Эквивалентность данных количественного анализа гетерогенности молекул по заряду методом капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ) в системах Maurice, iCE3 и iCE280

Эквивалентность данных количественного анализа гетерогенности молекул по заряду методом капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ) в системах Maurice, iCE3 и iCE280

Введение

Методы, используемые в системах iCE3, – одни из лучших для контроля гетерогенности молекул биопрепаратов по заряду. Система Maurice® оптимизирует платформу iCE3 за счет добавления КИЭФ с флуоресцентным детектированием и возможности проведения КЭ-SDS (капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия) в дополнение к отличный данным по поглощению, ожидаемым от систем iCE280™ и iCE3®. Система Maurice также упрощает рабочий процесс, за счет размещения капилляра и связанную с ним струйную автоматику в предварительно собранной кассете, что сокращает время подготовки прибора к работе и сводит к минимуму потенциальные источники ошибки пользователя.

В данной брошюре по применению приводится соответствие данных анализа множества молекул, полученных всеми тремя системами iCE. Соответствие данных между системами iCE280 и iCE3 с использованием автоматических пробоотборников Alcott и PrinCE было продемонстрировано ранее¹, поэтому основное внимание было уделено сравнению количественных показателей и воспроизводимости результатов в режиме поглощения на системах iCE280-PrinCE, iCE3-PrinCE и Maurice.

Maurice – упрощение рабочего процесса в системах iCE

Система Maurice упрощает процесс анализа гетерогенности по заряду за счет размещения всех клапанов и струйной автоматики, требующей ручного подсоединения в системах iCE280 и iCE3, в готовой к использованию кассете КИЭФ. Для дополнительного удобства система Maurice поставляется со встроенным автоматическим пробоотборником. Перед проведением анализа в системе Maurice нет необходимости проверять устройство ввода, капилляр и клапан, отсутствует долгая процедура установки кассеты. Нужно просто поместить в систему кассету, образцы и реактивы, настроить параметры партии и нажать на кнопку «Start». В конце рабочего цикла Maurice автоматически очищает кассету КИЭФ. Нужно только промыть ёмкости для электролита в кассете, удалить образцы и реактивы, и прибор готов для следующего рабочего цикла.

Беспрепятственный перенос метода между системами

Перенос метода поглощения между системами iCE280, iCE3, и Maurice идеально отлажен, поскольку системы имеют одинаковую пробоподготовку и рабочие характеристики. В системе Maurice используются специальные стандартные образцы pI, оптимизированные для метода поглощения и флуоресцентного детектирования, но для данной брошюры по применению использовали стандартные образцы pI iCE, поскольку сравниваются только данные поглощения. Пробоподготовка каждой исследуемой молекулы была одинаковой во всех трех системах.

Для проверки соответствия данных методом КИЭФ был проведен анализ 3 различных молекул в системах iCE280, iCE3 и Maurice в режиме поглощения. Один и тот же лаборант в течение трех дней каждый день анализировал партию из 6 проб; в итоге было проанализировано 36 проб каждой молекулы. Образцы приготавливались каждый день, и полученные данные анализировали для определения pI и % соотношения площадей пиков с использованием программного обеспечения ChromPerfect Software (v6.0.4). Метод анализа каждой молекулы был одинаковым для данных, полученных на всех трех системах.

Метод анализа эритропоэтина (EPO)

Ресуспендирование лиофилизированного EPO

Во всех трех системах также был проведен анализ эритропоэтина, - терапевтического белка, который по своим свойствам является кислым. Стандартный образец лиофилизированного EPO для физико-химических испытаний был приобретен у Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранения (EDQM, PN Y0001725, партия 1). Каждая пробирка содержала примерно 0,1 мг лиофилизированного вещества, которое было ресуспендировано путем добавления 200 мкл деионизированной воды на дно пробирки комнатной температуры. Пробирки поместили в вихревую мешалку минимум на 30 секунд до полного растворения твердого вещества.

Затем EPO обессоливали и концентрировали, используя спин-колонку Vivaspin 500 (Vivaspin, PN VS0101). Спин-колонки центрифугировали со скоростью 10000 об/мин в течение 6 минут или до тех пор, пока в концентраторе не оставалось примерно 25 мкл вещества. Затем образцы либо смешивали с исходной смесью, либо хранили при температуре 4 °C.

Рисунок 1. Эквивалентные профили EPO, полученные на системах iCE280, iCE3, и Maurice (вверху). Профили сопоставимы с данными капиллярного зонного электрофореза (CZE), полученными EDQM (внизу).

Описание параметров цикла

Ресуспендированный образец смешали с исходной смесью для КИЭФ таким образом, чтобы конечная проба содержала 4 М мочевины, 0,35% метилцеллюлозы, 3,5% Фармалита 2.5-5, 0,5% Сервалита 3-5 и маркеры pI 3.59 и 5.85. Всё вещества смешали в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл до конечного объёма 200 мкл для системы Maurice и 400 мкл для систем iCE3/iCE280. Образцы поместили в вихревую мешалку на 10 секунд, а затем центрифугировали в течение 3 минут со скоростью 10000 об/мин для осаждения всех нерастворимых частиц. 150 мкл или 330 мкл образца поместили в пробирки в системы Maurice и iCE соответственно, стараясь не касаться дна центрифужной пробирки. Образцы прошли предварительную фокусировку на всех трех системах при 1500 В в течение одной минуты с последующим разделением при 3000 В в течение 6 минут.

Эквивалентность данных EPO

Системы iCE280, iCE3, и Maurice показали сопоставимые профили EPO с 8 полностью разделенными пиками (рисунок 1, сверху). Профиль EPO состоял из 4 основных пиков и 3 слаборазличимых пиков, самый большой из которых достигал высоты примерно в 0,06 единиц поглощения. Профили также оказались сопоставимы с данными капиллярного зонного электрофореза (CZE), полученными EDQM (внизу), что подтверждает точность профиля, полученного с помощью платформы iCE.

Таблица 1. Значения pI EPO с коэффициентом вариации (%CV) для всех трех систем iCE

Значения pI во всех трех системах были в пределах 0,1 единиц pI и соответствовали коэффициентам вариации ≤0.1% (Таблица 1).

Процентное соотношение площадей пиков также оказалось эквивалентно сопоставимым во всех системах с вариацией ≤2,1 % для пиков с соотношением площадей 2 % и коэффициентами вариации ≤ 11,5 % для пиков с соотношением площадей свыше 10 % (Таблица 2).

Таблица 2. Средний % соотношения площадей пиков EPO во всех трех системах с указанием коэффициентов вариации (в скобках).

Количественное определение моноклональных антител 11 (mAb11)

Установки цикла

В системах iCE280, iCE3 и Maurice был проведен анализ моноклональных антител 11 (mAb11). 10 мг/мл белкового сырья разводили непосредственно с исходной смесью для КИЭФ таким образом, чтобы конечная проба содержала 0,35% метилцеллюлозы, 4% Фармалита pH 3-10 и имела маркеры pI 5.85 и 8.40. Образцы помещали в вихревую мешалку на 10 секунд, а затем центрифугировали в течение 3 минут со скоростью 10000 об/мин. 150 мкл или 330 мкл образца поместили в пробирки в системы Maurice и iCE соответственно, не касаясь дна центрифужной пробирки. Образцы прошли предварительную фокусировку на всех трех системах при 1500 В в течение одной минуты с последующим разделением при 3000 В в течение 6 минут.

Эквивалентность данных mAB11

Данные, полученные во всех трех системах, оказались эквивалентными. Было выявлено шесть пиков с основным пиком около pI 7,2 примерно в 0,15 единиц поглощения (Рисунок 2). Значения pI полностью сопоставимы без каких-либо вариаций в зависимости от использованных для анализа приборов (Таблица 3). Коэффициенты вариации для всех систем составили ≤0,2%. Процентное соотношение площадей пиков не превышало 2% даже для слаборазличимых пиков, что подтверждает соответствие данных, полученных всеми тремя системами (Таблица 4). Системы iCE280 и iCE3, а также Maurice, использующие КИЭФ в режиме поглощения, точно определили коэффициенты вариации для пиков с соотношением площадей свыше 10 % на уровне ≤11,5 %. Данные, полученные на системе Maurice, оказались исключительно точными в отношении коэффициентов вариации ≤2.4% для пиков с соотношением площадей свыше 10%.

Количественное определение анти- альфа-1-антитрипсина

Описание параметров цикла

В системах Maurice, iCE3, и iCE280 был также проведен анализ анти-альфа-1-антитрипсина, так как эта молекула использовалась в совместном исследовании iCE3, проведенном несколькими компаниями². 5,87 мг/мл маточного раствора анти-альфа-1-антитрипсина (производства EMD Calbiochem, PN 178260, LN 2638191) было введено в исходную смесь для КИЭФ таким образом, чтобы конечная проба содержала 0,35% метилцеллюлозы, 4 М мочевины, 3% Фармалита pH 5-8, 1% Фармалита pH 3-10 и маркеры pI 5.85 и 8.40. Образцы поместили в вихревую мешалку на 10 секунд перед центрифугированием в течение 3 минут со скоростью 10000 об/мин. Затем 150 мкл или 330 мкл образца поместили в пробирку в системы Maurice и iCE соответственно, не касаясь дна центрифужной пробирки. Образцы прошли предварительную фокусировку на всех трех системах при 1500 В в течение одной минуты с последующим разделением при 3000 В в течение 12 минут.

Эквивалентность данных анти-альфа-1-антитрипсина

Системы iCE280, iCE3 и Maurice показали эквивалентные профили анти-альфа-1-антитрипсина с 7 различимыми пиками и слаборазличимым восьмым пиком около pI 7.2 (Рисунок 3). Высота самого большого пика (пик 5) на всех трех системах составляла более 0,05 единиц поглощения.

Данные были сопоставимы во все трех системах.

Зарегистрированные показатели pI были одинаковы и соответствовали значениям коэффициента вариации ≤0,4% (Таблица 5). Процентное соотношение площадей пиков также было эквивалентно на всех системах с вариацией ≤0,4 % для пиков с соотношением площадей более 2 %, и с разницей коэффициентов вариации менее 0,1 % для всех крупных пиков с соотношением площадей ≥10 % (Таблица 6).

Заключение

Если речь идет об измерении гетерогенности молекул по заряду, системы iCE3и iCE280 всегда дают воспроизводимые результаты, требуемые для быстрого попадания лекарственного средства на рынок. Система Maurice позволяет получить столь же безупречные данные, а также гарантирует непревзойденную простоту использования, что сводит к минимуму время подготовки к работе и источники ошибок.

При сравнении количественных анализов методом КИЭФ с использованием режима поглощения в системах Maurice, iCE3 и iCE280 были получены эквивалентные данные для эритропоэтина (EPO), моноклональных тел 11 (mAB11) и анти-альфа-1-антитрипсина. Значения pI во всех трех системах были в пределах 0,1 единиц pI с коэффициентами вариации ≤0,4%. Процентное соотношение площадей пиков совпадало для пиков с соотношением >2%. Данные, полученные для повторных проб, также подтвердили робастность приборов iCE. Проводился анализ партий из 6 проб в течение трех разных дней; образцы приготавливались каждый день. В общей сложности было проанализировано 36 проб, и все пики, соотношение площадей которых превышало 10 %, имели коэффициенты вариации ≤11.5%. Среднее значение CV для всех пиков с соотношением площадей более10% во всех трех системах составило 2,4%.

Поэтому когда речь идет об анализе гетерогенности молекул по заряду в режиме поглощения, системы iCE3, iCE280 и Maurice всегда предоставляют эквивалентные данные. При необходимости возможен беспрепятственный перенос метода с одной из трех систем на любую другую.

Сравнение производительности систем анализа iCE3 и iCE280, брошюра по применению ProteinSimple.

Робастность методики iCIEF для анализа моноклональных антител: Межлабораторное исследование, O Salas-Solano, B Kennel, SS Park, K Roby, Z Sosic, B Boumajny, S Free, A Reed-Bogan, D Michels, W McElroy, P Bonasia, M Hong, X He, M Ruesch, F Moffatt, S Kiessig, B Nunnally, J. Sep. Sci. 2012; 35(22): 2124-2129.