Применение капиллярного электрофореза в анализе гликопротеинов

Применение Капиллярного Электрофореза в Анализе Гликопротеинов

Аннотация

Капиллярный электрофорез (КЭ) – это универсальный аналитический метод, используемый для описания свойств гликопротеинов. Для исследования фармакологических препаратов на основе гликопротеинов используется несколько режимов разделения основе КЭ: капиллярный гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (КГЭ); динамическое капиллярное изоэлектрофокусирование (дКИЭФ) и капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). КГЭ применяется для определения занятости гликанов и числа сайтов гликозилирования, а дКИЭФ – для определения гетерогенности по заряду, обусловленной сиаловыми кислотами в составе гликопротеинов. Для дальнейшего описания гликопротеина необходимо произвести отщепление N-связанных гликанов, где применяется метод КЗЭ для анализа каждого фрагмента гликана. Соответствующие образцы, полученные из моноклонального антитела, эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) представлены в данной главе для демонстрации полезности перечисленных форм КЭ. В данной главе описываются детали приготовления образцов и условия разделения для каждой формы КЭ.

Ключевые слова: капиллярный электрофорез, КГЭ, дКИЭФ, капиллярный зонный электрофорез, моноклональное антитело, эритропоэтин, ГКСФ, N-гликан, O-гликан, амфолит, 8-аминопирен-1,3,6-трисульфоновая кислота (APTS).

Гликопротеин представляет собой белок, имеющий различные типы углеводных фрагментов, присоединенных к одной из его аминокислот. Группы углеводов присоединены либо N-гликозидной связью к амидному азоту аспарагина (N-связанные гликаны), либо О-гликозидной связью к гидроксигруппе остатка серина/треонина (О-связанные гликаны). Олигосахариды могут содержать несколько типов нейтральных моносахаридов: галактозу, маннозу, N-ацетилглюкозамин, фукозу, и такие отрицательно заряженные гликаны, как сиаловая кислота. Анализ гликоформ может быть выполнен на исходном веществе (со всё еще присоединенными к белку гликанами), или после ферментативного отщепления или химического гидролиза. Существует несколько доступных методов анализа гликоформ: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флуоресцентными метками, импульсным амперометрическим детектором, детектором заряженного аэрозоля, ДСН-ПААГ - электрофорез, масс-спектрометрия (МС), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и капиллярный электрофорез (КЭ) (1-3). За последние несколько лет КЭ стал незаменимым инструментом в анализе гликопротеинов благодаря своей высокой разрешающей способности, количественному анализу, экспресс-анализу, возможности автоматизации и, что еще более важно, серийное оборудование намного надежней в эксплуатации. КЭ располагает несколькими режимами разделения: КГЭ, мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ), динамическое капиллярное изоэлектрофокусирование (дКИЭФ), капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ), - это лишь некоторых из них. КГЭ и МЭКХ позволяют описать гликопротеины, содержащие нейтральные олигосахариды, при этом гель-электрофорез является эффективным методом оценки занятости N-связанных или O-связанных гликанов. Методы разделения дКИЭФ и КЗЭ более целесообразны для гликопротеинов, содержащих такие заряженные олигосахариды, как сиаловые кислоты. Оба метода взаимодополняют друг друга, однако, дКИЭФ быстрее и проще реализовать, чем метод КЗЭ. Метод дКИЭФ основан на полном разделении заряда, в то время как КЗЭ основан на разделении по соотношению массы и заряда. Ниже приводится ряд примеров использования методов КЭ: КГЭ-ДСН, дКИЭФ – для анализа интактных гликопротеинов, и КЗЭ – для олигосахаридов, выделенных из гликопротеинов

3.1. Капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (КГЭ)

Данный метод разделения с помощью КЭ основывается на молекулярной массе белка, который перемещается в гелевой матрице капилляра. Данный метод первоначально был разработан для замены традиционного электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, процесс которого был более трудоемким. КГЭ обладает способностью к автоматизации и количественной характеристике, обладает высокой разрешающей способностью по сравнению с блочными гелями. Высокая разрешающая способность КГЭ является основным преимуществом при анализе гликопротеинов, особенно в определении занятости гликанов (4-6). Например, данный метод способен разделять гликозилированные и негликозилированные формы белка. Метод может быть применен для определения занятости N-связанных (Рис1, 2) и О-связанных (Рис.3) гликанов.

Рисунок 1. Электроферограммы образцов восстановленных mAb, полученных в различных условиях клеточной культуры. (А) негликозилированная тяжёлая цепь продуцируется в значительном количестве (12%); (B) клеточная культура продуцирует mAb с одним центром гликозилирования (HC1) и с двумя центрами гликозилирования в HC (HC2); (C) в данном образце образуется значительное количество вещества HC2; (D) обработанный ферментом PNGase образец (С) показывает, что оба пика превращаются в негликозилированную тяжёлую цепь, что подтверждает наличие у HC2 двух сайтов гликозилирования. Обработка ферментом PNGase описана в Подразделе 3.3.

КГЭ использует додецилсульфат натрия для изменения естественных свойств белка и для связывания с белком в постоянном весовом соотношении (1,4:1). Это ведет к постоянному поддержанию соотношения заряда и массы у белков, разделение происходит по гидродинамическому размеру частиц. Белки с высокой молекулярной массой перемещаются в матрице гель-фильтрации медленнее всего и проходят через детектор самыми последними. Разделение между гликозилированными и негликозилированными белками происходит в значительной степени из-за того, что гликаны не связываются с додецилсульфатом натрия. Поэтому ожидаемое отношение заряда к массе ниже, и длительность его миграции короче. Следовательно, гликопротеин всегда мигрирует медленнее, чем его негликозилированный образец.

Первым примером является моноклональное антитело (mAb) (Рис.1), у которого сайт (-ы) N-гликозилирования обычно расположены в тяжелой цепи (HC) (~50 кДа). Рисунок 1a показывает аналоговое mAb, имеющее один сайт N-гликозилирования и приблизительно 12% негликозилированный тяжелой цепи (NGHC). Рисунок 1b, c показывает, что на HC наблюдаются два пика: первый,HC1 - ожидаемый, как и на Рис.1a, а наличие второго пика, HC2, указывает на присутствие дополнительного сайта N-гликозилирования (подтверждено масс-спектрометрией). На Рисунке 1c представлены в основном образцы HC2, содержащие два центра гликозилирования. Наличие гликозилирования может быть дополнительно подтверждено с помощью фермента PNGase, используемого для расщепления N-связанных гликанов. Обработка данным ферментом приводит к тому, что HC1 и HC2 обрушиваются, сливаясь с NGHC на Рис. 1d.

Рисунок. 2. КГЭ-электроферограмма эритропоэтина, полученного в клетках дрожжей; (А) образец эритропоэтина содержит по меньшей мере три частично разрешенных пика на интервале 18-19,5 мин, что указывает на N-гликановые неоднородности; (B) эритропоэтин, обработанный ферментом PNGase при температуре 37 °C в течение 18 ч, показывает, что его пик на 14,7 мин является более гомогенным, это указывает на то, что N-гликан не присоединен, и дает ожидаемую молекулярную массу 18 кДа, характерную для негликозилированного эритропоэтина. Обратите внимание, что обработка ферментом PNGase описана в подзаголовке 3.3.

Рисунок 3. Электроферограмма ГКСФ, полученного с помощью дрожжей. Образец содержит негликозилированный ГКСФ (НГ-ГКСФ) и O-связанный ГКСФ. Отнесение сигналов спектра было выполнено косвенным путем с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

Во втором примере представлены N-связанные гликаны эритропоэтина (ЭПО), который, как известно, имеет три сайта N-гликозилирования. Рис.2 (линия А) иллюстрирует, что ЭПО имеет три частично разрешенных пика, которые, вероятно, обусловлены неоднородностями гликанов, и после обработки ферментом PNgase они сворачиваются в один однородный, почти симметричный, пик, указывающий, что гликаны больше не прикреплены (Рис.2, линия B). Третий пример - это O-связанный гликан на ГКСФ, который имеет по меньшей мере один O-связанный сайт гликозилирования. Результаты белка ГКСФ проиллюстрированы на Рис.3 и показывают два частично разрешенных пика. Первый пик представляет собой негликозилированную форму ГКСФ, а второй пик представляет собой O-связанную гликозилированную форму ГКСФ. Так как нет специального фермента для расщепления О-гликана, применялись ортогональные методы, такие как ВЭЖХ и масс-спектрометрия (данные не приводятся).

3.1.3. Выполнение анализа методом капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (КГЭ)

3.2. Динамическое капиллярное изоэлектрофокусирование (дКИЭФ)

Данный метод используется для разделения белков по общей неоднородности заряда гликопротеина . Он был разработан для замены традиционного блочного ИЭФ в геле, который был весьма трудоемок в использовании. дКИЭФ обеспечивает очень быстрый, эффективный, автоматизированный, количественный, надежный и высоковоспроизводимый метод анализа гликопротеинов. Данный высокоразрешающий метод незаменим при описании характеристик гликопротеинов, содержащих различные формы гликанов со схожей массой, но разными изоэлектрическими точками в результате сиалилирования, фосфорилирования, или сульфонирования. Раствор дКИЭФ, содержащий сложную смесь из амфолита, маркеров pI и исследуемой белковой смеси, вводится в капилляр с защитным покрытием (фтороуглеродным). Через капилляр подается высокое напряжение, и амфолиты устанавливают градиент рН вдоль длины капилляра. Под воздействием электрического поля pI маркеры и исследуемый гликопротеин будут мигрировать вдоль капилляра до достижения значения рН, где их суммарный заряд равен нулю. Система iCE280 использует визуальное детектирование по всей длине капилляра ПЗС-камерой с длиной волны 280 нм для отслеживания паттерна изоэлектрического фокусирования гликопротеина в капиллярной колонке (9-11). Для гликопротеинов может быть достигнута степень разделения pI равная 0,05 единиц рН. Рисунок 4 (линия А) иллюстрирует профиль изоформ mAb, содержащий несколько пиков с диапазоном pI от 7.2 до 7.8. Обработка образца сиалидазой дает электроферограмму на Рис. 4 (линия B), в которой исчезают некоторые кислотные пики, подтверждая, что некоторые из кислотных вариантов являются результатом разницы в сиалилировании гликопротеина. Рисунок 5 (линия А) показывает распределение изоформ эритропоэтина, полученного в клетках дрожжей. Содержащиеся в ЭПО три потенциальных сайта N-гликозилирования и различное количество остатков сиаловой кислоты в олигосахаридах, прикрепленных к разным сайтам белкового матрикса, приводят к образованию смеси изоформ ЭПО. В то время как теоретическая изоэлектрическая точка белка составляет ~ 8.4, экспериментально, значение изоэлектрических точек EPO колеблется в диапазоне pI от 4,5 до 5,1. После обработки сиалидазой (Рис.5, линия B) один главный и несколько второстепенных образцов четко прослеживаются при в области pI 8.5, что свидетельствует о том, что сложность белка ЭПО главным образом обусловлена гетерогенностью сиаловых кислот, связанных с остатками олигосахаридов.

3.2.1. Приготовление раствора

Раствор метилцеллюлозы, 0.5%

Рисунок 4. Десиалирование мышиного mAb. (А) Необработанное mAb, удерживаемое при 4°C; (B) Обработанное сиалидазой mAb в течение 18 ч при 37°C. Образец, содержащий 20 мкл mAb (20 мг/мл в фосфатно-солевом буферном растворе), 1 мкл pI маркера 4.65, 1 мкл pI маркера 9.22, 70 мкл 1% метилцеллюлозы, 100 мкл воды качества Milli-Q, 10 мкл амфолитов фармалита 3-10 (pharmalyte 3-10 ampholytes); Время фокусировки 8 мин, 80 мМ H3PO4 в анолите и 100 мМ NaOH в католите.

Рисунок 5. Десиалирование экспрессированного в дрожжах ЭПО. (А) Необработанный ЭПО, поддерживаемый при 4°С; (B) ЭПО, обработанный сиалидазой в течение 18 часов при 37°C. Образец, содержащий 70 мкл ЭПО (2 мг/мл), 70 мкл 1% метилцеллюлозы, 100 мкл воды качества Milli-Q, 10 мкл амфолитов фармалита (pharmalyte ampholytes); Время фокусировки 7 мин. Необработанный образец и обработанный сиалидазой образец, полученные с использованием рН 3-10 фармалита; Оба образца содержат по 1 мкл следующих pI маркеров: 3,59, 7,60, 9,0.

Раствор метилцеллюлозы, 0.1%

Ортофосфорная кислота (1 М)

Анодный раствор

Катодный раствор

3.2.2. Приготовление образцов

3.2.3. Ферментативное расщепление сиалидазой (см. Примечание 14)

3.2.4. Метод динамического капиллярного изоэлектрофокусирования (дКИЭФ)