан и выяснить его строение, являются масса гликана и данные тандемной МС, а GU имеют вспомогательное значение [159]. Кроме того, фракции HILIC можно проанализировать с помощью МАЛДИ-ВП(/ВП)-МС(/МС) детектирования, которое может сочетаться с высокоэнергичной фрагментацией натриевых аддуктов [161, 162]. HILIC-МС является весьма практичной для углубленного анализа сложных смесей олигосахаридов, так как с её помощью можно разделять гликаны различного строения и идентифицировать изомеры [158–162]. Доказанная практичность HILIC-МС для анализа сложных смесей олигосахаридов [156–160], несомненно, в будущем приведёт к её широкому применению.

Смешанный режим разделения HILIC/анионный обмен

Некоторые авторы проводили разделения помеченных 2-АК гликанов в смешанном режиме HILIC/анионный обмен, при котором происходят и ионные, и гидрофильные взаимодействия [74, 166]. Эти разделения проводят на колонках с привитыми аминогруппами, которые, благодаря (частичному) протонированию, проявляют анионообменные свойства [74], или на сильных анионообменных колонках для ВЭЖХ с четвертичными аммониевыми группами [166]. Вклад ионных взаимодействий, вносимых меткой и гликаном, можно регулировать, изменяя ионную силу элюентов (см. «Гидрофильная хроматография (HILIC)»), тогда как на гидрофильные взаимодействия с неподвижной фазой влияет содержание воды в элюентах. Градиенты, оптимизированные путём тщательной настройки двух режимов взаимодействия, приводят к разделению групп гликанов, различающихся по заряду (рис. 5). В пределах каждой группы, имеющей одинаковый заряд, разделение проводится с помощью HILIC. Разделения гликанов с различной степенью сиалирования несколько напоминают разделения непомеченных гликанов, проведённые с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии (ВЭАОХ) [74].

Анионообменная хроматография

Многие схемы фракционирования гликанов включают препаративную анионообменную хроматографию с флуоресцентным детектированием гликанов, помеченных АП или 2-АБ [92, 93]. Анионообменная хроматография гликанов обычно проводится в нейтральной или слабощелочной среде. В этих условиях заряд большинства гликанов определяется наличием карбоновых, сиаловых или глюкуроновых кислот, сульфатов и фосфатов. Разделение основано на (отрицательном) заряде гликанов, определяемом этими заместителями. Элюирование часто осуществляется солевым градиентом, что мешает сочетанию с масс-спектрометрическим детектированием. За анионообменной хроматографией может последовать разделение при помощи HILIC заряженных групп, полученных после десиалирования, что позволяет упростить профили элюирования [167].

Высокоэффективная анионообменная хроматография

В противоположность классической анионообменной хроматографии ВЭАОХ проводится при значениях pH приблизительно 13. В этих условиях часть гидроксильных групп гликанов депротонируется, что приводит к появлению частичного отрицательного заряда, который затем используется для разделения гликанов. Гликаны с восстановленным концом проявляют меньшее удерживание, чем гликаны с восстанавливающим концом, так как у них отсутствует аномерная гидроксильная группа, которая вносит основной вклад в частичный отрицательный заряд. Обычно в анализе, проводимом после разделения с помощью ВЭАОХ, применяется электрохимическое детектирование (импульсное амперометрическое детектирование, ИАД). ВЭАОХ подходит для разделения недериватизированных гликанов, а также для гликанов с различными типами меток и модификаций.

Kotani и Takaski [168] сообщили об анализе N-связанных олигосахаридов, которые отщеплены от различных гликопротеинов, помеченных 2-АБ, с помощью ВЭАОХ с ИАД. Чтобы далее можно было выполнить флуоресцентное детектирование, проводится последующая внутрипоточная нейтрализация элюента с помощью анионного микромембранного супрессора. При этом при высоких значениях pH происходило снижение интенсивности флуоресценции, что сделало необходимым проводить послеколоночную нейтрализацию. Более того, по наблюдению авторов, лучшее хроматографическое разрешение для помеченных 2-АБ асиалоолигосахаридов, высвобожденных из человеческого альфа-1-кислого гликопротеина, было получено с помощью ВЭАОХ, а не ВЭЖХ (рис. 6).

Ridley и др. [169] сообщили о методе биотинового мечения биологически активных олигогалактуронидов с использованием стабильной гидразидной связи, которую даёт образующийся вначале нестабильный в водной среде гидразон. С помощью ВЭАОХ-ИАД наблюдали оптимизацию условий реакции, определили выходы продуктов и провели последующее исследование стабильности. Можно было прийти к заключению, что выход олигогалактуронидбиотингидразида зависит от размера олигогалактуронида.

Stubbs и др. [170] описали полупрепаративную очистку четырёхантенных олигосахаридов, выделенных из человеческого альфа-1-кислого гликопротеина. Было очищено шесть трет-бутоксикарбонил-L-тирозин-олигосахаридов, а последующий процесс мечения наблюдали с помощью ВЭАОХ-ИАД. Хроматографическое разрешение трет-бутоксикарбонил-L-тирозин-олигосахаридов, полученное с помощью ВЭАОХ-ИАД, было сравнимо с таковым свободных олигосахаридов. Тесно связана с данной публикацией [170] работа Collard и др. [171], в которой ВЭАОХ-ИАД применяли для наблюдения за временной зависимостью удаления трет-бутоксикарбонильной группы (БОК) из помеченного БОК-тирозинамидом триантенного N-гликана с последующим восстановительным алкилированием/формилированием, в результате чего происходит диметилирование тирозинамидового фрагмента.

Хроматография на ПГУ

Как недавно было рассмотрено [84], неподвижные фазы ПГУ часто используются для разделения олигосахаридных альдитов, гликанов, помеченных флуоресцентными метками, и даже перметилированных гликанов [66]. Удерживание осуществляется преимущественно за счёт сочетания ионных и гидрофобных взаимодействий [84], а элюирование часто достигается с помощью градиента органических растворителей с добавлением небольших количеств летучих солей, кислот или оснований, что делает хроматографию олигосахаридов на ПГУ совместимой с масс-спектрометрическим детектированием [84].

На ПГУ удерживаются олигосахариды и малого, и большого размера. Более того, удерживаться могут гликаны с меткой на восстанавливающем конце, а также природные гликаны. Хроматография на ПГУ является предпочтительным методом разделения для прямой жидкостной хроматографии (ЖХ)–МС анализа O-гликанов, которые были отщеплены путём восстановительного β-элиминирования, так как эти гликаны часто довольно небольшого размера и не имеют восстанавливающего конца для мечения [172, 173]. Наряду с природными или восстановленными гликанами при помощи хроматографии на ПГУ часто анализируют гликаны, помеченные флуоресцентными метками [84]. Флуоресцентные метки вносят вклад в удерживание гликанов на ПГУ: АП – метка с умеренным удерживанием на ПГУ – приводит к превосходному разделению помеченных гликанов на ПГУ, в то время как дериватизация такой меткой, как 2-АБ, имеющей выраженное влияние на удерживание гликанов на ПГУ, приводит к плохому разрешению [174]. В частности, хроматография на ПГУ очень эффективена для разделения структурных изомеров. Времена удерживания в сочетании с анализом массы гликанов часто являются достаточными для приписывания структуры [175, 176].

Обращённо-фазовая хроматография (ОФ хроматография)

Гидрофобные взаимодействия между (помеченными) олигосахаридами и неподвижной фазой происходят как в разделении с помощью хроматографии на ПГУ, так и в ОФ-разделениях на фазах C18. Однако в противоположность разделениям с помощью хроматографии на ПГУ, для ОФ-ВЭЖХ олигосахаридов необходимо провести дериватизацию, так как удерживание недериватизированных гликанов часто является недостаточным [177]. В случае помеченных гликанов удерживающие свойства определяются сочетанием гидрофобных свойств метки и вкладом моносахаридных остатков [75]. Влияние добавления моносахаридов на удерживание помеченного гликана может отличаться в зависимости от метки: для N-гликанов, помеченных слабоудерживаемой меткой АП, удерживание будет больше при большей степени галактозилирования антенн, в то время как для того же самого набора гликанов, помеченных этиловым эфиром 2-аминобензойной кислоты, при большей степени галактозилирования антенн будет наблюдаться меньшее удерживание [75].

При флуоресцентном детектировании в ОФ-ВЭЖХ наиболее широко применяются метки АП [93, 178] и 2-AB [179, 180]. Вместе с HILIC и анионообменной хроматографией ОФ-ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием используется в стратегиях комплексного картирования, позволяющих приписать помеченным АП N-гликанам определённое строение [93].

Наряду с флуоресцентным детектированием ОФ-ВЭЖХ часто сочетают с поточным ЭРИ-МС анализом; например, это было сделано для гликанов, помеченных такими метками, как ФМП, фенилгидразин и биотиновая метка БАКГ [55, 78, 181, 182]. Более того, N-гликаны, помеченные 2-АБ и 2-АК, можно проанализировать с помощью ОФ-наноЖХ-МС/МС причём в этом случае было продемонстрировано разделение структурных изомеров [83, 179, 180, 183]. Chen и Flynn [180] ярко продемонстрировали разделительную способность ОФ-ВЭЖХ для помеченных 2-АБ гликанов и объединили её с многоступенчатой тандемной МС в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов на ионно-ловушечном масс-спектрометре, что позволило приписать гликанам определённое строение (рис. 7).

Кроме того, ОФ-ВЭЖХ-МС/МС помеченных гликанов в нанодиапазоне может быть выполнена без флуоресцентного детектирования. Большим преимуществом данного подхода является то, что необходимое аналитическое оборудование имеется во многих лабораториях, занимающихся исследованиями протеомики и метаболомики: колонки (нано-ОФ C18), а также растворители (смеси вода/ацетонитрил, содержащие обычно 0,1 % муравьиной кислоты), которые используются для ЖХ-МС анализа сложных белковых смесей, могут быть непосредственно использованы для анализа помеченных 2-АБ [83, 183] и 2-АК гликанов (результаты не опубликованы) без дополнительной корректировки.

Подобным же образом с помощью ОФ-ВЭЖХ-МС могут быть проанализированы перметилированные гликаны. С помощью этого подхода можно разделить структурные изомеры перметилированных гликанов [184]. Данный метод, в частности, имеет возможность углубленной структурной характеризации гликанов с помощью тандемной МС натриевых аддуктов, в которой до настоящего времени предварительное разделение в основном не проводилось [63].

Saba и др. [78] было проведено сравнительное исследование, в котором анализировались помеченные ФМП и АНТС гликаны, причём мечение АНТС завершалась восстановительным аминированием. В целом, при анализе с помощью ЖХ-ЭРИ-МС у помеченных ФМП олигосахаридов наблюдали лучшее обычное и обращённо-фазовое разделение, а также более высокую чувствительность по сравнению с сахарами, помеченными АНТС [78]. В будущем данный подход мог бы способствовать исследованию строения различных олигосахаридов.

Масс-спектрометрия

Ионизация и детектирование гликанов

Для масс-спектрометрического анализа гликанов часто применяются как ЭРИ-МС, так и МАЛДИ-МС. ЭРИ гликанов наиболее часто применяется поточно вместе с ВЭЖХ или КЭ (см. «Разделение и детектирование»), которые могут быть использованы для количественного определения в сочетании с (изотопным) мечением (см. «Сравнительная гликомика с помощью МС»). Здесь обсуждаются ЭРИ-МС и МАЛДИ-МС в автономном режиме, без подробного рассмотрения методик дериватизации.

На эффективность ионизации олигосахаридов заметно влияют заряженные заместители в гликане, такие как карбоксильные группы сиаловой или глюкуроновой кислот и сульфатные группы, которые будут способствовать режиму отрицательной ионизации. Более того, на эффективность ионизации влияет дериватизация, так как с её помощью вносятся дополнительные заряды. Гликаны с отрицательно заряженными заместителями более эффективно ионизируются в режиме отрицательных ионов по сравнению с их нейтральными аналогами, в то время как природные, а также помеченные гликаны, которые не имеют кислотных заместителей, преимущественно анализируют в режиме положительной ионизации [185]. Примечательно, что влияние заряженных заместителей на эффективность ионизации гораздо больше заметно в МАЛДИ, чем в ЭРИ. Кроме того, дериватизация часто придаёт олигосахаридам более гидрофобный характер, что обычно повышает эффективность ЭРИ. Помимо заметного влияния на ионизацию, метки также влияют на фрагментационное поведение гликанов и могут оказать помощь в приписывании фрагментационного спектра определённому гликану путём мечения восстанавливающего конца.

Автономная ЭРИ-МС

Автономная ЭРИ-МС гликанов проводится как для природных, так и для перметилированных гликанов. Автономная ЭРИ-МС природных гликанов в основном применяется для структурного анализа с помощью тандемной МС, и её возможно проводить как в режиме отрицательных, так и в режиме положительных ионов.

В режиме положительных ионов к распыляемому растворителю, состоящему обычно из смеси вода/метанол с содержанием летучей кислоты (муравьиная или уксусная кислота), добавляют некоторое количество соли натрия [186]. Ионы натрия подавляют образование протонных аддуктов. Получаемые натриевые аддукты более стабильны по сравнению с протонными аддуктами и менее склонны разлагаться в пробе при переходе ионов из области атмосферного давления в область вакуума. При этом получают лучшую чувствительность и менее сложные соединения. Более того, тогда как тандемная МС протонных аддуктов с помощью столкновительно-индуцированной диссоциации (СИД) приводит к расщеплению гликозидных связей, СИД натриевых аддуктов дополнительно приводит к расщеплению колец, позволяя получить информацию о связях [186]. Ионизация в отрицательном режиме и фрагментация были применены Pfenninger и др. [187, 188], и недавно – Harvey [189–191], который оптимизировал условия автономной ЭРИ, что позволило зарегистрировать (многочисленные) депротонированные молекулы и/или анионные аддукты (фосфаты, нитраты или хлориды). Тандемная МС отрицательно ионизированных молекул олигосахаридов обычно приводит к специфическим расщеплению связей в кольцах, позволяя тем самым прояснить строение.

В частности, фрагментация натриевых аддуктов и депротонированных молекул конкретных гликанов даёт очень разные профили расщепления связей в кольцах [192]. Тандемная МС отрицательных ионов олигосахаридов характеризуется значительной стабильностью гликозидных связей фукозы, в противоположность тандемной МС положительных ионов, в которой связи фукозы лабильны [192].

Наиболее широко применяемой методикой мечения для автономной ЭРИ положительных ионов является перметилирование. Перметилированные гликаны по сравнению с природными обычно дают более сильные сигналы в МС. Более того, перметилирование позволяет провести очистку/обессоливание гликанов с помощью жидкостно-жидкостной экстракции или ОФ-ТФЭ (таблица 1). Тандемные масс-спектры аддуктов перметилированных гликанов с ионами натрия или других щелочных металлов являются очень информативными: Профили метильного замещения позволяют различить концевые, внутренние или находящиеся в ветвях моносахаридные остатки. Происходит весьма обширный разрыв связей в кольцах, что позволяет получить информацию о связях. Предпочтительно использовать масс-спектрометр с ионной ловушкой, который позволяет выполнить множество циклов выделения/фрагментации ионов для углубленной структурной характеризации. Сила данного подхода была продемонстрирована Prien и др. [63], выполнившими характеризацию изомеров N-гликанов РНКазы B, причём некоторые из этих изомеров были описаны впервые.

Матрично-активированная лазерная десорбционная/ионизационная (МАЛДИ) МС

В противоположность ЭРИ-МС, которая часто используется поточно с методиками разделения, МАЛДИ-МС гликанов преимущественно используется как самостоятельная методика. МАЛДИ-МС природных гликанов в основном выполняется в режиме положительных ионов при использовании 2,5-дигидроксибензойной кислоты (ДГБ) в качестве матричного вещества, что приводит к регистрации натриевых аддуктов. В противоположность этому детектирование отрицательных ионов нейтральных природных гликанов является труднодостижимым, и для него могут потребоваться специфические матрицы и добавки [192].

Перметилирование часто применяется в сочетании с МАЛДИ-ВП-МС детектированием, в результате чего достигается высокочувствительное детектирование гликанов в основном в виде натриевых аддуктов [22, 72, 85, 193]. При перметилировании карбоксильные группы остатков сиаловых кислот превращаются в метиловые эфиры, которые гораздо менее лабильны по сравнению с недериватизированными группами сиаловых кислот, и поэтому МАЛДИ-ВП-МС анализ гликанов проходит без потери сиаловых кислот, происходящем при распаде в образце или распаде метастабильного состояния [22].

Другим методом мечения, который используется в сочетании с МАЛДИ-ВП-МС анализом гликанов, является дериватизация триметиламмонийэтангидразидом (реактив Жирара Т) [60]. Эта метка вносит постоянный положительный заряд в восстанавливающий конец, что позволяет провести очень эффективную ионизацию гликанов. Мечение гликанов с помощью восстановительного аминирования имеет несколько последствий для МАЛДИ: введение в результате данной реакции (вторичной) ароматической аминогруппы (см. рисунок 2a) делает гликаны, помеченные АП, 2-АБ и 2-АК, способными легко присоединять протоны. Соответственно, МАЛДИ-МС этих гликанов часто приводит к детектированию вместе с натриевыми аддуктами также и протонных аддуктов. Что касается МАЛДИ в режиме регистрации отрицательных ионов, то метка 2-АК, ввиду наличия у неё карбоксильной группы, делает структуры нейтральных гликанов легко ионизируемыми, позволяя тем самым провести совместную регистрацию сиалированных и несиалированных гликанов на одном спектре МАЛДИ [34]. Когда сиалированные гликаны анализируются в отражательном режиме МАЛДИ-ВП-МС, то часто вследствие распада в образце или распада метастабильного состояния происходит полная или частичная потеря сиаловых кислот. Потеря сиаловых кислот слегка менее выражена в режиме отрицательных ионов. Более того, сокращение проблем, связанных с распадом, может быть достигнуто путём применения альтернативных матриц, таких как 2,4,6-тригидроксиацетофенон, который является более холодной матрицей по сравнению с ДГБ [194]. В противоположность этому, горячие матрицы, такие как α-циано-4-гидроксикоричная кислота, приводят к более выраженному десиалированию. Следует отметить, что потеря сиаловой кислоты почти не наблюдается, когда МАЛДИ-ВП-МС проводится в линейном режиме [34]: в этих условиях всё ещё проходит распад метастабильного состояния, однако образующиеся фрагменты не видны. Ускорение начинается непосредственно после ионизации/десорбции, и заряженные фрагменты, образующиеся после этого в бесполевом пространстве, разделяться не будут.

Хотя для приборов МАЛДИ-ВП-МС обычно требуется начальное давление в диапазоне
10-6 миллибар, МАЛДИ с другими МС-детекторами может также выполняться при промежуточных давлениях (обычно в субмиллибаровом диапазоне). В этих условиях подавляется потеря сиаловых кислот: при использовании ДГБ в качестве матрицы МАЛДИ-FTICR-МС при промежуточном давлении позволяет провести анализ с высокой разрешающей способностью как сиалированных, так и несиалированных помеченных 2-АК N-гликанов из человеческой плазмы с практически отсутствующим распадом в образце (рисунок 8). Наши результаты показывают, что потери сиаловых кислот удаётся избежать благодаря уменьшению энергии ионов в ионизаторе за счёт соударений при промежуточном давлении. Более того, в ионизаторе используются относительно низкие вытягивающие напряжения по сравнению с МАЛДИ-ВП-МС.

Сравнительная гликомика с помощью МС

Наиболее часто относительное количественное определение гликоформ в одном образце проводят с помощью МС (с предшествующим разделением или без него) или с помощью ЖХ или КЭ с флуоресцентным детектированием (см. «Разделение и детектирование»). Сравнение большого количество образцов гликанов с помощью масс-спектрометрического анализа может быть нарушено вследствие изменений работы масс-спектрометра с течением времени, а также ввиду большого количество необходимых для подготовки образца этапов, которые могут вносить нежелательную систематическую ошибку, например, приводить к потере сиаловых кислот. Особенно трудным может быть сам этап мечения: в частности, трудности могут возникнуть в отношении эффективности мечения, влияния компонентов матрицы или последующего этапа очистки. Недавно нами был разработан метод с высокой пропускной способностью для определения профиля гликозилирования общего N-гликома плазмы с помощью МАЛДИ-ВП-МС в отрицательном линейном режиме, которая проводится после высвобождения гликана и его мечения 2-АК. Подобным образом, определение профиля N-гликозилирования может быть выполнено для перметилированных гликанов, которые обладают тем преимуществом, что группы сиаловых кислот стабилизированы путём перевода их в метиловые эфиры [22, 69–71].

В подходах, используемых в протеомике, часто применяется мечение изотопными или изобарными метками, которое позволяет получить хорошие количественные результаты [195]. Некоторые исследовательские группы начали внедрять идею изотопного [40–44, 196–198] и изобарного [61, 91] мечения также и в гликомном анализе (см. также «Восстановительное аминирование»).

Соединения с разными изотопами имеют одинаковый атомный состав, но различаются по массе ввиду наличия в них тяжёлых изотопов – наиболее часто D и 13C. Было опубликовано несколько отчётов об использовании данного подхода в сравнительной гликомике. Многие соединения с разными изотопами вводятся путём восстановительного аминирования, например, с помощью [H4]АП и [D4]АП [40], [H4]2-АК и [D4]2-АК [41], [12C6]аланина и [13C6]аланина [43, 44] (см. «Восстановительное аминирование»). Помеченные АП моносахариды были проанализированы с помощью хроматографии на ПГУ-ЖХ-МС, и полученные относительные стандартные отклонения (RSD) составили менее 7,2 % [40]. После дериватизации декстрановой лестницы анилином и последующего анализа с помощью HILIC-ЖХ-МС полученные RSD составили менее 10 % для Hex3-Hex5. Для более крупных олигосахаридов значения RSD были выше [44]. В другом исследовании после дериватизации лакто-N-неотетраозы анилином и последующего анализа с помощью HILIC-ЖХ-МС полученное значение RSD составило 4,85 % в широком динамическом диапазоне [43].

Введение изотопной метки с помощью перметилирования было описано Alvarez-Manilla и др. [196]. Олигосахариды перметилируют с помощью 12[C]H3I или 13[C]H3I, в результате чего масса участков перметилирования отличается на 1 Да. После дериватизации Hex3-Hex5 и последующего анализа с помощью МАЛДИ-ВП-МС полученное среднее значение RSD составило 12,7 % в линейном динамическом диапазоне величиной в 2 порядка. Дифференциально помеченные гликаны из альфа-1-кислого гликопротеина были смешаны с соотношении 1:1, в результате чего полученное среднее значение RSD для семи гликоформ составило 6 %.

Однако данные подходы позволяют сравнить за один раз только одну пару образцов, тогда как методики протеомного мечения, такие как iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation; изобарные метки для относительного и абсолютного количественного анализа), позволяют сравнить до восьми образцов [199]. Недавно Bowman и Zaia [197] на основе 2-аминобензойной кислоты, применяемой в восстановительном аминировании, синтезировали другие метки, которые пригодны для прямого сравнения четырёх образцов и в которых атомы водорода замещены атомами дейтерия, в результате чего разница масс гликанов в различных образцах составляет 4 Да. При анализе с помощью ЭРИ-квадрупольной ВП-МС смесей, состоящих из дифференциально помеченных гликанов в соотношении более 1:3, полученные значения RSD были меньше 10 %. Однако эти метки не совместимы с ЖХ-разделением, так как большое количество атомов дейтерия приводит к смешениям времён удерживания.

Все описанные ранее методики мечения основаны на одном и том же принципе – введении изотопной метки in vitro. Недавно Orlando и др. [198] сообщили о применении подхода метаболического изотопного мечения in vivo с помощью аминосахаров, содержащих 15N-глутамин. Все молекулы GlcNAc, GalNAc и сиаловых кислот были помечены 15N, в результате чего их масса увеличилась на 1 Да. С помощью данного похода дифференциально помеченные клеточные гликаны могут быть смешаны до всех процедур подготовки образцов, тем самым снижая риск появления систематической ошибки при обработке образцов. Изобарные производные имеют ту же самую номинальную массу, в то время как точная масса у них другая. Примером является дериватизация перметилированием с помощью 13CH3I или 12CH2DI, в результате чего на участке перметилирования образуется разность масс (Δm) в 0,003 Да. Недавно данный подход, называемый «количественным определением с помощью изобарного мечения», был описан для сравнительной гликомики N-гликанов и O-гликанов [61, 91]. Все гликаны имеют большое число участков метилирования, и благодаря умножению сдвига массы получается разность масс, позволяющая различить дифференциально помеченные пары гликанов, анализируемых с помощью масс-спектрометров с высоким разрешением (например МС с Фурье-преобразованием).

Микроматричные анализы

Хотя большинство обсуждаемых в настоящем обзоре методов относятся к мечению и анализу гликанов для идентификации, очистки и структурной характеризации, данный раздел посвящён подходам мечения, которые объединяют структурную характеризацию с анализом биомолекулярного взаимодействия. В анализах связывания гликанов с помощью микроматриц и планшетов для микротитрования гликаны часто иммобилизуют ковалентным или нековалентным способом. Затем применяют углеводсвязывающие белки (УСБ), такие как животные или растительные лектины и иммуноглобулины. Флуоресцентное детектирование прикреплённых УСБ получают с помощью непосредственного мечения УСБ или с помощью вторичных антител, помеченных флуоресцентной меткой.

Для нековалентной иммобилизации Liu и др. [200] разработали два типа неогликолипидных проб для микроматричных анализов гликанов: гликаны могут быть конъюгированы с 1,2-дигексадецил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламином путём восстановительного аминирования или с аминооксизамещённым 1,2-дигексадецил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламином путём оксимного связывания. Неогликолипидные пробы очищают хроматографически на диоксиде кремния, проводят их структурную характеризацию с помощью МС и используют для приготовления гликановых микроматриц.

С помощью нескольких содержащих биотин меток, доступных для мечения гликанов (см. «Восстановительное аминирование» и «Мечение гидразидом») можно провести анализ связывания на планшетах для микротитрования [57, 58], а также микроматричные анализы гликанов в сочетании с детектированием поверхностного плазмонного резонанса [201]. Недавно было показано, что подробный структурный анализ меченных БАКГ гликанов может быть проведён с помощью ЖХ-МС [55], что вместе с вышеупомянутыми анализами связывания делает возможным идентифицировать природные лиганды УСБ.

Xia и др. [80] предложили в качестве универсальной метки 2,6-диаминопиридин, который имеет две ароматических аминогруппы. После восстановительного аминирования свободные аминогруппы далее могут быть связаны с любым типом N-гидроксисукцинимид-активированного реактива, что делает возможным проведение иммобилизации на поверхности матрицы или биотинового мечения [80]. Недавно мы показали, что гликаны, выделенные из природных источников и помеченные путём восстановительного аминирования флуоресцентными метками, такими как 2-АК и 2-АБ, не только подходят для многих методик разделения с флуоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием (см. «Методы разделения»), но также могут быть использованы напрямую для ковалентной иммобилизации на микроматрице природных гликанов [202] (рис. 9). В данном подходе ключевой является реакционная способность эпокси-активированных препаратов, которые реагируют с вторичной аминогруппой, связывающей флуоресцентную метку с олигосахаридной частью, позволяя тем самым провести направленную иммобилизацию гликанов, помеченных флуоресцентной меткой, на микроматричных препаратах (рис. 9d). Полученные данным способом микроматрицы были опробованы на предмет взаимодействия с УСБ с помощью флуоресцентного детектирования [202] и поверхностного плазмонного резонанса [203].

Обсуждение

В данном разделе мы обсудим некоторые вопросы, касающиеся выбора метки для гликанов: внесение изменений в свойства гликанов при дериватизации, пробоподготовку и требования к аналитическому методу.

Пробоподготовка

При выборе конкретной метки необходимо учитывать не только возможность её детектирование и способность к разделению, но также и процесс дериватизации и возможные эффекты со стороны матрицы. Для некоторых меток необходимо оптимизировать условия реакции, поскольку равновесие сдвинуто в сторону непомеченных гликанов и свободной метки. Это справедливо в отношении общей схемы мечения с помощью 2-АБ, для которой в качестве реакционного раствора необходимы органические растворители, а также это справедливо для АПТС, когда удаётся достичь только низкого выхода помеченных молекул [75].

В большинстве аналитических методик после дериватизации образца необходим этап очистки. Для МАЛДИ, ВЭАОХ и некоторых методик электромиграционного разделения необходимы образцы с низким содержанием солей. При очистке ацетоном и бумажной хроматографии в образце остаётся довольно значительное количество компонентов матрицы и солей, поэтому предпочтительными могут быть методы ТФЭ.

В большинстве стратегий учитывается удаление избытка метки, поскольку могут произойти перегрузка, загрязнение колонки или подавление сигналов (в МС). Обычно из гликанов трудно удалить гидрофильные метки, так как их свойства весьма сходны со свойствами самих гликанов. Примером является АПТС, которую трудно удалить с помощью HILIC и ОФ-ТФЭ. В случае очень гидрофобных меток, весьма вероятно, необходима удобная в работе ОФ-ТФЭ; однако эти метки несовместимы со многими последующими методиками разделения. Кроме того, придание гликанам гидрофобных свойств может привести к увеличению взаимодействия с белками и пептидами при очистке и разделении, так как эти биомолекулы обычно проявляют более высокую гидрофобность, чем гликаны. Поскольку механизм связывания на ПГУ-ТФЭ не до конца ясен, оптимизация в основном проводится путём проб и ошибок, поскольку нельзя легко оценить адсорбционную и несущую способности.

Вообще говоря, помеченные и непомеченные гликаны удерживаются и в ПГУ-ТФЭ, и в HILIC-ТФЭ и могут быть проанализированы с помощью соответствующих аналитических методик. Этого не происходит в случае ОФ-ТФЭ, где метка оказывает преобладающее влияние на связывание, и непомеченные гликаны обычно не удерживаются.

В последние годы наблюдается нарастание коммерциализации стратегий очистки. В ближайшие годы можно ожидать приложения больших усилий в этой области.

Методы разделения

В большинстве приложений методики разделения используются для получения информации о составе гликана и для его идентификации. При выборе конкретной метки основными критериями являются её заряд и гидрофобность. Заряд имеет основополагающее значение для нескольких методик разделения, например, для методики электромиграционного разделения, анионообменной хроматографии, для разделения в смешанном режиме анионный обмен/HILIC и для ВЭАОХ. В разделениях на основе КЭ гликаны должны иметь заряд для того, чтобы обладать эффективной электрофоретической подвижностью для перемещения. В КЭ часто применяется мечение гликанов АПТС и АНТС: поскольку эти метки имеют три группы сульфоновой кислоты, они обеспечивают почти не зависящий от pH высокий заряд аниона, что позволяет уменьшить время анализа. Детектирование лазерно-индуцированной флуоресценции проводится при длинах волн 488 и 325 нм [105, 108, 109, 126, 147]. Хорошие пределы детектирования могут быть также получены для масс-спектрометрии за счёт использования высокочувствительного и селективного режима отрицательной ионизации и большого отрицательного заряда помеченных гликанов [105]. Хорошие результаты могут быть получены для помеченных
2-АК гликанов при использовании КЭ или КГЭ с детектированием лазерно-индуцированной флуоресценции (325 или 355 нм) или ЭРИ-МС детектированием в режиме отрицательной ионизации (см. таблицу 2).

При использовании ВЭАОХ необходимо, чтобы гликаны обладали (частичным) отрицательным зарядом, который можно получить путём частичного депротонирования гидроксильных групп гликанов при высоких значениях pH. В этих условиях можно провести разделение природных гликанов по заряду, а также дериватизацию гликанов нейтральными метками. Введение меток, вносящих дополнительный отрицательный заряд, приводит к увеличению времён удерживания, но при этом не следует ожидать изменения или увеличения селективности.

На разделение гликанов с помощью HILIC преобладающее влияние оказывают физические свойства гликановой части. Во многих случаях метка оказывает небольшое влияние на разделение. HILIC может быть использована в качестве метода ТФЭ для очистки гликанов после мечения, поскольку небольшие ароматические молекулы, такие как 2-АК и
2-АБ, практически не удерживаются [34]. В частности, метка АПТС, которая, благодаря трём своим группам сульфоновой кислоты, обладает выраженными гидрофильными свойствами, увеличивает время перемещения помеченных гликанов в HILIC по сравнению с природными гликанами (результаты не опубликованы). В ОФ-ВЭЖХ природные гликаны практически не удерживаются, и удерживание в значительной степени определяется меткой. Было продемонстрировано разделение помеченных 2-АБ N-гликанов с разрешением структурных изомеров и детектированием с помощью (тандемной) МС, что показывает возможности ОФ-ВЭЖХ [180]. Разделение с помощью хроматографии на ПГУ чем-то напоминает разделение с помощью ОФ-ВЭЖХ, однако в этом случае наблюдается значительное удерживание природных гликанов, в которое вносят вклад эффекты заряда.

Подводя итог, существует несколько меток, пригодных для большого числа различных приложений. Например, было показано, что 2-АБ можно использовать при проведении разделений с помощью МАЛДИ, HILIC, ОФ-ЖХ, хроматографии на ПГУ, а также ВЭАОХ. Эта метки вызывает приемлемое увеличение интенсивности сигналов в ЭРИ и может быть использована для флуоресцентного детектирования. 2-АК отчасти находит схожее широкое применение; однако она может также применяться в методиках электромиграционного разделения, так как вносит отрицательный заряд при промежуточных и высоких значениях pH. Более того, в противоположность 2-АБ данная метка может быть использована в МАЛДИ-ВП-МС анализе нейтральных и сиалированных гликанов в режиме отрицательной ионизации [34].

Однако сложные смеси N-гликанов, помеченных 2-АК, имеют склонность к менее эффективному разделению с помощью ОФ-ВЭЖХ по сравнению с помеченными 2-АБ гликанами (наблюдения не опубликованы).

Что касается определения эффективности мечения, то следует рассмотреть те методы, которые позволяют одновременно провести разделение и детектирование непомеченных и помеченных гликанов. К таковым, в частности относятся методики на основе МС-детектирования, а также ИАД. Для разделения могут быть использованы ВЭАОХ, хроматография на ПГУ и HILIC. С помощью КЭ с масс-спектрометрическим детектированием можно провести анализ сиалированных гликанов, которые имеют или не имеют метку на восстанавливающем конце, однако с её помощью нельзя провести анализ непомеченных нейтральных гликанов.

Оптическое детектирование

Для УФ-детектирования могут использоваться несколько меток для гликанов: 2-АК, имеющая максимум поглощения при длине волны 214 нм [204], и ФМП, имеющий максимум поглощения при длине волны 24  нм [205]. Однако, поскольку многие биомолекулы также поглощают УФ-свет, то специфичность данного детектирования в целом низкая, и обычно предпочитают использовать другие методики детектирования, которые позволяют добиться большей чувствительности. Флуоресцентное детектирование является наиболее часто используемым методом оптического детектирования в анализе гликанов. В то время как в хроматографических методиках может быть использована флуоресценция, полученная с помощью лампы, для КЭ обычно необходимы лазерные источники возбуждения ввиду короткого оптического пути при детектировании в капилляре. Поэтому необходимо выбирать флуоресцентные метки, которые проявляют возбуждающие/эмиссионные свойства, соответствующие длинам волн обычных лазеров, таких как аргоновый с длиной волны 488 нм (АПТС), гелий-кадмиевый с длиной волны 325 нм (2-АК, 2-АБ) и Nd:YAG лазер с утроенной частотой и с длиной волны 355 нм (2-АК, 2-АБ) (см. также таблицу 2).

Амперометрическое детектирование

Амперометрическое детектирование используется почти исключительно в сочетании с ВЭАОХ [206]. Оно позволяет провести анализ помеченных и непомеченных гликанов. Однако метод не очень селективен, и сигнал также увеличивают компоненты матрицы образца, например аминокислоты. При использовании мембранного обессоливателя ВЭАОХ в капиллярном формате с амперометрическим детектированием была успешно объединена с поточной ЭРИ-МС, что позволило провести характеризацию гликанов [207].

Масс-спектрометрическое детектирование

Масс-спектрометрическое детектирование гликанов с помощью ЭРИ-МС и МАЛДИ-МС обычно проходит лучше для помеченных гликанов по сравнению с анализом непомеченных гликанов. Приобретаемые при введении метки гидрофобные свойства и заряд могут быть выгодными. Некоторые метки являются особенно предпочтительными для детектирования в режиме положительной ионизации (например, ФМП, 2-АБ); другие метки лучше использовать в режиме отрицательной ионизации (например, АНТС, АПТС). Было показано, что использование таких меток, как 2-АК, позволяет получить приемлемую интенсивность сигнала в обоих режимах ионизации [75]. Тандемная МС гликанов в виде щелочных аддуктов или в депротонированном виде с помощью (высокоэнергичной) СИД является особо ценной для структурной характеризации, так как позволяет наблюдать расщепления связей в кольцах, позволяющие получить информацию о связях [8, 9, 22, 192]. Очевидно, что многочисленные расщепления связей в кольцах часто приводят к довольно сложным спектрам, делая установление структуры по спектру довольно затруднительным [161, 162].

Сиаловые кислоты

Анализ сиалированных гликанов по-прежнему является сложной задачей. Многие исследователи решают не регистрировать степень сиалирования и используют нейраминидазы, чтобы удалить сиаловые кислоты из гликанов [38]. Это значительно упрощает профили гликанов и в то же время повышает воспроизводимость метода.

Если определение сиалоформ представляет интерес, то следует выбрать такие условия мечения и очистки, при которых риск гидролиза сиаловых кислот уменьшается: необходимо избегать этапов, на которых используются низкие значения pH и высокие температуры, и в особенности их сочетание. Чтобы уменьшить риск гидролиза, помимо кислотного восстановительного аминирования можно также рассмотреть другие стратегии мечения, например, мечение ФМП. Кроме того, катализировать гидролиз могут кислотные условия, в которых происходит хранение. Потеря сиаловых кислот также происходит при хранении гликанов на планшетах для МАЛДИ с ДГБ в качестве матрицы (результаты не опубликованы). Перметилирование может значительно стабилизировать сиаловые кислоты; однако выбор последующих аналитических методик уменьшается, так как увеличивается гидрофобность помеченных гликанов. Потеря сиаловых кислот при разделениях с помощью ЖХ или КЭ обычно не создаёт трудностей даже в очень кислой среде. Однако в сочетании с нагреванием разделительной системы потеря сиаловых кислот может стать заметной.

Детектирование с помощью МС при использовании ЭРИ или МАЛДИ может также привести к потере сиаловых кислот в ходе распада в образце или распада метастабильного состояния. Выгодным является использование метода разделения, способного отделить сиалированные гликоформы от несиалированных, так как такой метод позволяет различить по временам удерживания/перемещения сиалированные молекулы гликанов, которые присутствуют в образце, и десиалированные молекулы, образовавшиеся в ходе МС.

Количественное определение и анализ профиля

Было показано, что при использовании масс-спектрометрического анализа для относительного количественного определения помеченных гликанов можно получить надёжные результаты [34, 193]. При этом необходимо учитывать распад в образце, когда происходит в основном потеря сиаловых кислот, но может также наблюдаться и потеря целых антенн. Использование специфических ионизаторов, таких как МАЛДИ при промежуточном давлении, может с успехом минимизировать распад в образце [185], в то время как сиаловые кислоты можно стабилизировать с помощью перметилирования [22].

В МАЛДИ в качестве матрицы широко используется ДГБ. С помощью ДГБ обычно получают крупнокристаллические препараты образцов. При перекристаллизации в этаноле происходит образование меньших и более равномерно распределённых кристаллов, которые увеличивают воспроизводимость от импульса к импульсу, и поэтому их выгодно использовать в количественном определении, а также в сочетании с автоматическими измерениями.

Наряду с относительным количественным определением в сравнительной гликомике возможно провести абсолютное количественное определение с использованием внутренних стандартов. Для этой цели можно использовать метки со стабильными изотопами в сочетании с МС (см. «Сравнительная гликомика с помощью МС»). Использование меток АП или 2-АК с изотопами можно легко внедрить в лабораториях, где уже используются неизотопные соединения [40, 41]. К сожалению, дейтерий может вызвать сдвиги удерживания, а Δm в парах гликанов, помеченных этими метками, составляет только 4 Да. Оба этих неудобства можно преодолеть путём использования помеченного 13C анилина, который даёт Δm 6 Да [43, 44]. Анилиновые производные можно детектировать по флуоресценции, но только с помощью УФ-детектирования. Однако абсолютное количественное определение с использованием помеченных изотопами внутренних стандартов будет основано на масс-спектрометрическом детектировании, и отсутствие флуоресцентного детектирования не должно являться серьёзным недостатком.

Кроме того, гликаны можно пометить изотопами путём перметилирования [70, 71, 196]. И снова это будет легко осуществить в лабораториях, в которых уже применяется перметилирование; однако, поскольку количество участков перметилирования в гликанах может быть различным, полученная Δm также будет различной. При применении данного метода для сравнения сложных смесей будут получены довольно сложные масс-спектры. Недавно была опубликована информация о попытке внедрения 4-плексного изотопного мечения [197]. К сожалению, сдвиги масс получены путём введения дейтерия, что затрудняет использование хроматографии. К тому же, метки пока ещё отсутствуют в продаже.

В качестве аналога методу мечения стабильными изотопами в культуре клеток с помощью аминокислот, который широко применяется в протеомике, можно использовать метаболическое мечение олигосахаридов изотопом 15N с помощью глутамата [198]. Поскольку получаемая разность масс составляет только 1 Да на GlcNAc, GalNAc и остаток сиаловой кислоты, то общая Δm, приходящаяся на молекулу гликана, получается довольно небольшой. Более того, этот метод можно применять в культуре клеток, но с помощью него нельзя сравнивать материал, взятый у пациентов.

Использование изобарного мечения в гликомике было внедрено совсем недавно [61, 91]. При использовании данного подхода детектируются пары гликанов с одинаковой номинальной массой. Поскольку образуется очень маленькая разность масс, то необходимо использовать масс-спектрометры высокого разрешения, которые имеются не в каждой лаборатории.

Все эти методы ещё не были использованы для больших наборах образцов; мы надеемся, что будут разрабатываться и будут доступны в продаже новые метки.

Выражение признательности L.R.R. получил поддержку в виде гранта IOP IGE05007, G.Z. получил поддержку от Netherlands Genomics Initiative (Horizon Breakthrough Project 93518016), а C.H. получил поддержку в рамках Postdoc-Program Германской службы академических обменов (DAAD).

Открытый доступ Настоящая статья распространяется в соответствии с условиями Creative Commons Attribution Noncommercial License, которые разрешают любое некоммерческое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что указаны первые авторы и источник.

Список литературы