Рекомендации по оценке культур клеток животных, используемых в качестве субстратов для производства биопрепаратов, а также по описанию характеристик банков клеток

1 Рекомендации по оценке культур клеток животных, используемых в качестве субстратов для производства биопрепаратов, а также по описанию характеристик банков клеток Аббревиатуры 1. Введение 2. Историческая справка 3. Сфера действия 4. Определения 5. Общие положения 5.1 Виды субстратов клеток животных 5.2 Потенциальные риски и уменьшение рисков, связанных с биопрепаратами, производимыми в культурах клеток животных Часть A. Общие рекомендации по производству всех типов клеточных культур А.1 Надлежащая производственная практика A.2 Принципы надлежащей практики культивирования клеток A.3 Отбор исходных материалов A.4 Аттестация банков клеток производителем А.5 Криосохранение и создание банков клеток Часть B. Рекомендации по описанию характеристик банков клеток на основе субстратов клеток животных B.1 Общие положения B.2 Подлинность B.3 Стабильность B.4 Стерильность B.5 Жизнеспособность B.6 Характеристики роста B.7 Гомогенность B.8 Туморогенность B.9 Онкогенность B.10 Цитогенетика B.11 Микробные агенты B.12 Краткое описание испытаний, используемых для анализа и описания характеристик субстратов клеток животных Авторы Список литературы Приложение 1 Испытания на вирусы крупного рогатого скота в сыворотке, используемой для производства банков клеток Приложение 2 2 Протокол испытаний на туморогенность с использованием бестимусных голых мышей для оценки клеток млекопитающих Приложение 3 Протокол испытаний на онкогенность для оценки ДНК клетки и лизатов клеток Аббревиатуры ALS антилимфоцитарная сыворотка ATCC Американская коллекция типовых культур ATG антитимоцитарный глобулин ATS антитимоцитарная сыворотка BAV5 аденовирус типа 5 крупного рогатого скота БЦЖ бацилла Кальметта-Герена п.о. пара оснований BPIV3 вирус парагриппа типа 3 крупного рогатого скота BPV парвовирус крупного рогатого скота BRSV респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота BSE губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота BTV вирус блютанга BVDV вирусная диарея крупного рогатого скота CCL непрерывная (постоянная) клеточная линия CEF фибробласты куриного зародыша CHO яичник китайского хомячка CJD болезнь Крейтцфельда-Якоба CPE цитопатический эффект CTL цитотоксический Т-лимфоцит CWD хронический вастинг-синдром DCL линия диплоидных клеток EBV вирус Эпштейна-Барра ECB расширенный банк клеток (extended cell bank) EFSA Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов ELISA иммуносорбентный ферментный анализ EMA Европейское агентство по лекарственным средствам EOP получаемый в конце производственного цикла EOPC клетка, получаемая в конце производственного цикла EPIC-PCR ПЦР с использованием праймеров к экзону и прилежащему к нему интрону FBS фетальная бычья сыворотка FDA Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (США) FFI фатальная семейная бессонница GBR уровень риска BSE, характерный для географического региона GMP надлежащая производственная практика GSS синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера HCP защечный мешок хомяка HDC диплоидная клетка человека HEK мезонефрос человека ВИЧ вирус иммунодефицита человека 3 HLA антиген лейкоцитов человека IBR вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ICH Международная конференция по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для применения у человека IFA иммунофлуоресцентный анализ IFN интерферон LCMV вирус лимфоцитарного хориоменингита MAbs моноклональные антитела MCB главный банк клеток MDCK клетки Мадин-Дарби почек собак mRNA информационная РНК miRNA микро-РНК МПС массовое параллельное секвенирование NAT технология амплификации нуклеиновых кислот NCL национальная контрольная лаборатория NK натуральная (клетка-) киллер NOD не страдающий ожирением больной диабетом NRA национальный регуляторный орган OIE Всемирная организация здравоохранения животных PBS фосфатно-солевой буферный раствор PCC первичная культура клеток ПЦР полимеразная цепная реакция PDL уровень удвоения популяции PERT усиленная препаратом активность обратной транскриптазы (product-enhanced reverse transcriptase) PMCA циклическая амплификация неправильно свернутого белка PrP белок приона RCB стандартный банк клеток rcDNA остаточная клеточная ДНК rDNA получаемый при помощи технологии рекомбинантной ДНК REO3 реовирус 3-го типа RFLP полиморфизм длины рестрикционных фрагментов RT обратная транскриптаза SCID тяжелый комбинированный иммунодефицит SCL линия стволовых клеток СПФ свободный от специфических патогенов STR короткий тандемный повтор SV вирус обезьян TCID50 средняя инфекционная доза в тканевой культуре ПЭМ просвечивающая электронная микроскопия TPD50 доза, вызывающая образование опухоли в 50% случаев (tumour-producing dose at the 50% end-point) ТГЭ трансмиссивная губчатая энцефалопатия vCJD вариантная болезнь Крейтцфельда-Якоба VNTR варьирующееся число тандемных повторов VSV вирус везикулярного стоматита WCB рабочий банк клеток 4 1. Введение Клеточные субстраты представляют собой клетки, используемые для производства биопрепаратов. Достоверно известно, что как сами клеточные субстраты, так и события, связанные с клеточным ростом, могут влиять на характеристики и безопасность производимых биопрепаратов. Поэтому чтобы определить вопросы, вызывающие опасения, и разработать систему контроля качества, учитывающую данные вопросы, необходимо полное понимание характеристик клеточных субстратов. Последние достижения, связанные с использованием и контролем качества новых субстратов клеток животных, в особенности постоянных (непрерывных) клеточных линий (CCL) и клеток насекомых, поставили на повестку дня пересмотр требований ВОЗ (Требования к использованию клеток животных в качестве субстратов для производства биопрепаратов) 1. Чтобы упростить решение регуляторных/научных вопросов, связанных с использованием культур клеток животных (в том числе клеток человека) в качестве субстратов для производства биопрепаратов, ВОЗ инициировала пересмотр требований к клеточным субстратам путем утверждения Исследовательской группы ВОЗ по клеточным субстратам. Термин «клетки животных» относится к клеткам, получаемым от организмов, которые относятся к царству животных. Настоящий документ является результатом работы Исследовательской группы, которая включала в себя множество консультаций с отдельными экспертами и экспертными организациями в данной области. После получения комментариев от указанных выше экспертов и организаций, а также от приглашенных рецензентов, была продолжена работа по пересмотру настоящих рекомендаций, которые были в итоге представлены на заседании Экспертного комитета ВОЗ по биологической стандартизации в 2010 г. Во время разработки настоящего документа во внимание принимались схожие руководства по данной теме, опубликованные другими авторитетными организациями, и была предпринята попытка, по мере возможности, согласовать текст настоящего документа с другими действующими руководствами. Настоящий документ представляет собой руководство для национальных регуляторных органов (NRA), национальных контрольных лабораторий (NCL) и производителей по основным принципам и, в ряде случаев, подробным методикам, которые следует использовать при описании характеристик клеток животных, используемых в производстве биопрепаратов. Хотя полномочия по принятию решений принадлежат национальным регуляторным органам, им рекомендуется консультироваться с экспертами национальных контрольных лабораторий в данной области. 2. Историческая справка Исторически самые большие опасения, касающиеся безопасности биопрепаратов, получаемых из клеток животных, были связаны с возможным присутствием контаминантов микробного происхождения и, в некоторых случаях, со свойствами и компонентами самих клеток, таких как ДНК и белки. Например, в 1954 г. разрабатывалась экспериментальная аденовирусная вакцина, и в качестве клеточного субстрата было решено использовать «нормальные» клетки, а не 5 человеческие опухолевые клетки (HeLa) 2. В то время о биологическом механизме (механизмах) возникновения рака было известно довольно мало, поэтому сложно было проанализировать и дать научную количественную оценку канцерогенного риска для пациентов, связанного с введением вакцины, произведенной на основе клеток HeLa. Хотя понятие «нормальных» клеток не было на тот момент определено, было принято решение использовать первичные культуры клеток (PCC), получаемых от таких животных, как обезьяны, хомяки, а также из оплодотворенных куриных яиц, для научных исследований и разработок в области вакцин 3. Первые требования к клеточным субстратам были опубликованы ВОЗ в 1959 г. и касались использования первичных культур клеток, получаемых из почек клинически здоровых обезьян, для производства инактивированной полиомиелитной вакцины 4. Данные требования были пересмотрены и заново опубликованы в 1966 г. 5. Впоследствии для производства других вирусных вакцин стали использовать другие первичные культуры клеток. В 1960-ых годах были получены диплоидные клетки человека (HDC), и они были предложены в качестве альтернативы первичным культурам клеток, получаемых из почек обезьян, для производства полиомиелитной и других вирусных вакцин. В основу использования диплоидных клеток человека легли следующие связанные с ними возможности: ■ возможность осуществлять криогенное сохранение клеток при низких уровнях удвоения популяции (PDL); ■ возможность создавать криосохраненные банки клеток и описывать их характеристики, с тем чтобы в дальнейшем расширять банки и иметь возможность использовать их в качестве источника клеток в течение многих десятилетий; ■ возможность проводить всесторонние испытания размороженных клеток перед их использованием для производства вакцин; ■ возможность демонстрировать отсутствие в клетках детектируемых занесенных агентов и отсутствие потенциала к образованию опухолей при введении иммуносупрессированным животным. Таким образом, диплоидные клетки человека удовлетворяли всем существовавшим на тот момент критериям. Утверждалось, что поскольку диплоидные клетки человека являются нормальными, и могут быть стандартизованы, могут испытываться и использоваться в течение многих лет, они значительно лучше первичных культур клеток. Однако преимущества диплоидных клеток человека были признаны не сразу, в основном потому, что некоторые члены научного сообщества опасались, что диплоидные клетки человека могут содержать латентные и неизвестные онкогенные вирусы человека, и что такие потенциальные вирусы ставят под угрозу здоровье реципиентов вакцины, производимой на основе диплоидных клеток человека. Множество конференций и дебатов, в которых обсуждались новые данные, в итоге привели к тому, что диплоидные клетки человека стали использоваться в качестве субстрата для производства вирусных вакцин и продолжают использоваться многими производителями в настоящее время для производства вакцин, безопасность и эффективность которых подтверждается данными многолетних исследований. В это же время были введены понятия главного банка клеток (MCB) и рабочего банка клеток (WCB), а также процедура описания характеристик клеточного субстрата 6, 7. 6 Понимание биологии опухолевых клеток было в то время гораздо более ограниченным, чем сейчас, так же как и имевшиеся в наличии технические средства. Поэтому сторонники использования диплоидных клеток человека для производства вакцин использовали следующие четыре аргумента, чтобы доказать «нормальность» и, следовательно, безопасность этих клеток: отсутствие в них детектируемых занесенных агентов, ограниченный срок жизни диплоидных клеток человека; диплоидная природа диплоидных клеток человека и отсутствие способности к образованию опухолей в различных тест-системах in vivo. Для того чтобы обеспечить высокую степень уверенности в стабильности четырех указанных характеристик, первоначальные испытания при выпуске партий для каждой серии вакцины, полученной из диплоидных клеток человека, включали испытания клеточного субстрата на занесенные агенты, кариологические испытания и испытания туморогенности 8,9. Основной вопрос, который рассматривался в стандартных испытаниях туморогенности, это наличие контаминации или трансформации клеточной культуры, используемой в производстве препарата, которые приводили бы к появлению в клеточной культуре смеси из «нормальных» и туморогенных клеток. Позднее было установлено, что испытания на туморогенность не обладали достаточной чувствительностью для обнаружения низких уровней содержания туморогенных клеток, поэтому повторные испытания хорошо охарактеризованной клеточной линии, создаваемой для формирования банка клеток, были сочтены нецелесообразным расходом подопытных животных и времени. Поэтому в итоге испытания туморогенности стали требоваться только для описания характеристик главного банка клеток (использующего клетки, чей возраст соответствует предполагаемой продолжительности жизни in vitro, необходимой для производства препарата, или превышает ее) как для диплоидных клеток человека, так и для непрерывных клеточных линий 10, 11. В 1970-ых годах возникла необходимость в проведении клинических исследований интерферона альфа в большем количестве, чем могло быть произведено из первичных клеток лимфоцитов человека. В качестве альтернативного клеточного субстрата для производства ИФН-α были предложены опухолевые клетки человека (Namalwa), выращенные in vitro. Основные опасения, связанные с использованием клеток Namalwa, касались возможного содержания в них генома вируса Эпштейна-Барра (EBV), встроенного в клеточную ДНК, и передачи либо целого вируса либо ДНК, содержащей элементы вируса, реципиентам препаратов на основе ИФН-α. Тем не менее, к концу 1970-ых годов регуляторные агентства разрешили проведение клинических исследований препарата с участием людей, и он в итоге был зарегистрирован в ряде стран. Среди наиболее важных причин, повлиявших на это решение, был тот факт, что ИФН, в противоположность живым вирусным вакцинам, не реплицируется, и ИФН-α использовался как терапевтическое, а не как профилактическое средство, поэтому оценка соотношения риска-пользы для него была иная. Кроме того, технологии значительно усовершенствовались и позволили выполнять тщательную очистку ИФН-α , а также валидацию процедуры очистки, благодаря которой демонстрировалось отсутствие EBV и клеточной ДНК в конечном препарате в пределах возможностей количественного определения, доступных на тот момент, что способствовало снижению рисков. В 1980-ых годах развитие науки и техники позволило получать рекомбинантные белки (с использованием технологии рекомбинантной ДНК) и моноклональные антитела (MAb). В качестве субстратов было решено использовать клетки животных, обладающие возможностью непрерывного роста in vitro (CCL), поскольку их достаточно легко